Анализ пищевых макромолекулярных комплексов и исследование протеолиза модельных современных пищевых продуктов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

С1 а -V"

• 8 МО

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЗАОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи УДК 543:С78.012.614.3

Стрлкова Татьяна Михайловна

Анализ ишцевиж гакрсмолекулярных комплексов я

исслздеаанма првтавлиза недельных совраквикых пищевых яроцуитвв

¡поциальиость 02.0') = 02 - Аналитическая химия

АЗТОРШРАТ '"ч

диссертации на соискакиа учаной степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Институте злементорганических соединений им. А. К. Несмеянова Академии наук РФ и на 'лафэдре аналитической химии Московского государственного института пищевой промышленности '.

Научные руководители : Заслуженный деятель науки и техни-

Официальные оппоненты : Доктор химических наук

проф. Е. Е. Брауде кандидат химических наук В. С. Падалкина

Ведутида организация - Московская государственная академия пищевых производств , кафедра V аналитической химии .

Заидота диссертации состоится "30" _мая__ 1995 г'. ,

в 14_час. на заседании специализированного совета К 063.'

по аналитической химии в Московском государственном инст! пищевой промышленности по адресу : г. Москва , 109803, ул, Чкалова , 73 .

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института .

ки РФ доктор химических наук профессор Ю. А. Клячкс кандидат физико-математических наук ст. нау<шый сотрудник Е. М. Цидавцева

%

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми

Важное место в решении задачи существенного улучшения структуры и сбалансированности питания занимает задача расширения ассортимента продуктов диетического и лечебного питания .

В комплексной целевой программе " Здоровье " г. Москвы на период до 2000 года отмечается , что производство продуктов питания для профилактики ряда заболеваний , и и первую! очеиедь сахарного диабета , пищевой аллергии / ожирения и др . , чвлн ется совершенно новой и крайне важной задачей . Поэтому представляется весьма актуальной задачей создание композиций , наиболее соответствующих сформировавшемуся физиологическому процессу переработки и усвоения пищевых веществ .

Анализ динамики потребления пищевых волокон ДО показывает, что эа последние 25 лет оно уменьшилось примерно на 30 1 . Установлено , что недостаток пищевых волокон в пштканиЛ' нище , в ряде случаев достигающий 50 %, приводит к росту укапанных заболеваний .

Такими-композициями могут бить системы, еодержащие белковые гндролизати и пищевые волокна .

Озлковые гидролизаты находят самое широкое применение в создании новых диетических продуктов питания и в медицине . Получение белковых гидролиэатов в присутствии пищевых во.ппкин и пектина позволяет , с одной стороны , регулировать скорость и степень гидролиза 0ел|са,а с другой стороны , изучить некоторые аспекты процесса пищеварения , в том числе возможности де-токсикации организмом посредством сорбции волокнистыми составляющими .

Институт пищевых веществ Российской академии наук ч последнее время занимается проблемой получения и исследования свойств имеыю таких новых продуктов питания .

Ш решение этой проблемы тяеоует применения и соответствующих методов хими алалит». .некого контроля , как в процессе самих исследований , так и конечного пиш,евог< продукта .

-

Специфический химическйй-даализ продуктов , основные компоненты которых представляет полймеры , именно так называемые биополимеры ( белки , полисахариды .дипиды , дубильные соединении ) , превращающиеся в процессе технологической переработки и физиологической метаболизации в другие полимерные , оли-гомерные и вааимодействющие друг с другом вещества , а также с неполимерными реагентами , представляет и особые требования к применяемым в нем методам .

В работах кафедры аналитической химии МГЗИГО1 ( б. ВЗИПГ1) предложен в качестве специфического качественного и количественного анализа полимеров в растворах и гелях электронномик-роекопический метод . В сочетании с другими методами химического и структурного анализа этот метод дает весьма содержательную информацию о сущности , природе и состоянии, а также о количественных соотношениях в реакциях макромолекулярных компонентов . '•

\

Дальнейшее развитие метода в приложении к вновь разрабатываемым комплексным пищевым продуктам - актуальная задача > современной нутритологии .

Цель и задачи данного исследования

Таким образом цель данной работы состояла в том , чтобы применить современные методы электронной микроскопии и химической кинетики как методы структурного химического анализа к исследованию процесса гетерофазного гидролиза белков ферментами в присутствии целлюлозных пищевых волокон и пектина . Дня достижения поставленной цели было необходимо :

1 . Исследовать характер надмолекулярной организации образующихся в ходе протеолиза комплексов .

2. Исследовать разработанными методами электронной микроскопии микроструктуры , образующиеся в ходе гидролиза казеина пепсином в присутствии целлюлозных волокон и пектина .

3. Определить основной состав'сорбционных комплексов , образованных на поверхности волокна целлюлозы в результате гидролиза казеина пепсином .

4. Исследовать устойчивость образующихся комплексов гидроли-

-31

ттов в системе казеин - целлюлоза и казеик-целлюлоза-пектин .

5. Исследовать еорбциокную способность пепсинового гидролиза га казеина в присутствии целлилозы , пектина и без нет по от Юшенип к ионам различных металлов и фенолу . .

6. Использовать в качестве независтмого контрольного и дополнительного метода исследование кинетики гидролиза казеина пепсином и химотрипсином в присутствии в растворе различит концентраций пектина , целлюлозных пищевых волокон и пектина .

Научная новизна работы заключается в следующем :

1. Разработан метод электронно -микроскопического анализа сложной многокомпонентной системы -канцентрированных растворов белка , пектина в присутствии волокнистого компонента-целлюло-вы .

2. Методом термического анализа в процессе реализации кри-ометода пробоподготовки изучена зависимость кристаллизации льда в системе целлкгоза-пектш-вода от концентрации целлюлозы и пектина . Показано , что при концентрации целлюлозы более 20Х и концентрации пектина 102 по отнесению к мессе целлплазы

3. Термический анализ является необходимым элементом разработки аналитического электронно-микроскопического метода иссхедования растворов полимерных комплексов « так как он дает возможность устанавливать условия получения реальных и безартефактных данных.

4. Установлено, что сорбционный слой исследуемой системы казеина -пепсина-целлюлозы и пектина состоит преимущественно из ди- и три -пептидов .

5. Установлено , что начальная и стационарная скорость гидролиза зависит от соотношения компонентов системы . При соотношении белок-волокно 1/2 , и содержание пектина 102

по отноиэ.'шю к массе тппевых волокон отмечена наиболее высокая скорость гидролиза .

6. Ясслеповано .влияние пектина на устойчивость сорбцюниях

комплексов в системе кааеин-пепсин-пищевое волокно целлюлоза .

В системе с пектином она наивысшая .

Исследованы сорбционных способности образовавшихся комплексов по отношению к тяжелым ионам металлов и фенола .

?. Установлено" влияние на кинетику и характер надмолекулярной организации образующихся сорбционных комплексов ионов ранение необходимых металлов гп.Ге.Са.Мц в системе казеин-пепсин -пищевые волокна целлюлозы с пектином и без него .

кристаллизация льда не происходит , если скорость замораживания достигает 100 град/с и выше .

Научно- практическое значение работы

1. Показано . что для макромолекулярного анализа канцентриро-ванных ( более 1 X) растворов биополимеров следует применять растровую электронную микроскопию с криоподготовкой пробы методика которого устанавливается посредством термического анализа .

2. Макромолекулнрный анализ дает возможность устанавливать качественный и количественный состав комплексных полимерных соединений .

а. Макромолекулярний анализ в сочетании с методом кинетического анализа позволяет идентифицировать наличие и состав сорбционных слоев на поверхности полимерных комплексов ' и состав сорбционных слоев ;

4. • Пищевые волокна благодаря способности образовывать комплексы с промежуточными продуктами гидролиза , сорбция и десорбция которых зависит от состояния системы , выполняют различные функции на различных этапах пищеварения. Физиологическая роль пищевых волокон определяет« физико-химическими свойствами компонентов , из которых они состоят .

5. При наличии в системе пектина образуются более устойчивые, комплексы . Способность пектинов образовывать соли обуславливает их возможность в значительных количествах связывать ионы металлов , что может быть широко использовано для терапии от-

равлений тяжелыми металлами , так л для транспорта жизненно необходимых металлов в организм человега .

Изучение свойств, исследуемых комплексов безусловно не исчерпывают всего многообразия сопряженных и взаиморегулируемнх пищеварительно транспортных процессов в реальных условиях пищеварения , ко полученные данные открывают возможность для получения новых диетических продуктов питания , обогащенных пищевыми волокнами , пектином, и лечебных препаратов .

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены

- на восьмом симпозиуме по РЭМ и аналитических методов исследования твердых тел РЭМ-9, г. Черноголовка 1993 г. .доклад " Методические аспекты РЭМ пищевых систем "

- на Всесоюзной конференции " Интродукция микроорганизмов в окружающую среду " 15-20 апреля 1994 г. Москва .доклад

" Эффект интродукции автолизата дрожжей в организм человека и животных "

•- на Московском семинаре по аналитической химии . Научного соета РАН по аналитической химии .28 марта 1995 г. , "Применение электронной мироскопии в анализе растворов полимеров"

- на научных ' конференциях Московского государственного заочного института пище вой-, промышленности в 1993-1994 г.

- на кафедре аналитическойчхимии МГЗИЛП в 1995 г.

Автор выносит на защиту следующие положения :

1. Метод ■элрктронно-микроскопического анализа систем 1елок- целлтоопа-иектин водч » присутствии протеолитичеекого {орм^нта и система криопробоподготоЕКИ ;

-¿г-

2 Идентификация поверхностного комплекса 6елок-ферыент-пе> "тин в присутствии волокон целлюлозы ;

3. Установление относительной химической устойчивости этих комплексов и 'их электронно-микроскопический анализ .

4. Обнаружение активизируизрго и ингибирушвго влияния целлюлозных аолокон и пектина на нротеолиз казеина в зависимости от концентрации целлшозы и пектина в системе .

5. Обнаружение влияния пектина на кинетику гидролиаа казеина пепсином в присутствии пицзвых волокон целлюлозы.

6. Анализ сорбции и десорбции ионов металлов и фенола в системе белок -фермент- пищэвое волокно-пектин

Структура и обьем работы

Диссертация состоит из введения , обзора литературы.экспериментальной части , включающей данные о материалах и метода* исследования , результатах исследования и обнаружения полученных результатов; выводов, списка цитируешй литературы . Работа изложена на страницах машинописного текста содержит рисунков и таблиц'.

| ■

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I

Литературный обзор

Проблеме создания новцх диетических продуктов писания

-

, отличавшихся легкой усвояемостью , полноценным аминокис тог иым составом и достаточным содержанием пищевых лолотн я последние года уделяется достаточно большое 'значение .

Велксвт гэдролизаты являются одни** из лучках йоточнккоя для создания ксзьк белковых продуктов .

Вместе с тем большое значение придается в инстоя1'».-о арами и содержания в пищевых продуктах йолокнистых вещает.-) , и 'такле веществ, споссботвуадк вщелент из организма токсических , г том числе и радиактизаах микро<сокпонел?ов , чн-о пвц/

вводятся кекоторыэ спацйфлческле сорбенты , например, .ч^ктик

'Пока недостаточно разработана лроЗяе.ча как еоэпан.ча *лиа«1 пищэзых продуктов , та;'; а установлена их оптимального коли чественнсго состава , отвечающего требовании устоявшейся ныне физиологии питания современного человека . Но проблема зть но может быта ревзка без решения задачи разработки соврешьких адекватных ¡¿етодов химического анализа ¿иоиолимеров , ч ндак~ заткых именно самому содержанию сформулированной проблемы . * Вэлькйштсво обычных катодов анализа растворов мзкроколе-крярных веществ э' значительной мере двлякггея 'косвенны-мй-злекнтньаси или хиыичс-ск» функциональными , т. о %о :шолне аыралаюЕИМй специфически ¡«акрсмолеклярнь'О ссобонноатк . Более эффективный о этой откоыгкии электронно шкросксличаекий метод аналяаа растзороп полимеров . з частности биополимеров , раз-рабтываемый з последнн годы совместно е ИН5С0 РАН ,

поскольку сн дает возможность целостного анализа обсектор исследования в их катквноч состоянии и с необходимой локализацией .

Задачей данной работы , осноьанной на оценке современного состояния проблемы г явилось дальнейшее развитие гналитнчьско-го метода электронной микроскопий концентрированных растворов и исследование модельных, многокомпонентных полимеров ,

О

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы электронной микроскопии Предварительные термографические исследования и разработка метода .

Цдя исследования структуры казеина в процессе гидролиза использовался растровый электронный микроскоп 3-4.05 А (Япония).

Поскольку объекта содержали жидкость , важным этапом работу являлась разработка методов препарирования , так как необходимо удалить воду таким образом , чтобы не нарушить естественную структуру биополимера .

В последние годы для исследования систем биополимер- вода в электронном микроскопе используются различные способы подготовки сбьекта к исследованию в РЭМ . Для сохранения тонкой структуры биологического обьекта в РЗМ применяется несколько методов . Было показано , что сушка ка воздухе нарушает структуру . Поэтому наиболее распространенными методами являются использование сушки в критической точке (КТС) и метод замораживания высушивания (3-В) .

Другим методом в РЭМ является метод замораживания- травления. Сущьность его в том , что образец замораживается при г. низкой температуре до -150 С. с большой скоростью и затем высушивается при температуре -80 С.

Сравнительный анализ методов КТС с метода замораживания -высушивания показывает , что метод КТС включает химическое воздействие на обьект , что нежелательно , так как такое воздействие может существенно изменить структуру . Поэтому в этой работе мы обратились к криогенным методам в РЗМ .

-А

Методы ааморамгеании используется для фиксации структуры

-в -

образца в стеклообразном состоянии таким образом лишены п >д-вижноети большие и малые молекулы а твердой матриц С! >дова-тельно , к образцу не добавляются не свойственные ему зг кть , которые могут изменить структуру или состав образца , •/, ничего не удаляется из образца , пока он не будет высушен б замороженном состоянии . 3 этом случае образец теряет только воду и аналогичные летучие материалы . Сублимационная суика е замороженном состояния обладает тем яг достоинством , что и суика в критической точке , а именно отсутствием исчезающий поверхности раздела жидкость -пар и связанными с ней возмущающими силами .обусловленными позерхосгньм натяжением . Несмотря на то, что принципы лежащие в основе этого метода , являются разумными к имеются трудности , с которыми приходится сталкиваться при попытка заморозить биологические образцы достаточно быстро* чтобы получить воду в стеклообразном , а не кристаллическом состоянии . Для получения воды и стеклообразном состояния необходимо быстро снизить температуру во всем образце и выдерживать ее ниже температуры , при которой происходит переход воды иа стеклообразного в кристаллическое состояние ,

рис 1 Температурная хараятврвстзка пря зяморакгьавии

суспензий целлюлозы а/ Н, в/ 20* в/ 30*

-¿о-

Какое бы вещество не применялось в крупных образцах нельзя обеспечить текие скорость теплопередачи во всем образце от центра к периферии . В результате этого.стеклообразный лед не получается и образуются кристаллы льда .

Анализ структур показывает , что метод замораживания высушивания успешно используется в РЭМ . Однако иаученте литературы показывает также , что практически отсутствуют методические работы , касающиеся суспензий целлюлоза- вода . Поэтому наш проводилась работа по определению режимов , при которых не возникают артефакты , связанные с кристаллизацией льда в системах целлюлоза -■вода . Так , как метод замораживания - высушивания состоит иа двух этап ов 1) замораживание и 2) высушивание , то мы подробно изучали их как электронно микроскопическим методом , так и методом термического анализа .

Контроль качества криофиксации в электронной микроскопии с помощью термограмм предложен Белавцевой и Чемерисом . Этот метод выгодно отличается от предложенного Моором ( Швейцария ) , основанным на выживаемости микроорганизмов . Шрр подбирал условия криофиксации с помощью контроля за выживаемостью дрожиэвых клеток . Однако такой способ необъективен и подвергается критике , т. к. кристаллизация замороженной воды- и выживаемость микроорганизмов неоднозначные процессы .

Обьективным методом является метод Белавцевой- Чемериса , так как он основан на физическом явлении )' выделения теплоты при замораживании .

Необходимо, было создать аппаратуру для регистрации этого явления . Она была создана на Сумском заводе электронных микроскопов и называется приборов ИСК ( индикатор степени кристаллизации) . I 1

Кратко остановимся на принципах работы этого прибора .

При разработке прибора^ ИСК конструкторами ПО "Электрон " ( г. Сумы) были решены следующие вопросы:

1) Выбран термочуствительный элемент , обладающий высокой механической лрэчночтью , стабильностью и малыми габаритами , инерционностью, теплоемкостью .

2) Разработано регистрирующие устройство позволяющее как

визуально исследовать полученную термограмму , так. < фотографировать .

При разработке термочуствительгного элемента и основу била положена медь-константаковая термопара , обладающая достаточной линейностью характеристики и чуствительностыо в диалозоне п,емпе-ратур от 30 до -100 . °С.

Для определения степени кристаллизации криофиксируемый о''-,¡-.т помешают на спай термопары и медленно охлаждают в услоьи. к , обеспечивающих полную кристаллизацию ( например , в азоте } .

После оттаивания и удаления обьекта на спай термопары пепел-ют новую пробу и криофиксируют в заданном режиме ( например , пу • тем погружения в жидкий фреон ) . При этом совмещают начальные точки..

Полученные термограммы позволяют определить начальную тем.:-. ратуру (Тн) , полное время охлаждения обьекта , время фагг^.<у\ перехода при сверхбыстрой криофиксации , температуру фазового .•-рехода (Тф) .

Проведенные исследования в ряде работ кашей лаборатории "О::. -зывают , что разработанный метод и аппаратура вполне ил- -;и для изучения влияния скорости охлаждения, и наличия крг.опр«-.'ек•■. ров на кристаллизацию и рекристаллизацию различных ос:и-и.-.>:н' ри криогенном методе препарирования . Результаты исследов'.ш ''.»и в основу при разработке функциональных схем и конструл.'иикь". параметров промышленных приборов криогенного препариэов:-.чгя V1 "П--1, РУПЙК, ИСК Этот прибор использован наш ддч разрдбпт,-'. етода криогенного препарирования систем целлюлоза-вода .

.Результаты , полученные методом термического алг^л.";; , чик-годны при интерпретации результатов как просвечивает-.--11 , гак л растровой электронной микроскопии .

С помощью данных термографии научно обоснован 1 ;жим криогенного препа}!," вания систем целлюлоза- ко^ -я\ ,.• „оляет избежать артефактов препарирования .

Для растровой электронной микроскопии образец ( цел-шолоза-вода ) замораживается со'скооостью 1С0 град/с , затем помешается к специальный ст-олик вакуум, эй установки .

¡Тооизводится сублисчцг" ль; сначала при температуре -10° ,а "пи тр>'- . уре - 80 . С. Далее температура дос-

тигает ' .

-

Вамшм момент'" ' использованных нами методик для РЭМ являете исключение перенсод образца из хладоагента по воздуху , что га "радтируе:.' постоянство температуры образца при температур -150— 130 еС. и исключает его нагрев . Нагрев замороженного образца , как показали раэультаты термограммирования приводит ! рекристаллизации льда и , следс -* -- льно , к артефактам . Электронные микрофотографии позволяют убедиться , что при правильно! подборе условий криогенного препарирования удается получить реальную структуру объекта .

Исследовалась структура волокна в суспензиях о различной концентрацией полимера и соотношения пектина и целлюлозы для РЭМ - 1% ,20% ,30Х . Причем , исходя из кинетики гидролиза соотношение пектина к целлюлозе составляло 10 % . Представляло интерес проследить влияние концентрации полимера е суспензии на появление артефактов , вызванных криогенным препарированием . В некоторых работах отмечалось, что концентрации полимера в объекте существенно влияет на результаты электронной микроскопии если препарирование осуществляется криометодаш .

На рис 1 приведены термограмш , полученные при замораживании суспензий целлюлозы различных концентраций . Скорость залираживаник длк термограмм , представлении:« на рис 1 а, б,С составлю" 100 град/с . Из термограмм видно , что при концентрации полимера в суспензии 1-20 7. имеет место перегиб кривой , что свидетельствует об образовании кристаллов льда при замора-йиваки*: этик систем , При концентрации целлюлозы 20 X и более такой перегиб отсутствует что указывает на. аморфизацию льда при замораживании объекта . Следовательно , в концентрированных системах целлюлоза вода заморатшвание обьекта со скоростью 100 грац/с не приводит к приеталлизации растворителя . Полученные нами данные согласуются с результатами рабе ты , в которой для определения кристаллизации льда при замораживании код-ных растворов полимеров использовался метод' сканирующей дифе-ренциальной голориыетрии .

Результаты , полученные нами методом термического анализа , согласуются с данными электронной микроскопии , При исполь— ас чаны: з РЭМ метода замораживания-высушивания на микрофотог-ра.иях суспензий целлюлозы с высокой концентрацией полимера моано наблюдать реальные структуры , что позволяет оценит*

эмер структурных элементов целлюлозы . Если т исследуются :пекзии с концентрацией менее ЗОХ , то на микрофотографиях 1вляюгся артефакты , которые вызваны агрегацией мелких эуктурных элементов ( менее 100 им ) , возникающей бедствие образования" кристаллов льда при замораживании ( :2) Крупные частицы волокна размером более 1 мкм но образуют эегатов в процессе криогенного препарирования при заморажи-\т образца со скоростью 100 град/с независимо от концентра-полимера а системе . Следовательно , для оценки размеров :г;иц целлюлозы менее 100 им метод замораживания-высушивания позволяет определить реальную структуру . если применяется ¡тровая электронная микроскопия .

Исследование таких систем в замороженном состоянии в РЗМ [изкотемпературной приставкой , показало ( что агрегация 1ких структур • вознигает в процессе сублимации замороженного творителя при повышении температуры замороженного обьекта Поэтому для избежания ошибок при определении размеров

ких частиц целлюлозного волокна необходимо исследовать в [ замороженный образец , не подвергая его сублимации.

Что касается сильно разбавленных суспензий » то согласно ным метода термического анализа , при замораживании таких тем со скоростью 100 град/с возникают в обьекте мелкие сталлики льда .

Проведенные нами исследования показали , что при спреде-ии размеров мелких частиц волокна целлюлозы в суспензии с эщью РЭМ м«"тод замораживания высушивания должен использо-;я с большой осторожностью . Практически этот метод позво-? получить информацию о о реальной структуре волокна цеялю-^ лишь для крупных -частиц V. мелкие частицы образуй агрэга-в процессе криогенного препарирования .

Следовательно можно считать .. что при исследовании гензий целлюлозы в РЭМ можно использовать препаративный ме-замораяивания- высушивания по стандартной методике : замораживание до температура -'150 "с со скоростью 100 град/с , твивание - при температуре -80'с , перенос образца в среде ;ого азота .

Аналогичное методическое исследование проведено для раст->в казеина : второго-белкового -обьекта данной работы ) и

- /У-

пектина .

Для РЭМ беэартефактную " структуру можно получить методе замораживания-высушивания , если концентрация казеина боле 200% или локальная концентрация казеина в растворе также- аысс гдя ( т. е. используется неоднородное распределения биополимер в обьеме ) .

Проведенной электронно -микроскопическое исследование пс казало , что в случае адсорбции казеина или его гидролизата, присутствии пектина и без него, имеет место высокая локальна концентрация биополимера , что позволило изучать структуру бе артефактов . ( рис 2) . Для растрового электронного микроског образцы готовили следутаям образом .

Исследуемое вещество наносили на фольгу . Фольгу с исследуемым веществом заморшизайи в жидком азоте после чего висукивали объект на БУП-2К ь течении 8-10 часов Высушенный образец приклеивали к специальному столику ДJ рассматривания в растровый электронный микроскоп .

<

рис 2,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Электронно микроскопический анализ суспензии целлюлозы в присутствии белка -казеина констатирует образование локальных комплексов между волокнами целлюлозы и глобулами белка ( вблизи иэоэлектрической точки ). В присутствии продуктов гидролиза белка на поверхности. ПВ возникает сорбционный слой , толщина которого пропорциональна концентрации белка в растворе . Параллельные кинетические, исследования подтверждают данные электронно-микроскопического анализа и дополняют их количественными результатами о степени протеолиза в постоянных условиях этого процесса.

В двойных системах целлюлоза - пектин наблюдаются отдел;, -чые агрегаты волокон целлюлозы и микрофибрилл пектина . Мйкро-.'стографии этих систем в реферате не приводятся , т. к. они известны из предидущих работ нашей лаборатории .

В протеолитических тройных системах ( целлюлоза + белок + пектин) в присутствии постоянной концентрации фермента наблюдалось образование сорбционного слоя продуктов гидролиза , более толстого , чем в отсутствии пектина , на слой один , не разделенный . Компонентный анализ сорбционного слоя показал , что он в основном состоит ди - и три- пептидов . Очевидно , а присутствии пектина в слой включаются пектин-пептидные комп- -лексы .

Болысое иесто в.наших исследованиях заняли вопросы , связанные, с кинетикой биокаталитичесхчх процессов , протекающих в рассматриваемых системах з соответветствии со схемой реальных процессов в кишечно-желудочком тракте и согласование с данными макромалекулярного электронно микроскопического анализа ,

о

Материалы к методика исследования

В качестве источника ПВ "пименяли нерастворимые полисахариды -целлюлозу (?,iin!<tell)- мы""Pharmacia" Швеция В работе использовали казеин во Гаммерстену , как наиболее перевариваемый белок ( ^производство НШ Биохимреакяиз , Ъ-,.,0лейне ),пепсин кристаллический ффмц "Kferk" (ФРГ) , пектин отечественного производства( город '{алии УССР), сульфаты металлов Zn(F.e,Ca,M]r . Соли , кислоты , я/елочи и растворители применял!! марки"х. ч. " или "х.д. а.•

Гидролиз казеина пепсином проводили в термостатированной кю-н»;ти с магнитной мешалкой при температуре 37 С в присутствии волокон целлюлозы и без них -контроль .

Соотношение белок- пищевое волокно во всех исследованиях ис-ммльяоьалось 1/2

При исследовании влияния ионов металлов на процесс- протеолиза н систему добавляли соли: гпС12- 0,1 %, ГеС13- 0,2 ГаС12 - 1,4% , МеБ04 7Н20 - 1% , что соответствует суточной норме потребления человека . За кинетикой гидролиза наблюдали по изменению аминного азота

который определяли путем осаждения пробы в ТХУ и анализа фильтрата с помощью 2,4,6, тринитробензосульфокислота ( ТНБС) .

Скорость реакции гидролиза поределяли по тангенсу угла наклона полученных кинетических кривых . Активность фермента определяли по модифицированному методу Ансрна . Для определения устойчивости комплексов на поверхности волокон в ходе протеолиза , проводили его многократную промывку 0,1 Н НСЬ Все спектрофотомет-рическиэ определения проводили на приборе " Зресогс! ЦУ-У1з" оборудованном цифровым вольтметром Щ 1312 , погрешность прибора -10,00] . Оптическую плотность фильтратов измеряли при длине волнг ЗЙОнм.

Содержание общего г^ота определяли по методу Дюма .

Для моделирования процессов протеолиза и транспорта в ЖКТ было проведено исследование последовательности влияние ферментов -непсина и -химотрипсина . Для этого исследуемые системы ПВ1 иПВ2 после проведения гидролиза пепсином , как описано ранее , фильтровали , и фильтрат упаривали. Затем фильтрат разводили в 25 мл фосфатного буфера рН 8 и проводили дальнейший гидролиз по указанной выше методике.

Среднюю длину ( количество аминокислотных остатков ) (п ср) определяли по увеличению концентрации аминкого азота после щелочного гидролиза этой фракции с некоторой модификацией , заключающейся в использовании для определдения аминного азота реакции с ТНБС вместо реакции с нингидрином , как предлагается в оригинальной методике . Точность и надежность метода г^ролиза проверяли : используя 1-аланин-1~аланин и Ь-лейцил-Ь-лейцин в качество стандартных веществ .

Среднее количество аминокислотных остаткои в пупглде (м ср) поределали по формуле (1)

СМам.п. г.

п =------------

■ СМам, д. г.

где : СК'ам.п. г.-аминный азот выделенной фракции после ее кислотного гидролиза , СМам, д. г.-аминный азот фракции до гидролиза ,

Молекулярную массу пептидов определяли по формуле (2) М =п Мак -(п-1) . М Н20

где : Мак - средняя молекулярная масса аминокислоты , равная

' . 120;

Ы Н20 -молекулярная масса воды , равная 18.

Исследование дезинтоксикационных свойств модифицированных ПВ, полученных после проведения гидролиза в присутствии пектина , так я без него и затем высушенных до постоянного веса, проводили в термостатированной кювете с магнитной мешалкой при температуре 37

С.. ПВ предварительно смачивали фосфатным буфером рН 5 и оставляли на 24 часа (1,5 г. волокон в 0,5 мл. буфера). Затем к 25 мл 0,06 % фенола добавляли 1.5 г. смоченных волокон .

Каждые 30 минут ( начиная с 0 момента времени) брали пробу 2 лл раствора и фильтровали.

Спектрофотометрические исследования проводили на длинне волны 340 им.

1сследование способнссти сорбировать металлы модифицированными ПВ фоводили в термостатированной кювете с магнитной мешалкой при температуре 37 °С . 2 грамма модифицированных ПВ помещали в 25 «л. фосфатного буфера рН 5 . Через 30 мин вводили соли тяделых еталдоа соответсть,дшдх концентраций : Сс1С12 - 0,02£ , Си С1Й-',01%, Ге С1з- 0,01 % .

Каждые 15 минут отбирали 2мл. раствора и фильтровали . 1тическую плотность фильтрата для каздого металла измеряли при ределенной длинне волны : Сс1С12-210нм. , Си С12-240м:. ^е СЬз- 290 нм.

Процентное содержание в стеме ме1 ;лои после сорбции для Сс1 /

, 2п- методом ренгенофлуоресцентной спектрометрии

—/«й- -

¡//,\3 Влияние соотношения пектин/ ПВ на степень гидролиза 1^-изеина п^-сином .

!) пектин - ПВ 1 1, 2) пектин-ПВ 1 2 3) пектин - 11Б 1 I ,4) пектин -ПВ I 3

-/у-

Умл,НС1

рис.'¥ Дина-ика изменения оптической плотности в системах-' 1) Казеин-пектин -целлюлоза ") Казеин -целлюлоза

- ¿о-

.для Си и Fe методом полягрофического определения металлов,' для Оа методом Атомно-абсорбционного определения металлов в

:3<х\

Проведенные ранее исследования влияния пищевых волокон на гидролиз казеина пепсином показали, что протеолиз в присутствии пищевых волокон протекает с образованием сорбционны комплексов . . "

Исследуя состав сорбционных комплексов можно сказать , что в начальной фазе гидролиза возможна сорбция как казеина , так и пепсина , влияюшэя на начальную скорость гидролиза .

Начальная и стационарная скорость гидролиза зависит от соотношения белок - волокно , причем как при небольшом , так и при избыточном количестве волокон значительно снижается каталитическая активность системы , При соотношении белок-волокно 1/2 отмечена наиболее высокая скорость гидролиза .

Исследование влияния пектина на скорость гидролиза беЛка в описанных системах проводили при различных соотношениях пектин и ПВ Как видно из рис. 3 при соотношениях пектин к ПВ (1/4) скорость гидролиза белка в системе наивысшая , при этом каталитическая активностьсистемы возрастает приблизительно на 12% . При исследовании гидролиза белка в различных системах : 1) казеин 2) казеин- ПВ , 3) казеин- ПВ-лектин , 4)казеин -пектин, было показано s что наибольшая каталитическая активность достигается в системе казеин-ПВ-пйктин. Таким образом, введение в систему целлюлозы и пектина приводит к увеличению скорости гидролиза .белка . ■' .' '

Были исследованы целлюлозные волокна, 'полученные после гидро лиза казеина ( как в присутствии пектина . так и без него).

Многократное промывание ПВ'0,1 Н HCL и дальнейшее исследование этого раствора показало , что оптическая плотность смывов с ПВ полученных в системах с пектином, ниже , чем аналогичная в систе мах без пектина , что дает возможность предположить , что сорбци-ошше комплексы .образующиеся на поверхности ПВ более устойчивы системе с пектином (рис..

Это подтверждают такж1 и результаты исследования содержания общего азота в ПВ в системах без пектинаС ПВ1) и с пектином( ПВ2) Общий аззот. ( Noöiftl ПВ1 составил 0,18 % . ПВ2 - 0.25 Z, что свидетельствует о наличии более плотных и устойчивых комплексов на иг'.-.Ф/жюти ПВ в системе с пектином .

рис.5". Электронная микрофотография сорбционного комплекса на поверхности волокон целлюлолэы после многократного промывания 0,1 Н в-системе казеин-пепсин-пектин -целл! эза . Увеличение 6000

рис.б . Электронная микрофотография сорбционного компле1 на поверхности волокон целяшолзы после многократ» промывания 0,3 Н HCL в системе казеин-пепсин; -целлюлоза . Увеличение 600Q

- Ä3-

Электронно-микроскопические исследования ПВ1 и 1Ш2 локааали что. на поверхности волокна формируется плотный слои продул1. <jb гидролиза казеина пепсином толщиной от 2 до 17 мкм, отличающим, я по структуре от казеина . , причем толщина слоя на по

верхности ПВ2 суЕ{ественно больше , чем на поверхности 1Ш1 (Рис Как показали исследования ПВ1 и ПВ2 , полученных после многократно го промывания 0,01 Н HCL , образовавшийся на поверхности сорбционный слой более устойчив , что видно при сравнении элект ронных микрофотографий .Из приведенных фотографий видно ,

что на поверхности ПВ2 сохраняется значительное количество участков покрытых сорбционным слоем С рис>5), тогда как у ПВ1 их практически не остается ( рис6).

Таким образом , введение в систему пектина позволяет получить более прочные еорбционные слои на поверхности целлюлозного волокна .

Для моделирования процессов протеолиэа и транспорта в ЖКТ исследовали влияние поледовательности действия ферментов - пепсина и химотрипсина на кинетику гидролиза в системах с пектином и без него. На рис.7 преведены кинетические кривые дальнейшего гидролиза полученных пепсиновых гидролизатов«£-хшотрипсином . Как видно иа приведенного графика гидролизаты , полученные в присутствии пектина гидролизуются -химотрипсином значительно быстрее Оценивая йолученные данные с точки зрения роли ПВ в пнщеварительно транспортных процесса^ , можно отметить следующее . Физиологическая роль ПВ определяется физико-химическими свойствами компонентов , из которых они состоят : лигнина , целлюлозы , кислых полисахаридов и пектина. /&ги вещества способны к гелеобрэзованию и обладают различными ионогенными группировками , как кислого , так и основного характера , что обуславливает характер взаимодействия с растворенными веществами

Как известно олыдую физиологическую роль в пищеварении играют ионы различных металлов . Поэтому нам представлялось интересным исследовать влияние ионов жизненно необходимых металлов на г о-цесс протеолиза .

В нашей работе были использованы соли Zn,Fe,Ca,M.j в количествах cor тветствупцих суточной норме ir -ребления их человеком .

Проведенные исследован, л показали , что при проведении г дро-. лиза в системах кааеин - пепсин - целлюлоза и казеин- непсин -целлюлоза - пекть. в присутствии ионов указанных ме лилов ски-

рис.Т Гидролиз пепсинового гидгьш^ата L : химотрипсином и системах : 1) ПВ-п«п.пшов»и гидролкзат- пектин

2) ПГ.-п»>псино№й гидролшат .

О

— Кй

рис.8 Динамика сорбции Фенола на волокна целлюлоз» в системах 1) Цпр - промытые волокна целлюлозы после гидролиза каьеина пепсином

2) Ц - волокна целлюлозы после гидролиза

казеина пепсином

3) ЦПпр- промытые волокна целлюлозы после

гидролиза казеина пепсином а присутствии пектина 4) ЦП - волокна целлюлозы после гидролта казенна пепсином в присутствии, ■ ' • ' пектина

-Z6 -

поотъ реакции не меняется.

-¡юсобность пектиновых веществ"образовывать соли обуславливает их применение в качестве профилактического средства для выведе ■чц из пищеварительного тракта человека ионов тяжелых металлов.

На основании этих сеойств пектина нам в нашей . работе предс-ганлнлось интересным исследовать сорбционные свойства исследуемы? 1 щ ррм ПВ1 иПВЙ на примере некоторых ионов тяжелых металлов, ко-ч.рнч находят наиболее широкое применение в различных области) Г'-хники, медицины , сельского хозяйства . Это ионы таких металло! . как Cd.Cu, к Fe .

!1ри введении в систему ионов этих металлов , происходит сорбцю последних на волокно . О чем свидетельствует значительное уменьшение оптической плотности фильтратов

Таблица 1

Содержание металлов в сорбционном слое

Введенные в раствор ПВ1 ПВ2 , ■. соединения

< 0dC12 0,23 0,38

CuC12 . 0,18 0,21

. , ' FeCl 8 \ 0,96 1,3

. Положительное действие ПВ на иногие физиологические функцш организма хорош иавестны . Проведенные нами исследования показа ли , что пособны сорбировать, а следовательно и выводить из орга ниама такие яды , как,например, фенол .

, При введении ПВ1 и ПВ2 в раствор фенола оптическая пдотноет раствора уменькается , что указывает на сорбции фенола на волок но( рис.-ф) Из приведенного рисунка видно , что сорбция фенола н волокно зависит от величины сорбционного слоя на поверхности цел ' лшозы . Так на волокнах промытых. 01 Н HCL после реакции сорбиру ется меньше фенола , чем на непромытых волокнах ( сравни Цпр и , а также ДПпр и ЦП) .причем в системах содержащих пектин ( ЦПпр и ЦП) сорбция" фзнола на поверхностьволокна значительно в

ВЫВОДЫ.

1. В работе впервые проведено Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия целлюлозы с белком в присутствии пектина в условиях ферментативного гидролиза белка , и обнаружено образование поверхостного комплекса пектина , целлюлозы и белка в определенном узком интервале концентраций компонентов.

2. Данные электронно -микроскопического анализа подтверждаются результатами химико-кинетического контроля процесса ферментативного гидролиза в присутствии целлюлозы и пектина , а также элементным анализом поверхностного соединения .

3. Впервые установлена высокая устойчивость комплексов , образованных гидролизатами казеина на . поверхности волокна в присутствии пектина и высокая сорбционная. способность образованных комплексов по отношению к ионам металлов и фенолу-.—

4. Установлен характер надмолекулярной организации и основной состав сорбционных комплексов , образованных на поверхности волокна целлюлозы в результате гидролиза казеина пепсином . Можно отметить , что он в основном состоит из ди и три-пептидов .

9

5. Установлены условия препарирования и ■ пробоподготовки суспензий казеина . целлюлозы и пектина для обеспечения безар-тефактного электронно-микроскопического исследования этих

систем . '

' X - -

Б. Разработанные в диссертации физико-химические аналитические методы и полученные результаты могут быть использованы при исследовании процессов биотехнологии и физиологии пищеварения . ' 4