Биоэлектрохимия бислойных липидных мембран, не содержащих растворитель тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им А Н ФрумкинаРАН

на правах рукописи

БАТИЩЕВ ОЛЕГ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

БИОЭЛЕКТРОХИМИЯ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН, НЕ СОДЕРЖАЩИХ РАСТВОРИТЕЛЬ

Специальность 02 00.05 - Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2008

~ п г-и 2008

003447380

Работа выполнена в Учреждение Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН

Научный руководитель.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Андрей Владимирович Инденбом

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук

Александр Михайлович Емельяненко

Доктор химических наук

Александра Мордухаевич Скундин

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится октября 2008 года в ¿¿_ час. мин. на заседании диссертационного совета Д 002 259 03 при Учреждение Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А. Н Фрумкина РАН по адресу: 119991, г Москва, Ленинский проспект, д 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина

РАН.

Автореферат разослан сентября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Г. М. Корначева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение. Актуальность проблемы. Плоские бислойные липидныс мембраны (БЛМ) являются давно известной удобной системой для моделирования клеточных мембран. Они позволяют изучать различные электрохимические свойства лилидных бислоев, такие как распределение электрического потенциала, адсорбция ионов, строение двойного электрического слоя, влияние внешних электрических полей, ионный транспорт, процессы их слияния, деления и т п (Tien, 1974) Все известные на сегодняшний день методы получеши БЛМ сводятся к двум основным первый - нанесение на отверстие в тефлоновой перегородке капельки раствора липида в неполярном органическом растворителе (метод Мюллера-Рудина) (Mueller et al, 1962), второй - сведение двух монослоев на отверстии в перегородке, разделяющей две полуячейки (метод Монтала) (Takagi et al, 1965, Montai and Mueller, 1972) Оба эти метода имеют один значительный недостаток -это наличие микролинз растворителя в центральной гидрофобной области мембраны и избыток липида в растворителе в окаймляющем мембрану мениске (Montai and Mueller, 1972, White et al, 1976, Chantunya, 1996) Присутствие растворителя в мениске приводит к неконтролируемому значению натяжения мембран, что затрудняет изучение их механических параметров, слияние мембран может инициироваться при встрече микролинз растворителя, принадлежащих контактирующим бислоям (Berestovsky and Gyulkhandanyan, 1976), что не может реализовываться на биологических мембранах Все это послужило причиной поиска возможных путей минимизации количества растворителя в БЛМ Существует целый ряд работ, в которых описаны различные модификации методик формирования мембран, подразумевающие использование высокомолекулярных растворителей, почти не образующих микролинз, (White, 1978), вымораживание растворителя из мениска (White, 1974) или изменение экспериментальной системы (Vodyanoy and Murphy, 1982). Однако эти модификации вносили ограничения в применимость данной модельной системы Таким образом, получить БЛМ, не содержащей растворитель ни в мениске, ни в самом бислое, так и не удалось

Недавно для формирования мембран было предложено использовать гидрофобизировапные неорганические материалы (стекло или кремний) вместо полимеров (Pantoja et al, 2001), так как поверхностные свойства полимерных пленок (тефлон, полиэтилен и т п ) характеризуются большой нестабильностью, в отличие от твердой поверхности неорганических материалов Это направление показалось нам достаточно перспективным, так как химическая модификация поверхности неорганических материалов различными агентами открывает практически неограниченные возможности изменения ее свойств, не влияя при этом на свойства бислоя Для формирования мембран в наших экспериментах мы решили использовать дифиганоилфосфатидилхолин, ДФФХ, т к из литературных данных известно, что он имеет рКа 2,1 и 10,5, т е остается электронейтральным в широком диапазоне рН (Davenport, 1971), а также не претерпевает фазовый переход в диапазоне температур от -120°С до +80°С (Silvius, 1982)

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и исследование свойств бислойных липидных мембран, не содержащих растворитель Конкретные задачи состояли в следующем

1) разработать методы химической модификации поверхности материалов для последующего формирования на отверстиях в них БЛМ, не содержащих растворитель;

2) изучоть влияние раствора электролита на процесс формирования мембран,

3) разработать методику формирования мембран, не содержащих растворитель, на отверстиях в материалах с модифицированной поверхностью,

4) определить электрические (удельные емкость и проводимость) и механические (латеральное и линейное натяжение) параметры БЛМ, не содержащих растворитель, и сопоставить их со свойствами классических БЛМ

Научная новизна. В работе удалось решить задачу формирования БЛМ, полностью лишенных растворителя, с помощью разработки методик алкилирования стекол, что является существенным прорывом в вопросе создания

искусственных липндных мембран Были обнаружены и исследованы эффекты изменения поверхностных свойств монослоев используемого липида и их роль в процессе формирования бислоев Сделан вывод о влиянии специфической адсорбции гидроксил-иоиов в области полярных «головок» липидных молекул на натяжение липидных монослоев и бислоев

Практическое значение работы. Разработанная и исследованная в диссертации методика формирования бислойных липидных мембран может быть использована для изучения широкого круга мембранных явлений, таких, как процессы слияния и деления мембран, вирус-индуцированного слияния, транспорта ионов через каналы, образование доменов в липидном бислое и тд Одним из важных результатов работы является демонстрация того, что нейтральный липид ДФФХ значительно меняет свои свойства при изменении рН в области электронейтральности вблизи от изоэлектрической точки Полученные в работе зависимости натяжения липидных монослоев и бислоев от рН среды важны для описания процессов функционирования клеточных мембран

Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях молодых ученых ИФХЭ РАН (Москва, 2006, 2007); на 8-м международном Фрумкинском симпозиуме «Кинетика электродных процессов» (Москва, 2005), на 19-м международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Тулуза, Франция, 2007), на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва, 2004-2008)

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в трех статьях в отечественных и международных реферируемых журналах, входящих в список ВАК

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 33 страницах, включает £Г"иллюстраций Диссертация состоит из введения, четырех основных частей и заключения Список цитированной литературы содержит /Jg наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение гидрофобных стекол.

Подложки для последующего формирования БЛМ изготовлялись из покровных стекол (Thomas Scientific, США) толщиной 100 мкм, в которых путем химического травления в плавиковой кислоте получали круглые отверстия диаметром 150 - 400 мкм Для очистки и активации поверхности стекла применялся метод обработки плазмой водяных паров Создание индукционного плазменного заряда осуществлялось посредствам собранной нами установки, состоящей из форвакуумного насоса («MLW», модель DSE 8, Германия), генератора ультравысоких частот (модель УВЧ-30-2, ГЗАС им АС Попова, Россия) и системы напуска водяных паров, контролируемого с помощью вакуумметра (13BT3-003, Россия) Обработка покровных стекол производилась в течение 40 минут непосредственно перед дальнейшей химической модификацией

Гидрофобизация проходила согласно предложенной нами методики их последовательной обработки несколькими хлорсиланами в порядке убывания длины углеводородного «хвоста» октадецшггрихлорсиланом,

диметилдецилхлорсиланом и диметилдихлорсиланом («Fluka Chemie», Германия) Покровные стекла выдерживались в 3% растворе (по объему) соответствующего хлорсилана в толуоле (для УФ - спектроскопии, «Chemapol», Чехия) в течение часа в атмосфере аргона, после чего троекратно промывались толуолом для удаления молекул хлорсилана, не связавшихся с поверхностью, и выдерживались в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов Затем процедура повторялась для следующего хлорсилана (Батищев и Инденбом, 2004) Для дальнейшей работы использовались только свежеприготовленные образцы (в течение 1 - 3 суток после изготовления)

Получение амфифобных стекол.

Предварительная обработка покровных стекол перед амфифобизацией (фторосиликонизацией) проводилась так же, как и при гидрофобизации

Фторосиликошвация осуществлялась путем кипячения стекол в течение 8 часов в 2% растворе (по объему) 3,3,3-Трифторпропилтриметоксисилана («Fluka Chemie», Германия) в толуоле (для УФ - спектроскопии, «Chemapol», Чехия) в колбе с обратным холодильником, после чего они троекратно промывались толуолом для удаления остатков фторсилоксана, не связавшихся с поверхностью, и прогревались в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов При такой обработке поверхность стекла приобретала амфифобные свойства, т е становилась как гидрофобной, так и липофобной (Batishchev and Indenbom, 2008) Для дальнейшей работы также использовались только свежеприготовленные образцы (в течение 1 - 3 суток после изготовления)

Измерение краевых углов смачивания.

О гидрофобности и липофобности полученных образцов и их изменении в присутствии липидов судили по краевым углам смачивания чистой водой и водой с монослоем липида Для этого на поверхность стекла или тефлоновой пленки наносили каплю воды объемом 5 мкл и 0,25 мкл раствора 1,2-дифитаноил-зп-глицеро-3-фосфохолина, ДФФХ, («Avanti Polar Lipids», США) в гексане (для хроматографии, «Реахим», Россия) с концентрацией 0,1 г/л Такое количество липида является минимально необходимым для образования монослоя на поверхности водной капли Краевой угол измеряли по изображению капли на экране монитора («TVS», модель ММ-15, Тайвань), полученному с помощью микроскопа (МБС-2, Россия) посредством цифрового фотоаппарата («Nikon», модель Coolpix 4500, Япония)

Формирование мембран.

Бислойные лшшдные мембраны, не содержащие растворитель, формировались методом сведения монослоев (Takagi et al, 1965, Montai and Mueller, 1972) в ячейке, состоящей из двух частей (полуячеек), между которыми располагалось гидрофобизированное либо амфифобизированное покровное стекло с отверстием Полуячейки заполнялись 0,1 M раствором KCl (чистота 99,8%, «Реахим», Россия) в

дважды дистиллированной воде так, чтобы уровень жидкости находился немного ниже отверстия в стеклянной перегородке Кислотность среды варьировали добавлением НС1 Для образования монослоя липида на поверхность воды в каждую полуячейку наносили 5 мкл раствора ДФФХ в гексане концентрацией 1 г/л Монослои сводились путем поочередного поднятия уровней жидкости в полуячейках через 15 мин после нанесения раствора липида За процессом образования мембран следили по изображению на экране монитора («TVS», модель ММ-15, Тайвань), полученному с помощью микроскопа (МБС-9, Россия) посредством цифрового фотоаппарата («Nikon», модель Coolpix 4500, Япония)

Электрические измерения проводились разработанным в нашей лаборатории потенциодинамическим методом (Абидор и др, 1980) Треугольные импульсы напряжения амплитудой 100 мВ (от пика до пика) и частотой 200 Гц подавались с генератора электрических сигналов специальной формы («EG&G Parc», модель 175, США) на мембрану с помощью пары хлорсеребряных электродов Токовые отклики регистрировались с помощью усилителя тока («Keithley», модель 428, США) и выводились на компьютер с помощью карты АЦП («Л-кард», модель L761, Россия) Величины проводимости и емкости мембран рассчитывались на основе эквивалентной схемы с их параллельным соединением (аналог адмиттанса) Такая схема отвечает свойствам липидных мембран, имеющих значительно более высокое удельное электрическое сопротивление, чем удельное сопротивление раствора электролита в ячейке Формирование мембран регистрировали по резкому росту электрической емкости

Измерение разности граничных потенциалов на мембране.

Измерения проводились по методу компенсации внутримембранного поля, предложенному в (Соколов и др , 1980) БЛМ формировались по методу Мюллера-Рудина (Mueller et al, 1962) из раствора ДФФХ в декане (концентрация 15 г/л) на отверстии диаметром 1 мм в тефлоновой перегородке Разность граничных потенциалов БЛМ измеряли по величине второй гармоники емкостного тока Измерения осуществлялись посредствам фазочувствительного усилителя DSP-7265

(Signal Recovery, США), который управлялся через приборный интерфейс GPIB (Measurement Computing, США) Кислотность среды варьировали добавлением ЮОмМ раствора НС1 в соответствующем растворе электролита (КС1) с одной стороны от мембраны

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование БЛМ на отверстиях в гидрофобизированных стеклянных перегородках.

Получение гидрофобизированных поверхностей. Причины, по которым присутствие растворителя столь необходимо для формирования плоских БЛМ, кроются в граничных условиях, определяющих этот процесс И главной из этих причин является то, что для правильной ориентации липидных молекул вблизи кромки отверстия необходимо повышать гидрофобность перегородок (подложек), так как в присутствии амфифильных молекул липида она значительно снижается Для достижения максимальной гидрофобности гладких стеклянных перегородок нами была разработана методика последовательной гидрофобизации поверхности несколькими хлорсиланами в порядке убывания длины углеводородного «хвоста», когда более короткие молекулы хлорсиланов могут занимать свободные участки на поверхности, оставшиеся после обработки более длинными В результате были получены значения краевых углов смачивания водой на данной поверхности около 100° - 110°, что близко к таковым для тефлона (110° - 120°) При наличии липидного монослоя на поверхности капли этот угол уменьшался примерно до 60 градусов, что ставило под сомнение возможность формирования устойчивых БЛМ на отверстиях в таких перегородках

В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что эффект сшшешш краевого угла смачивания в присутствии ДФФХ становился менее выраженным при повышении кислотности раствора Так, угол смачивания силанизированных стекол водой в присутствии ДФФХ рос примерно от 60 до 80 градусов при уменьшении рН раствора от 7 до 3 Аналогичный эффект наблюдался и на

поверхности тефлона В контрольных экспериментах было показано, что в отсутствии липида краевой угол не зависит от рН

Формирование БЛМ, не содержащих растворитель. Весьма существенно, что при низких значениях рН краевой угол приближается к 90 градусам, что обеспечивает необходимые граничные условия для формирования БЛМ, не содержащих растворитель (White et al, 1976) По описанной выше методике нам удалось сформировать такие мембраны при низких значениях рН Их время жизни в среднем составляло несколько часов, а электрическая емкость не зависела от частоты подаваемого переменного напряжения в диапазоне от 10 до 1000 Гц Оптические наблюдения за процессом формирования мембран показали, что при значениях от 3 до 3,5 мембрана полностью закрывает отверстие в перегородке (см Рис 1 б и 1 г), т е ее площадь можно считать равной площади отверстия Исходя из этого предположения, мы оценили удельную электрическую емкость наших мембран и получили значение 0,86 мкФ/см2±5% Эта величина выше, чем для БЛМ, полученных по классическому методу Монтала (0,8 мкФ/см2) (Chanturiya, 1996) В ходе экспериментов была зафиксирована значительная зависимость электрической емкости полученных мембран от рН среды, в которой они формировались (см Рис 1а) Из оптических наблюдений видно, что при увеличении рН второй монослой начинает закрывать лишь часть отверстия в перегородке (см Рис 16 и 1 г) После образования мембраны изменение рН уже не влияло на ее емкость и способствовало разрушению Кроме того, как при полном закрытии отверстия вторым монослоем, так и при частичном, невозможно было поднять уровень выше того, на который произошло спонтанное поднятие

Для проверки бислойности полученных мембран была исследована их проводимость в присутствии каналоформеров, которые могут создавать каналы только в бислойных мембранах (Klemberg and Finkelstein, 1984) В результате одностороннего добавления нистатина в окружающий мембрану раствор мы наблюдали пропорциональный его концентрации рост проводимости БЛМ (см Рис 2)

Рисунок 1. а) Электрическая емкость мембран, не содержащих растворитель, как функция рН водных растворов, в которых они формировались. Диаметр отверстия составляй 277мкм. б) ив) Фотографии мембран, сформированных при различных рН. Диаметр отверстия - 180 мкм. Один уровень раствора (верхняя граница темной и светлой областей) всегда находится выше отверстия. Второй -подводится под нижний край отверстия. Образование БШ4 происходит спонтанно. Конечное положение второго уровня видно по границе нижней темной области, б) рН = 3,5; БЛА4 сформировалась практически на всей площади отверстия, в) рН = б; бислойная часть занимает лишь небольшую долю отверстия вблизи нижней кромки, г) и д) схематическое изображение ETflvl, сформированных при низких (г) и высоких (д) значениях рН водного раствора.

Концентрация нистатина, икМ

Рисунок 2. Зависимость проводимости БЛК4 от концентрации нистатина в растворе в одной из полуячеек. Диаметр отверстия 300 мкм, рН 4,5. Прямая на графике соответствует линейной регрессии полученных результатов.

Эти эксперименты однозначно свидетельствуют о бислойной природе полученных мембран Значит, изменение электрической емкости на Рис 1а действительно может быть вызвано только изменением площади БЛМ

Зависимость межфазного натяжения монослоя ДФФХ от рН среды. Для объяснения зависимости площади БЛМ, сформированных по нашей методике, от рН среды, мы изучили рН-зависимость натяжения липидного монослоя на водной субфазе Было исследовано изменения высоты капиллярного поднятия кромки воды в присутствии липида вдоль гидрофобизированных покровных стекол В результате измерений были получены следующие зависимости (см Рис 3)

рн

рн

Рисунок 3. а) Зависимость краевого угпа смачивания (0) воды в присутствии ДФФХ от рН для вертикальных гидрофобизированных стеклянных пластинок, б) Зависимость высоты капиллярного поднятия кромки воды в присутствии липида вдоль гидрофобизированных покровных стекол Каждая точка отвечает отдельному эксперименту, проведенному па свежеприготовленном гидрофобизированном покровном стекле.

Для расчета натяжения монослоя была определена форма поверхности жидкости вблизи перегородки (см Рис 4)

а . , ал/2 L 2г

х = —j=Arch----т- +х0

V2 2 \ а1

О)

где х0 определяется из условия, что при х=0 z'=-ctg 9, т е z=h=<Wl-sin0, где h -

искомая высота поднятия жидкости у самой стенки.

Рисунок 4. Форма поверхности жидкости вблизи вертикальной смачиваемой стенки. 0 - краевой угол.

На основе полученных результатов и формулы для высоты капиллярного поднятия кромки жидкости вдоль перегородки мы получили зависимость натяжения монослоя ДФФХ от рН водной субфазы (см. Рис 5, точки)

Рисунок 5. Зависимость межфазного натяжения монослоя ДФФХ от рН водной субфазы Точки — экспериментальные данные, линия -расчет по уравнению (9), который изложен ниже.

Для описания полученной зависимости мы решили рассчитать изменение натяжения монослоя ДФФХ, происходящее вследствие кислотно-основной диссоциации его полярных групп Этот липид является цвитгерионом, электронейгральным в широком диапазоне рН, тк рКа фосфатной и холиновой группы составляют 2,1 и 10,5 соответственно (Матинян и Абидор, 1984). Для молекулы ДФФХ, имеющей одну кислотную (Ьа) и одну основную группу (Ьь), уравнения диссоциации будут следующими

(2)

1ьОН с$Ь1 + ОН~ (3)

НОН оЯ* + ОН' (4)

Соответственно, константы равновесия будут иметь вид

к« = ан-аон-> где V' аа

активности соответствующих компонентов, К„ - иошюе произведение воды

Изменение межфазного натяжения при адсорбции ионов на границе раздела описывается формулой Гиббса:

-¿Г = £ Ш (5)

где у - межфазное натяжение, Г\ - поверхностный избыток адсорбирующегося иона,

Д - электрохимический потенциал иона В нашем случае на границе раздела

липидный монослой-водный раствор происходит химическое связывание только

двух типов ионов - И4" и ОН , поэтому мы можем переписать уравнение (5) в виде

-а7 = тн^н,+тон.сЩон. (б)

Считая, что электрический потенциал в объемной фазе не изменяется в

процессе адсорбции ионов Н+ и ОН , а также предполагая, что пришедшие к

поверхности ионы всегда участвуют в кислотно-основном равновесии с

соответствующей группой молекулы липида согласно уравнениям (2-4), мы можем

записать'

= С7)

где Г£>я=Г,ГгЛ" г^=^г<в«г> а Г^ + Гг„=5 и г4«/ + г4=5> где 5 - это поверхностная концентрация липида Таким образом, интегрируя уравнение (7) мы получим.

r = -SRTh

+ 1

+ 1

+ const

(8)

где Я - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура Констшггу интегрирования выберем из условия, что в изоэлектрической точке, когда ан* = > натяжение должно быть максимальным В результате мы получим

следующее выражение для натяжения липидного монослоя

y = y„„ + 2SRT In

- + 1

-БИТ 1п

(9)

Из данного уравнения следует теоретическая зависимость натяжения монослоя ДФФХ от рН водного раствора (см Рис 5, линия) Из нее следует, что адсорбция Н+ и ОН ионов, участвующих в кислотно-основной диссоциации полярных групп липида, хорошо описывает изменение натяжения монослоя вблизи рК, однако, не может описать уменьшение натяжения, происходящее при рН от 4 до 7

Известно, что у молекул ДФФХ холиновая группа, заряжаемая положительно, находится на самом краю полярной головки, а фосфатная группа, способная приобретать отрицательный заряд, находится ближе к углеводородному «хвосту» Однако при образовании контактирующей с водой мембраны из молекул этого липида (как и других фосфатидилхолинов) картина кардинально меняется в бислое минус (фосфатная группа) оказывается расположенным снаружи, а плюс (холино-группа) смещается в сторону углеводородных «хвостов», углубляясь внутрь мембраны за счет изменения конформащш полярной головки (Dill and Stigter, 1988) На свойства слоя молекул липида также может оказывать влияние специфическая адсорбция ионов, находящихся в растворе Недавно появилось большое количество работ, указывающих на значительную адсорбцию гидроксил-ионов на гидрофобных поверхностях (Beattie et al, 2005, Creux et al, 2007, Franks et al, 2005) Поэтому мы предположили, что, возможно, именно специфическая адсорбция ОН ионов на поверхности мембраны может внести изменения в натяжение монослоя и бислоя

В щелочной среде поверхность липидного бислоя заряжается отрицательно, благодаря диссоциации фосфатной группы, соответственно на рис 6 в интервале рН от 9 до 10 наблюдается падение натяжения При дальнейшем переходе в сторону нейтральной среды отрицательный заряд поверхности уменьшается, и натяжение растет согласно формуле (9), постепенно выходя на постоянное значение Но снижение отрицательного заряда может способствовать усилению адсорбции ОН -ионов вблизи холшювых групп ДФФХ благодаря сильному сродству этих ионов к гидрофобной фазе Такая неэлектростатическая, т е специфическая адсорбция, по-видимому, ведет к заряжению поверхности

мембраны и, как следствие, к наблюдаемому при уменьшении рН от 7,5 до 5,5 снижению натяжения (см Рис 5)

При дальнейшем уменьшении рН от 5,5 до 3,5 начинается постепешшй рост положительного заряда поверхности мембраны, обусловленный заряжением холино-групп, с одновременным падением концентрации ионов ОН в растворе, Оба этих фактора снижают специфическую адсорбцию гидроксил-ионов, что приводит к возврату (росту) значений натяжения на расчетную кривую Далее, при уменьшении рН ход кривой натяжения определяется ростом положительного заряда холино-группы и уже полностью соответствует уравнению (9)

С вышеописанной картиной согласуются и результаты измерения разности граничных потенциалов на мембранах, полученных по методу Мюллера-Рудина, при закислении раствора по одну сторону от них (см Рис. б) Рост граничного потенциала в области рН от 2 до 2,5 и от 10 до 11 соответствует сильному заряжению поверхности мембраны, отвечающему ионизации холиновой и фосфатной групп ДФФХ По аналогии со стандартными кривыми титрования, средняя часть участков резкого увеличения потенциала отвечает 50% ионизации соответствующих групп, т е. значению рК этих групп Соответствующие значения рК составляют 2,1 и 10,5, что полностью отвечает литературным данным (Матинян и Абидор, 1984) Необходимо отметить, что изменение потенциала при ионизации холиновой группы в пять раз меньше, чем при ионизации фосфатной Этот эффект может объясняться сильной экранировкой холиновой группы в молекуле ДФФХ

Что же касается области рН от 3,5 до 7,5, где наблюдалось значительное снижение натяжения липидного монослоя, то разность граничных потенциалов на мембране ведет себя в этой области следующим образом (см Рис 7)

Рисунок 6. Зависимость разности граничных потенциалов на мембране, от pH раствора эпектролита. Концентрация электролита (KCl) составляю 100 м\1.

Рисунок 7. Зависимость разности граничных потенциалов на мембране, сформированной из раствора ДФФХ в декане, от pH раствора электролита Концентрация электролита составляла: а) ЮОмМ KCl; б) 10 мМ KCl.

При падении концентрации ионов ОН в растворе их специфическая адсорбция и обусловленный ею отрицательный заряд поверхности уменьшаются, в результате чего на кривой изменения граничного потенциала возникает дополнительный перегиб, аналогичный по форме тем, которые отражают ионизацию фосфатной и холиновой групп ДФФХ, но только меньший по амплитуде Фактически, адсорбированные на мембране вблизи гидрофобных «хвостов» ионы ОН ведут себя как некая новая ионизующаяся группа Кроме того, как было показано в работе (Zhou and Raphael, 2007), для фосфатидилхолиновых мембран дипольный скачок потенциала изменяется на 6,5 мВ пропорционально рОН Таким образом, можно

предположить, что именно специфическая адсорбция гидроксил-ионов приводит к падению натяжения монослоя ДФФХ в диапазоне рН от 4 до 7

Из экспериментальных данных о зависимости электрической емкости БЛМ, не содержащих растворитель, от рН водного раствора мы можем рассчитать высоту спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому, происходившего в процессе формирования липидного бислоя (см Рис 8) Предположим, что верхняя граница частично «запрыгнувшего» монослоя является прямой Тогда площадь соответствующего сегмента отверстия, занятого этим монослоем, можно записать в виде 5

Я

. к .. к \2к к

-л-2 агссоэ,--и--),—--

\2Я 2Я

(10)

где Ь- высота поднятия, Я - радиус отверстия в перегородке Значения площади мы можем рассчитать, зная величину удельной емкости БЛМ

6

рН

Рисунок 8. Рассчитанная из величин электрической емкости БЛМ рН-зависшюсть высоты спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому, происходящего в прогрессе формирования мембраны.

Таким образом, обнаруженная нами зависимость высоты спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому является, по всей видимости, следствием изменения краевого угла смачивания перегородки водным раствором с монослоем липида от рН среды, а также начальной высотой поднятия кромки жидкости у гидрофобной перегородки

Исходя из полученных данных, мы можем рассчитать значения краевого угла смачивания на границе между липидными хвостами и натяжение липидного бислоя как функции от рН среды

Формирование БЛМ методом сведения монослоев определяется балансом трех сил Две из них равны по модулю натяжению липидного монослоя на поверхности воды, а третья соответствует натяжению бислоя Рассчитанная зависимость последнего от рН в этом случае будет иметь вид (см Рис 96)

рН рН

Рисунок 9. Рассчитанные по экспериментальным данным: а) рН-зависимость краевого угла смачивания (&) одного монослоя ДФФХ другим, б) Зависимость натяжения липидного бислоя от рН среды.

Полученные результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными по изменению натяжения БЛМ, сформированных по методу Мюллера-Рудина из раствора яичного фосфохолина, от рН водного раствора (Petelska and Figaszewski, 2000) Более высокие значения натяжения по сравнению с литературными данными являются следствием того, что наши мембраны не содержат растворитель и не имеют мениска с избытком липида

БЛМ, не содержащие растворитель, на отверстиях в амфпфобнзнрованных стеклянных перегородках.

Формирование мембран на отверстиях в покровных стеклах с амфифобной поверхностью. Очевидно, что, несмотря на простоту предложенной методики гидрофобизации стеклянных перегородок для получения БЛМ, не содержащих

растворитель, проводить некоторые исследования на мембранах, площадь которых зависит от рН, может быть достаточно проблематично Поэтому нам необходимо было создать покрытия с минимальной поверхностной энергией, чтобы краевой угол смачивания таких поверхностей был близок к 90 градусам В этом случае изменение межфазного натяжения ДФФХ от рН среды не оказывало бы столь значительного влияния на процесс формирования мембран, не содержащих растворитель Иными словами, кроме гидрофобных свойств покрытия должны обладать и липофобностью, т е быть амфифобными Эти свойства определяются концевыми группами «пришитых» к стеклу молекул Известно, что наименьшей поверхностной энергией обладает мономолекулярный слой CF3 (б мН/м в отличие от 18 мН/м для тефлона) Нами была разработана методика «пришивки» к поверхности стекла и последующей двумерной полимеризации молекул фгорсодержащего силоксана (3,3,3 трифторпропил-триметоксисилана) Краевой угол смачивания получепных образцов чистой водой достигал 110 градусов В присутствии монослоя ДФФХ, этот угол падал примерно до 85 градусов, но уже не зависел от рН На отверстиях в таких амфифобизированных стеклянных пластинках удалось получить устойчивые БЛМ, не содержащие растворитель, электрическая емкость которых не зависела от рН среды в диапазоне от 2,6 до 8,1, т е при любой кислотности мембраны полностью заполняли отверстия Удельная емкость полученных мембран составляла 0,86 мкФ/см2 ± 5% (как на гидрофобных перегородках) Кроме того, в отличие от гидрофобизированных поверхностей, образование мембраны в этом случае происходило не спонтанно, а контролируемо, при постепенном «накатывании» одного монослоя на другой, что позволило полностью «погрузить» мембрану под поверхность водного раствора

Измерение натяжения БЛМ, не содержащих растворитель Амфифобные поверхности позволили впервые непосредственно измерить натяжение БЛМ, не содержащих растворитель (Batishchev and Indenbom, 2008) Согласно уравнению Лапласа, перепад гидростатического давлешм по разные стороны мембраны обратно пропорционален ее радиусу кривизны с коэффициентом

пропорциональности, равным 2а, где а - это натяжение мембраны &Р = ^

Определить значение радиуса кривизны выдутой мембраны стандартными оптическими методами представляется достаточно затрудшггельным из-за малости размера мембраны и особенностей строения экспериментальной ячейки Поэтому его значите вычислялось из величины электрической емкости мембраны Процедура вычисления была следующей Площадь поверхности выдутой мембраны задается простым геометрическим соотношением

3 = 2кЩк-^2 ~г2) (11)

где г - это радиус отверстия, т котором была сформирована бислойная

липидная мембрана Предполагается, что мембрана может быть выдута только до

формы полусферы Так как наши БЛМ не содержат растворителя, мы будем

считать, что радиус отверстия соответствует радиусу плоской мембраны Тогда "ф

Площадь мембраны связана с ее электрической емкостью по следующей

С

формуле 5 = — лг2, где Со - это емкость плоской БЛМ Отсюда мы получаем, что электрическая емкость БЛМ будет иметь следующий вид

С = ^~т(2о-^4а2-г2(&Р)2) С0 (13)

г (АР)

Как было показано в экспериментах по измерению натяжения мембран, их электрическая емкость увеличивалась в полтора раза при перепаде гидростатического давления в 74±3 Па (смотри рисунок 10а) Столь значительное увеличение площади мембраны могло быть, по-видимому, обусловлено наличием избытка липида в области границы бислоя Экспериментальные данные экстраполировались полиномом второй степени, и емкость плоской мембраны определялась по минимуму кривой Она составила 69 пФ Это значение отличается от начальной емкости мембраны (66 пФ) менее чем на 5%, поэтому можно считать,

что изначально мембрана была плоской Используя уравнение (13) и значение С0> мы можем оценить натяжение мембран

Рисунок 10 а) Зависгшость электрической емкости БЛМ от перепада гидростатического давления, б) Зависимость перепада гидростатического давления от обратного радиуса кривизны выдутой БЛМ Диаметр отверстия составлял 100 мш. pH = 5,8.

По линейной экстраполяции эксперимегггальных данных, приведенных на рисунке 106, натяжение мембраны было оценено как с = 4,3 ± 0,4 мН/м Это значение выше, чем для БЛМ, содержащих растворитель (3,4 мН/м) (Coster and Simons, 1968), и практически совпадает с величиной, рассчитанной для такого же значения pH по результатам совершенно других измерений (см Рис 96)

Измерение линейного натяжения кромки пор в БЛМ, не содержащих растворитель. Важным параметром, характеризующим свойства БЛМ, является величина линейного натяжения кромки пор, образующихся при электропорации мембран Изменение свободной энергии липидной мембраны при образовании в ней сквозной поры радиусом г определяется по формуле (Чизмаджев и др , 1982)

&Е=2пгГ-ж'а-т-гСу„^-1у^- (14)

где о - это поверхностное натяжение мембраны, у - линейное натяжение кромки поры, Суд - удельная емкость мембраны, Ев - диэлектрическая проницаемость воды, Ем - диэлектрическая проницаемость мембраны, U - величина

приложенной к мембране разности потенциалов Величина энергетического барьера, соответствующего критическому радиусу поры, определяется по формуле

Е---Г~—V/7 <15)

Таким образом, мембрана рассматривается как метастабильная система, разрушение которой происходит за счет роста дефектов - гидрофильных пор Выражение для среднего времени жизни БЛМ имеет вид (Чизмаджев и др , 1982)

а ту-

^ADrJa + cJ^-lK

лу

кТ\о + С„„

(16)

где Со - средняя концентрация дефектов на единицу площади мембраны, А -площадь БЛМ Аппроксимируя экспериментальные данные (см Рис 11) уравнением (16), мы определили величину линейного натяжения кромки пор в БЛМ, не содержанок растворитель, составляющую 11,8 ± 0,2 пН Это значение практически совпадает с литературными данными о линейном натяжешш кромки поры в липосомах (Evans et al, 2003), и несколько выше значений, полученных для мембран с растворителем (Чизмаджев и др , 1982)

а . б

0,4

m 0,2 =Г

0,0

I, С

1, с

0,15 0,20 0,25 0,30

U, В

Рисунок 11 а) Характерный вид зависимости токового отклика (сверху) БЛМ, не содержащей растворитель, на приложенную ступеньку напряжения (снизу), б) Зависимость среднего времени жизни мембраны от величины приложенного напряжения. Каждая точка отвечает усредненному по 10 экспериментам значению среднего времени жизни БЛМ. Сплошная линия соответствует аппроксимации экспериментальных данных уравнением (16)

выводы

1. Были разработаны методики химической модификации поверхностей стеклянных пластинок, позволившие получить на отверстиях в них устойчивые БЛМ, не содержащие растворитель Бислойная природа таких мембран была доказана по росту проводимости в присутствии нистатина и грамицидина

2 Удельная электрическая емкость таких мембран составила 0,86 мкФ/см2±5% -выше, чем у мембран, полученных классическим методом Монтала (0,8 мкФ/см2)

3 Было обнаружено изменение натяжения монослоя ДФФХ на границе вода-воздух в изоэлектрической области в зависимости от рН среды, зафиксированный по изменению краевых углов смачивания и электрической емкости мембран

4 Предположено, что этот эффект обусловлен специфической адсорбцией OI Г-ионов Это подтверждается измерениями разности граничных потенциалов

5 Разработан метод расчета зависимости натяжения БЛМ от рН Полученные результаты хорошо согласуются с прямыми экспериментальными измерениями

6 С помощью методики создания амфифобных покрытий с низкой поверхностной энергией впервые было измерено латеральное натяжение БЛМ, не содержащих растворитель, а также исследован процесс электрического пробоя таких мембран, позволивший оценить величину их линейного натяжения

7 Измерения показали, что как латеральное натяжение полученных мембран (4,3 ± 0,4 мН/м), так и линейное натяжение кромок пор в этих мембранах (11,8 пН ± 0,2 пН) выше, чем в классических БЛМ, содержащих растворитель

Список публикаций.

1 Батшцев О В , Инденбом А В Формирование бислойных липидных мембран на отверстиях в гидрофобизированных стеклах // Биол мембраны - 2004 - Т 21 -С 415-419

2 Батшцев О В , Инденбом А В Влияние рН на формирование липидных бислоев, не содержащих растворитель//Электрохимия - 2006. - Т. 42 -№10 - С. 1230-1236

3 Batishchev О V, Indenbom А V. Alkylated glass partition allows formation of solventfree lipid bilayer by Montal-Mueller technique// Bioelectrochemistry - 2008 -doi 10 1016/] bioelechem 2008 02 002

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д 37А Тираж 100 экз. 2008 год.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Строение и функции биологических мембран.

Глава 2. Компоненты мембранного потенциала.

Глава 3. Модельные мембраны.

ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Получение гидрофобных покрытий.

Получение амфифобных покрытий.

Измерение краевых углов смачивания.

Формирование мембран.

Получение изотерм сжатия монослоя ДФФХ.

Измерение разности граничных потенциалов на мембране.

ЧАСТЬ Ш. БЛМ НА ОТВЕРСТИЯХ В ГИДРОФОБИЗИРОВАННЫХ СТЕКЛЯННЫХ ПЕРЕГОРОДКАХ.

Глава 1. Исследование гидрофобизированных поверхностей.

Глава 2. Формирование БЛМ, не содержащих растворитель.

Глава 3. Зависимость межфазного натяжения монослоя ДФФХ от рН среды.

ЧАСТЬ IV. БЛМ, НЕ СОДЕРЖАЩИЕ РАСТВОРИТЕЛЬ, НА ОТВЕРСТИЯХ В АМФИФОБИЗИРОВАННЫХ СТЕКЛЯННЫХ ПЕРЕГОРОДКАХ.

Глава 1. Формирование мембран на отверстиях в покровных стеклах с амфифобной поверхностью.

Глава 2. Измерение натяжения БЛМ; не содержащих растворитель.

Глава 3. Измерение линейного натяжения кромки пор в БЛМ, не содержащих растворитель, образующихся при электропорации.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) являются давно известной удобной системой для моделирования клеточных мембран. Они позволяют изучать их электрохимические свойства, такие как распределение электрического потенциала, адсорбция ионов, строение двойного электрического слоя, влияние внешних электрических полей, ионный транспорт, а также процессы слияния, деления и т.п. [1].

Все известные на сегодняшний день методы получения БЛМ сводятся к двум основным: первый — нанесение на отверстие в тефлоновой перегородке капельки раствора липида в. неполярном органическом растворителе (метод Мюллера — Рудина) [2], второй - сведение двух монослоев на отверстии в перегородке, разделяющей две полуячейки (метод Монтала) [3, 4]. Однако, как было показано ранее, оба эти метода имеют один значительный недостаток -наличие микролинз растворителя в центральной гидрофобной области мембраны [3, 5, 6] и избытка раствора липида в окаймляющем мембрану мениске [5]. Присутствие растворителя в мениске приводит к неконтролируемому значению натяжения мембран, что затрудняет изучение ее механических параметров и может препятствовать встраиванию в них многих трансмембранных белков [7]. Расстояния, с которых начинается монослойное слияние мембран, качественно коррелирует с размерами микролинз растворителя [8], т.е. может инициироваться при встрече таких микролинз, принадлежащих контактирующим бислоям [9], что не может реализовываться на биологических мембранах. Все это послужило причиной поиска возможных путей минимизации количества растворителя в. БЛМ. Существует целый ряд работ, в которых описаны различные модификации методик формирования мембран, подразумевающие использование высокомолекулярных растворителей, почти не образующих микролинз, [10], вымораживание растворителя из мениска [11] или изменение экспериментальной системы [12]. Однако каждая из этих модификаций вносит свои ограничения в применимость данной модельной системы. Таким образом, получить удобную модель плоской липидной мембраны, не содержащей растворитель ни в мениске, ни в самом бислое, так и не удалось.

Недавно для формирования мембран было предложено использовать гидрофобизированные неорганические материалы (стекло или кремний) вместо полимеров [13], так как поверхностные свойства полимерных пленок (тефлон, полиэтилен и т.п.) характеризуются большой нестабильностью, в отличие от твердой поверхности неорганических материалов. Это направление показалось нам достаточно перспективным, так как химическая модификация поверхности стекла или кремния различными агентами открывает практически неограниченные возможности изменения ее свойств, при этом не влияя на свойства бислоя. Определенная модификация могла позволить взять на себя часть функций растворителя, чтобы получить бислойные липидные мембраны, не содержащие посторонних углеводородов.

Очевидно, что БЛМ, не содержащие растворитель, будут менее устойчивыми, чем обычные искусственные мембраны. Поэтому для наших экспериментов мы решили использовать в качестве базового липида дифитаноилфосфатидилхолин, т.к. из литературных данных известно, что он имеет рКа 2,1 и 10,5, т.е. остается нейтральным в широком диапазоне рН [14], а также не совершает фазового перехода в диапазоне температур от -120°С до +80°С [15]. Кроме того, известно, что основной частью мембранных липидов являются именно фосфатидилхолины [16].

Целью настоящей работы являлось получение и исследование свойств бислойных липидных мембран, не содержащих растворитель. Конкретные задачи состояли в следующем:

1) разработать методы химической модификации поверхностей материалов для последующего формирования на отверстиях в них БЛМ, не содержащих растворитель;

2) изучить, влияние состава раствора электролита на процесс формирования мембран;

3) разработать методику формирования мембран, не содержащих растворитель, на отверстиях в материалах с модифицированной поверхностью;

4) определить электрические (удельные емкость и проводимость) „ и механические (латеральное и линейное натяжение) параметры БЛМ, не содержащих растворитель, и сопоставить их со свойствами классических БЛМ.

Работа состоит из введения, четырех основных частей и выводов. Часть I содержит обзор литературы. В Части II рассматриваются экспериментальные методики, использованные в данной работе. Часть III посвящена исследованию процесса формирования бислойных липидных мембран, не содержащих растворитель, на отверстиях в гидрофобизированных стеклянных пластинках и изучению свойств полученных мембран. В Части IV рассматривается образование БЛМ на отверстиях в амфифобизированных стеклах, даются характеристики механическим параметрам полученного липидного бислоя.

Часть I. Обзор литературы

Выводы.

1. Были разработаны методики химической модификации поверхностей стеклянных пластинок, позволившие получить на отверстиях в них устойчивые БЛМ, не содержащие растворитель. Бислойная природа таких мембран была доказана по росту проводимости в присутствии нистатина и грамицидина.

2. Удельная электрическая емкость полученных мембран составила 0,86 мкФ/см ±5% - выше, чем у мембран, сформированных классическим методом Монтала (0,8 мкФ/см2).

3.Было обнаружено изменение натяжения монослоя ДФФХ на границе вода-воздух в изоэлектрической области в зависимости от рН среды, зафиксированное по изменению краевых углов смачивания и электрической емкости мембран.

4. Предположено, что данный эффект обусловлен специфической адсорбцией гидроксил-ионов. Это подтверждается измерениями разности граничных потенциалов.

5. Разработан метод расчета зависимости натяжения БЛМ от рН. Полученные результаты хорошо согласуются с прямыми экспериментальными измерениями.

6. С помощью методики создания амфифобных покрытий с низкой поверхностной энергией впервые было измерено латеральное натяжение БЛМ, не содержащих растворитель, а также исследован процесс электрического пробоя таких мембран, позволивший оценить величину их линейного натяжения.

7. Измерения показали, что как латеральное натяжение полученных мембран (4,3 ± 0,4 мН/м), так и линейное натяжение кромок пор в этих мембранах (11,8 пН ± 0,2 пН) выше, чем в классических БЛМ, содержащих растворитель.

1. Tien Н. Т. Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice. New York: Marcel Dekker Inc. - 1974. - 655 p.

2. Mueller P., Rudin D. O., Tien H. Ti., Wescott W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.// Nature 1962. - V. 194. - P. 979-80.

3. Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. A new method for the formation of bilayer membranes in aqueous solution.// Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ.-1965.-V. 13.-P. 107-110.

4. Montal M., Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1972. - V. 69. - P. 3561-3566.

5. Gennis R. В., Jonas A. Protein-Lipid Interactions.// Ann. Rev. Biophys. Bioen. 1977. -V. 6.-P. 195-238.

6. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. Динамическая структура липидного бислоя. Москва: Наука. - 1981. - 296 с.

7. Berestovsky G. N., Gyulkhandanyan М. Z. Contact interaction of bilayer lipid membranes.// Stud. Biophys. 1976. - V. 56. - P. 19-20.

8. White S. H. Formation of "solvent-free" black lipid bilayer membranes from glycerylmonooleate dispersed in squalene.// Biophys. J. 1978. - V. 23. - P. 337-347.i о

9. White S. H. Temperature dependent structural changes in planar bilayer membranes: "Solvent freeze-out".// Biochim. Biophys. Acta 1974. - V. 356.-P. 8-17.

10. Vodyanoy V., Murphy R. B. Solvent-free lipid bimolecular membranes of large surface area.//Biochim. Biophys. Acta 1982. -V. 687. -P. 189-194.

11. Pantoja R., Sigg D., Blunck R., Bezanilla F., Heath J. R. Bilayer reconstitution of voltage-dependent ion channels using microfabricated silicon chip.// Biophys. J. -2001. -V. 81. P. 2389-2394.

12. Davenport J. B. Physical chemistry of lipids.// Biochemistry and methodology of lipids. / Ed. Johnson A. R., Davenport J. B. New York: Wiley-Interscience - 1971. - P. 47-83.

13. Silvius J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modification by membrane proteins.// Lipid-Protein Interactions. / Ed. Jost P. C., Griffith О. H. New York: John Wiley and Sons - 1982. - V. 2. - P. 239-281.

14. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. Липидный бислой биологических мембран. Москва: Наука - 1982. - 224 с.

15. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts К., Watson J. D. Molecular biology of the cell. 3rd edition. New York: Garland Publishing, Inc. - 1994. - P. 477-506.

16. Gorter E., Grendel F. On biomolecular layers of lipids on the chromocytes of the blood.// J. Exp. Med. 1925. -V. 41. -P. 439-443.

17. Danielli J.F., Davson H. A contribution to the theory of permeability of thin films.// J. Cell. Сотр. Physiol. 1935. - V. 5. - P. 495-508.

18. Singer S. J., Nicolson G. J. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.// Science 1972. -V. 175. - P. 720-731.

19. Mouritsen O. G., Jorgensen K. Dynamical order and disorder in lipid bilayers.// Chem. Phys. Lipids 1994. - V. 73. - P. 3-25.

20. Welti R., Glaser M. Lipid domains in model and biological membranes.// Chem. Phys. Lipids 1994. -V. 73. - P. 121-137.

21. Luna E. J., Hitt A. L. Cytoskeleton plasma membrane interactions.// Science - 1992. - V. 258. - P. 955-964.

22. Jacobson K., Sheets E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes.// Science 1995. - V. 268. - P. 1441-1442.

23. Sackmann E. Biological membranes. Architecture and function.// Structure and dynamics of membranes. From cells to vesicles. / Ed. Lipowsky R., Sackmann E. Amsterdam: Elsevier - 1995. - P. 1-63.

24. Devaux P. F., Seigneuret M. Specificity of lipid-protein interactions as determined by spectroscopic techniques.// Biochim. Biophys. Acta — 1985 -V. 822-P. 63-125.

25. Singer S. J. The molecular organization of biological membranes.// Structure and function of biological membranes. / Ed. Rothfield L. I. New York: Academic Press - 1971. - P. 145-222.

26. Branton D., Deamer D. W. Membrane structure. Berlin - New York: Springer-Verlag - 1972.

27. Trauble H., Overath P. The structure of Escherichia coli membranes studied by fluorescence measurements of lipid phase transition.// Biochim. Biophys. Acta- 1973. -V. 307. P. 491-512.

28. Bretscher M. S. Membrane structure: Some general principles.// Science -1973.-V.181.-P. 622-629.

29. McLaughlin A. C., Cullis P. R., Hemminga M. A., Hould G. I., Radda G. K., Ritchie G. A., Seeley P. J., Richards R.E. Application of 31P NMR to model and biological membrane systems.// FEBS Lett. 1975. - V. 57. - P. 213218.

30. White D. A. The phospholipids composition of mammalian tissue.// Form and Function of Phospholipids / Ed. Ansell G. В., Hawthorne J. N., Dawson R. M. C. Amsterdam: Elsevier - 1973. - P. 441-482.

31. McLaughlin S. Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces.// Curr. Top. membr. Transp. 1977. - V. 9. - P. 71-144.

32. Ohki S. Evidence for a new cocept of membrane potential.// J. Theor. Biol. -1973.-V. 42.-P. 593-596.

33. Flewelling R. F., Hubbel W. L. The membrane dipole potential in a total membrane potential model. Applications to hydrophobic ion interactions with membrane.// Biophys. J. 1986. - V. 49. - P. 541-552.

34. Seelig J., Macdonald P. M., Scherer P. G. Phospholipid head groups as sensors of electric charge in membranes.// Biochemistry 1987. - V. 26. — P. 7535-7541.

35. Gouy M. Sur la constitution de la charge electrique a la surface d'un electrolyte.// J. Phys. (Paris) 1910. - V. 9. - P. 457-468.

36. Chapman D. L. A contribution to the theory of electrocapillarity.// Philos. Mag. 1913. -V. 25. - P. 475-481.

37. Stern O. The theory of the electrolytic double-layer.// Z. Elektrochem. -1924.-V. 30.-P. 508-516.

38. McLaughlin S. G. A., Szabo G., Eisenman G. Divalent ions and the surface potential of charged phospholipid membranes.// J. Gen. Physiol. 1971. - V. 58.-P. 667-687.

39. Lee A. G. Lipid phase transitions and phase diagrams. I. Lipid phase transitions.// Biochim. Biophys. Acta 1977. - V. 472. - P. 237-281.

40. Eisenberg M., Gresalfi Т., Riccio Т., McLaughlin S. Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids.// Biochemistry 1979. -V. 18. - P. 5213-5223.

41. Marrink S.-J., Berendsen H. J. C. Simulation of water transport through a lipid membrane.// J. Phys. Chem. 1994. - V. 98. - P. 4155-4168.

42. Essmann U., Perera L., Berkowitz M. L. The origin of the hydration interaction of lipid bilayers from MD simulation ofdipalmitoylphosphatidylcholine membranes in gel and liquid crystalline phases.// Langmuir 1995. - V. 11. - P. 4519-4531.

43. Moncelli M. R., Becucci L., Guidelli R. The intrinsic pKa values for phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylserine in monolayers deposited on mercury electrodes.// Biophys J. 1994. — V. 66. — P. 1969-1980.

44. Матинян H. С., Абидор И. Г. Протонное равновесие на бислойных липидных мембранах.// Биофизика 1984. - Т. 28. - № 5. - С. 12261229.

45. Aguilella V. М., Mafe S., Manzanares J. A. Double layer potential and degree of dissociation in charged lipid monolayers.// Chem. Phys. Lipids -2000. V. 105. - P. 225-229.

46. Clarke R. J. The dipole potential of phospholipid membranes and methods for its detection.// Adv. Colloid Interface Sci. 2001. - V. 89-90. - P. 263281.

47. Franklin J. C., Cafiso D. S. Internal electrostatic potentials in bilayers: measuring andcontrolling dipole potentials in lipid vesicles.// Biophys. J.1993.-V. 65.-P. 289-299.

48. Pickar A. D., Benz R. Transport of oppositely charged lipophilic probe ions in lipid bilayer membranes having various structures.// J. Membr. Biol. -1978.-Y. 44.-P. 353-376.

49. Brockman H. Dipole potential of lipid membranes.// Chem. Phys. Lipids1994.-V. 73.-P. 57-79.

50. Gawrisch K., Ruston D., Zimmerberg J., Parsegian V. A., Rand R. P., Fuller N. Membrane dipole potentials, hydration forces, and the ordering-of water at membrane surfaces.// Biophys. J. 1992. - V. 61. - P. 1213-1223.

51. Vogel V., Mobius D. Local surface potentials and electric dipole moments " of lipid monolayers: contributions of the water/lipid and the lipid/airinterfaces.// J. Colloid Interface Sci. 1988. - V. 126. - P. 408-420.

52. Stigter D., Dill K. A. Lateral interactions among phospholipid head groups at the heptane/water interface// Langmuir 1988. - V. 4. - P. 200-209.

53. Taylor J. A. G., Mingins J., Pethica B. A. Phospholipid monolayers at the n-heptane/water interface. Part 2. Dilute monolayers of saturated 1,2-diacyl lecithins and cephalins.// J. Chem. Soc., Faraday Trans. I 1976. - V. 72. -P. 2694-2702.

54. Dill K. A., Stigter D. Lateral Interactions among Phosphatidylcholine and Phosphatidylethanolamine Head Groups in Phospholipid Monolayers and Bilayers.// Bichemistry 1988. - V. 27. - P. 3446-3453.

55. Stern H. A., Feller S. E. Calculation of the dielectric permittivity profile for a nonuniform system: application to a lipid bilayer simulation.// J. Chem. Phys.-2003.-V. 118-P. 3401-3412.

56. Cevc G. Membrane electrostatics.// Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. -1031-3.-P. 311-382.

57. White J. M. Membrane fusion.// Science 1992. - V. 258. - P. 917-924.

58. Lucy J. A. The fusion of biological membranes.// Nature 1970. - V. 227. -№4037.-P. 814-817.

59. Chernomordik L., Kozlov M. M., Zimmerberg J. Lipids in Biological membrane fusion.// J. Membrane Biol. 1995. - V. 146. - P. 1-14.

60. Honig В. H. Elecrtostatic interactions in membranes and proteins.// Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1986. -V. 15. - P. 163-193.t

61. Thuren Т., Tulkki A.-P., Virtanen J. A., Kinnunen P. K. J. Triggering the activity of phospholipase A2 by an electric field.// Biochemistry 1987. V. 26.-P. 4907-4910.

62. Jones M. N., Chapman D. Micelles, Monolayers and Biomembranes. New York: Wiley-Liss, Inc. - 1995. - 252 p.

63. Petty M. C. Langmuir-Blodgett films: an introduction. — Cambridge: University Press 1996. - 234 p.

64. Mohwald H. Phospholipid monolayers.// Structure and dynamics of membranes. From cells to vesicles. / Ed. Lipowsky R., Sackmann E. -Amsterdam: Elsevier 1995. - P. 161-211.

65. Cseh R., Benz R. The adsorption of phloretin to lipid monolayers and bilayers cannot be explained by Langmuir adsorption isotherms alone.// Biophys. J. 1998. -V. 74. - P. 1399-1408.

66. Smaby J. M., Brockman H. L. Surface dipole moments of lipids at the argon water interface.// Biophys. J. - 1990. - V. 58. - P. 195-204.

67. Tamm L. K., McConnell H. M. Supported phospholipid bilayers.// Biophys. J. 1985.-V. 47.-P. 105-113.

68. Benz M., Gutsmann Т., Chen N., Tadmor R., Israelachvili J. Correlation of AFM and SFA measurements concerning the stability of supported lipid bilayers.// Biophys. J. 2004. - V. 86. - P. 870-879.

69. Keller C. A., Glasmastar K., Zhdanov V. P., Kasemo, B. Formation of supported membranes from vesicles.// Phys. Rev. Lett. 2000. - V. 84. - P. 5443-5446.

70. Reimhult E., Hook F., Kasemo B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrarie formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.// Langmuir -2003.-V. 19.-P. 1681-1691.

71. Gu L., Wang L., Xun J., Ottova-Leitmannova A., Tien H. T. A new method for the determination of electrical properties of supported bilayer lipidmembranes by cyclic voltammetry.// Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. - V. 39.-P. 275-283.

72. Lindholm-Sethson B. Electrochemistry at ultrathin organic films at planar gold electrodes.// Langmuir 1996. -V. 12. - P. 3305-3314.

73. Haas H., Lamura G., Gliozzi A. Improvement of the quality of self assembled bilayer lipid membranes by using a negative potential.// Bioelectrochemistry 2001. - V. 54. - P. 1-10.

74. Wiegand G., Arribas-Layton N., Hillebrandt H., Sackmann E., Wagner P. Electrical properties of supported lipid bilayer membranes.// J. Phys. Chem. В 2002. - V. 106. - P. 4245-4254.

75. Cornell B. A., Braach-Maksvytis V. L. В., King L. G., Osman P. D. J., Raguse В., Wieczorek L., Pace R. J. A biosensor that uses ion-channel switches.//Nature 1997. -V. 387. - P. 580-583.

76. Ivnitski D., Wilkins E., Tien H. Т., Ottova A. Electrochemical biosensor based on supported planar lipid bilayers for fast detection of pathogenic bacteria.// Electrochem. Commun. 2000. - V. 2. - P. 457-460.

77. Passechnik V. I., Hianik Т., Ivanov, S. A., Sivak B. Specific capacitance of metal-supported lipid membranes.// Electroanalysis 1998. V. 10. - P. 295302.

78. Osborn T. D., Yager P. Modeling success and failure of Langmuir-Blodgett transfer of phospholipid bilayers to silicon dioxide.// Biophys. J. 1995. - V. 68.-P. 1364-1373.t

79. Starr Т. E., Thompson N. L. Formation and characterization of planar phospholipid bilayers supported on TiCb and SrTi03 single crystals.// Langmuir 2000. — V. 16.-P. 10301-10308.

80. Salafsky J., Groves J. Т., Boxer S. G. Architecture and function of membrane proteins in planar supported bilayers: a study with photosynthetic reaction centers.// Biochemistry 1996. - V. 35. - P. 14773-14781.

81. Guidelli R., Aloisi G., Becucci L., Dolfi A., Moncelli M. R., Tadini Buoninsegni F. Bioelectrochemistry at metal | water interfaces.// J. Electroanal. Chem. 2001. - V. 504. - P. 1-28.

82. Raguse В., Braach-Maksvytis V., Cornell B. A., King L. G., Osman P. D. J., Pace R. J., Wieczorek L. Tethered lipid bilayer membranes: formation and ionic reservoir characterization.// Langmuir 1998. - V. 14. - P. 648-659.

83. Neher E., Sakmann B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.// Nature 1976. - V. 260. - P. 799-802.

84. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann В., Sigworth F. J., Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.// Pflugers Arch. 1981. - V. 391. - P. 85-100.

85. Suarez-Isla B. A., Wan K., Lindstrom J., Montal M. Single-channel recordings from purified acetylcholine receptors reconstituted in bilayers formed at the tip of patch pipets.// Biochemistry 1983. - V. 22. - P. 23192323.

86. Coronado R., Latorre R. Phospholipid bilayers made from monolayers on patch-clamp pipettes.// Biophys. J. 1983. - V. 43. - P. 231-236.

87. Hanke W., Methfessel C., Wilmsen U., Boheim G. Ion channel reconstitution into lipid bilayer membranes on glass patch pipettes.// Bioelectrochem. Bioenerg. 1984. -V. 12. - P. 329-339.

88. Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.// J. Mol. Biol. 1965. - V. 13. -P. 238-252.

89. Kagawa Y., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorilation. Reconstruction of vesicles catalyzing "P-adenosinetriphosphate exchange.// J. Biol. Chem. 1971. - V. 246. - P. 5477-5487.

90. Hinkle P. C., Kim J. J., Racker E. Ion transport and respiratory control in vesicles formed from cytochrome oxidase and phospholipids.// J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 1338-1339.

91. Martonosi A. Sarcoplasmic reticulum. Solubilization of microsomal adenosinetriphosphatase.// J. Biol. Chem. 1968. — V. 243. - P. 71-81.

92. Radler J. O., Koltover I., Salditt Т., Safmya C. R. Structure of DNA -cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes in distinct interhelical packing regimes.// Science 1997. - V. 275.-P. 810-814.

93. Меликян Г. Б., Черномордик JI. В., Абидор И. Г., Чайлахян Л. М., Чизмаджев Ю. А.// Докл. АН СССР 1983. - Т. 269. - С. 1221-1225.

94. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.// J. Physiol. 1952. -V. 117.-P. 500-544.

95. Mueller P., Rudin D. O. Action potential phenomena in experimental bimolecular lipid membranes.// Nature 1967. - V. 213. - P. 603-604.

96. Mueller P., Rudin D. O. Development of potassium sodium discrimination in experimental bimolecular lipid membranes by macrocyclic antibiotics.// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1967. -V. 26. - P. 398-404.

97. Mueller P., Rudin D. O. Action potentials induced in biomolecular lipid membranes.//Nature 1968. -V. 217. - P. 713-719.

98. Henn F. A., Thompson Т. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: compositional studies.// J. Mol. Biol. 1968. -V.31.-P. 227-235.

99. Andrews D. M., Hay don D. A. Electron microscope studies of lipid bilayer membranes.// J. Mol. Biol. 1968. -V. 32. - P. 149-150.

100. Pagano R. E., Ruysschaert J. M., Miller I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.// J. Membr. Biol. 1972. -V. 10.-P. 11-30.

101. White S. H., Thompson Т. E. Capacitance, area, and thickness variation in thin lipid films.// Biochim. Biophys. Acta 1973. - V. 323. - P. 7-22.

102. Benz R., Frohlich O., Lauger P, Montal M: Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.// Biochim. et Biophys. Acta-1975. V. 394. - P. 323-334.

103. Montal M. Asymmetric lipid bilayers. Response to multivalent ions.// Biochim. Biophys. Acta 1973. - V. 298. - P. 750-754.

104. Montal M., Korenbrot J. I. Incorporation of rhodopsin proteolipid in bilayer membranes.// Nature (London) 1973. - V. 246. - P. 219-221.

105. Bargeman D. Contact angles on nonpolar solids.// J. Colloid Interface Sci. -1972. V. 40.-P. 344-348.

106. Jaklevic J. M., Garner H. R., Miller G. A. Instrumentation for the genome project.// Annu Rev Biomed Eng. 1999. - V. 1. - P. 649-678.

107. Voldman J, Gray M. L., Schmidt M. A. Microfabrication in biology and medicine.// Annu Rev Biomed Eng. 1999. - V. 1. P. 40M25.

108. Pantoja R., Sigg D., Blunck R., Bezanilla F., Heath J. R. Bilayer reconstitution of voltage-dependent ion channels using microfabricated silicon chip.//Biophys. J. 2001. - V. 81. - P. 2389-2394.

109. Arkles B. Tailoring Surfaces with Silanes.// Chemtech 1977. - V. 7. - P. 766-778.

110. Nakajima A., Hashimoto K., Watanabe T. Recent studies on super-hydrophobic films.// Chemical Monthly 2001. - V. 132. - P. 31-41.

111. Батищев О. В., Инденбом А. В. Формирование бислойных липидных мембран на отверстиях в гидрофобизированных стеклах.// Биологические мембраны 2004. - Т. 21. - № 5. - С. 415-419.

112. Batishchev О. V., Indenbom А. V. Alkylated glass partition allows formation of solvent-free lipid bilayer by Montal-Mueller technique.// Bioelectrochemistry — 2008. doi:10.1016/j.bioelechem.2008.02.002

113. Абидор И. Г., Айтьян С. X., Черномордик Л.В., Черный В. В., Чизмаджев Ю. А. Определение внутримембранного падения потенциала с помощью потенциолдинамического метода.// Докл. Акад. наук СССР 1980. - Т. 245. - С. 977-981.

114. Соколов B.C., Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока.// Биофизика 1980. - Т. 25. - С. 170-172.

115. Батищев О. В., Инденбом А. В. Влияние рН на формирование липидных бислоев, не содержащих растворитель.// Электрохимии -2006 Т. 42. -№10. - С. 1230-1236.

116. Marty A., Finkelstein A. Pores formed in lipid bilayer membranes by Nystatin.//J. Gen. Physiol. 1975. -V. 65. - P. 515-526.

117. Kleinberg M. E., Finkelstein A. Single-length and double-length channels formed by nystatin in lipid bilayer membranes.// J. Membr. Biol. 1984. -V. 80.-P. 257-269.

118. Caffier G, Shvinka N. E. Effects of channel-forming antibiotics on the membrane of skeletal muscle fibre.// Biomed. Biochim. Acta 1989. - V. 48.-P. 552-557.

119. Ландау, Л. Д. Теоретическая физика: учеб. пособие для ун-тов : в 10 т. / Л. Д. Ландау, Е. М. Лифпшц. Изд. 3-е, перераб. - Москва : Наука, 1986. - Т.6: Гидродинамика. - 1986.

120. Beattie J. К., Djerdjev А. М., Franks G. V., Warr G. G. Dipolar Anions are not Preferentially Attracted to the Oil/Water Interface.// J. Phys. Chem. B. Lett.-2005.-V. 109.-P. 15675-15676.

121. Creux P., Lachaise J., Graciaa A., Beattie J. K. Specific Cation Effects at the Hydroxide-Charged Air/Water Interface.// J. Phys. Chem. С 2007. - V. 111.-P. 3753-3755.

122. Franks G. V., Djerdjev A. M., Beattie J. K. Absence of Specific Cation or Anion Effects at Low Salt Concentrations on the Charge at the Oil/Water Interface.// Langmuir 2005. - V. 21. - P. 8670-8674.

123. Zhou Y., Raphael R. M. Solution pH Alters Mechanical and Electrical Properties of Phosphatidylcholine Membranes: Relation between Interfacial Electrostatics, Intramembrane Potential, and Bending Elasticity.// Biophys. J. 2007. - V. 92. - P. 2451-2462.

124. Brzozowska I., Figaszewski Z. A. The influence of pH on phosphatidylcholine monolayer at the air/aqueous solution interface.// Colloids and Surf. B. 2003. - V. 27. - P. 303-309.

125. Petelska A. D., Figaszewski Z. A. Effect of pH on the interfacial tension of lipid bilayer membranes.// Biophys. J. 2000. - V. 78. - P. 812-817.

126. Coster H. G. L., Simons R. Energy of formation of bimolecular lipid membranes. Biochem. Biophys. Acta 1968. -V. 163. - P. 234-239.

127. Чизмаджев Ю. А., Черномордик Л. В., Пастушенко В. Ф., Абидор И. Г. Электрические пробой бислойных липидных мембран.// Биофизика мембран, Т.2. Ионные каналы и их модели. / Итоги науки и техн., ВИНИТИ, АН СССР, Москва, 1982.

128. Абидор И. Г., Аракелян В. Б., Пастушенко В. Ф., Тарасевич М. Р., Черномор дик Л. В., Чизмаджев Ю. А. Электрический пробой бислойных липидных мембран.// Докл. Акад. наук СССР 1978. - Т. 240 - №3. - С.733-736.