Блеомициновые производные олигонуклеотидов: синтез и эффективное сайт-специфическое расщепление ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

%

российская академия наук

сибирское отделение новосибирский институт биоорганической химии

РГБ ОД

_ ,., На правах рукописи

/. и />Е!{ 10П/. УДК 577.113.4 + 615.779.9

СЕРГЕЕВ ДМИТРИЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

ВЛЕОМИЦИНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ: Синтез и эффективное сайт-специфическое расщепление ДНК

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель: д. х. н. Зарытова В.Ф.

к. х. н. Годовикова Т. С.

Официальные оппоненты: д. б. н. Загребельный С.Н.

к. х. н. Халимская Л.М.

Ведущая организация: МГУ, институт физико-химической

биологии им. А.Н.Белозерского

Защита состоится " /3 " 1994~г. в часов на

заседании совета К 003.52.0!7 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАК.

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций к. х. н.

^"У^^Федорова О.С.

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии, биотехнологии и медицины является осуществление эффективного анпгсмыслового и ген-направленного воздействия с помощью реакционноспособных производных олиго-нуклеотидов. Несмотря на то, что к настоящему моменту существует широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группировки, группировки окислительно-восстановительного механизма действия, поиск более эффективных реакционноспособных группировок для деструкции нуклеиновых кислот, особенно способных каталитически расщеплять ДНК, продолжается. В этой связи представляется перспективным использование в качестве активней группировки гликопептидного антибиотика блеомицина, способного вызывать одно- и двуцепочечные разрывы ДНК с высокой эффективностью. Благодаря уникальному строению своего металлсвязывающего центра антибиотик способен многократно генерировать активные кислородные частицы, каталитически расщепляя ДНК.

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка метода синтеза блеомициновых производных олигонуклеотидов и исследование полученных коныогатов в качестве реагентов для направленной химической модификации ДНК.

Научная новизна. В настоящей работе впервые было осуществлено ковалентное присоединение противоопухолевого антибиотика блеомицина А5 к олигонуклеотидам. Показано, что полученные коныогаты способны к эффективному сайт-специфическому расщеплению как короткой (14-звенной), так и протяженной (302-звенной) ДНК-мишеней. Обнаружено,что блеомициновые производные олигонуклеотидов способны расщеплять двуцепочечную ДНК в составе тройного комплекса. На примере расщепления 14-звенной ДНК-мишени была продемонстрирована способность остатка блеомицина в составе олигонуклеотидного реагента каталитически расщеплять ДНК-мишень. Таким образом, впервые созданы сайт-направленные расщепляющие ДНК реагенты на основе олигонуклеотидов с каталитическим типом действия.

Практическая ценность. В результате проделанной работы в арсенал ген-направленных соединений включен новый тип производных олигонуклеотидов, содержащих остаток противоопухолевого антибиотика блеомицина А5. ДНК-расщепляющая активность полученных коныогатов позволяет надеяться на успешное применение данных производных в качестве

сайт-специфических химических эндонуклеаз в молекулярно-биологических исследованиях. Избирательность по отношению к определенным нуклеиновым кислотам в дополнение к высокой противоопухолевой активности антибиотика являются основой для возможного использования блеомициновых производных олигонуклеотидов как нового класса терапевтических средств.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах "Синтетические олигонуклеотиды : проблемы и перспективы практического использования" (Москва, 1991 г.), "Антисмысловые олигонуклеотиды и рибонуклеаза Н" (Франция, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 2 статьи приняты в печать.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 190 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 289 наименований и содержит 2 таблицы и 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез и свойства блеомициновых производных моно- и олигонуклеотидов.

При конструировании блеомицинового производного олигонуклеотида, пригодного для сайт-специфической деградации ДНК-мшпени, необходимо сохранить способность остатка антибиотика деградировать ДНК и одновременно сохранить способность олигонуклеотидной части синтезируемого реагента образовывать комплементарные комплексы.

Для выполнения этих требований присоединение антибиотика к олигонуклеотиду проводили по 5'- или З'-концевой фосфатной группе, предварительно активированной смесью трифенилфосфина (Ph3P) и 2,2'-Д1тиридалдисульфида (PyS)2 в присутствии 4-N,N-диметиламинопиридин-1-оксида (DMAPO) (схема 1). Известно, что полученная таким образом цвитгер-ионная фосфатная группа легко реагирует с алифатическими аминогруппами (Годовикова и др., 1989). Блеомицин А5 (Blm-RH) в своей структуре содержит несколько алифатических аминогрупп (Рис.1). Аминогруппы металлсвязывающего центра, необходимые для ДНК-расщепляющей активности антибиотика, защищали путем хелатирования с ионом меди, направляя тем самым присоединение по аминогруппам остатка спермидина (RH) на С-конце молекулы. Во избежание присоединения двух молекул олигонуклеотида к

одной молекуле антибиотика использовали 10-кратный избыток последнего.

Схема 1

О-Р-Х

-I

О

сх> сиз (III) СIV)

с\о

С У15 СУ113

РЬ3Р, СРу55 2

ОМАРО

и

ас ССАААСАЭ

ассвтсстсэ

аССАААСАЗ асеССАААСАЭ ас АСССТСТТСССАЭ ас ТвАСССТСТТСССАЭ

СИ,

сн_

/ЗЛ II н-о-р-х

сис11эв1т-1гн

СиС115В1т-«-Р-Х

С1а-ХаЭ ' О, 1М ЕВТА1

I»

ф II

1-К-Р-

| о

сVIII) астэ1В

з'-астэ.^-з*

С1ХЭ СХЭ

ас СА<5С(5СЧЗЛТ<ЗСААСАО

В1т—К—Р—X

С16-Ш6,ИП®

Образующиеся блеомициновые производные (1а)-(Ха) выделяли обращенно-фазовой хроматографией. Выход соединений (1а)-(Ха) составляет 60-80%.

ш

2 Vй

сн3 о

н

сн, но сн.

Л V

ж

Си(П)В1т-1Ш

Рис.1. Структура медьсодержащего комплекса блеомишша А5 (Си(Н)В1ш-ВН). Кружком отмечена аминогруппа, участвующая в образовании фосфамидной связи с моно- и олшонуклеотидамн.

о

х

В электронном спектре поглощения блеомициновых производных олигонуклеотидов (На)-(Ха) присутствует полоса при 260нм, характерная для нуклеотидной компоненты, и плечо при 290-320нм, соответствующее полосе поглощения блеомицинов. Кроме этого наблюдается появление полосы поглощения с максимумом при 610 нм (Е2бо=1'Ю2 М^см"1), которая указывает на наличие блеомицина в составе синтезированного соединения в форме хелатного комплекса с нонами меди.

Обработка полученных блеомициновых производных моно- и олигонуклеотидов 0,1 М раствором N^'-отилендиаминтетра-уксусной кислоты (ЕОТА) при рН 6,5 (схема 1) приводит к постепенному удалению ионов меди, что регистрируется по исчезновению поглощения при 610 нм.

Для окончательного заключения о месте присоединения фосфатной группы было получено блеошщиновое производное уридин-5 '-фосфата (16), которое было исследовано 13С-ЯМР спектроскопией.

Присоединение атома фосфора, обладающего ядерным спином 8=1/2, должно повлечь за собой изменение химического сдвига и расщепление сигналов близлежащих атомов углерода. Присоединение по вторичной алифатической аминогруппе остатка

7 6 5 4 3 2 1

спермндина (КН= -ЖСНгСНгСНгМНСНгСНгСНгСНгЖг) должно отразиться на сигналах 3-6 атомов углерода, а присоединение по первичной аминогруппе - на сигаалах С-1 и С-2.

Химические сдвиги сигналов атомов 13С блеомицина А5 (без

С-концевого амина) практически совпадают с таковыми для

блеомицина А2, 13С-ЯМР спектр которого полностью

охарактеризован ^адапахуа, 1979). Для С-концевого амина

блеомицина А5 химические сдвиги 13С сигналов совпадают с

таковыми для остатка спермидина, входящего в состав

таллизомицина В. Присоединение уридин-5'-фосфата практически

не влияет на химические сдвига 13С основной части молекулы

блеомицина А5, однако приводит к сильному сдвигу в слабое поле

для С-1 и С-2 атомов спермидиновой части (на 1,8 и 4,2 м.д.,

соответственно). Кроме того, сигнал С-2 в соединении (16) имеет

расщепление с константой 6,8 Гц вследствие спин-спинового

взаимодействия с атомом близлежащего фосфора; в то же время

расщепление сигнала С-1 практически отсутствует. Сигналы ЯМР 13С

уридиновой части молекулы соответствуют литературным данным (КаШнтвЫ е1 а1., 1988), при этом наблюдается расщепление сигнала С-5' (64,3 м.д.) с константой 4,8 Гц и сигнала С-4' (84,2 м.д.) с константой 8,8 Гц. Совокупность данных

убедительно доказывает, что присоединение нуклеотида происходит по первичной аминогруппе остатка спермидина блеомицина А5.*

2. Деградация одноцепочечной 14-звенной ДНК-мишени блеомициновыми производными олигонуклеотидов.

Известно, что эффективность сайт-специфического воздействия па ДНК в большой мере зависит от стабильности образующегося между ДНК-мишенью и реагентом комплементарного комплекса. Влияние антибиотика на комплексообразующие свойства олигонуклеотидов оценивали путем сравнения температуры плавления комплексов, образованных pd (TGTTTGGCAAGGA) (XI) с pd(CCAAACA) (II) или его блеомициновым производным (116) (концентрация компонентов -2,5-10-% в 0,16М NaCl, 0,02М NaH2P04, 0,1мМ EDTA (рН 7,4)). Температура плавления дуплекса, образованного блеомициновым производным (ТПЛ.=33°С), выше на 11°С температуры плавления дуплекса, сформированного с участием исходного олигонуклеотида (ТШ1.=22°С). Таким образом, ковалентное присоединение объемного остатка нтибиотика не только не нарушает комплексообразующие свойства олигонуклеотида, но и стабилизирует образующиеся комплементарные комплексы.

Известно, что блеомицин более эффективно расщепляет двуцепочечную ДНК, чем одноцепочечную (Kross et al., 1981). Учитывая это обстоятельство, для исследования расщепляющей активности ковалентно присоединенного к олигонуклеотнду остатка антибиотика была выбрана модель, состоящая из 14-звенной ДНК-мишени, 5'-блеомицинового производного гептануклеотида и гептануклеотида, комплементарного 3'-концу мишени (схема 2).

Схема 2

5' pd(T1-G2-T3-T4-T5-G6-Q7-C0-G9-A1O-A11-G12-Gl3-A14) В'

d(A - С-А-А-А- С - С)р d(G - С- Т - Т- С - С -Tip 3' B1m-R 5'

В присутствии 2-меркаптоэтанола, как восстанавливающего агента, и ионов двухвалентного железа в условиях образования комплементарного комплекса блеомициновое производное олигонуклеотида (Нб) или (На) эффективно расщепляет 5'-32Р-меченую ДНК-мишень (XI) (Рис.2, дорожки 2 или 12, соответственно). Эквимолярное количество реагента (Нб) вызывает прямое расщепление 70% тетрадекануклеотида (XI), и дополни-*13С-ЯMP спектры записаны и интерпретированы Денисовым АЛО.

(НИБХ СО РАН).

тельная пиперидиновая обработка увеличивает степень расщепления до 80%. Для сравнения, расщепление (XI) свободным антибиотиком в тех же условиях и при той же концентрации составляет 60% (дорожка 6). Данные значения степени расщепления были получены при инкубации реакционной смеси в течение 6 часов при 20°С. Обнаружено, что в данных условиях достигается предельная степень расщепления.

Позиционная направленность расщепления для олигонуклеотидного реагента (116) отличается от таковой для свободного антибиотика (Рис.2, дорожки 2 и 6, соответственно). Соединение (116) расщепляет мишень по G7, Т5, Т4 и Т3 положениям. Для свободного блеомищша основным местом расщепления является С8, что соответствует литературным данным о предпочтительном расщеплении гуанин-пиримидиновых

Рис.2. Анализ расщепления 32Р-меченой 14-звенной ДНК-мишени. 1 -ДНК-мишень в условиях реакции (0,05М 2-меркап-тоэтанол, 1104М Ре^ЫБО^г в 0,2М 1ЛС1, 0,01М трис-НС1 (рН 7,5)), 2-12 - ДНК-мишень в условиях реакции в присутствии следующих олигонуклео-тидов и реагентов: 2 - (Иб)+(ХН), 3 (Нб), 4 - (Нб)+ (XII) (110"5М ионов Ре(И)), 5 - (Иа)+(ХП) без добавления ионов Ге(И), 6 - В1т-1Ш+(II)+(XII), 7 - В1т-1Ш+(ХШ) (см. схему 3), 8 - (Шб)+(11)+(ХН), 9 - (Шб)+(ХШ), 10 -(У1Нб)+(Н)+(ХН), 11 - (УШб)+(ХШ), 12 - (На)+(ХН). Концентрации олигонуклеотидов, реагентов и ДНК-мишени 110"5М. Реакционные смеси инкубировали 6 ч при 20°С и после пиперидиновой обработки (95°С, 30 мин) анализировали электрофорезом в 20% полиакриламидном геле.

/f—1 {• \

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- i"-i"f • fJ2» «£»

Г' - ^ •

/ ■1 if- «»

о —! S

)

i G 'J tt;^

' т т

<& т&

C^J"'"

С2> СЭР «о» «о»

OQ — -

G -

о •

О

- ©

последовательностей (D'Andréa S* Haseltine, 1£ 78). Некомплементарные тетрадекануклеотиду (XI) олигонуклеотидные реагенты (HI6) и (VIII6) расщепляют ДНК-мишень со специфичностью свободного антибиотика, но с меньшей эффективностью (35% и 10%, рис.2, дорожки 8 и 10, соответственно). Меньшая эффективность действия (Шб) и (VIII6) в сравнении с блеомицином (60%, дорожка 6) может быть связана с появлением полианиоинош фрагмента на С-конце молекулы антибиотика, что должно уменьшать константу связывания остатка блеомицина с ДНК.

Влияние комплементарных взаимодействий на эффективность и позиционную направленность действия блеомициновых производных олигонуклеотидов убедительно демонстрируют следующие эксперименты. В присутствии комплементарного ДНК-мишени (XI) тетрадекануклео-тида (XIII) (схема 3) реагент (116) не способен образовать комплементарный комплекс с мишенью и практически не расщепляет ее. В то же время в отсутствие конкурентного

ингибитора (ХП1) имеет место эффективная деградация ДНК-мишени (Рис.2, дорожка 2).

Комплементарные олигонуклеотидные реагенты разной длины имеют различную позиционную направленность расщепления (схема 4). Основными места ми расщепления в случае 6-звенного реагента (IVa) являются Т5 и Т3, в случае 7-звенного реагента (На) - G7, Т5 и 'Г3 и в случае 8-звсппого реагента (Va) - С8 и Т5.

3. Расщепление протяженного одноцепочечного фрагмента

ДНК блеомицин-олигонуклеотидными коныогатами.

Исследование сайт-специфичности блеомициновых производных олигонуклеотидов проводили на 302-звенном фрагменте ДНК, являющимся копией фрагмента РНК вируса клещевого энцефалита (Рис.3). Использовали олигонуклеотиды, комплементарные участку 261-274, преимущественно находящемуся в одноцепочечной части шпильки.

Схема 3

5 pdC TGTTTCGCGAAGGA) 3" CXI)

3' dCACAAACCGCTTCCT)p S* CXIII)

3, dCACAAACOp s>

Blm-R СПб)

* Схема 4

5'pdC TGTTTGGCGAAGGA) з» Л CXI)

t * С IVa)

Ф f t СИа)

С Va)

* Стрелками указаны основные

места расдаплення.

so

GATCCGTCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGCTCAGGGTGAGGC —————— j 00

GGAAAAGAGTCGACCCAACCTTCCGCCGGCCGTCACTGGCACAGGCTGGA

ISO

CAGCAAAAGGGCAGATCACAGTGCTGGACATGCACCCAGGCTCTGGGAAG

200

ACCCACAGAGTCCTCCCGGAGCTCATTCGCCAATGCATTGACAGACGCCT

2S0

AAGGACATTGGTGTTGGCCCCAACCCGTGTGGTGCTTAAGGAAATGGAGC

300

GTGCCTTGAATGGGAAGAGGGTCAGGTTCCATTCTCCTGCAGGCTCGACGGA

d С ACCCTTCTCCCA}P

1 CVIA)

3' CUCII)Blm-R 5'

d СACCCTTCTCCCAGTJ P

i (VIIa) CuCII>Blm-R

Рис.3. Структура 302-звенного одноцепочечного фрагмента ДНК и олигонуклеотидных реагентов (Via) и (Vila), комплементарных участку 261-272 и 261-274, соответственно. Подчеркнута олигогуаниловая последовательность, с которой реагенты могут образовывать несовершенные комплексы.

Деструкцию ДНК проводили в условиях образования комплементарного комплекса в присутствии ионов Fe (И) и 2-меркаптоэтанола в качестве восстановителя. Продукты реакции анализировали электрофорезом в денатурирующих условиях (Рис.4).

Результаты анализа свидетельствуют о том, что как 12-звенный реагент (Via), так и 14-звенный реагент (Vila) индуцируют разрывы по ближайшим к месту связывания реагентов GT-последовательностям, а именно по Т272 и Т277 (Рис.4). Кроме того происходит расщепление в олигогуаниловой области G17-G34, содержащей 18 остатков гуанозина, где исследуемые реагенты могут образовывать достаточно прочный несовершенный дуплекс, что было отмечено ранее в других работах (Бросалина и др., 1986; Власов и др., 1987).

При концентрации реагента (Via) 110"5М прямым разрывам по Т272 и Т277 подвергается 70% ДНК-мишени. С понижением концентрации 12-звенного реагента от 1Ю"5М до 110"7М происходит заметное уменьшение степени расщепления ДНК (Рис.4, дорожки 1-3). Низкая степень деструкции при

концентрации реагента (Via) 1-10"7М является, очевидно, результатом образования лишь незначительного количества комплементарного комплекса НК-мишени с реагентом. Так, исходя из количественных характеристик модификации данного фрагмента ДНК алкилирующим реагентом с аналогичной pearemy (Via) нуклеотидной последовательностью (Власов и др., 1987), можно заключить, что при концентрации 12-звенного реагента 110'7М дуплексная структура между ним и фрагментом ДНК будет образовываться не более, чем на 10%. При повышении концентрации реагента на два порядка количество комплементарного комплекса возрастает до 80-90%, что в случае (Via) приводит к почти количественной деструкции ДНК-мишени.

6 7 8 910

Рис.4. Данные анализа продуктов расщепления 302-звенной 3'-32Р-ме-ченой ДНК-мишени реагентами (Via) и (Vila). Концентрация ДНК-мишени 1-10 8М. Дорожки

1-3 - реагент (Via) в концентрации 110"7М, И0 6М и 110"5М, соответственно. Реакционные смеси в буферном растворе 0,2М LiCl, 0,01М трис-HCl (рН 7,5) в присутствии И0"4М Fe(NH4)2(S04)2, 0,05 М

2-меркаптоэтанола и 5 мкг/мл двуцепочечной плазмидной ДНК инкубировались при 20°С в течение 6 ч. Дорожки 4-6 - расщепление реагентом (Vila) (510"6М) в течение 1, 3 и 6 ч, соответственно. Дорожка 7 - ДНК-мишень, инкубированная в отсутствие реагентов 6 ч. Дорожки 8-10 - расщепление реагентом (Via) (510"6М) в течение 1, 3 и 6 ч, соответственно.

«■»«Э

«5» О

Таким образом, показано, что блеомициновые производные олигонуклеотидов могут с высокой эффектностью вызывать прямое сайт-специфическое расщепление 302-звенного фрагмента ДНК по ближайшим к месту расположения остатка антибиотика СТ-последовательностям.

4. Каталитическая деградация ДНК-мишени блеомициновым производным олигонуклеотида.

Преимущество использования для сайт-специфической модификации ДНК группировок окислительно-восстановительного механизма действия заключается в их способности каталитически продуцировать активные кислородсодержащие часгицы, и, следовательно, в возможности многократного воздействия на ДНК-мишень. На протяженных ДНК и на олигонуклеотидах было обнаружено, что одна молекула аптибиотика вызывает образование нескольких молекул свободных гетероциклических оснований или пропеналей оснований (Ро\1гк, 1979; Бифуата е1 а1,, 1986).

Исследование способности остатка блеомицина в составе олигонуклеотидного конъюгата каталитически расщеплять ДНК проводили на использованной ранее модели, представленной на схеме 2. При этом ДНК-мишень (XI) и гептануклеотид (XII) брали в 10-кратном избытке по отношению к реагенту (Пб). На рис.5 представлены результаты расщепления тетрадекануклеотнда (XI) реагентом (Нб) при разных температурах. Максимальная степень расщепления мишени наблюдается в интервале 25-35°С, который включает в себя температуру плавления комплекса реагент-мишень (ТПЛ.=33°С). В данных условиях легко протекает диссоциация реагента из комплементарного комплекса, что обеспечивает переходы с одной молекулы мишени на другую. Повышение температуры приводит к резкому падению степени расщепления, что, вероятно, связано с уменьшением концентрации комплементарного комплекса реагент-мишень (Рис.5). Понижение температуры также приводит к меньшей степени расщепления мишени, что может быть связано с неоптимальными условиями для проявления каталитической активности реагента.

Деградация около 30% тетрадекануклеотида (XI) олигонуклеотидным реагентом (Нб) в условиях 10-кратного избытка мишени (Рис.5) свидетельствует о том, что одна молекула реагента способна атаковать в среднем три молекулы мишени. Ограничение эффективности действия реагента (Пб) при наличии достаточного количества ионов железа, восстанавливающего агента и молекулярного кислорода может быть связано или с деградацией

Рис.5. Результаты деструкции тетрадекаиуклеотида

(XI) (110"5М) реагентом (Иб) (110-6М) в присутствии олигонуклеотида

(XII) (И0"5М) при разных температурах по данным электрофоретического анализа. Условия реакции см. рис.2, "к" - мишень в отсутствие реагента в условиях реакции при 45°С.

»20 25 30 33 35 33 40 *3°С

ei'-^тч

его олигонуклеотидной части, или с деградацией самого остатка антибиотика.

Известно, что при окислении комплекса Ге(И)-блеомицин кислородом как в отсутствие, так и в присутствии ДНК часть молекул антибиотика инактивируется и в дальнейшем теряет способность индуцировать разрывы ДНК (Burger et al., 1981). Для выяснения причины ограничения каталитической активности был синтезирован 5'-32Р-меченый реагент (Иб), и осуществлено расщепление немеченой ДНК-мишени (XI) в условиях 10-кратного избытка последней (Рис.6). По появлению продуктов (дорожки 3 и 4), имеющих большую электрофоретическую подвижность, чем исходный реагент (Нб) (дорожка 2), можно заключить, что в условиях каталитической деградации мишени (XI) существенно разрушается сам реагент как в присутствии ДНК-мишени (дорожка 4), так и в отсутствие ее (дорожка 3). При выдерживании реакционной смеси после проведения реакции в условиях гидролиза фосфамидной связи между остатком антибиотика и

шшгонуклеотидом в реагенте (Нб) (рН 3,5, 37°С, 16 ч) образуется немодифицированный 5'-меченый гептануклеотид (II) (дорожка 5). Дополнительная пиперидиновая обработка последнего не приводит к какой-либо деградации (дорожка 6). Таким образом, ограничение каталитической активности реагента (Иб) связано, по-видимому, с деструкцией самого остатка антибиотика.

Рис.6. Данные электрофоретичес-кого анализа 5'-32Р-меченого реагента (Нб) после деградации им тетрадекануклеотида (XI) (20°С, 6 ч) при концентрациях (Нб) 110'6М, (XI) и (XII) - 110-5М. Условия реакции см. рис.2. Дорожка 1 - 32Р-меченый олигонуклеотид (И), 2 - реагент (Иб), 3 - выдержанный в условиях реакции реагент (Нб), 4 - реагент (Нб) после деградации мишени (XI), 5 - кислотный гидролиз реагента (Иб) после деградации мишени (XI), 6 - кислотный гидролиз реагента (Пб) после деградации мишени (XI) с последующей обработкой

пиперидином (95°С, 30 мин).

т А

+ 1 2 3 15 6 +

с а

•

ф

О А

О А

ФА

о С

« С

Предложенный нами метод ковалентного присоединения блеомицина к олигонуклеотиду сохраняет не только способность антибиотика к деградации ДНК, но и свойственную свободному блеомицину способность к каталитическому типу действия.

5. Деградация двуцепочечной ДНК-мишени блеомициновымл производными олигонуклеотидов, образующими тройной комплекс.

Использование реакционноспособных производит, 1.\ олигонуклеотидов, способных воздействовать на выбранные участки двуцепочечной ДНК в результате формирования тройного

комплекса, является одним из перспективных направлений в рамках исследований по созданию ген-направленных соединений.

Выбор ДНК-мишени для воздействия олигонуклеотидного реагента в составе тройного комплекса осуществляли в соответствии со следующими требованиями. Во-первых, она должна содержать участок гомопуриновой и гомопиримидиновой последовательностей для формирования тройного комплекса. Во-вторых, прочный тройной комплекс должен образовываться при нейтральных рН, поскольку блеомицин эффективно расщепляет ДНК в пределах рН 7-9 (Sausville et al., 1978).. При таких условиях образуются прочные тройные комплексы состава Т АТ. В-третьих, участок образования комплекса с реагентом должен бьггь фланкирован последовательностями, которые будут являться мишенью для воздействия остатка блеомицина при формировании тройного комплекса. Блеомицин вызывает расщепление ДНК преимущественно в последовательностях GT, GC, AT и GA по дезоксирибозе второго нуклеотида (D'Andrea & Haseltine, 1978). Исходя из этого была выбрана 30-звенная двуцепочечная мишень, представленная на рис.7.

Воздействие на данную мишень 16-звенного олиготимидилатного реагента, несущего ковалентно связанный с 5'-концевым фосфатом остаток блеомицина, в условиях образования тройного комплекса приводит к расщеплению мишени (Рис. 7, триплекс Г). Пуринбогатая цепь расщепляется в районе 5'-конца олиго(А) тракта (дорожка 2), а пиримидинбогатая цепь - в районе З'-конца олиго(Т) тракта (дорожка 6), то есть вблизи расположения остатка антибиотика при связывании третьей цепи (реагента) параллельно пуринбогатой и антипараллельно пиримидинбогатой последовательностям. Это согласуется с литературными данными (Strobel & Dervan, 1990; Francois et al., 1989) по расщеплению двуцепочечной ДНК EDTA- и 1,10-^енантролин содержащими олигонуклеотидными реагентами, образующими с ней тройной комплекс. Отсутствие расщепления А-богатой цепи на З'-конце свидетельствует о том, что в выбранных условиях не происходит формирования Уотсон-Криковского комплекса между реагентом и данной цепью.

Воздействие З'-блеомицинового производного

гексадекатимидилата на двуцепочечную ДНК-мишень в условиях образования тройного комплекса (Рис.7, триплекс II') приводит к расщеплению пуринбогатой цепи в районе З'-конца олиго(А) тракта и пиримидинбогатой цепи в районе 5'-конца олиго(Т) тракта (дорожки 3 и 7, соответственно). Кроме данного сайт-специфического расщепления, которое осуществляется благодаря

образованию тройного комплекса, наблюдается заметное расщепление на З'-конде ниримидинбогатой цепи (дорожка 7). Это неспецифическое расщепление происходит по С30, С28 и Т26 в последовательностях СС и СГ, которые являются предпочтительными для связывания и расщепления самим блеомицином. В условиях 5-кратного избытка реагента по отношению к мишени данное

Рис.7. Данные

алектрофоретического анализа расщепления

двуцепочечной ДНК-

мишени (110*6М) в триплексах Г и II' реагентами (Villa)-(Ха) (5106М) при 20°С в течение 6 ч. Дорожки 1-4 -5'-32Р-меченая А-богатая цепь, дорожки 5-8 - 5'-32Р-меченая Т-богатая цепь. 1 и 5 - двуцепочечная ДНК-мишень без реагента в условиях реакции. (1М LiCl, 0,1М трис-HCl (рН 7,5), 0,01М MgCl2 в присутствии ионов Fe(II) (110-4М) и 2-

меркаптоэтанола (0,05М). Расщепление ДНК-мишени реагентами (Villa) - 2 и 6, (1Ха) - 3 и 7, (Ха), не образующим тройной

комплекс, - 4 и 8. Внизу изображены триплексы Г и II' с указанием стрелками мест расщепления. Длина стрелок соответствует

интенсивности расщепления. ХС, BP - маркерные красители ксиленцианол FF, бромфеноловый синий.

I . И

4 8 10

5" pd(ОСССАССЛААЛАААААААЛААААСТССАСС) 3*

:V Д(СССГЛГ.СТТГГГТТТГПТПТТСАССГСС)р 5' 3ft 28 2« 2.1 13

И4

Тришкжг Г

jl 11

31 23 25 28

.v |»|(<;(:мли;ллллллллллАлллм<;'ш;л<;(;) з-.у <|( ПТПТПТПТП ТТ | р K llliu 3'

:с ,н(:<;«/г(;(:п-п-п-птп-п"пт(л<,(:1(.<:>1> у 3d 28 2(1 11 Я (>

. I . •>(.,[

TpHILM'KC |Г

расщепление может быть обусловлено способностью остатка блеомищша связываться с двуцепочечной ДНК без формирования триплекса олигонуклеотидной частью реагента. Для проверки данного предположения было проведено расщепление ДНК-мишени 5'-блеомициновым производным 16-звенного олигонуклеотида В1т-11-рс1 (САСССССАТССААСАС) (Ха), заведомо не образующего тройной комплекс с мишенью. При этом пуринбогатая цепь расщепляется незначительно (6%, дорожка 4), а пиримидинбогатая цепь, как и в случае блеомициновых производных гексадекатнмидилата, расщепляется на 3'-конце по С30, С28 и Т26 (16%, дорожка 8). Это свидетельствует о том, что воздействие на двуцепочечную ДНК-мишень 5'- и 3'-блеомициновых производных гексадекатнмидилата при 5-кратном избытке последних осуществляется как сайт-специфически за счет адресовки олигонуклеотидом при образовании тройного комплекса, так и неспецифически за счет связывания остатка блеомицнна с

двуцепочечной ДНК. .

Сравнивая общие степени расщепления двуцепоцечной ДНК-мишени блеомицин-содержащими реагентами (таблица), можно заключить, что как для 5'-, так и для 3'-блеомициновых производных гексадекатнмидилата сайт-специфическое

расщепление, обусловленное образованием тройного комплекса, преобладает над неспецифическим.

ТАБЛИЦА

ОБ1Э1Е СТЕПЕНИ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЗО-ЗВЕННОЯ ДВУЦЕПОЧЕЧНОЙ ДГОС-МНЕЕНИ БЛЕОМИЦИНОВЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛНГОНУКЛЕОТИДОВ*

Реагент Общая степень расщепления, У.

А-богатоЯ цепи Т-богатой цепи

В1ш-К-рс!СТ31в 23 47

аст>1вр-к-в1ш 33 36

В1т-к-р<к слес-^

&ЮАТССААСАСУ 6 16

'"условия эксперимента даны в подписи к рис.7 Не образует тройного комплекса с ДНК-мишень»

выводы

В рамках поиска новых ген-направленных биологически активных соединений, а также эффективных сайт-направленных химических эндонуклеаз получен новый тип соединений - коньюгаты противоопухолевого антибиотика блеомицина А5 с олигонуклеотидами.

1. Разработан метод ковалентного присоединения к концевой фосфатной группе олигонуклеотида противоопухолевого антибиотика блеомицина А5, с сохранением способности последнего к деструкции ДНК. Селективное образоание фосфамидной связи с первичной аминогруппой остататка спермидина блеомицина А5 осуществляли путем взаимодействия медьсодержащего комплекса антибиотики с цвиттер-ионной концевой фосфатной группой олигонуклеотида, несущей остаток 4-1Ч,Р^-диметиламинопиридин-1-оксида. Выход продукта реакции 60-80%.

2. Исследовано влияние ковалентно присоединенного остатка антибиотика на способность 7-звенного олигонуюгеотида образовывать комплекс с комплементарной ему 14-звениой матрицей. Обнаружено, что введение остатка блеомицина А5 в олигонуклеотид повышает стабильность образованного им комплементарного комплекса на 11°С.

3. На примере расщепления короткого (14-звешюго) и протяженного (302-звенного) фрагментов ДНК показано, что блеомициновые производные олнгонуклеотидоп с высокой эффективностью (до 70% расщепления) вызывают прямые сайт-специфические разрывы одноцепочечной ДНК-мишени.

4. Показано на примере расщепления 14-звениой мишени, что остаток блеомицина в олигонуклеотидном реагенте сохраняет способность свободного антибиотика к каталитической деградации ДНК-мишени. Каждая молекула реагента способна повреждать в среднем 3 молекулы мишени; в этом процессе олигонуклеотндная часть реагента сохраняется, по остаток блеомицина, по данным электрофоретического анализа, разрушается.

5. Продемонстрирована возможность использования блеомициновых производных олнгонуклеотидоп для деградации двуцепочечных фрагментов ДНК в составе тройного комплекса. Расщепление 30-звенпой ДНК-мишени как 5'-, так и 3'-блеомициновыми производными гексадекатимидилата

осуществляется в основном сайт-специфически по обеим цепям в соответствии со связыванием реагента параллельно пуринбогатой цепи мишени.

Основное содержание диссертационной работы опубликовано в следующих сообщениях:

1. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Сергеев Д.С. Прямые разрывы одноцепочечного фрагмента ДНК блеомициновым производным олигонуклеотида. Биоорган, химия. 1991. Т.17. №9. С.1193-1200.

2. Sergeyev D.S., Godovikova T.S., Zarytova V.F. Direct cleavage of a DNA fragment by a bleomycin-oligonucleotide derivative. FEBS Lett.

1991. V.280. №2. P.271-273.

3. Sergeyev D.S., Zarytova V.F., Mamaev S.V., Godovikova T.S., Vlassov V.V. Sequence specific cleavage of single-stranded DNA by oligonucleotides conjugated to bleomycin. Antisense Res. Develop.

1992. V.2. №5. P.235-211.

4. Zarytova V.F., Sergeyev D.S., Godovikova T.S. Synthesis of bleomycin A oligonucleotide derivatives and site-specific cleavage of the DNA target. Bioconjugate Chem. 1993. V.4. №3. P.189-193.

5. Сергеев Д.С., Годовикова T.C., Зарытова В.Ф. Каталитическое расщепление ДНК-мпшени блеомициновым производным олигонуклеотида. Биоорган, химия. 1995. Т.21. №5. С.

6. Сергеев Д.С., Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф. Расщепление двуцепочечной ДНК-мишени блеомициновыми производными олигонуклеотидов, образующими тройной комплекс. Биоорган, химия. 1995. Т.21. №3. С.

Подписано к печати Формат бумаги 60x84 1/"1б Заказ 11

Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз.

Полиграфический участок НИБХ СО РАН 630090, Новосибирск-90, пр.Лаврентьева, 8.