Жидкостно-твердофазная экстракция основных классов биологически активных веществ корня солодки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

РГБ ОД

1 / дзг г

ДЕНИСОВА СВЕТЛАНА БОРИСОВНА

ЖИДКОСТНО-ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ОСНОВНЫХ КЛАССОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ КОРНЯ СОЛОДКИ

02.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Уфа - 2000

Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор

Муринов Ю.И.

чл.-корр. РАН,

до1сгор химических наук, профессор Казаков В.П.

доктор технических наук, доцент Зиганшин Г.К.

Ведущая организация:

Башкирский государственный университет

Защита диссертации состоится "30 " мая 2000 г на заседании диссертационного совета К 002.14.01 в Институте органической химии УНЦ РАН по адресу: 450054, г.Уфа-54, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ УНЦ РАН.

Автореферат разослан «29» апреля 2000 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Ф.А. Валеев

Л£Ь2.. Х>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тенденция к использованию лекарственны?; препаратов, получаемых из продуктов переработки растительного сырья, постоянно возрастает. Среди лекарственных растений особое место занимает солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), экстракты которой содержат широкий диапазон продуктов, в основном смеси тритерпенов и полифенолов. Интерес к данным классам соединений обусловлен широким спектром проявляемом ими биологической активности, а также низкой токсичностью и отсутствием побочных эффектов.

Однако, одним из наиболее значительных недостатков существующих процессов переработки солодкового корня для нужд химико-фармацевтической и медицинской промышленности является недостаточная степень извлечения экстрактивных веществ - -40-60%. Кроме того, получаемые в промышленности экстракты часто содержат значительное количество балластньгч веществ, что осложняет дальнейший процесс получения субстанций для лекарственных препаратов.

Экстракционный метод переработки лекарственно-технического сырья сегодня является одним из немногих, гарантирующих глубокое и практически полное извлечение биологически активных веществ (БАВ). Применяемые методы жидкостно-твердофазной экстракции (ЖТФЭ) в технологии получения фитопрепаратов должны обеспечить возможность комплексного использования растительного сырья. Использование нескольких селективных экстрагентэв дает возможность получения ряда субстанций (чаще всего суммарных).

До настоящего времени остаются не изученными физико-химические закономерности селективного извлечения различных классов БАВ корня солодки. Отсутствуют и данные по термодинамике соответствующих процессов, необходимые для понимания механизма экстракции. Поэтому систематическое исследование процессов ЖТФЭ является актуальным и позволит решить ряд задач теоретического и практического значения.

Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР Института органической химии УНЦ РАН по темам: "Комплексообразование и сольватация низкомолекулярных биорегуляторов с d- и f- металлами и фармаконами" (номер государственной регистрации 01.9.40009079), "Разработка физико-химических методов комплексной переработки солодки - высокоценного растительного сырья - как основа получения лекарственных препаратов" (how ер проекта 8.1.28) в рамках РГНТП "Экологически безопасные процессы химии и химической технологии" (Научный совет направления: "Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья").

Цель работы.

- определение оптимальных параметров ЖТФЭ и термодинамики процессов селективного извлечения основных классов БАВ;

- разработка методов фракционирования экстрактов;

- выделение и идентификация ряда компонентов корня солодки;

- разработка технологичного способа комплексной переработки корня солодки с целью получения ряда субстанций для производства фармпрепаратов.

Научная новизна. Разработаны научные основы комплексной переработки корня солодки и предложена схема селективного извлечения и разделения основных классов БАВ путем последовательной жидкостно-твердофазной экстракции корня солодки растворителями возрастающей полярности. Проведена оптимизация экстракционных процессов и определены термодинамические параметры ЖТФЭ.

Разработаны методы фракционирования фенольных соединений, основанное на различиях кислотно-основных свойств компонентов экстрактов. Из этилацетатного экстракта (ЭА) выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами производные изофлавана глабридина.

iПрактическая' ценность. Разработана схема селективного извлечения основных классов БАВ, имеющая преимущества перед используемыми в промышленности способами переработки корня солодки и позволяющая упростить ряд технологических процессов получения отдельных субстанций фармакологических пргпаратов.

Выделенные из корней Glycyrrhiza glabra L. экстракты, проявили высокую противовоспалительную, противоязвенную, репаративную, гепатопротек-торную активности. Они являются ценными субстанциями для создания ряда лекарственных форм и фармацевтических препаратов.

Разработаны технологичные способы получения тринатриевой соли гли-цирризнновой кислоты (ГК) и глицирама. Наработаны опытные партии соли (Na3riC) для нового гепатопротекторного препарата "Фосфолив" и переданы в Институт Бномедицинской химии РАМН.

Для экспресс-оценки суммы флавоноидов в растительном сырье изучено электрохимическое восстановление флавоноидов из корня солодки и предложена методика их определения в воде и этанольных экстрактах методами циклической и дифференциальной импульсной вольтамперометрии со статическим ртутным капельным и платиновым ультрами^роэлектродами с нижней границей определяемых содержаний п-10"7 моль/л.

Яа защиту выносятся:

- закономерности ЖТФЭ компонентов корня солодки органическими растворителями;

- механизм экстракции основных классов биологически активных веществ корня солод ки;

- принципиапьная схема комплексной переработки корня солодки;

- экстраки.ионно-хроматографическое выделение и разделение липофильной фракции флавоноидов корня солодки;

- пути практической реализации результатов проведенных исследований.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X (Уфа, 1994) и XI (Москва, 1998) конференциях по экстракции, II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического исгользо-вания" (Пущино, 1997), III симпозиуме "Физико-химические оснозы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), Международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), III Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (1998), V конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998), Международном симпозиуме "Solvent extraction for the XXI century" и IV школе по современным проблемам химии и технологии экстракции (Москва, 1999), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи и тезисы 13 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам выделения, разделения, идентификации и анализа основных классов БАВ корня солодки, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы.

Работа изложена 16S страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и Збтаблиц. Список цитируемой литературы включает 217 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методы исследования

Для более полного и безотходного использования растительного сырья предложена схема селективного извлечения основных классов БАВ методом последовательной жидкостно-ивердофазной экстракции (ЖТФЭ) измельченного корня солодки растворителями возрастающей полярности (Рис. 1.). Схема предполагает выделение следующих классов соединений в зависимости от природы используемого экстрагента: гексан или петролейный эфир (липиды), этилацетат (агликоны флавоноидов и полифенолы), этанол (гл икозиды флаво-ноидов и сахара). Извлечение глицирризиновой кислоты (ГК) возможно водными растворами оснований (например, карбонатом натрия) или ацетоном, содержащим кислоту.

Проведена оптимизация экстракционных процессов по извлечению отдельных классов БАВ по следующим параметрам: соотношение между твердой фазой и экстрагентом, время контакта фаз (достижения экстракционного равновесия), температура.

Корни солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) собраны в Туркмении в пойме реки Амударьи. Экстрагированы сухие, измельченные на мельнице корни. Предварительно определен фракционный состав материала методом сигового анализа.

Солодковый корень (СК)

\

Шрот СК

\

Шрот СК

\

Шрот СК

Гексан/Петролейный эфир

1=20 "С, ч, т:ж=1:4

Этилацетат

Липиды (выход-0.5%)

1-40-50 °С, 1=4 ч, т:ж=1:4

Этанол

Агликоны флавоноидов (выход-4%)

1=40-50 °С, 1=4 ч, т:ж=1:4

Гликозиды флавоноидов, сахара(вы-ход-12-14%)

н;о

1=70 "С, т=2 ч, т:ж=1:6

_И'

| Сахара

Глкцирам ^

Водная фаза

сахара (выход 4.5-7.6%)

НС1

Рис. 1. Схема комплексной переработки корня солодки методом ЖТФЭ

Липиды выделены петролейным эфиром (Тип. 40-60 °С) или гексаном при 20 °С (соотношение сырье-экстрагент 1:4).

Основные: классы полифенольных соединений выделены экстракцей этилацсгганом и этанолом. Установлено, что равновесие в экстракционной системе устанавливается за 4-5 часов процесса. Максимальное извлечение экстрактов достигается при соотношении фаз 1 : 4,1 : 5 и составляет 4 и 12% для этил-ацетага и этанола соответственно. Выход целевого продукта повышается с ростом температуры процесса. Однако, увеличение температуры ТЖФЭ выше 4050 С нежелательно вследствие значительных потерь экстрагента, а также воз-

можной изомеризации флавоноидных соединений. Кроме того, при высоких температурах этанол может в значительной степени экстрагировать различные побочные продукты, такие, например, как сахара.

Электронные спектры поглощения (ЭСП) соединений записаны на спектрофотометре Specord М40 с использованием кварцевых кювет толщиной 0.1 см. Температура плавления (разложения) соединений определена на нагревательном столике Boetius.

Спектры 'Н липидов записаны на спектрометре Bruker АМ300 (300 МГц) с введением внутреннего стандарта (ТМС). ГЖХ-анализ стерикзв проводили на хроматографе "Chrom-5" (ДИП, колонка 1.2 м х 3 мм, 5% SE-30 на Inerton-Supper, программирование температуры 200-300 °С, газ-носитель Не, 40 млмнн'1). Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществлен с использованием системы: хроматограф - масс-спектрометр — ЭВМ фирмы "Hewlett Packard". Хроматограф 5890 с масс-селективным детектором 5972А (колонка 30 м х 0.25; фаза 5% фенил-метилсиликон). Программирование температуры 10 0 в минуту в диапазоне 40-250 °С. КХ Выполнена на силикагеле марки "Chemapol" L, оксиде алюминия, полиамиде 100/160 мкм, ТСХ - на пластиках "Silufol". ВЭЖХ-анализ проведен на хроматографе "Ликвохром 2010" с УФ-детекггором, колонка Сепарон SGX С,8> элюент СН30Н-Н20-СН3С00Н 60:35:5 (об.); хроматографе "Du Pont", колонка с обращенной фазой "ц-Bondapak С-18' (30 см х 3,9 мм), элюент МеОН-НгО-АсОН (65:30:5, об. %), , скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин; "Милихром-2", колонка 2x80 мм, сорбент Silasorb Cig, элюент СН30Н-Н20-СН3С00Н 60:30:1).

2. Термодинамика процессов экстракции БАВ корня солодки

Для определения термодинамических характеристик ЖТФЭ различных классов БАВ корня солодки рассчитаны константы распределения между экст-рагентом и твердой фазой для процессов экстракции флавоноидов этанолом и этилацетатом и извлечения ГК ацетоном, содержащим минеральную кислоту.

Константа распределения Р, характеризующая экстрагирующую способность растворителя по отношению к данному распределяемому веществу А, определяется следующим равновесием:

■Ата ' Лж

Распределение вещества при этом определяется уравнением Нернсга:

М^/М^Р (1)

где М,. и Мт, - равновесное содержание вещества А в жидкой и тЕ:ердой фазах.

На основании данных по межфазному распределению БАЕ; определены основные термодинамические характеристики изучаемых систем. Изменения энтальпии процессов экстракции вычислены по температурной зависимости констант распределения (графическим методом по тангенсу угла наклона прямой Р=Г (1ЛГ>).

-0,70

2,80 2,90 3,00 3.10 3.20 330 3,40 3.50 3.60 : Ю'/Т.К-1

: (1)

0.10

3.10 3,15 3.20 3.25 3,30 3.35 3,40 3,45

КЛТ.К"1 (2)

Рис. 2. Зависимость констант распределения от температуры при извлечении

- глицирризиноной кислоты (1) ацетоном, содержащим минеральную кислоту (т=1 ч, т:ж=1:3, С икс,- 5%мас.);

- агллконов флавоноидов (2) этилацетатом (ж:т = 4:1,т = 4.5ч).

Изменение свободной энергии Гиббса Дв и энтропии ДБ при экстракции вычислены по следующим формулам:

Дв = - РХ1пР = -19.15 Т^Р (2)

ДБ = (ДН-ДО)/Т (3).

Полученные значения термодинамических функций приведены в таблице 1.

Таблица 1

Теру;одинЕ1Мические характеристики экстракционных процессов извлечения основных биологически активных веществ корня солодки

ДН, кДж/моль ДБ, Дж/(моль-К) ДОзоз, кДж/моль

. ПС (ацетон+.5%НЫ03) -12.6 -48 2.03

Агл иконы флавоноидов (этнлацетат) 39.0 133 - 1.28

Гликозиды флавоноидов (ЕЮН/ЭА) 65.1 209 0.59

Агликоны и гликозиды ф лавоноидов(ЕЮН) 29.9 97 0.73

Процессы извлечения как агликонов, так и гликозидов флагюноидов эн-дотермичны (ДН>0), что связано с разрушением межмолекулярных водородных связей и малыми значениями энергии сольватации молекул флавоноидов экст-рагентами, и сопровождаются увеличением энтропии системы (100-200 Дж/(моль-К)). Вклад энтропийного фактора в энергию Гиббса приводит к тому, что при 40-50 °С экстракция флавоноидов этанолом становится самопроизвольным процессом (ДС<0).

Энтальпия экстракции флавоноидов этанолом имеет менее положительную величину, чем этилацетатом, что связано с выигрышем энергии при сольватации флавоноидов спиртом. Энергию разрыва межмолекулярных водородных связей и в том и в другом случае можно считать близкой. Взаимодействие флавоноидов с растворителями сопровождается большими изменениями вели-, чин ДН и ДБ, практически компенсирующими друг друга; разность между ДН и ТД§ и определяет величину Дв, которая сравнительно невелика - 1-2 кДу</моль-(см. Табл. 1.).

- Установлено, что процесс извлечения ГК ацетоном, содержащим мине-> ральную кислоту, является экзотермическим (ДН<0). Повышение температуры вызывает уменьшение коэффициента распределения ГК в изучаемой системе и смещает равновесие экзотермической реакции, уменьшая скорость прямого процесса. Неблагоприятное изменение энергии Гиббса (Дв>0 во е.сем изучаемом температурном интервале) в процессе выделения ГК обусловлено большим

отрицательным изменением энтропии, которое намного превосходит энталь-пийный фактор процесса экстракции. Этот факт можно интерпретировать как следствие высокой степени сольватации молекул ГК экстрагешом. В растворе также возможны процессы ассоциации молекул ГК за счет образования межмолекулярных водородных связей (Рис.3.).

Рис. 3. Ассоциация молекул ГК в растворе.

Установлено, что между изменениями энтальпии и энтропии при извлечении основных биологически активных компонентов корня солодки соответствующими экстрагентами наблюдается линейная зависимость, характеризующая наличие термодинамического компенсационного эффекта (Рис. 4.), что указывает на сходный механизм извлечения компонентов корня солодки.

О 50 100 150 Д Э, Дж I моль-К

Рис. 4. Зависимость энтальпии от энтропии экстракции основных биологически активных компонентов корня солодки:

1 - экстракция этилацетатом;

2 - экстракция этанолом после экстрагирования этилацетатом;

3 - экстракция корня солодки этанолом;

4 - выделение ГК экстракцией ацетоном, содержащим 5% азотной кислоты

Полученные при ЖТФЭ экстракты имеют довольно сложный многокомпонентный состав. Однако биологическая активность самого экстракта может быть связана как с суммарным содержанием компонентов, так и с возможным проявлениеVI активности одним или группой соединений, присутствующих в экстракте. Вследствие этого для получения более узких фракций, объединенных некоторыми общими свойствами, был изучен процесс распределения компонентов эгилацетатного экстракта корня солодки в ряду галогенсодержащих растворителей (ССЦ. С^СЬ, СН2С12, СНС13).

Установлено, что зависимость изменения энергии Гиббса процесса распределения в данном ряду растворителей имеет линейный характер в зависимости от дипсльлого момента (ц) и акцепторного числа (АИ) используемых растворителей (Рис. 5.) и может быть описана следующими корреляционными (эмпирическими) уравнениями:

АС=8.15-0.51АМ (4);

АС=4.04-3.87 ц (5).

2,00

Рис. 5. Зависимость энергии Гиббса процессов ЖТФЭ этилацетатного экстракта корня солодки от акцепторного числа (а) и дилольного момента (б) органических растворителей;

1 - чстырелхлористый углерод,

2 - дихлорэтан,

3 - хлористый метилен,

4 - хлороформ.

Полученный эффект подтверждает предположение, что движущей силой процесса распределения этилацетатного экстракта в данном ряду растворителей являются диполь-дипольное взаимодействие, ориентационный эффект и донор-но-акцепторное взаимодействие между экстрагентом и компонентами этилацетатного экстракта.В данном ряду растворителей наблюдается аддитивность по массовому % извлечения (см. Табл. 2 и 3.). При последовательном извлечении компонентов этилацетатного экстракта растворителями возрастающей полярности было установлено, что в данном ряду более полярный растворитель способен извлечь при однократном контакте и ту часть соединений, которые были извлечены предварительно менее полярными растворителями.

Таблица 2

Свойства растворителей и их экстракционная способность по отношению к этилацетатному экстракту

Растворитель Дипольный момент, ц Акцепторное число, АЫ %

ССЦ 0 8.6 16.8

С2Н4С12 1.44 16.7 60.0

сн2сь 1.60 20.4 70.0

СНС13 1.87 23.1 82.0

СН3СООС2Н5 1.78 ' 9.3 100.0

Таблица 3

Последовательная экстракция ЭА экстракта

п Растворитель <5п.% 20„, %

1 ССЦ . 17.6 17.6

2 С2Н4О2 40.0 57.6

3 СН2С12 13.3 70.9

4 СНС13 11.0 81.9

3. Экстракционио-хроматографическое разделение этиацетатного экстракта корня солодки

Трудности, возникающие при выделении природных фенолышх соединений, объясняются многообразием изомерных структур относительно гидро-ксильных групп ароматического кольца, поэтому практически невозможно выделить за одну или две стадии экстракции или сорбции определенную группу соединений. Были использованы комбинированные приемы, сочетающие предварительное фракционирование "(экстракционное или хроматографическое) с последующим разделением одним из хроматографических методов.

Рис. 6. Схема разделения этилацетатного экстракта корня солодки

Изучен процесс распределения компонентов этилацетатиого экстракта, основанный на кислотно-основных свойствах его компонентов. Из этилацетатиого экстракта корня солодки выделены липофильные флавоноиды, растворимые в дихлорэтане (60% от исходного экстракта), разделение которых проведено по схеме, приведенной на Рис. 6. Извлеченные водным раствором карбоната натрия из липофильной фракции и, следовательно, так называемые "кислые" соединения, составили 23-24% (фенолкарбоновые и оксикоричныг кислоты), "слабокислые" фенолы или агликоны флавоноидов (растворимые в НаОК} - 3840%, "нейтральные" (неполярные) соединения - ~22%.

Анализ фракции липофильных флавоноидов, растворимой в гидроксиде натрия, методами ВЭЖХ и ГЖХ (в виде триметилсилильных производных) показал, что она является сложной системой (50-60 компонентов). Однако, на полученных хроматограммах можно четко выделить группу из 7 пиков, которые составляют более 90% (по площади хроматографических пиков). Для разделения и идентификации компонентов фракции использован метод хромато-масс-спектрометрии электронного удара (в виде триметилсилильных. производных). Установлено, что мажорные компоненты фракции - пренилированные изофла-воноиды. Масс-спектры представляют собой результат одного или двух альтернативных направлений фрагментации. При этом распад молекул флавоноидов происходит преимущественно по схеме Ретро-Дильса-Альдера (Рис. 7).

Рис. 7. Схема фрагментации глабридина по Ретро-Дильсу-Лльдеру

лсипаапсе

I !

8000 •

| 6000 ]

■ А

4000 <!

I

■ 2000 ' 0

БСШ 726 (13.667 Шп): АКЛШ.О (•) «$3

ДЪиг.с5д Гсв

115

2«0

199

379 ,1 1,!«??,

(1)

¡>0__5.00__150 200 250 300 350 400 450 500

I

ВСОО -I !

6СС0 : !

4СС0-.

2ССоЗ

5сап 015 (15.157 в!п) : АТОНИ.О (•)

з за:

187

73

9.1 115

В1/1"»

115 : |

осн,

(2)

(Ьип&пс«

1000

800

«00

400 44 1

200 1 I

0 д.

В/2-*> 50

Рис. 8. Масс-спектры ТМС-производных: глабридина (1), 4'-0-метилглабридина (2), гиспаглабридина В (3).

Идентифицированы производные изофлавана: глабридин (1) - основной компонент гидрофобной фракции этилацетатного экстракта корня солодки (-35%), а также 4'-0-метилглабридин (2), гиспаглабридин В (3). Наряду с изо-флавановыми производными идентифицированы также изофлавен глабрин (4) и лико.капкон А (5).

но-^о-Г

но

но

сн3

(4)

(5)

4. Липидм

Солодковое масло получено экстрагированием измельченных корней солодки петролейным эфиром или гексаном при комнатной температуре. Проведенными исследованиями установлено, что выход липидов составляет 0.5 % от веса воздушно-сухого сырь,я и не зависит от времени экстрагирования, соотнот шения жидкой и твердой фаз и температуры процесса. Селективность извлечения липидов обеспечивается использованием указанных выше растворителей. С использованием колоночной хроматографии (КХ) на силикагеле, сумма липидов была разделена на отдельные липидные классы, идентификация которых, проводена по данным ТСХ сравнением Rf с соответствующими значениями для модельных образцов, выделенных из природных объектов.

Таблица 4

Классы липидов корней Glycyrrhisaglabra (в % к сумме липидов)

Класс липида Содержание

Углеводороды 0.5 .

Эфиры стериноз 27.5,

Метиловые эфиры жирных кислот Следы

Триацилглицерины 10.Q

Свободные жирные кислоты 10.5

Свободные стерины 11.5

Диацилглицерины 6.2

Гликолипиды 19.0

Фосфолипиды 10.1

Неидентифицированные 4.7

ГЖХ-анализом определен жирно кислотный состав всех ацилсодержащих фракций липидов. В общем липидном 'экстракте идентифицированы 14 кислот, из которых практически 30 % составляют насыщенные, а 70 %—ненасыщенные жирные кислоты. Последние представлены в основном двумя кислотами: 18:2 (линолевая, ~52 %) и 18:1 (олеиновая, 12%). Основная насыщенная кислота -пальмитиновая (16:0).

Обнаружено, что стерины в экстракте корней солодки содержатся как в свободном, так и в связанном (сложные эфиры) виде. ГЖХ-анализ (табл. 5.) показал наличие грех компонентов.

Таблица 5

Содержание и состав свободных стеринов и их эфиров из корней-Glycyrrhiza glabra, их хрома1^)афические характеристики

Стерины Свободные стерины Связанные стерины Rf RR,

Р-Ситостерин 70.9 77.6 0.5 4.9

Стигмастерин 25.1 17.9 0.5 4.5

Брассикастерин 4.0 4.5 0.5 4.1

5, Сс/хара

Фракционирование этанольного экстракта по схеме, приведенной на Рис. , показало, что значительную его-часть - ~50-56% - составляют сахара (7-8% от веса сухого сырья). Появление сахарюв при выделении и разделении флавоно-идных гликозидов может быть связгио и с частичным их гидролизом.

Анализ осуществляли с использованием системы: хроматограф - массс-спектрометр — ЭВМ. Сахара анализировали в виде триметилсилильных производных. Идентификацию масс-спетроз проводили на основании сравнительного анализа с базой данных ЭВМ хроматографа по углеводам. Площади хро-матографических пиков были измерены с помощью электронного интегратора.

Основным компонентом Сахаров этанольного экстракта является сахароза - 46%. Это единственный дисахарид, определенный в рассматриваемом экстракте. Все остальные сахара идентифицированы как моносахариды.

Среди идентифицированных Сахаров также содержатся значительные количества арабинозы (15.4%) маннозы (9.06%), глюкозы (7.06%). В меньших количествах обнаружены О-фруктоза (2%), галактоза (2%), О-ксилоза (4.2%). В незначительных количествах отмечено присутствие: сахарных спиртов: араби-тола (0.95%), маннитол (1.33%), иноситол (0.33%).

6. Выделение ГК т шрота корня солодки

Глицирризиновая кислота - основной продукт переработки солодкового корня, поскольку его содержание в сухом корне достигает 24%. Предлагаемая нами схема комплексной переработки корня солодки позволяет упростить процесс выделения и очистки ГК. Согла сно этой схеме предложено извлекать гли-цирризиновую кислоту из шрота солодкового корня после выделения из него липидов, фенолкарбоновых кислот., агликонов и гликозидов флавоноидов. Для оптимизации этого процесса были определены основные параметры извлечения ГК методом ЖТФЭ.

Для определения оптимальных параметров экстракции глицирризиновой кислоты были изучены различные способы извлечения ее из шрота СК после экстракции его гексаном, этилацетатом и этанолом.

Первоначально был изучен процесс извлечения глицирризиновой кислоты из шрота корня солодки, основанный на экстракции водорастворимых солей ГК (водными растворами щелочей) с последующим осаждением ее водными растворами минеральных кислот. Проведена оптимизация процесса по таким параметрам, как концентрация экстрагента, соотношение сырье-экстрагент, кратность и температура процесса экстракции, а также значение рН осаждения ГТ< минеральной кислотой из полученного щелочною экстракта.

Установлено, что оптимальной является концентрация МаОН 0.5%, так как при этом извлечение ГК составило -40% (чистота извлеченной ГК в полученном продукте 60%). Повышение концентрации щелочи увеличивает степень извлечения, но ухудшает качество извлекаемой глицирризиновой кислоты (Рис.9). .

Г', %

' ЫаОН

Рис. 9. Зависимость степени извлечения ГК (Р,%) от- концентрации экстрагента (Скаон, %)'■ т=1 ч, ¡=20 °С, т:ж=1:8, 2-кратная экстракция.

Рис. 10. Зависимость степени из-впечения ГК от числа стадий экстракции' (п) солодкового шрота водным раствором МаОН: т=1 ч, 1=20 °С, т:ж=1:8, Сы,он=0.5%.

Увеличение числа стадий экстракции 0.5%-ным растрором ЫаОН приводит к повышению извлечения ГК с 40% (п=1) до 50% (п=2). При дальнейшем увеличении числа стадий экстракции существенного увеличения выхода ГК не наблюдается (Р ис. 10). Осаждение ГК из водорастворимых солей проводили концентрированной серной кислотой при комнатной температуре. Значения рН исходных экстрактов составляли 11.5-12.5. Максимальный выход глицирризи-новой кислоты происходит в интервале рН осаждения 1.0-1.5.

Так как при применении в качестве экстрагента водных растворов щелочи степень извлечения ГК ниже 45%, была изучена экстракция глицирризино-вой кислоты органическими растворителями, содержащими одну из минеральных кислот (соляную, сер'ную или азотную кислоту). Установлено, что наибольший выход продукта с минимальным количеством примесей наблюдается при использовании в качестве экстрагента ацетона, в то время как спирты в значительной мере извлекают и другие компоненты. Хлороформ практически не извлекает ГК как в присутствии кислот, так и при их отсутствии - 0.5-1.0% (вероятнее всего при этом извлекаются небольшие количества глицирретовой кислоты, присутствующей в экстракте). Исходя из полученных данных, в качестве основного экстрагента для выделения глицирризиновой кислоты из шрота солодкового корня использовали ацетон, содержащий минеральную кислоту.

Проведена оптимизация процесса. Максимальный выход ГК достигается при соотношении твердой и жидкой фаз 1 : 3.

Чистый ацетон количественно не извлекает ГК, так как она содержится в корнях солодки в виде смешанной К^^-Са-соли (Ко.б-М&п-СаадГК). Поэтому в качестве экстрагента использовали ацетон, содержащий одну из минеральных кислот - азотную, соляную или серную. Зависимости степени извлечения ГК от концентрации каждой из указанных кислот представлены на Рис. 11. Наиболее эффективно ГК извлекается ацетоном, содержащим 2.0-2.5% серной кислоты.

2 Срга. н2504]. % (мае. Ю С(тю}), % (мае.)

Рис. 11: Зависимость степени извлечения ГК от содержания кислоты в ацетоне (г=2 ч, 1=20 °С, т:ж=1:3): 1-НС1, г-НгБО.,, З-ШОз.

Как видно из Рис. 12. межфазное: равновесие данного процесса в обоих случаях достигается за 2 часа. Степень извлечения ГК при этом составляет ~50-65%. Дальнейшее увеличении времгни контакта фаз более 3-х часов не приводит к увеличению выхода ГК, кроме того, увеличивается вероятность протекания процесса гидролиза ГК по гликозидмой связи.

Рис.12. Зависимость степени извлечения ПС от времени контакта фаз (1==20 °С, т:ж=1:3): 1 - Сцс1=1.5%, 2 - СНгЗОд =2.5% (мае.).

Увеличение числа ступеней экстракции приводит, с одной стороны, к увеличению выхода целевого продукта, с другой стороны - происходит снижение его содержания в экстракте за счет повышения извлечения балластных веществ. Оптимальным является проведение одной ступени экстракции, что особенно актуально для промышленного производства.

Ргк.%

Рис. 13. Зависимость извлечения ГК из шрота солодкового корня от температуры процесса (т=1 ч, т:ж=1:3, Снш,= 5%мас.) .

Как видно из зависимости, представленной на Рис. 13, повышение температуры приводит к уменьшению степени извлечения глицирризиновой кислоты.

Установлено, что оптимальными условиями выделения ГК из шрота солодкового корня и продуктов его переработки (экстракт СК и концентрат ГК) являются следующие:

- экстрагент - ацетон, содержащий 2.5% (мае.) серной кислоты;

- соотношение твердой и жидкой фаз 1:3;

- время контакта фаз -2ч;- температура процесса - 20 °С;

- одна ступень экстракции (при этом практически достигается максимально возможное извлечение ГК в данных условиях).

6. Пути практической реализации результатов проведенных исследований

Одним из путей использования ГК является получение ее солей. Разработаны технологичные способы получения ПС, тринатриевой соли ГК и глицира-ма (моноаммокийной соли ГК). Полученные соли полностью соответствуют требованиям Временной Фармакопейной сгатьи и могут быть использованы в качестве субстанций для получения лекарственных препаратов. Наработаны опытные партии Ыа3ГК для нового гепатопротекторного препарата "Фосфолив" и переданы в Институт Бномедицинской химии РАМН. Полученные результаты клинических испытаний "Фосфолива" свидетельствуют о более выраженном действии по сравнению с известным препаратом "Эссенциале".

Таблица 6

Степень извлечения ГК и чистота получаемой Ш3ГК из различного сырья

Исходное сырье Степень извлечения ГК, % Содержание Ыа3ГК в продукте, %

Солодковый корень (СК) 40-45 (л=1) 50-55 (п=2) 25-30 15-25

Шрог СК 50-55(п=1) 65 (п-<1) 55-60 <50

Промышленный экстракт СК ' ~60(п=1) 75 (п=<>) 65 <50

Промышленный концентрат ГК 80-90 70-80 (до 92)

В лаборатории новых лекарственных средств ИОХ УНЦ РАН проведена оценка биологической активности экстрактов и фракций, полученных по предлагаемой схеме. Установлено, что фланоноиды корня солодки, наряду с противовоспалительной и противоязвенной акппшостыо, обладают гепатозащитным

и антноксидантным действием, выраженным в ингибировании перекисного окисления липидов. Масло солодки (экстракт липидов) более эффективно, чем масло шиповника, стимулирует репаративную регенерацию кожи. Сахара и водорастворимые флавоноиды этанольного экстракта оказывают выраженное спазмолитическое действие. Проведенными исследованиями в НПО "Вектор" показано, что флавоноиды корня солодки эффективно ингибируют репликацию вируса ВИЧ-1 в значительно меньших концентрациях по сравнению с ГК. Выделенные экстракты и продукты их. дальнейшей переработки могут быть предложены в качестве субстанций для создания ряда лекарственных форм и фар- . мацевтнческих препаратов.

Для экспресс-оценки суммы флавоноидов в растительном сырье изучено электрохимическое восстановление флавоноидов из корня солодки и предложена методика их определения в воде и этанольных экстрактах методами циклической и дифференциальной импульсной вольтам перометрии со статическим ртутным капельным и платиновым ультрамикроэлектродами с нижней границей определяемых концентраций п-10"7 моль/л.

Таблица 7

Результаты вольтамперометрического определения ликуразида и глаброзида в воде и этанольных экстрактах (п-5; Р=0,95)

Электрод Флавоноид Введено, мкг/мл Найдено, (х±5), мкг/мл S, Т,.

СТРКЭ Ликуразид в воде 41.3 42.3±2.5 0.02 1.52

Ликуразид в этаноле 41.3 42.1±2.4 0.02 1.56

Глаброзид в воде 110.3 102.9±13.2 0.05 2.15

УМЭ Сумма ФЛ в воде 55.0 51.4±4.8 0.05 1.94

Изучение каллусных тканей солодки голой показало, что культивируемые клетки этого растения сохраняют генетический и физиологический потенциал к биосинтезу вторичных метаболитои. Показано, что в каллусной ткани происходит не только значительное снижение содержания липидов (0.01-0.06%) и флавоноидов , но и обеднение компонентного состава в культивируемых in vitro клетках по сравнению с натуральным сырьем. Установлено, что в изучаемых условиях культивирования каллус и суспензионные культуры не продуцируют детектируемых количеств глицирризиновой кислоты, основного тритерпеново-го гликозида корня солодки. Отсутствие ГК в недифференцированных культивируемых клетках при этом частично связывается с прерыванием цепи реакций, ведущей к синтезу ГК из тритерпеиоидиого интермедиата.

Однако использование различных факторов, такт: как, регуляторы роста, свет, температура, введение в среду предшественников и др. может привести к повышению содержания или синтезу БАВ. Только н этом случае линии каллусных тканей с повышенным содержанием определенных компонентов могут быть предложены к использованию в качестве альтернативного источника сырья для промышленной разработки.

В ы В о д ы

1. Разработаны основы селективного извлечения и разделения основных классов БАВ корня солодки методом последовательной жидкостно-твердофазной экстракции растительного сырья растворителями возрастающей полярности. Проведена оптимизация экстракционных процессов.

2. Рассчитаны константы распределения между экстрагентами и твердой фазой. На основании данных по межфазному распределению БАВ определены термодинамические характеристики изучаемых систем. Найдено, что ЖТФЭ как агликонов так и гликозидов флавсноидов эндотермична и протекание процесса связано с увеличением энтропии системы. Обнаружена линейная зависимость изменения энтальпии ог изменения энтропии извлечения биологически активных компонентов корня солодки, что указывает на наличие термодинамического компенсационного эффекта.

3. Предложены методы фракционирования фенольных соединений солодки голой. основанные на свойствах растворителей и кислотно-основных свойствах компонентов экстрактов. Установлено, что в зависимости от природы экстрагента возможно селективное получение фракций, компоненты которых характеризуются определенным строением и физико-химическими свойствами. № этилацстатного экстракта выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами производные изофлавана глабридина.

4. Впервые исследован петролейно-эфирный экстракт корня солодки. Выявлены условия выделения и разделения липидов, идентифицированы их основные классы. Методом хроматомасс-спеклрометрии определен компонентный состав фракции Сахаров.

5. Предложены новые способы выделения из шрота солодкового корня гли-цирризиновой кислоты. Разработаны технологичные способы получения тринатриевой соли глицирризиновой кислоты и глицирама из продуктов переработки корня солодки. Наработаны опытные партии соли (ЪГазГК), компонента нового гепатопротекторного препарата "Фосфолив".

6. Выделенные из корней Glycyrrhiza glabra L. экстракты, проявили высокую противовоспалительную, противоязвенную, репаративную, гепатопротек-торную активности, сочетающиеся с низкой токсичностью, и могут быть предложены в качестве субстанций для создания ряда лекарственных форм и фармацевтических препаратов.

7. Предложена вольтамперометрическая методика определения флавоноидов в воде и этанол ьных жстрактах со статическим ртутным капельным и платиновым ультрамикроэлектродами с нижней границей определяемых содержаний п-10'7 моль/л.

8. Впервые проведено комплексное определение содержания биологически активных веществ каллусной ткани солодки голой.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Русаков И.А., Алехина И.Е., Денисова С.Б., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия флавоноидов из корня солодки на статическом ртутном капельном и платиновом ультрамикроэлектроде // Журн. анал. химии.-1993.-Т. 48, вып. 6.-С. 1025-1031.

2. Миназова Г.И., Денисова С.Б., Данилов В.Т., Муринов Ю.И. Спектрофото-метрическое определение суммы флавоноидов в сборе "Гепафит" // Фармация. - 1997. - № 1. - С. 27-28.

3. Карачурина JI.T., Давьщова В.А., Денисова С.Б., Зарудий Ф.С., Муринов Ю.И., Исмагилова А.Ф. Флавоноиды корня солодки как гепатопротекторы и антиоксиданты // Проблемы агропромышленного комплекса на Южном Урале и Поволжье: Сб. статей, ч. I. - Уфа, 1998.- С. 25-28.

4. Денисова С.Б., Муринов Ю.И. Некоторые термодинамические аспекты процессов экстракции биологически активных веществ корня солодки // Современные проблемы химии и технологии экстракции: Сб. статей, ч. II. - М., 1999.-С. 60-68.

5. Денисова С.Б., Данилов В.Т., 'Муринов Ю.И. и др. Экстрагирование биологически активных веществ солодкового корня // Тез. докл. X конф. по экстракции. -М-- 1994.-С. 212.

6. Мардамшин А.Г., Муринов Ю.И., Денисова С.Б., Колядина O.A., Шайхутдинова С.А. Влияние фазы роста и способа сушки каллусной ткани солодки голой на содержание флавоноидов // Тез. докл. Второго Междунар. симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". - Ч. II. - Пущино. - 1997. - С. 69.

7. Мардамшин А.Г., Муринов Ю.И.,, Денисова С.Б., Колядина O.A., Шайхутдинова С.А. Липиды каллусной ткани солодки голой // Тез. докл. VIII Симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология". -М,- 1997.-С. 40.

8. Мардамшин А.Г., Муринов Ю.И., Денисова С.Б., Колядина O.A., Шайхутдинова С.А., Валиева Р.Д. Флавоноиды каллусной ткани солодки голой // Тез. докл. Второго съезда биохимического общества. - Ч. II. - М. - С. 543.

9. Мардамшин А.Г., Муринов Ю.И!., Денисова С.Б., Колядина O.A., Шайхутдинова С.А., Валиева Р.Д. Каллусная ткань солодки голой как источник биологически активных соединений /У ¡Материалы Междунар. конф. "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений". Алматы. - 1997,- Биотехнология. Теория и практика. - 1997. - № 3. - С. 79-80.

10. Денисова С.Б., Муринов Ю.И. Оптимизация процессов выделения глицир-ризиновой кислоты и ее солей // Тез. докл. III Всероссийского совещания "Лесохимия и органический синтез". - Сыктывкар. -'1998. - С. 39.

11. Денисова С.Б., Данилов В.Т., Юнусова С.Г., Муринов Ю.И. Выделение основных классов биологически-активных веществ корня солодки // Тез. докл. III Всероссийского совещания "Лесохимия и органический синтез". — Сыктывкар. - 1998. - С. 37-38.

12. Денисова С.Б., Кабалышва H.H., Шерешовец В.В., Муринов Ю.И. Антиок-сидантная активность биологически активных соединений корня солодки // Тез. докл. V конф. "Биоантиоксидант". - М. - 1998.

13. Денисова С.Б., Муринов Ю.И. Термодинамика экстракции биологически активных веществ корня солодки // Тез. докл. XI конф. по экстракции. — М. -1998.-С. 51.

14. Денисова С.Б., Колядина O.A., Марщаяшии А.Г., Муринов Ю.И. Экстрагирование биологически активных веществ каллусной ткани солодки голой // Тез. докл. XI конф. по экстракции. - М. - 1998. - С. 214.

15. Денисова С.Б., Данилов В.Т., Муринов Ю.И. Определение тринатриевой соли глицирризиновой кислоты - компонента препарата "Фосфолив" -методом ВЭЖХ // Тез. докл. Всероссийской конф. "Химический анализ веществ и материалов". - М. - 2000. - С, 75.

16. Денисова С.Б., Мнназова Г.И., Данилов В.Т., Муринов Ю.И. Количественное определение суммы флавоноидои в сборе "Гепафит" // Тез. докл. Всероссийской конф. "Химический анализ веществ и материалов". — М. -2000. - С. 92-93.

17. Денисова С.Б., Мардамшин А.Г., Муринов Ю.И. Разработка методов анализа каллусной ткани солодки голой // Тез. докл. Всероссийской конф. "Химический анализ веществ и материалов". - М. - 2000. - С. 91-92.

Соискатель

С.Б. Денисова

Денисок. Сьетлана Борисовна

жидкостно-твердофазная экстракция основных классов биологически активных веществ корня солодки

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01 99 г.

Подписано в печать 26.04.2000 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Компьютерный набор. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л. 1,38. Уч.-изд.л. 1,86. Заказ 291. Тираж 100 экз.

Редакционно-издательский центр Башкирского университета Отпечатано на множительном участке Башкирского университета 450074. Уфа, ул.Фрунзе, 32. Тел.: (3472)236-710

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 4 ВВЕДЕНИЕ '

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Биологическая и фармакологическая активность соединений солодки

1.2. Липиды

1.3. Флавоноидные соединения

1.1.1. Методы выделение флавоноидов из растительного сырья

1.1.2. Основные методы разделения и идентификации флавоноидов

1.1.3. Идентификация спектральными методами

1.4. Глицирризиновая кислота

1.5. Сахара

1.6. Жидкостно-твердофазная экстракция основных классов БАВ

Влияние различных факторов на экстракционное равновесие

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Используемые реагенты

2.2. Получение экстрактов солодкового корня

2.3. Разделение и анализ липидов

2.4. Разделение этилацетатного экстракта методом ЖТФЭ растворителями различной полярности и водными растворами оснований

2.5. Фракционирование этилацетатного экстракта методом колоночной хроматографии

2.6. Анализ разделяемых смесей с помощью ТСХ

2.7. Силилирование соединений для масс-спектрометрического анализа

2.8. Получение глицирризиновой кислоты из глицирама

2.9. Получение концентрата глицирризиновой кислоты

ГЛАВА III. ТЕРМОДИНАМИКА ПРОЦЕССОВ ЭКСТРАКЦИИ БАВ КОРНЯ СОЛОДКИ

3.1. Определение оптимальных параметров ЖТФЭ флавоноидов

3.1.1. ЖТФЭ этилацетатом

3.1.2. ЖТФЭ этанолом

3.2. Термодинамика ЖТФЭ

3.3. Термодинамика фракционирования этилацетатного экстракта корня солодки

ГЛАВА IV. ЭКСТРАКЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

ЭТИЛАЦЕТАТНОГО ЭКСТРАКТА КОРНЯ СОЛОДКИ

4.1. Разделение этилацетатного экстракта корня солодки

4.2. Анализ VIII фракции этилацетатного экстракта

4.3. Экстракционное разделение ЭА экстракта водными растворами оснований

ГЛАВА V. ЛИПИДЫ, САХАРА, ГЛИЦИРРИЗИНОВАЯ КИСЛОТА

5.1. Липиды корня солодки

5.2. Сахара

5.3. Выделение ГК из шрота корня солодки

5.3.1. Экстракция корня солодки водным раствором щелочи

5.3.2. Извлечение ГК из шрота солодкового корня и промышленных 112 экстрактов органическими растворителями

ГЛАВА VI. ПУТИ ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

6.1. Биологическая активность некоторых компонентов, выделенных из корня солодки

6.2. Вольтамперометрия флавоноидов из корня солодки на статическом ртутном капельном и платиновом ультрамикроэлектроде

6.3. Получение глицирама '

6.4. Получение тринатриевой соли глицирризиновой кислоты

Актуальность темы. Тенденция к использованию лекарственных препаратов, получаемых из продуктов переработки растительного сырья, постоянно возрастает. Среди лекарственных растений особое место занимает солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), экстракты которой содержат широкий диапазон продуктов, в основном смеси тритерпенов и полифенолов. Интерес к данным классам соединений обусловлен широким спектром проявляемой ими биологической активности, а также низкой токсичностью и отсутствием побочных эффектов.

Однако, одним из наиболее значительных недостатков существующих процессов переработки солодкового корня для нужд химико-фармацевтической и медицинской промышленности является недостаточная степень извлечения экстрактивных веществ --40-60%. Кроме того, получаемые в промышленности экстракты часто содержат значительное количество балластных веществ, что осложняет дальнейший процесс получения субстанций для лекарственных препаратов.

Экстракционный метод переработки лекарственно-технического сырья сегодня является одним из немногих, гарантирующих глубокое и практически полное извлечение биологически активных веществ (БАВ). Применяемые методы жидкостно-твердофазной экстракции (ЖТФЭ) в технологии получения фитопрепаратов должны обеспечить возможность комплексного использования растительного сырья. Использование нескольких селективных экстрагентов дает возможность получения ряда субстанций (чаще всего суммарных).

До настоящего времени остаются не изученными физико-химические закономерности селективного извлечения различных классов БАВ корня солодки. Отсутствуют и данные по термодинамике соответствующих процессов, необходимые для понимания механизма экстракции. Поэтому систематическое исследование процессов ЖТФЭ является актуальным и позволит решить ряд задач теоретического и практического значения.

Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР Института органической химии УНЦ РАН по темам: "Компле^сообразование и сольватация низкомолекулярных биорегуляторов с d- и f- металлами и фармаконами" (номер государственной регистрации 01.9.400009079), "Разработка физико-химических методов комплексной переработки солодки - высокоценного растительного сырья - как основа получения лекарственных препаратов" (номер проекта 8.1.28) в рамках РГНТП "Экологически безопасные процессы химии и химической технологии" (Научный совет направления: "Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья").

Цель работы.

- определение оптимальных параметров ЖТФЭ и термодинамики процессов селективного извлечения основных классов БАВ;

- разработка методов фракционирования экстрактов;

- выделение и идентификация ряда компонентов корня солодки;

- разработка технологичного способа комплексной переработки корня солодки с целью получения ряда субстанций для производства фармпрепаратов.

Научная новизна. Разработаны научные основы комплексной переработки корня солодки и предложена схема селективного извлечения и разделения основных классов БАВ путем последовательной жидкостно-твердофазной экстракции корня солодки растворителями возрастающей полярности. Проведена оптимизация экстракционных процессов и определены термодинамические параметры ЖТФЭ.

Разработаны методы фракционирования фенольных соединений, основанные на различиях кислотно-основных свойств компонентов экстрактов. Из этилацетатного экстракта выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами производные изофлавана глабридина.

Практическая ценность. Разработана схема селективного извлечения основных классов БАВ, имеющая преимущества перед используемыми в промышленности способами переработки корня солодки и позволяющая упростить ряд технологических процессов получения отдельных субстанций фармакологических препаратов.

Выделенные из корней Glycyrrhiza glabra L. экстракты, проявили высокую противовоспалительную, противоязвенную, репаративную, гепатопротекторную активности. Они являются ценными субстанциями для создания ряда лекарственных форм и фармацевтических препаратов.

Разработаны технологичные способы получения тринатриевой соли глицирризино-вой кислоты и глицирама. Наработаны опытные партии соли (ЫазГК) для нового гепато-протекторного препарата "Фосфолив" и переданы в Институт Биомедицинской химии РАМН.

Для экспресс-оценки суммы флавоноидов в растительном сырье изучено электрохимическое восстановление флавоноидов из корня солодки и предложена методика их определения в воде и этанольных экстрактах методами циклической и дифференциальной импульсной вольтамперометрии со статическим ртутным капельным и платиновым ульт

-l рамикроэлектродами с нижней границей определяемых содержаний п-10* моль/л.

На защиту выносятся; закономерности ЖТФЭ компонентов корня солодки органическими растворителями;

- механизм экстракции основных классов биологически активных веществ корня солодки;

- принципиальная схема комплексной переработки корня солодки;

- экстракционно-хроматографическое выделение и разделение липофильной фракции флавоноидов корня солодки;

- пути практической реализации результатов проведенных исследований.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X (Уфа, 1994) и XI (Москва, 1998) конференциях по экстракции, на П съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на II международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997), на III симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), на международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), на 1Й Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (Сыктывкар, 1998), на V конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998), на международном симпозиуме и IV школе по современным проблемам химии и технологии экстракции (Москва, 1999), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи и тезисы 13 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам выделения, разделения, идентификации и анализа основных классов БАВ корня солодки, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны научные основы селективного извлечения и разделения основных классов БАВ методом последовательной жидкостно-твердофазной экстракции корня солодки растворителями возрастающей полярности. Проведена оптимизация экстракционных процессов.

2. Рассчитаны константы распределения между экстрагентами и твердой фазой. На основании данных по межфазному распределению БАВ определены термодинамические характеристики изучаемых систем. Найдено, что ЖТФЭ как агликонов так и гликозидов флавоноидов эндотермична и протекание процесса связано с увеличением энтропии системы. Обнаружена линейная зависимость изменения энтальпии от изменения энтропии извлечения биологически активных компонентов корня солодки, что указывает на наличие термодинамического компенсационного эффекта.

3. Впервые исследован петролейно-эфирный экстракт корня солодки. Выявлены условия выделения и разделения липидов, идентифицированы их основные классы. ГЖХ-анализом определен жирнокислотный состав ацилсодержащих липидов.

4. Предложены методы фракционирования фенольных соединений солодки голой, основанные на свойствах растворителей и кислотно-основных свойствах компонентов экстрактов. Установлено, что в зависимости от природы экстрагента возможно селективное получение фракций, компоненты которых характеризуются определенным строением и физико-химическими свойствами. Из этилацетатного экстракта выделены и идентифицированы современными физико-химическими методами производные изо-флавана глабридина.

5. Установлено, что этанольный экстракта корня солодки, наряду с гликозидами флавоноидов, содержит свободные сахара (7-8% от веса сухого сырья). Методом хромато-масс-спектрометрии определен компонентный состав фракции Сахаров.

6. Предложены новые способы выделения из шрота солодкового корня глицирризиновой кислоты. Разработаны технологичные способы получения тринатриевой соли глицирризиновой кислоты и глицирама из продуктов переработки корня солодки. Наработаны опытные партии соли (№зГК), компонента нового гепатопротекторного препарата "Фосфолив".

148

7. Выделенные из корней Glycyrrhiza glabra L. экстракты, проявили высокую противовоспалительную, противоязвенную, репаративную, гепатопротекторную активности, сочетающиеся с низкой токсичнос!ъю, и могут быть предложены в качестве субстанций для создания ряда лекарственных форм и фармацевтических препаратов.

8. Предложена вольтамперометрическая методика определения флавоноидов в воде и этанольных экстрактах со статическим ртутным капельным и платиновым ультрамик-роэлектродами с нижней границей определяемых содержаний п-10"7 моль/л.

9. Впервые проведено определение содержания биологически активных веществ каллусной ткани солодки голой по схеме, разработанной нами для выделения основных БАВ корня солодки.

1. Lutomski J., Nieman С., Fenwick G.R. Liquorice, Glycyrrhiza glabra L. Biological properties // Herba Polonica - 1991. - V. 37, № 3-4. - P. 163-178.

2. Yano S., Harada M., Watanabe K. Et al. Antiulcer activities of glycyrrhetinic acid derivatives in experimental gastric lesion models // Chem. And Pharm. Bull. 1989. - V. 37, № 9. - P. 2500-2504.

3. Заявка 64-380325 Япония, МКИ 4 A 61 К 35/78. Препараты для лечения желудочно-кишечных заболеваний / Юда М. № 62-192307; Заявл. 31.07.87; Опубл. 08.02.89 // Кокай токкё кохо. Сер. 3 (2). - 1989. - 14. - С. 161-166. РЖ Хим. 1989:240315П.

4. Ikram М., Zirvi А.К. Chemistry and pharmacology of licorice (genus Glycyrrhiza) // Herba Pol. 1976. - № 3-4. - P. 312-320.

5. Wang Y.T., Su C.Y., Ко W.C., Hsu S.Y., Tsai C.S. Antiulcer biopharmaceutical produced in Taiwan // Tai-Wan I Hsueh Hui Tsa Chih. 1972. - V. 7, № 4. - P. 256-259. - C.A. 1972:77:15:96972g.

6. Shibata S. Antitumor-promoting and antiinflammatory activities of licorice principles and their modified compounds // ACS Symposium Series. 1994. - V. 547. - P. 308-321.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х ч. Ч. 1. М.: Медицина, 1984. - 580 с.

8. Kowalczyk В. Determination of ammonium glycyrrhizate in Tussilinar preparation // Herba Pol. 1986. - V. 32, № 3-4. - P. 167-171.

9. Shibata S., Inoue H., Iwata S. et al. Inhibitory effects of licochalcone A isolated from Glycyrrhiza inflata roor on inflammatory ear edema and tumor promotion in mice // Planta Med. -1991. V. 57, № 3. - P. 221-224.

10. Yokota Т., Nishi H., Kubota Y., Mizoguchi M. The inhibitory effect of glabridin from licorice extracts on melanogenesis and inflammation // Pigm. Cell Res. 1998. - V. 11, № 6. -P. 355-361.

11. Kobayashi S., Miyamoto Т., Kimura I., Kimura M. Inhibitory effect of isoliquiritigenin, a compound in licorice root, on angiogenesis in-vivo and tube formation in-vitro // Biol. Pharmacol. Bull. 1995. -V. 18, № 10. -P. 1382-1386.

12. Shibata I.M., Elghamry M.I. Estrogenic activity of Glycyrrhiza glabra with its effect on uterine motility at various stages of the sex cycle // Zentr. Veterinaermed. Ser. A. 1963. -10.-P. 155-162. -C.A. 1963:59:7:7815h.

13. Zayed S.M., Elghamry M.I., Hassan A. Estrogenic substances from Egyptian Glycyrrhiza glabra // Zentr. Veterinaermed. Ser. A. 1964. - 11. - P. 773-776. - C.A. 1965:62:8:9465h.

14. Муравьев И.А., Кононихина Н.Ф. Эстрогенные свойства травы солодки голой // Растительные ресурсы. 1972. - Т. 8, № 4. - С. 490-497.

15. Кононихина Н.Ф. Условия экстракции фитоэстрогенов солодки голой (Glycyrrhiza glabra) // Актуальные вопросы фармации. 1968. - С. 112-114.

16. Hayashi Т. The role of renal mineralocorticoid receptor mechanisms in the pathogenesis of mineralocorticoid-induced hypertension in the rat // Inzen Igakkai Zasshi. 1981. - V. 90, № 2. - P. 282-289. - C.A. 1982:96:63188v.

17. Zhang H., Liu F., Sun В., Li G. Antiallergic action of glycyrrhizin // Zhongguo Yaoli Xuebao. 1986. - V. 7, № 2. - P. 175-177. - C.A. 1986:104:199763v.

18. Пат. 2027438 Россия, МКИ 6 A 61 К 35/78. Способ получения средства, обладающего антианафилактическим действием / Степанова Э.Ф., Сараф А.С., Самлиев A.M. -№5026101/14; Заявл. 07.02.92; Опубл. 27.01.95, РЖ Хим., 150183П.

19. Пат. 2028152 Россия, МКИ 6 A 61 К 35/78. Антитоксический сбор / Володяев B.C. № 5051648/14; Заявл. 02.07.92; Опубл. 09.02.95, Бюл. № 4.

20. Weinberg D.S., Manier M.L., Richardson M.D., Halbach J.G., Regers T.S. Identification and quantification of anticarcinogens in garlic extract and licorice extract powder // J. High Re-solut. Chromatogr. 1992. - V. 15, № 10. - P. 641-654.

21. Nagai Т., Egashira Т., Yamanaka Y., Kohno M. The protective effect of glycyrrhizin against injury of the liver caused by ischemia-reperfusion // Arch. Environ. Contam. Toxicol. -1991. -V. 20, № 3. P. 432-436. -C.A. 1991:114: 25:240575g.

22. Shiota G., Harada K., Ishida M., Tomie Y., Katayama S., Ito H., Kawasaki H. Inhibition of hepatocellular carcinoma by glycyrrhizin in diethylnitrosamine-treated mice // Carcinogenesis. 1999. - V. 20, № 1. - P. 59-63.

23. Fujisawa K., Watanabe Y., Kitahara Т., Kimura K., Kanase H., Fukyzawa K. SNMC (stronger neo-minophagen C.) // Shindan to chiryo. 1984. - V.72, № 6. - P. 726-732. -C.A. 1984:101:163033f.

24. Moon A., Kim S.H. Effect of Glycyrrhiza glabra roots and glycyrrhizin on the glucuronida-tion in rats //Planta Med. 1997. - V. 63, № 2. -P. 115-119.

25. Sato H., Goto W., Yamamura J., Kurokawa M., Kageyama S., Takahara Т., Watanabe A., Shiraki K. Therapeutic basis of glycyrrhizin on chronic hepatitis В // Antiviral. Res. 1996. -Y. 30, №2-3.-P. 171-177.

26. Ипатова O.M., Торховская Т.И., Княжев В.А. и др. Сравнительное исследование действия эссенциале и нового отечественного гепатопротектора "Фосфолив" на модели острого гепатита у крыс // Вопросы Мед. Химии. 1998. - Т. 44, вып. 6.

27. Драник Л.И., Давигора И.В., Петухова Т.Д. и др. Новое желчегонное лекарственное средство в форме капсул из корней солодки // Новые лекарственные препараты из раст. Сибири и Дал. Вост.: Тез. докл. Всес. Конф. Вып.2. Томск, 1989. - С.56-57.

28. Segal R., Pisanty S., Wormser R. et al. Anticariogenic activity of licorice and glycyrrhizine. 1. Inhibision of in vitro plaque-formation by streptococcus-mutans // J. Pharm. Sci. 1985. -V. 74, № l.-P. 79-81.

29. Mitscher L.A., Park Y.H., Clark D., Beal J.L. Anti-microbial agents from higher-plants antimicrobial isoflavonoids and related substances from Glycyrrhiza glabra L var typica // J. Nat. Prod. - 1980. - V. 43, № 2. - P. 259-269.

30. Haraguchi H., Tanimoto К., Tamura Y., Mizutani K., Kinoshita T. Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflata // Phytochemistry. 1998. - V. 48, № 1. - P. 125-129.

31. Pompei R., Activity of glycyrrhiza glabra extract and glycyrrhizic acid on virus growth and infectivity // R. Riv. Farmacol. Ter. 1979. - V. 10, № 3. - P. 281-284.

32. Utsunomiya Т., Kobayashi M., Herndon D.N., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin improves the resistance of thermally injured mice to opportunistic infection of herpes-simplex-virus type-I // Immunol. Lett. 1995. - V. 44, № 1. - P. 59-66.

33. Christensen S.B., Ming C., Andersen L., Hjorne U., Olsen C.E., Cornett C., Theander T.G., Kharazmi A. An antileishmaial chalcone from Chinese licorice roots // Planta Med. 1994. -V. 60,№2.-P. 121-123.

34. Bi W., Yang G. Studies on the antiviral effect of Glycyrrhiza Uralensis Fish, polysaccharide (GPS) // Zhongguo Zhougyao Zazhi. 1989. - V. 14, № 4. - P. 236-238. - C.A. 1989:1 ll:3:17206e.

35. Hatano Т., Yasuhara Т., Miyamoto К., Okuda Т. Anti-human immunodeficiency virus phe-nolics from licorice // Chem. And Pharm. Bull. 1988. -V. 36, № 6. - P. 2286-2288.

36. Заявка 2274058 Великобритания, МКИ 5 А 61 К 35/00, НКИ А 5 В. Кремы для лечения псориаза, экземы и лишаев / Shan Е. № 9224754.3; Заявл. 26.11.92; Опубл. 13.07.94. -РЖ Хим. 1995:130179П.

37. Taylor Е J., Evans F.J. Evaluation of Glycyrrhiza glabra used in the treatment of psoriasis //J. Pharm. And Pharmacol. 1997. - V. 49, № 4. p.34. РЖ Хим. 1998:50171.

38. Пат. 2089178 Россия, МКИ 6 А 61 К 9/06, 35/78. Мазь Белова для лечения химических, термических ожогов и отморожений / Белов С.Н. № 95108622/14; Заявл. 26.05.95; Опубл. 10.09.97, Бюл. № 25.

39. Цетлин А.Л., Никонов Г.К., Шварев И.Ф., Пименов М.Г. К вопросу о противоопухолевой активности природных кумаринов // Растительные ресурсы. 1965. - т. 1, вып. 4.-С. 507-511.

40. Заявка 93052542/14 Россия, МКИ 6 А 61 К 35/78. Средство для профилактики и лечения злокачественных новообразований / Бурага Я.П. № 9305254214; Заявл. 18.11.93; Опубл. 10.07.96, Бюл. № 19.

41. Fukai Т., Cai S.S., Maruno К., Mitakawa Y., Konishi M., Nomura Т. An isiprenylated flava-none from Glycyrrhiza glabra and REC-assay of licirice phenols // Phytochemistry. 1998. -V. 49, №7.-P. 2005-2013.

42. Hatano Т., Takagi M., Ito H., Yoshida T. Phenolic constituents of liquorice. 7. A new chal-cone with a potent radical scavenging activity and accompanying phenolics from liquorice // Chem. Pharm. Bull. 1997. - V. 45, № 9. - P. 1485-1492.

43. Belinky P.A., Aviram M,, Mahmood S., Vaya J. Structural aspects of the inhibitory effect of glabridin on LDL oxidation // Free Radic. Biol. Med. 1998. - V. 24, № 9. - P. 1419-1429.

44. Yaya J., Belinky P.A., Aviram M. Antioxidant constituents from licorice roots: Isolation, structure elucidation and antioxidant capacity toward LDL oxidation // Free Radic. Biol. Med. 1997. - V. 23, № 2. - P. 302-313.

45. Haraguchi H., Ishikawa H., Mizutani K., Tamura Y., Kinoshita T. Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflata // Bioorg. Med. Chem. -1998. -V. 6, № 3. P. 339-347.

46. Пат. 2071783 Россия, МКИ 6 A 61 К 35/78. Способ получения средства для лечения сахарного диабета / Бабякин А.Ф., Найданова Л.Ф., Мазуров В.Н. и др. № 93044820/14; Заявл. 07.09.93; Опубл. 20.01.97, Бюл. № 2.

47. Найданова Л.Ф., Бабякин А.Ф., Руженков Д.В. и др. Динамика углеводного обмена при использовании нового растительного сбора гипогликемического действия // Тез. докл. 4 Рос. Нац. Конгр. "Человек и лекарство", Москва, 8-12 апр. 1997 г. М., 1997. - С. 89.

48. Aida К., Tawata М., Onaya Т. et al. Isoliquiritigenin: a new aldose reductase inhibitor from Glycyrrhizae Radix // Planta Med. 1990. - V. 56, № 3. - P. 254-258.

49. Tawata M., Aida K., Noguchi T. et al. Antiplatelet action of isoliquiritigenin, an aldose reductase inhibitor in licorice //Eur. J. Pharmacol. 1992. -V. 212, № 1. - P. 87-92.

50. Заявка 1-207243 Япония, МКИ 4 A 61 К 35/84, A 61 К 35/78. Ингибитор агрегации тромбоцитов / Судзуки Й. № 63-28722; Заявл. 12.02.88; Опубл. 21.08.89 // Кокай ток-кё кохо. Сер. 3 (2). - 1989. - 69. - С. 301-303. РЖ Хим. 1990:160177П.

51. Пат. 2104024 Россия, МКИ6 А 61 К 35/78. Сбор "Касмин" для профилактики и лечения тромбозов / Быков В.А., Климахин Г.И., Черных Д. и др. № 96113069/14; Заявл. 02.07.96; Опубл. 10.02.98, Бюл. № 4.

52. Wegener J.W., Nawrath Н. Cardiac effects of isoliquiritigenin // Eur. J. Pharmacol. 1997. -V. 326, № 1,-P. 37-44.

53. Заявка 1-224321 Япония, МКИ4 А 61 К 31/725, А 61 К 9/08. Офтальмологический препарат / Курино М., Кацумата С.,Мисава Ю. № 63-48896; Заявл. 02.03.88; Опубл. 07.09.89 // Кокай токкё кохо. Сер. 3 (2). - 1989. - 74. - С. 131-133. РЖ Хим. 1990:160208П.

54. Заявка 283318 Япония, МКИ 5 А 61 К 31/14, 9/08. Стабилизированные глазные капли / Фуканори К., Хара Э., Такахаси И. № 63-233564; Заявл. 20.09.88; Опубл. 23.03.90 // Кокай токкё кохо. Сер. 3 (2). - 1990. - 33. - С. 155-159. РЖ Хим. 1992:30249П.

55. Пат. 2106874 Россия, МПК6 А 61 К 35/78. Биологически активная композиция "Фитаон-2,2" и способ ее получения / Бобров-Егоров Н.Н., Дорошенко А.Н., Новиков И.К. и др. № 95101570/14; Заявл. 1.02.95; Опубл. 20.03.98; Бюл. № 8. РЖ Хим. 1999:210189П.

56. Пат. 2097052 Россия, МКИ6 А 61 К 35/78. Лекарственный сбор для очищения организма / Пономарева А.Г. № 94035971/14; Заявл. 26.09.94; Опубл. 27.11.97; Бюл. №33. РЖ Хим. 1998:110197П.

57. Пат. 2020950 Россия, МКИ6 А 61 К 35/78. Сбор лекарственных растений "Вера" для реабилитации организма после ОРЗ / Пономарева А.Г., Поверин Д.И. № 93012482/14; Заявл. 1.04.93; Опубл. 15.10.94; Бюл. № 19. РЖ Хим. 1995:60154П.

58. Pat. 8165813 Japan, CI. А 61 К 7/46. Toothpastes containing glycyrrhizin and menthol / Ma-cAndews and Forbes Co. US № 86014; Заявл. 17.10.79; Опубл. 03.06.81. - C.A. 1981:95:14:120993j.

59. Заявка 1149706 Япония, МКИ 4 A 61 К 7/00. Косметические препараты / Такагаки Р. -№ 62-307452; Заявл. 07.12.87; Опубл. 12.06.89 // Кокай токкё кохо. Сер. 3 (2). 1990. -51. - С. 43-46. - РЖ Хим. 1990-.17Р2094П.

60. Pat. 07277943 95277943. Japan, CI. А 61 К 7/48. Skin cosmetics containing mucopolysaccharides and glycyrrhizic acid / Tsucha J., Yoshida K. № 941958598; Заявл. 08.04.94; Опубл. 24.10.95. - C.A. 1996:124:8:97269j.

61. Пат. 687127 Швейцария, МКИ 6 A 61 К 007/06, 035/78. Косметический препарат против выпадения волос и способ его йолучения / Szaloki Е., Kristif I., Pal V., Szabo Е. № 01814/94; Заявл. 09.06.94; 0публ.30.09.96. - РЖ Хим. 1997-.80143П.

62. Kikuchi H. Licorice extract as a sweetening agent with useful function // Gekkan Fudo Ke-mikaru. 1989. -V. 5, № 10. - P. 79-83. - C.A. 1990:112:5:34463z.

63. Методы биохимического анализа растений / Под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова.- Л.:Изд-во Ленингр. Ун-та, 1978. С. 82-83.

64. Исамбаев А.И., Саурамбаев Б.Н., Кузьмин М.К. и др. Солодка ценнейшее лекарственно-техническое растение природной флоры Казахстана. - Алма-Ата, 1991. - 20 с.

65. Кононихина Н.Ф., Пономарев В.Д., Муравьев И.А. Исследование жиростероидного комплекса солодкового корня // Вопросы изучения и использования солодки в СССР. -М-Л.: Наука, 1966. С. 159-162.

66. Beaton J.M., Spring F.S. Triterpenoids. 41. The isolation and characterisation of glabric acid, a new triterpenoid acid from liquorice root // J. Chem. Soc. 1956. - V. 468. - P. 2417-2419.

67. Frattini C,, Bicchi C., Barettini C., Nano G.M. Volatile flavor components of licorice // J. Agric. Food Chem. 1977. - V. 25. - P. 1238-1241.

68. Kameoka H., Nakai K. Components off essential oil from the root of Glycyrrhiza glabra // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1987. - V. 61. - P. 119-121.

69. Юнусова С.Г., Данилов B.T., Юнусов M.C., Муринов Ю.И. и др. Липиды корней Glycyrrhiza glabra // Изв. АН. Сер. хим. 1995. - № 2. - С. 367-370.

70. Надежина Т.П., Литвиненко В.И., Богаткина В.Ф., Аммосов А.С. Солодки уральская в Монгольской народной республике. Сообщение 3. Химический состав солодкового корня // Растительные ресурсы. 1981. - Т. 17, вып. 3. - С. 457-462.

71. Rao A.S. Root flavonoids // The botanical review. 1990. - V. 56, № 1. - P. 1-84.

72. Hayashi H., Hiraoka N., Ikeshiro Y., Yamamoto H. Organ specific localization of flavonoids in Glycyrrhiza glabra L. // Plant Sci. -1996. -V. 116, № 2. P. 233-238.

73. Hayashi H., Hiraoka N., Ikeshiro Y., Yamamoto H., Yoshikawa T. Seasonal variation of gly-cyrrhizin and isoliquiritigenin glycosides in the root of Glycyrrhiza glabra L. // Biol. Pharmacol. Bull. 1998. - V. 21, № 9. - P. 987-989.

74. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук C.E. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990. - 333 с.

75. Saitoh Т., Noguchi Н., Shibata S. A New Isoflavone and the Corresponding Isoflavanone of Licorice Root // Chem. Pharm. Bull. 1978. - V. 26, № 1. - P. 144-147.

76. Okada К., Tamura Y., Yamamoto M. et al. Identification of Antimicrobial and Antioxidant Constituents from Licorice of Russian and Xinjiang Origin // Chem. Pharm. Bull. 1989. V. 37, №9.-P. 2528-2530.

77. Hatano T.,Kagawa H., Yasuhara Т., Okuda T. Two new flavonoids and other constituents in licorice root: their relative astringency and radical scavenging effects // Chem. Pharm. Bull. -1988. V. 36, № 6. - P. 2090-2097.

78. Asada Y., Li W., Yoshikawa T. Isoprenylated flavonoids from hairy root cultures of Glycyrrhiza glabra // Phytochemistry. 1998. - V. 47, № 3. - P. 389-392.

79. Литвиненко В.И. Химическое исследование флавоноидов солодки: Автореф. дис. . канд. хим. наук. Харьков, 1964. - 17 с.

80. Saitoh Т., Kinoshita Т., Shibata S. New Isoflavan and Flavanone from Licorice Root // Chem. Pharm. Bull. 1976. - V. 24, № 4. - P. 752-755.

81. Каттаев Н.Ш., Никонов Т.К. Флавоноиды Glycyrrhiza glabra // Химия природных соединений. 1972. - № 1. - С. 93.

82. Shibata S., Saitoh Т. Flavonoids Compounds in Licorice Root // J. Indian Chem. Soc. 1978. -V. 55,№ 11.-P. 1184-1191.

83. Segiet-Kujawa E., Drozdzynska M., Michalowska A., Jastrzab B. Comparison of methods of flavonoids and chalcones determination in Glycyrrhiza glabra L. Root // Herba Polonica- 1990. V. 36, № 1-2. - P. 33-41.

84. Литвиненко В.И. Халконовые гликозиды солодки голой Glycyrrhiza glabra L. // ДАН СССР - 1964. - Т. 155, № 3. - С. 600-602.

85. Yahara S., Nishioka J. Flavonoid glucosides from licorice // Phytochemistry. 1984. - V. 23,№9. -P. 2108-2109.

86. Nakanishi Т., Inada A., Kambayashi K., Yoneda K. Flavonoid glucosides of the roots of Glycyrrhiza uralensis // Phytochemistry. 1985. - Y. 24, № 2. - P. 339-341.

87. Kinoshita Т., Saitoh Т., Shibata S. The Occurence of an Isoflavene and the Corresponding Isoflavone in Licorice Root // Chem. Pharm. Bull. 1976. - V. 24, № 5. P. 991-994.

88. Bhardwaj D.K., Seshadri T.R., Singh R. Glyzarin, a new isoflavone from Glycyrrhiza glabra // Phytochemistry 1977. - V. 16, № 3. - P. 402-403.

89. Bhardwaj D.K., Murari R., Seshadri T.R., Singh R. Occurrence of 2-methylisoflavones in Glycyrrhiza glabra // Phytochemistry 1976. - V. 15, № 2. - P. 352-353.

90. Fukai Т., Tantai L., Nomura T. Isoprenoid-substituted flavonoids from Glycyrrhiza glabra // Phytochemistry. 1996. - V. 43, № 2. - P. 531-532.

91. The flavonoids: advances in reasearch.- London, New York, Chapman and Hall., 1982. -P. 1-51.

92. Аммосов A.C., Литвиненко В.И. Фенольные соединения родов Glycyrrhiza L. и Meristotropis Fisch. et. Mey. Сообщение 1. // Растительные ресурсы. 1995. - т. 31, вып. З.-С. 116-136.

93. Bhardwaj D.K., Murari R., Seshardri T.R., Singh R. Liqcoumarin, a novel coumarin from Glycyrrhiza glabra // Phytochemistry 1976. - V. 15, № 7. - P. 1182-1183.

94. Kinoshita Т., Saitoh Т., Shibata T.R. A new 3-arylcoumarin from licorice root // Chem. Pharm. Bull. 1978. - Y. 26, № 1. - P. 135-140.

95. Saiton Т., Kinoshita Т., Shibata S. Flavonols of licorice root // Chem. Pharm. Bull. -1976. V. 24, № 6. - P. 1242-1245.

96. Toshio F., Junco N., Masami J. Five new isoprenoid-substituted flavonoids, kanzonols M-P and R, from two Glycyrrhiza species // Heterocycles. 1994. - V. 38, № 5. - P. 10891098.

97. Kiuchi F., Chen X., Tsuda Y. Four new phenolic constituents from licorice (root of Glycyrrhiza sp.) // Heterocycles. 1990. - V. 31, № 4. - P. 629-636.

98. Tsutomu Furuya, Kazuo Matsumoto, Manabu Hikichi. Echinatin, a new chalcone from tissue culture of Glycyrrhiza echinata'// Tetrahedron Letters. -1971. № 27. - P. 2567-2569.

99. Toshio Fukai, Qing-Hua Wang, Ryouhei Inami, Taro Nomura. Structures of prenylated dihydrochalcone, gancaonin J and homoisoflavanone, gancaonin К from Glycyrrhiza pallidiflora // Heterocycles. 1990. - V. 31, № 4. - P. 643-650.

100. Ayabe Shin-ichi, Kobayashi Miynki, Hikichi Manabu et. Flavonoids from the cultured cells of Glycyrrhiza echinata // Phytochemistry. 1980. - V. 19, № 10. - P. 2179-2183.

101. Methods in plant biochemistry. London, New York, 1989, v. 1. - P. 237-323, 421 -449.

102. Хроматография: Практическое приложение метода: В 2-х ч. 4.2 Пер.с англ./ Под ред. Э. Хейфтмана. М.: Мир, 1986. - С.242-276.

103. Тюкавкина Н.А., Литвиненко В.И., Шостаковский М.Ф. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии. Новосибирск: Наука, 1973. - 176 с.

104. Tsutomu H., Toshiyuki F., Toshio M. et. Phenolic constituents of licorice. Ш. Structure of glicoricone and licofuranone and inhibitory effects of licorice constituents on monoamine oxidase // Chem. Pharm. Bull. -1991. V. 39, № 5. - P. 1238-1243.

105. Литвиненко В.И., Максютина Н.П., Колесников Д.Г. Химическое исследование промышленных видов солодки // Вопросы изучения и использования солодки в СССР. М-Л.: Наука, 1966. - С. 145-153.

106. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. - Т. 1, вып. 4. - С. 591596.

107. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса и К. Мацека. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1962. - 851 с.

108. Георгиевский В.П. Применение величин hRf и hRst для идентификации флавоноидов и антрахинонов // Растительные ресурсы 1982. - Т. 18, вып. 3. - С. 427-434.

109. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л. Тонкослойная хроматография флавоноидов // Химия природных соединений. 1973. - Т. 9, № 1. - С. 20-25.

110. Kitagawa I., Chen W.Z., Taniyama Т. et al. Quantitative determination of constituents in various licorice roots by means of high performance liquid chromatography // J. Pharm. Soc. Jpn. 1998. - V. 118, № 11. - P. 519-528.

111. Daigle D.J., Conkerton E.J. Analysis of flavonoids by HPLC: an update // Journal of liquid chromatography. 1988. - V. 11, № 2. - P. 309-325.

112. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Пер. с англ. А.П. Синицына; Под ред. А. Хеншен и др. М.: Мир, 1988. - 688 с.

113. Lu Zeng, Ru-Yi Zhang, Tong Meng, Zhi-Cen Lou. Determination of nine flavonoids and cumarins in licorice root by high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography 1990. - V. 513. - P. 247-254.

114. Ручкин B.E., Руленко И.А., Ефремова Т.Н., Литвиненко В.И., Аммосов А.С. Количественный анализ флакарбина методом ВЭЖХ // Тез. докл. V Всесоюз. симп. по фе-нольным соединениям. Секция химии. Таллин, 1987. - С. 87-88.

115. Ахтанова Н.К. Исследование халкон-флаваноновых препаратов солодки голой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Автореф. дис. .канд. фармац. наук. М., 1991.-24 с.

116. Браун Д., Флойд А., Сейнзбери М. Спектроскопия органических веществ. М.: Мир, 1992. - 175 с.

117. Harbome J.B. Phytochemical methods. London, NewYork: Chapman and Hall Ltd. -1984.-288 p.

118. Запрометов M.H. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. М., 1971. - С. 185-208.

119. Takayama М., Fukai Т., Hano Y., Nomura Т. Mass-spectrometry of prenylated flavo-noids // Heterocycles. 1992. - V. 33, № 1. - P. 405-434.

120. Biochemical applications of mass spectrometry / Edited by Waller G.R., Dermer O.C. New York-Chichester-Bristane-Toronto: J.Wiley&sons. 1980.-p. 255-310, 1131-1158.

121. Fukai Т., Nishizawa J., Nomura T. Phenolic constituents of Glycyrrhiza species. 14. Variations in the chemical-shift of the 5-hydroxyl proton of isoflavones 2 isoflavones from licorice // Phytochemistry. - 1994. - V. 36, № 1. - P. 225-228.

122. Fukai Т., Nomura T. H-l-NMR spectra of prenylated flavonoids and pyranoflavonoids // Heterocycles. 1993. -V. 36, № 2. - P. 329-343.

123. Carbon-13 NMR Flavonoids. Amsterdam ets.,1989.

124. Толстиков Г.А., Балтина JLA., Шульц Э.Э., Покровский А.Г. Глицирризиновая кислота // Биоорганическая химия. 1997. - т. 23, № 9. - С. 691-709.

125. Pat. 4176228 USA, CI. 536-4; С 07 Н 15/20. Potassium-magnesium-calcium glycyrrhizin / Hartung Harold A. № 942313; Заявл. 14.09.78; Опубл. 27.11.79. - 4pp. -C.A. 1979:9217:145286g.

126. Fenwick G.R., Lutomski J., Nieman C. Liquorice, Glycyrrhiza glabra L. Composition, uses and analysis // Food Chemistry. - 1990. - V. 38. - P. 119-143.

127. El-Tail N.H., Shabana M. Preparation and evaluation of commercial ammoniated glycyrrhizin // Egypt. J. Pharm. Sci. 1986. - V. 17, № 3. - P. 383-289.

128. Муравьев И.А., Маняк B.A. Бескислотный способ получения триаммонийной соли сырой глицирризиновой кислоты // Фармация. 1983. - Т. 32, № 5. - С. 36-39.

129. Маняк В.А., Муравьев И.А. Использование сульфокатионита KU-2-8 для улучшения точности спектрофотометрического определения глицирризиновой кислоты в корнях Glycyrrhiza и сыром экстракте // Фармация. 1984. - Т. 33, № 4. - С. 31-33.

130. Авт. свид. СССР № 1223911. Способ получения глицирама / Маняк В.А., Муравьев И.А. // Открытия, изобретения. 1986. - № 14. - С. 14.

131. А. с. 1189453 СССР, МКИ А 61 ,К 35/78. Получение глицирама из густого экстракта солодки / Маняк В.А., Муравьев И.А. 3711337; Заявл. 11.03.84; Опубл. 07.11.85 // Открытия, изобретения. - 1985. - № 41. - С. 22.

132. Маняк В.А. Совершенствование методов получения производных глицирризиновой кислоты // Науч. тр. НИИ фармации. 1985. - № 34. - С. 67-71.

133. Pat. 57144297 82144297. Japan, С1 С 07 Н 15/24. Очистка глицирризина / Maruzen Chemical Co., Ltd. Jpn. 81/2940003; Заявл. 03.03.81; Опубл. 06.09.82. - 3 pp. - C.A. 1983:98:11:89815р.

134. Pat. 8013217 Japan, CI С 07 H 15/24. Separation and purification of glycyrrhizin / Turuse N., Tachikawa T. 78/85; 410; 13; Заявл. 13.07.78; Опубл. 30.01.80. - C.A. 1980:93:4:31773d.

135. Wang Qihao, Pei Yaqun, Jiang Tingda, Li Rongchun, Du Jingying. Extraction, separation and purification of glycyrrhizic acid from licorice and glycyrrhiza extract // Yiyao Gongye. -1987.-V. 18, № 11.-P. 481-484. C.A. 1988:108:4:26863h.

136. Pat. 57145897 82145897. Japan, CI С 07 H 15/24. Очистка глицирризина / Maruzen Chemical Co., Ltd Jpn. 81/3051405; Заявл. 05.03.81; Опубл. 09.09.82. - 3 pp. - C.A. 1983:98:ll:89814n.

137. Pat. 8151500 Japan, CI. С 07 H 15/24. Pure glycyrrhizin from licorice /Maruzen Chemical Co., Ltd. Jpn. № 79/127362; Заявл. 04.10.79; Опубл. 09.05.81. - 7 pp. - C.A. 1982:95:13:115956v.

138. Pat. 8186199 Japan, CI С 07 H 15/24. Pure glycyrrhizin from licorice / Maruzen Chemical Co., Ltd. Jpn. 79/16217315; Заявл. 15.12.79; Опубл. 13.07.81. - 4 pp. - C.A. 1982:95:13:115957w.

139. Pat. 8197298 Japan, CI С 07 H 15/24. Isolation and purification of glycyrrhizin / Maruzen Chemical Co., Ltd. Jpn. 79/17381828; Заявл. 28.12.79; Опубл. 05.08.81. - 4 pp. - C.A. 1982:95:21:187607e.

140. Pat. 85104970 CN, CI. С 07 J 63/00. Separation and purification of high purity crystalline glycyrrhizic acid / Pan Fusheng, Zhang Hauhui, Tang Shirong. Заявл. 25.07.85; Опубл. 07.01.87. - C.A. 1988:109:23:211394р.

141. Pat. 1036960 CN, CI. С 07 J 63/00. Pure glycyrrhizic acid from licorice / Yao Dejia, Chang Fucheng, Huang Jin, Wei Ning. № 88101932; Заявл. 14.04.88; Опубл. 8.11.89. -C.A. 1990:113:94991a.

142. Bullman J., Steinert P., Galling G. A simple method to optain glycyrrhizin from licorice root (Glycyrrhiza glabra) // Chem. Microbiol., Technol. Lebensm. 1990. - V. 12, № 6. - P. 179-184.

143. Pat. 01190695 89190695. Japan, CI С 07 H 15/256. Очистка глицирризина из лакрицы с помощью противоточной хроматографии / Yamada Tsuyoshi, Saito Isao, Morinada

144. Eriko, Moriguchi Soyao. 88/1431225; Заявл. 25.01.88; Опубл. 31.07.89. - 3 pp. - C.A. 1989:111:24:219270g.

145. Заявка 56-55398 Япония, Кл. С 07 Н 15/24. Очистка глицирризина / Накамура тоси-хиро, Танигути Тамио. № 54-131970; Заявл. 12.10.79; Опубл. 15.05.81, - РЖ. Хим. -1982. - 60206П.

146. Заявка 57-149897 Япония, МКИ С 07 Н 15/24. Способ очистки глицирризина / Накамура Нобутака. № 56-30514; Заявл. 05.03.81; Опубл. 09.09.82. - РЖ Хим. -1984-.30139П.

147. Муравьев И.А., Пономарев В.Д. О стандартизации солодкового корня и его препаратов по чистой глицирризиновой кислоте // Вопросы изучения и использования солодки в СССР. М-Л.: Наука, 1966. - С. 133-144.

148. Song Hongchun, Wang Wei. Determination of glycyrrhizic acid in liquid extract of glycyrrhiza by a.c. oscillopolarographic method // Yaowu Fenxi Zazhi. 1987. - V. 7, № 2. -P. 108-110.

149. Пат. 2000117 Россия, МКИ5 А 61 К 35/78. Способ получения сухого экстракта солодки // Касьянов Г.И., Квасенков О.И. № 4947880/14; Заявл. 24.0691; Опубл. 07.09.93, Бюл. № 33-36. -РЖ. Хим. - 1994:Ю0163П.

150. Пат. 2054433 Россия, МКИ6 С 07 J 63/00. Способ получения глицирама // Рагимов А.В., Гаджилы Р.А., Касумов М.А., Джаваншир М.О. № 5033673/04; Заявл. 29.01.92.; Опубл. 20.02.96, Бюл. №5. - РЖХ. - 1996:200115П.

151. Пат. 2000800 Россия, МКИ5 А 61 К 35/78. Способ получения экстракта корня солодки // Терновой А.П., Дмитриенко Н.В., Михалев В.Ю. № 5061555/14; Заявл. 13.10.92.; Опубл. 15.10.93, Бюл. № 37-38. - РЖХ. - 1994:12087П.

152. Xue Xiaoxian, Xiao Lin. Determination of glycyrrhizic acid in Glycyrrhiza and its products //Fenxi Huaxue. 1985.- V. 13, №3.- P. 176-179. - C.A. 1985:103:15:121856n.

153. Якубова М.Р., Генкина Г.Л., Шакиров Т.Т. УФ-спектрофотометрическое определение глицирризиновой кислоты в Glycyrrhiza glabra // Химия природных соединений. -1977.-№6.-С. 802-806.

154. Liu Lijuan, Pan Jinyuan, Yin Xuhong, Lu Yuanshi. Quantitative determination of glycyrrhizin in Glycyrrhiza and its preparation by macroreticular resin // Zhongcaoyao. -1985. V. 16, № 5. - P. 202-206. - C.A. 1985:103:8:59374y, 1987:106:18:144062b.

155. Stabrowska-Ostrowska E. Comparison of methods for determining a dried Glycyrrhiza extract// Farm. Pol. 1974. - V. 30, № 10. - P. 941-943. - C.A. 1975:82:24:160295w.

156. Du Yingying, Wang Qihao, Pei Yagun, Li Rongchun. Colorimetric determination of glycyrrhizic acid in licorice and its preparation with methylene blue // Yiyao Gongye. 1987.- V. 18, № 10. P. 451-455. - C.A. 1988:108:6:44095n.

157. Vanhaelen M., Vanhaelen-Fastre R. Quantitative determination of biologically active constitutents in medicinal plant crude extracts by thin-layer chromatography-densitometry // J. Chromatogra. 1983. - V. 281. - P. 263-271. - C.A. 1984:100:8:5691 ly.

158. Sobotra-Wierzbowicz Jamina, Adamczyk Halina, Smulkowska Hanna. Densitometric determination of glycyrrhizic acid in dried licorice extract // Farm. Pol. 1984. - V. 40, № 9.- P. 527-529. C.A. 1985:103:l:3762f.

159. Shu Yonghua, Xu Guangxin, Tang Weijie. Determination of glycyrrhizic acid in Glycyrrhiza uralensis Fisch. and G. inflata Batal. by TLC-UV // Zhongcaoyao. 1986. - V. 17, № 5. - P. 202-203. - C.A. 1986:105:7:57940x.

160. Alam Mahbub, Umar Mohammad, Dar Farrukh. Quantitative determination of glycyrrhizin in licorice root // J. Farm. (Lahore). 1986. - V. 7, № 1-2. - P. 21-24. - C.A. 1987:107:24:223358b.

161. Hurst W.J., McKim J.M., Martin R.A. The determination of glycyrrhizin in licorice products // Abstrs Pap. Pittsbursh Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Atlantic City, 1982.-P. 276.

162. Li Rongchun, Wang Qihao, Don Jingying, Pei Yagun. Determination of glycyrrhizin in licorice (Glycyrrhiza Uralensis) and its extractum by HPLC // Zhongcaoyao. 1987. - V. 18, № 4. - 157-158. - C.A. 1987:107:12:102745r.

163. Hurst W.J., McKim J.M., Mrtin R.A., Robert A.J. High-performance liquid chromatographic determination of glycyrrhizin in licorice product // J. Agric. Food Chem. -1983.-V. 31, №2.-P. 387-389. C.A. 1983:98:15:124274k.

164. Lu Guibao, Liu Jun. Determination of glycyrrhizin in Radix Glycyrrhizae and its preparation by HPLC // Yaowu Fenxi Zazhi. 1988. - V. 8, № 3. - P. 137-139. - C.A. 1988:109:16:135046j.

165. Sekai Yoshimichi et. Study on the pretreatment with silica gel cartridge for the determination of glycyrrhizin in extracts of Kanpo preparation // Gigu-ken Eisei Kenkyushoho. 1988. - V. 33. - P. 17-21. C.A. 110:179595.

166. Bell J.H. Determination of glycyrrizic acid in licorice extracts and chewing tobaccos // Tob. Int. 1980.-V. 182, №21.-P. 68-71. C.A. 1981:94:l:2161t.

167. Tsutomu Ichikawa, Shiko Ishida, Yoko Sakiya, Yoshinobu Akada. High-performance liquid chromatographic determination of glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid in biological materials //Chem. Pharm. Bull. 1984. - V. 32, № 9. - P. 3734-3738.

168. Mihami Eiichi et. Determination of glycyrrhizin in cosmetic lotions and creams with cleon-up procedure on bilayer column chromatography // Eisei Kagahu. 1988. - V. 34, № 5. -P. 466-469. C.A. 110:28908.

169. Okada Kenzo, Tanaka Jun, Miyashita Akira, Imato Katsue. High-speed liquid chromatographic analysis of constituents in licorice root. 1. Determination of glycyrrhizin // Yakugaku Zasshi. -1981. V. 101, № 9. - P. 822-828. C.A. 1981:95:23:199935y.

170. Hiraga Yukio, Endo Hitomi, Takahashi Kunio, Shibata Shoji. High-performance liquid chromatographic analysis of licorice extracts // J. Chromatogr. 1984. - V. 292, № 2. - P. 451-453. - C.A. 1984:101:12:97721a.

171. Collinge A., Hermesse В., Noirfalise A. Study and determination by high-performance liquid chromatography of glycyrrhizin in food products // Belg. J. Food Chem. Biotechnol. 1985. - V. 40, № 6. - P. 143-145. - C.A. 1986:105:l:5268q.

172. Wang P., Li S.F.Y., Lee H.K. Determination of glycyrrhizic acid and 18-P-glycyrrhetinic acid in biological fluids by miccelar electrokinetic chromatography // J. Chromatography A.- 1998. v. 811.-p. 219-224.

173. Koga K., Ohmachi K., Kawashima S., Takada K., Murakami M. Determination of 18a-glycyrrhizin and 18P-glycyrrhizin in dog plasma by high-performance liquid chromatography // J. Chromatography B. 2000. - v. 738. - p. 165-168.

174. Zhang G., Ji S., Chai Y., Wu Y., Yin X. Determination of glycyrrhizin in Radix glycyr-rhizae and its preparations by capillary zone electrophoresis // Biomedical Chromatography.- 1999. V. 16, № 6. - P. 407-409.

175. Мучник Ж.С. Содержание глицирризиновой кислоты, Сахаров и экстрактивных веществ в подземных органах солодки голой, выращиваемой в Молдавии // Растительные ресурсы. 1976. - т. 12, вып. 1. - С. 78-84.

176. Сабоиев С.С., Мастоншоева Х.С., Султонназаров А.С. Химический состав подземных органов двух видов P. Glycyrhiza L., произрастающих в Горно-Бадахшанской АО Таджикистана // Растительные ресурсы. 1992. - т. 28, вып. 2. - С. 66-69.

177. Джумамуратова А., Алламбергенова С.Т., Сдыков Т. Углеводный состав солодки // Вестник КК ФАН УзССР. 1990. - № 4. - С. 52-57.

178. Akmamedov К., Annadurdyev Kh., Dovletmuradov К. Chemical composition and hydrolysis of licorice oil cake // Izv. AN Turkm. SSR. Ser. Biol. Nauk. 1984. - № 3. - P. 7376.

179. Чурашенко Б.М., Литвиненко В.И., Аммосов O.C. и др. Углеводы травы и корня солодки // Фармац. журнал. 1996. - № 3. - С. 93-97.

180. Noriko S., Masashi Т., Mieko K., Ryoko G., Akemi S., Noriko S. A novel polysaccharide having activity on the reticuloendothelial system from the root of Glycyrrhiza uralensis // Chem. and Pharm. Bull. 1990. - v. 38, № 11. - P. 3069-3071.

181. Методы исследования углеводов / Пер. с англ. В.А. Несмеянова; Под ред. А.Я. Хорлина. М.: Мир, 1975. С. 10,409-410.

182. Vora Pramathesh S., Tuorto Raymond M. Liquid chromatographic determination of sugars in licorice products // J. Assoc. Off Anal. Chem. 1984. - V. 67, № 3. - P. 529-531.

183. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ. М.: Химия, 1977. -200 с.

184. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии. М.: Мир, 1991.-763 с.

185. Биохимия фенольных соединений / Под ред. Харборна Дж. М.: Мир, 1968. - С. 3451.

186. Биохимические методы анализа растений / Под ред. М.Н. Запрометова. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1960. - С. 9-68,453-519.

187. Лабораторная техника органической химии /Пер. с чешского В.А. Вовера; Ц.А. Егорова и А.Н. Ушакова; Под ред. Л.Д. Бергельсона.- М.: Мир, 1966. С. 335-360.

188. Желявский В., Галиньский В. Термодинамические аспекты онтогенеза растений / Термодинамика и регуляция биологических процессов. М.: Наука, 1984. - С. 120-125.

189. Кесслер Ю.М., Зайцев А.Л. Сольвофобные эффекты. Л.: Химия, 1989. - 312 с.

190. Гладышев Г.П. Термодинамика и макрокинетика природных иерархических процессов. М.: Наука, 1988. - 287 с. .

191. Эдсолл Дж., Гатфренд X. Биотермодинамика. М.: Мир, 1986. - 296 с.