Факторы, определяющие рибонуклеазную активность миметиков рибонуклеаз: структура химических рибонуклеаз, последовательность и пространственная организация РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ТАМКОВИЧ НИКОЛАЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ РИБОНУКЛЕАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МИМЕТИКОВ РИБОНУКЛЕАЗ: СТРУКТУРА ХИМИЧЕСКИХ РИБОНУКЛЕАЗ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ И ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РНК

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

"о

Новосибирск-2008

003450784

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Готтих Марина Борисовна к.х.н. Пышная Инна Алексеевна

Ведущая организация:

Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Защита состоится О^С/и-Ы^иЛ. 2008 г. в ^ часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан » ¿^^-^у^Х^СЮз г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. РНК - важнейший участник большинства биохимических процессов, происходящих как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве. Разработка методов направленного воздействия на РНК открывает возможность регулировать различные клеточные процессы, в том числе экспрессию генов, передачу внутриклеточных сигналов и инактивировать геномы РНК-содержащих вирусов. Создание высокоэффективных катализаторов искусственного происхождения является актуальной задачей биоорганической химии на протяжении уже нескольких десятилетий. В последние годы в нашем институте и других лабораториях мира было получено большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях. Однако, на настоящий момент не найден алгоритм получения эффективных катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей, а существующие эффективные химические рибонуклеазы найдены, преимущественно, путём скрининга разнообразных соединений. Более того, роль РНК, как второго участника реакции расщепления фосфодиэфирной связи, на настоящий момент, изучена не полностью. Исследования чувствительности различных фосфодиэфирных связей к расщеплению велись по двум основным направлениям: изучение влияния пространственной структуры РНК на устойчивость к гидролизу определённых фосфодиэфирных связей и влияние последовательности или контекста, в котором расположена фосфодиэфирная связь, на её стабильность.

На данный момент систематизировать и сравнить имеющиеся данные разных исследователей по расщеплению РНК не представляется возможным, поскольку они получены на разных моделях и в разных условиях, однако актуальность такого анализа несомненна особенно ввиду перспективы их использования в качестве новых лекарственных препаратов. Для такой систематизации необходим анализ различных экспериментальных данных по изменению свойств фосфодиэфирной связи РНК в зависимости от её структуры и последовательности, в которой расположена эта связь и, с другой стороны, анализ структуры и активности искусственных рибонуклеаз.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов определяющих эффективность расщепления фосфодиэфирных связей РНК искусственными рибонукпеазами: влияние последовательности и пространственной структуры РНК и структуры и состава искусственных рибонуклеаз.

В рамках заявленной цели решались следующие задачи: 1. Определить функции и оптимальное строение, а так же вклад в

рибонуклеазную активность доменов химических рибонуклеаз -конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазолсодержащей группы; 2. Изучить рибонуклеазную активность новых пептидоподобных соединений; 3. Изучить влияние последовательности РНК на эффективность протекания реакции трансэтерификации под действием химической рибонуклеазы AB1L3C3 и конъюгата антисмыслового олигонуклеотида и РНК расщепляющей группы.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы проведено систематическое исследование функциональной роли элементов структуры (доменов) искусственных рибонуклеаз, конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазолсодержащей конструкции. Определено оптимальное строение РНК-связывающего домена. Показано, что остаток имидазола в значительной степени определяет рибонуклеазные свойства искусственных рибонуклеаз посредством кислотно-основного катализа.

Проведено исследование новых искусственных рибонуклеаз, сконструированных на основе пептидоподобных и гидрофобных фрагментов и формирующих ряд серий соединений, отличающихся по составу и строению. Показано, что соединения, содержащие пару остатков аминокислот Lys...Glu, в целом проявляют значительно большую активность, чем соединения с другими исследованными комбинациями.

Впервые изучено влияние однонуклеотидных замен на чувствительность фосфодиэфирных связей в линейных и структурированных РНК с гомологичными последовательностями к расщеплению искусственной рибонуклеазой. Показано, что однонуклеотидная замена существенным образом меняет чувствительность к расщеплению как близкорасположенных связей, так и связей, расположенных на расстоянии 6-8 нуклеотидов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на международных конференциях: "RNA as a therapeutic and genomics target" (Новосибирск, 2001), "Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference" (Новосибирск, 2003), "20th International tRNA Workshop" (Germany, 2003), "29 th FEBS congress" (Poland, 2004), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), "7th International Meeting on Ribonucleases" (Slovak Republic, 2005), "1st International Symposium on Biomoleclules and Related compounds" (France, 2005), "International Conference on Chemical Biology (Новосибирск, 2005), "Physical-chemical biology" (Новосибирск, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 59 рисунков и 8 таблиц. Библиография включает 277 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Все соединения исследованные в настоящей работе синтезированы в ЛОС ИХБФМ СО РАН к.х.н. Коневцом Д. А. и к.х.н. Королёвой Л. С. под руководством д.х.н. Сильникова В. Н. Их синтез и описание не является предметом настоящей работы и описаны в других диссертационных работах.

Анализ функциоанальной роли структурных доменное конъюгатов на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола

Химические рибонуклеазы - конъюгаты 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (DABCO) и имидазола - соединения ABnLkCm (Рис. 1) построены по блочному принципу, где каждый блок (домен) несет определённую функцию. Эти соединения состоят из четырёх функциональных доменов A,B,L и С, где РНК-связывающий доиен В представлен одним, двумя или тремя остатками дважды кватернизованного 1,4-диазабицикло[2.2.2]окта-на; домен А (высший предельный углеводородный радикал) во многом определяет рибонуклеазную активность соединений; каталитический домен С представляет собой остаток гистамином (т=1), метиловый эфиром гистидина (т=2) или гистидин (т=3). Кроме того, в соединениях присутствует домен L - линкер связывающий РНК-связывающий и каталитический домены.

С целью детализации функциональной роли каждого из доменов соединений ABLkCm были исследованы соединения различающиеся длиной линкера (к = 1, 3, 4, 5) и числом остатков кватернизованного 1,4-диазабицикло[2.2.2]окгана. Следует отметить, что из этих соединений, только соединения ABL3Cm были изучены ранее.

Изучение рибонуклеазной активности соединений проводили с использованием в качестве мишеней меченной [32Р] по 5' или 3' концу тРНКРИе из дрожжей, транскриптов TPHKPhe из дрожжей и фрагмента HIV-1 РНК длиной 96 нукпеотидов (далее РНК96), полученных реакцией транскрипции in vitro меченых [32Р] по 5'концу. Реакцию проводили в 50 мМ имидазольном буфере pH 7.0, содержащем 0.2 М KCl, 0.1 мМ EDTA и 100 мкг/мкл РНК носителя, используя [3'-32Р]-тРНКРИе в качестве субстрата. Данные по эффективности расщепления РНК этими соединениями показали, что длина линкера незначительно влияет на скорость расщепления РНК. Для всех соединений наблюдается небольшое увеличение скорости расщепления при увеличении длины линкера от 1 (ABLICm) до 5 (ABL5Cm) метиленовых звеньев.

Данные, полученные ранее в нашей лаборатории, позволили предположить, что

увеличение

положительного заряда соединений, содержащих гидрофобный фрагмент А, может существенно увеличить их

рибонуклеазную активность (соединения AB2L1C1 и AB3L1C1). Из приведенных данных (Рис. 2) видно, что соединение AB2L1C1 проявляет специфичностью расщепления РНК сходную с ABL1C1 (описан ранее): в первую очередь расщепление происходи! по СрА и UpA мотивам, расположенным в одноцепочечных участках РНК96. Однако, расщепление РНК в присутствии соединения AB2L1C1 протекает существенно быстрее, чем ABL1C1, что находит отражение в высокой скорости накопления продуктов расщепления по связям (UhA12, U7A8) расположенным близко к меченому концу РНК. Кроме того, в присутствии соединения AB2L1C1 наблюдается увеличение скорости расщепления по связи С22рА2з и заметно усиливается расщепление по связям CiopUn, С18рС19 и Ci9pC2o, менее чувствительным к действию химических рибонуклеаз. Заметное накопление продуктов расщепления РНК96 по этим связям для химической рибонуклеазой AB2L1C1 наблюдается уже после 3 ч инкубации, тогда как для соединения ABL1C1 заметное накопление продуктов расщепления по этим связям наблюдается 8 и более часов.

Ранее было показано, что для соединений ABLkCm характерна колоколообразная зависимость эффективности расщепления РНК от концентрации соединения. Определение оптимальной концентрации AB2L1C1 и AB3L1C1 (соединение ABL1C1 использовали в качестве положительного контроля) показало, что концентрационные зависимости для AB2L1C1, AB3L1C1 и ABL1C1 также имеют колоколообразный вид с оптимумом 30 мкМ для AB2L1C1 и AB3L1C1 и 0.1 мМ для ABL1C1 (Рис. 3). Степень расщепления РНК в оптимальных условиях для каждого соединения различалась: соединения с одним, двумя и тремя остатками 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (суммарный заряд +2, +4 и +6, соответственно) расщепляли РНК за 8 ч на 38, 48 и 40%, соответственно. Из представленных данных можно сделать

СННСНгЬэ — В — <CHz)k- С—NHCHCH2—/=\ I N^NH L_f_ I

Вл Lk Cm

П = 1. B= V- X 2Br"

/—\ О

Л = 2, B=-X X iB'~

H

/—\ О /—\ О / \

л» 3. В..W -

H н X 6Br"

О О

mi1. R = -H; m = 2, R= -C-0 CH3; m = 3,R«-C-OH

Рис. 1 Структурная формула искусственных рибонуклеаз ABnLkCm.

Ш1Л12 С10Ш1

АВ2ЫС1

20

С54А55

1ЖА42

шглзз

С27Л28 С26С27

С22Л23

С19С20 С18С19

К АВЫС1 время, ч 0 20 0 3 5 8

Концентрация, мМ

Рис. 3. Зависимости эффективности расщепления [5'-32Р]-РНК96 соединениями АВ2ИС1 (сплошная линия), АВ2ИС1 (длинный пунктир) и АВИС1 (короткий пунктир) от концентрации соединения. [5-32Р]-РНК96 инкубировали в присутствии искусственной рибонуклеазы в 50 мМ имидазольном буфере (рН 7.0), содержащем 0.2 М КС1, 0.1 мМ ЕРТА, 100 мкг/мл РНК-носителя, при 37еС в течение 8 ч.

Рис. 2. Рибонуклеазная активность соединения АВ2ИС1. Анализ продуктов расщепления [5'-32Р]-РНК96 соединениями АВПС1 (0.1 мМ) и АВ2ИС1 (0.03 мМ) в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. 1_ и Т1- расщепление РНК96 в 2 М имидазольном буфере (рН 7.0) и рибонуклеазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. К - контроли, инкубация РНК в отсутствие соединений.

вывод, что оптимальным для проявления рибонукпеазной активности является заряд химической рибонуклеазы +4.

Для исследования функциональной роли доменов А и В и степени их участия в рибонукпеазной активности, проявляемой соединениями АВп1_кСт, мы сравнили соединения, в которых присутствовал или отсутствовал домен А; а также изменялось количество остатков ОАВСО (один или два) в домене В. Для соединений серии Вп1кС1 (п=1 или 2) при возрастании суммарного заряда соединения от +2 до +4, степень расщепления РНК возрастает от 0.5 до 5%. При введении в структуру соединения гидрофобного заместителя А (соединения АВ11_1С1 и АВ2ИС1) степень расщепления РНК возрастает на порядок. С другой стороны, при увеличении суммарного заряда соединения, содержащего домен А, с +2 до +4 наблюдается лишь небольшое возрастание рибонукпеазной активности: примерно в 1.3

раза. Полученные данные показывают, что соединение AB2L1C1 гораздо более эффективно. Механизм, по которому гидрофобный заместитель "участвует" в реакции расщепления РНК пока не выяснен, однако его присутствие усиливает суммарное действие функциональных групп в составе химических рибонуклеаз. Это отражается в соотношении эффективностей расщепления РНК соединениями с одинаковым зарядом, содержащими и не содержащими домен А (B1C1L1/ABC1L1 = 0.5/37; B2C1L1/AB2C1L1 » 5/48).

Для того, чтобы оценить вклад каталитического фрагмента в рибонуклеазную активность, проявляемую соединениями, соединение ABL1C1 инактивировали, подвергнув остаток имидазола модификации диэтилпирокарбонатом (DEPC). Для этого ABL1C1 инкубировали в присутствии 1% DEPC перед добавлением к РНК96. Контролем служило соединение ABL1C1 подвергнутое таким же обработкам, но в отсутствие DEPC. В качестве отрицательного контроля использовали соединение AB, в составе которого отсутствует каталитический домен. Поученные данные показали, что модификация DEPC в 1.7 раза снижает рибонуклеазную активность соединения ABL1C1, тогда как рибонуклеазная активность соединения AB в результате проведённых процедур существенно не изменяется (Рис. 4). Другими словами DEPC приводит к снижению рибонуклеазной активности соединений ABnLkCm до уровня соединения AB, не содержащего остатка имидазола, что свидетельствует о том, что именно наличие имидазола в структуре соединений ABnLkCm обеспечивает их высокую эффективность катализа.

Известно, что имидазол способен сам катализировать реакцию трансэтерификации или ускорять её в присутствии других катализаторов. Мы изучили влияние имидазола на расщепление РНК

60

50

Рис. 4. Роль остатка имидазола каталитического (С) домена химических рибонуклеаз в реакции расщепления РНК. [5'-згР]-РНК96

инкубировали в 50 мМ имидазольном буфере (рН 7.0), содержащем 0.2 М КС!, 0.1 мМ ЕЭТА, в присутствии 100 мкг/мл РНК-носителя при 3793 в течение 8 ч. Реакционные смеси содержали исходные соединения АВИС1 (0.1 мМ) и АВ (0.1 мМ) (серые столбцы) или эти же соединения, предварительно инкубированные в присутствии ОЕРС (черные столбцы).

о

ABL1C1

AB

соединением AB2L1C1 (Рис. 5). При увеличении концентрации имидазола от 0 до 150 мМ наблюдается возрастание степени расщепления РНК в 10 раз, а при повышении концентрации имидазола до 200 мМ - снижение скорости расщепления РНК. Данные представленные на рис. 5 наглядно показывают синергическое действие соединения AB2L1C1 и имидазола: степень расщепления РНК96 в присутствии 15 мкМ AB2L1C1 и 150 мМ lm составляет 27%, тогда как каждое из соединений по отдельности в аналогичных условиях расщепляет РНК на 2.5% (AB2L1C1) и 1% (200 мМ имидазол), соответственно. Колоколообразный характер кривой зависимости эффективности расщепления РНК от концентрации имидазола, очевидно, связан с электростатической природой взаимодействий между нуклеиновой кислотой и химической рибонукпеазой.

30

5

I 20

С с

0)

г 15

О

та а л

г10 -

с

V

н

° 5

о СП □ □ □ □ □

200 0 0.01 0.1 1 10 50 100 150 200 мМ |щ

Концентрация 1т, мМ

Рис. 5. Влияние имидазола на эффективность расщепления РНК соединением АВ2ИС1. [5'-32Р]-РНК96 инкубировали в присутствии 1.5 х 10"5М АВ2ИС1 в 50 мМ Тгиз-НС1 буфере (рН 7.0), содержащем 0.2 М КС!, 0.1 мМ ЕРТА, 100 мкг/мл РНК-носителя и имидазол при 37°С в течение 8 ч. Первый столбец - контроль, расщепление в 200 мМ 1т в отсутствие химической рибонуклеазы. Синяя область столбцов - аддитивный эффект, зелёная область - синергический эффект расщепления РНК имидазолом и соединением АВ2ПС1.

Таким образом, проведённые исследования соединений АВп1_кСт показали, что проявление ими высокой рибонуклеазной активности достигается за счёт уникального сочетания в их структуре различных функциональных групп, дополняющих друг друга. Полученные результаты являются ярким подтверждением правильности стратегии получения искусственных рибонуклеаз АВп1_кСт, в основе которой лежит принцип реализации в одной молекуле небольшого размера различного типа взаимодействий с РНК.

Изучение рибонукпеазной активности новых химических рибонуклеаз

Настоящий раздел посвящён описанию свойств и рибонуклеазной активности новых соединений, содержащих короткие пептиды. Набор аминокислот, включённых в эти соединения, ограничивался аминокислотами, входящими в состав активного центра РНКазы Т1. В настоящей работе исследовано семь серий соединений, различающихся между собой, внутри серии и между сериями строением одного или нескольких из структурных элементов.

Соединения серий К, R, K-D и R-D

Структурные формулы соединений серий К, R, K-D и R-D представлены на рис. 6 А -Г, соответственно. Каждая серия содержит по пять пептидоподобных соединений (кроме серии K-D в которую входит четыре соединения). Присутствие в названии серии литеры К или R указывают, что соединения этой серии в своём составе содержат остаток лизина или аргинина, соответственно, а литеры D - остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]окгана. Серии соединений

сформированы таким образом, чтобы различие внутри каждой из них обеспечивается изменением длины линкера X между двумя остатками аминокислот Glu -Х- Arg и Glu -Х- Lys, где X - остаток Gly, ß-Ala, у-аминомасляной, е-аминокапроновой или п-аминобензойной кислоты.

Рибонуклеазную активность этих соединений изучали в реакции расщепления 96-звенного фрагмента РНК HIV-1 (РНК96) в стандартных условиях (см. подпись к рис. 3). Позиционная направленность расщепления РНК была одинакова для всех и аналогична соединениям

ABLkCm.

По типу зависимостей степени расщепления РНК от

Рис. 6. Пептидоподобные

искусственные рибонуклеазы серии К (А) R (Б), K-D (В) и R-D (Г). Серия K-D содержит 4 соединения (отсутствует соединение с п = 5, где п - количество метиленовых звеньев линкере X).

концентрации соединений все соединения можно разделить на три группы: соединения, для которых характерна линейная концентрационная зависимость; соединения, для которых наблюдается колоколообразная зависимость и зависимость с выходом на плато. Линейная зависимость наблюдается для большинства соединений серий R (R-1 - R-4) и К (К-1 - К-4). Для соединений R-5, К-5 и большинства соединений серий K-D и R-D наблюдается колоколообразная зависимость с максимумом при концентрации около 0.1 мМ. Такой тип зависимости характерен для соединений имеющих в своём составе алифатический фрагмент и остаток DABCO.

Для выявления наиболее активных соединений РНК96 инкубировали в стандартных условиях в присутствии искусственной рибонукпеазы в течение 6 и 18 ч. Количественные данные по эффективности расщепления РНК96 всеми соединениями приведены в таблице 1. Полученные данные показывают, что рибонукпеазная активность соединений R и К возрастает по мере увеличения длины линкера X: активность соединений падает в ряду R-4 > R-3 > R-2 ä R-1; К-4 > К-3 > К-2 > К-1. Стоит отметить,

что соединения, содержащие в качестве линкера остаток п-аминобензойной кислоты (R-5 и К-5), в обеих сериях проявляют близкую рибонуклеазную активность. Таким образом, наиболее активными соединениями в этих сериях являются R-4 и К-4, расщепляющие РНК за 6 ч на 32 и 71%, соответственно. Соединения на основе лизина (серия К) расщепляют РНК за 6 ч с эффективностью более чем в два раза больше, чем соединения на основе аргинина (серия R).

Данные представленные в таблице 1, показывают, что ряды активностей соединений серий K-D и R-D отличаются от рядов для соединений серии R и К. Среди соединений R-D соединения R-D-2, R-D-3 и R-D-5 проявляют близкую активность. При этом 4 из 5 соединений этой серии расщепляет РНК более чем на 60% за 6 ч, а наименее активное соединение R-D-4 - на 40% за это же время. В случае соединений K-D и R-D, содержащих остаток DABCO, замена аргинина на лизин не приводит к значительной увеличению рибонуклеазной активности, в отличие от соединений серий R и К.

Наиболее активные соединения K-D-1 и K-D-3 почти количественно расщепляют РНК за 6 ч. В случае соединений с линкером в виде остатка п-аминобензойной кислоты K-D-5 и R-D-5 проявляют разную рибонуклеазную активность относительно друг друга, чем соединения с таким же линкером в сериях К и R. Соединение K-D-5 проявляет низкую рибонуклеазную активность (6% за 6 ч) в исследованном диапазоне концентраций, соединение R-D-5 является одним из наиболее активных соединений в своей серии (79% за 6 ч).

Таблица 1. Эффективность расщепления РНК96 соединениями серии R,

К, R-D и K-D.

Соединение Степень расщепления РНК, % п

6ч 18ч

R-1 13±1.3 24 ± 2.4

R-2 15 ±1.5 31 ±3.1

R-3 25 ±2.5 51 ±5.1

R-4 32 ± 3.2 56 ± 5.6

R-5 2) 29 ±2.9 62 ± 6.2

К-1 37 ± 3.7 80 ±8

К-2 49 ±4.9 87 ± 8.7

К-3 50 ±5 84 ± 8.4

К-4 71 ±7.1 98 ± 9.8

К-5 21 ±2.1 60 ±6

R-D-1 62 ± 6.2 82 ± 8.2

R-D-2 77 ± 7.7 99 ± 9.9

R-D-3 69 ± 6.9 99 ± 9.9

R-D-4 40 ±4 82 ± 8.2

R-D-5 79 ± 7.9 98 ±9.8

K-D-1 89 ± 8.9 98 ± 9.8

K-D-2 49 ± 4.9 93 ± 9.3

K-D-3 82 ± 8.2 98 ± 9.8

K-D-5 6 ±0.6 15 ± 1.5

11 Реакцию проводили в 50 мМ Тиэ-НС! буфере (рН 7.0), 0.2 М КС1, 0.1 мМ ЕЭТА, 100 мкг/мл РНК-носителя в присутствии 1 мМ соединений серий R (31-х), К (30-х), И-Э (33-х) или К-Э (32-х)при 37°С в течении 6 и 18 ч.

1 Цветом выделены соединения линкер которых представлен п-аминобензойной кислотой

Соединения серии I.

Один из возможных механизмов действия соединений серий К и R предполагает формирование надмолекулярных структур за счёт взаимодействия гидрофобных фрагментов нескольких молекул искусственных рибонуклеаз. Простейшая структура такого типа, включающая лишь две молекулы соединения, будет представлять собой линейную молекулу с пептидными фрагментами на концах, соединённых гидрофобным линкером. Соединения такого типа реализованы в сериях 1.1 и 12. Серии 11 и 12 различаются между собой по степени гидрофобности линкера: в серии 1_1 линкер содержит две эфирные группы, что делает его более гидрофильным, чем линкер 12 (серия 12 ), который содержит 12 метиленовых звеньев. Серия И более представительна, чем 12 и содержит 8 соединений (Таблица 2).

В качестве РНК субстратов для изучения рибонуклеазной активности соединений L1 и L2 использовали 96-звенный фрагмент HIV-1 РНК и 21-звенный олигорибонуклеотид ON21 (Рис 7). Следует отметить, что паттерн расщепления РНК96 соединениями серии L1 и L2 не отличается принципиально от паттерна расщепления этой РНК другими исследованными соединениями.

Аналогично, расщепление ON21 всеми соединениями серий L1 и L2 происходит по двум прилегающим СА связям (Сю-Ац, С12-А13); а различия между соединениями нашли своё отражение лишь в скорости расщепления ON21 в целом или каждой из СА связей по отдельности.

Сравнение соединений L1-1 - L2-1, L1-2 - L2-2 и L1-6 - L2-4 с одинаковыми функциональными группами, но отличающихся типом линкера показывает, что искусственные рибонуклеазы с более гидрофобным линкером (L2) проявляют в целом рибонуклеазную активность в 1.5 -10 раз более высокую, чем соединения L1. Ранее и в настоящей работе было продемонстрировано, что наличие в структуре искусственной рибонуклеазы гидрофобных фрагментов, приводит к возрастанию её рибонуклеазной активности. Вторым фактором (после линкера), определяющим активность соединений, является природа аминокислот (R) (см. Таблицу 2).

Характерной чертой наименее активных соединений (L1-1, L1-2, L1-7, L1-8, L2-1 и L2-2) является фланкирование линкера фрагментами, содержащими остатками серина (присутствует у L1-2, L1-7, L1-8 и L2-2), боковой радикал которого не заряжен, не проявляет кислотно-основные свойства, но способен формировать водородную связь. Соединение L1-7 проявляет наибольшую рибонуклеазную активность среди серин-содержащих соединений, однако оно в два раза менее активно, чем L1-6, в котором остаток серина заменён на лизин.

Средне и высокоактивные соединения серий L1 и L2 (L1-5, L1-3, L1-4 , L1-6, L2-3 и L2-4) характеризуются присутствием в их составе более широкого набора остатков аминокислот. В состав искусственных рибонуклеаз L1-4, L1-5, L1-6 и L2-4 кроме лизина входят остатки аминокислот, содержащие -NH2, lm, -СООН функциональные группы, способные проявлять кислотно-основные свойства в условиях реакции

^ А11 г »

Сю С« S

с А13

и G U—А U—А A—U A—U G-C С—G

и, и„

5- У

Рис. 7. Структура 21-звенного олигорибонуклеотида ON21. Стрелками обозначены сайты расщепления.

(рКа -СООН, - 1ш и -МН2 равны 4.1, 6.0 и 9.5, соответственно). Таким образом, можно заключить, что соединениям 11 и 1.2 для проявления рибонуклеазной активности необходимо наличие в структуре пары функциональных групп, одна из которых является донором водородной связи, а вторая проявляет выраженные основные свойства.

Эффективные константы скоростей, рассчитанные на основе данных по кинетике расщепления РНК96, показывают, что соединения серии И и 1_2 входят в группу наиболее активных существующих искусственных рибонуклеаз (Таблица 2).

Таблица 2. Эффективность расщепления РНК соединениями сеоий 1.1 и 12.

!.»• 11-1 ваг и-2 Агд и-З ипЯ-уаСЬгС! И-4 Н«Ну» И-5 аи-АКК-1уз и-в ^и-АКК-вег 11-7 Цуз-АКК-Эвг И-8 Степень расщепления РНК за 7 ч, % кэфф, ч1 2)

0№1 РНК96

1.1-1 8.41 ±2 19.84 ±4 0.0115

1.1-2 3,67±1.5 6.52 ± 2 0.00254

и-з 25.49 ± 5 38.19 ±8 0.06217

и-4 42.14 ±8 52.47 ± 10 0.11066

и-5 25.99 ± 5 44.72 ± 9 0.07031

1.1-6 33.10 ±6 57.7 ±11 0.08213

и-7 18.55 ±4 23.51 ±5 0.03369

И-8 11.73 ± 3 10.35 ±3 0.00565

(мг-р* 1.»« и-1 Эег 12-2 аи 12-3 аи-АКК-Ьув 12-4 0|и0ВЙ 1-2-5 Степень расщепления РНК за 3 ч, % кэфф, ч"1

СМ21 РНК96

1.2-1 8.17 ± 2 24.82 ± 5 0.07009

12-2 13.27 ±3 28.59 ± 6 0.07913

12-3 39.69 ± 8 60.03 ±12 0.27678

1.2-4 35.91 ±6 55.09 ±10 0.25451

1.2-5 45.25 ± 9 18.82 ±4 0.0533

11 - обозначение не отображает структурную формулу соединения

2> кэфф рассчитывалась по формуле для реакций псевдопервого порядка -

Р=100х(1-еи).

3) Цветом выделены наиболее активные соединения.

Для наиболее активных искусственных рибонуклеаз серий L1 и L2 (L1-5, L1-6, L2-3 и L2-4) были получены зависимости рибонуклеазной активности от рН (Рис. 8). Профили рН-зависимостей для L1-6, L2-3 и L2-4 имеют схожий вид с оптимумом в области рН 6.2 - 7.2. Такое совпадение не случайно, поскольку эти соединения имеют одинаковые функциональные группы (карбоксильная и аминогруппа) среднеарифметическое рКа, которых равно 6.7. Оптимум рН зависимости L1-5 мало выражен и смещен в область щелочных значениях рН.

рн

—г—1.2-3 —■—Ц2-4 —*—И-5 —>*—1.1-6

Рис. 8. Зависимость степени расщепления РНК искусственными рибонуклеазами 1-1-5, 1.1-6, 1.2-3 и 1.2-4 от рН. Реакцию проводили в 50 мМ буферах: рН 5.0 - 5.8 -ацетатный, рН 5.8 -7.2- какодилатный, рН 7.2 -8.0- Трис-НС1; содержащих 0.2 М КС1, 0.1 мМ ЕРТА, 10 7 М [32Р]-ОЫ21 и ОЫ21 в концентрации 5 мкМ в качестве носителя при 37°С в течении 3 (12-3,1.2-4) и 5 (И-5,1.1-6) ч.

Таким образом, описанные искусственные рибонуклеазы уникальны по своему строению, хотя механизм их действия на данный момент не вполне ясен. Катализ расщепления фосфодиэфирных связей соединениями серий 11 и 1.2, вероятно, осуществляется по кислотно-основному механизму с участием функциогнальных групп пептидных фрагментов.

Влияние последовательности РНК на чувствительность ее фосфодиэфирных связей к расщеплению под действием искусственных рибонуклеаз

В настоящем разделе работы изучена чувствительность фосфодиэфирных связей в РНК к расщеплению в зависимости от фланкирующих её нуклеотидов.

В качестве субстратов были тРНКРЬв из дрожжей содержит уникальную последовательность С61АСАСе5, расположенную в ТФС стебле, которая обладает повышенной чувствительностью к

расщеплению под действием различных агентов, в том числе и искусственных рибонуклеаз. 16-ти звенные рибоолигонуклотиды представляли собой последовательность 52-67 этой же тРНК (Рис. 9). Мутантные тРНК и олигонукпеотиды отличались однонуклеотидными заменами, приведёнными на рис. 9.

В этих экспериментах использовали соединение ABL3C3, а

а. б.

А Ce.ACAGes: wt

С C^ACCGes: АС-2

С CdGCAGes: AG-1

г * C«,ACGGe5: AG-2

C-G Ue,ACAGe5: CU-1

G-C " Ce,AUAGe5: CU-2 G. U A-U

U'A \u

„6. "ч/ m'o 1: 'UGUUCGAUCCjHCflG.íAA3

D С U Cm'G шЧП1ТЕТГет „, с .. ,,

G ¿AG С С«'И 2:5UGUUCGAUCCjrAUAGi^AA

G°A с-G^5 3: 'UGUUCGAUCUinACAGuAA3

4:5UGUUCGAUCy,nA£GG,4AA3'

yo~G -m*C—4» 5. 'UGUUCGAUCCjoACGGuAA3

£ * 6:5 UGUUCGAUCCinACCGi<AAJ

GmA A 7: 5UGUUCGAUCC10ACAAhAA3'

Рис 9. РНК-субстраты, использованные для исследования влияния контекста на устойчивость фосфодиэфирных связей РНК к расщеплению искусственными рибонуклеазами. А. Вторичная структура тРНК 1,6 дрожжей, цветом выделен участок по которому вносились однобуквенные замены. Б. Последовательности участка 61-65 мутантных тРНКр|1е В. Последовательности рибоолигонукпеотидов, отличающиеся одно- или двухбуквенной заменой. Замен выделены красным цветом, последовательность САСАС и мутантные последовательности подчёркнуты.

реакцию расщепления проводили в стандартных условиях (см. выше). На основании данных по расщеплению 16-звенных олигорибонуклеотидов (Рис 10 А) можно сказать, что незначительное изменение их последовательности приводит к существенному изменению, как скорости, так и позиционной направленности расщепления. Расщепление олигонуклеотида, гомологичного последовательности тРНКРЬе протекает по обеим СА связям с одинаковой эффективностью. При замене С14 на А, позиционная направленность расщепления не изменяется, однако скорость расщепления падает в 3-4 раза. Замена последовательности САСАС (1) на СА11АС (2) и иАСАв (3) приводит к снижению и возрастанию

суммарной степени расщепления по этому участку, соответственно. Однако, в первом случае это происходит за счёт увеличения стабильности связи UA по сравнению с СА, а во втором - за счёт увеличения эффективности расщепления по связи СА, прилегающей с З'-стороны к новой связи UA. Большая чувствительнсть к расщеплению связи UA, чем СА наблюдается для олигонуклеотида содержащего последовательность UACGG (4) (сравните с CACGG (5)), степень расщепления которого состовляет 27% против 2.5 % для CACGG (5) (Рис. 11 А). При замене в олигонуклеотиде 5 остаток G13 на цитидин (Gi3—>С) происходит образование последовательности CACCG (6) в которой СА связь гиперчувствительна к расщеплению. Таким образом олигонуклеотиды 5 и 6 являются наглядным примером влияния локальной последовательности на стабильность фосфодиэфирных связей РНК.

Аналогичные данные были получены для тРНК№е дикого типа и серии мутантных тРНК (Рис. 10 Б), ввиду того, что расщепление природной тРНКРЬе и тРНКРЬе-транскрипта различаются расщепление мутантных тРНК сравнивали с расщеплением тРНК№е-транскрипта дикого типа.

Замена C6i-+U (CU-1) приводит к образованию UA связи более чувствительной к расщеплению, тогда как при замене C63-»U (CU-2) образуется UA связь в два раза более стабильная, чем связь СА в исходной РНК. В то же время в обоих случаях (UACA и CAUA),

А

30

Рис. 10. Влияние однобуквенных замен в последовательности C10ACAG14 олигонуклеотида 5'-UGUUCGAUCC,0ACAGi4AA-3'

САС/С слило UACAG UACGG CACGG СЛССв C/CAA

(А.) и C61ACAG65 дрожжевой тРНКрг,е (Б) к расщеплению химической рибонуклеазой ABL3C3.

-Phe

Б

2

3

4

5 6 7

0,1 п 0,08 -0,06 -I 0,04

0,02 0

tRNA wt CU-2 CU-1 AG-1 AG-2 AC-2

□ N61 N62

■ N63N64

оставшаяся СА связь становится в 2 раза более чувствительной к расщеплению. Замена одного из аденинов (Ае2 или Аы) на гуанин приводит либо к полному ингибированию расщепления, либо к сильному снижению чувствительности связей в участке 61 - 65 к расщеплению, несмотря на присутствие в каждой из мутантных тРНК по СА связи (CGCA и CACG).

Анализ влияния однобуквенных замен в последовательности CACAG на общие закономерности расщепления этой РНК по всем другим связям показал что при внесении таких замен происходит изменение интенсивностей расщепления по всем расщепляемым связям, особенно по связям С13А, C^G и С75А, причём для каждой из мутантных тРНК эти изменения индивидуальны. Связь C513G57, расположенная в TTC петле тРНКРИе и отдалённая от точек мутации на 6-8 нуклеотидов в разных мутантных тРНК, как оказалось, проявляет различную чувствительность к расщеплению. С одной стороны, в мутантных тРНК AG-1 и АС-2, в которых расщепление по участку 61-64 (AGCA и САСС) подавляется вследствие мутации, расщепление по связи C56G57 возрастает в 2 - 3 раза. С другой стороны, для тРНК AG-2 (замена A64->G), для которой также наблюдается подавление расщепления в участке 61-64, связь C56G57 расщепляется в два раза медленнее, чем в тРНК-wt. При расщеплении тРНК CU-1 и CU-2 не обнаружено ни заметного изменения пространственной структуры, ни изменения скорости расщепления связи C56G57 по сравнению с тРНКР|1в дикого типа. Однако суммарная степень расщепления по трём связям (С61А, С63А и C56G) в мутанте CU-1 значительно выше, чем у CU-2 и wt. Проведённый анализ показывает, что на изменение эффективности расщепления по связи C56G57 является следствием замены оснований в участке 61-64.

Представленные выше данные по влиянию однонуклеотидных замен на чувствительность связи в структурированных и линейных РНК к расщеплению показали, что между этими РНК имеются как сходства, так и различия.

В ряде случаев однонуклеотидные замены одинаковым образом меняют реакционную способность связи: и в тРНК, и в олигонуклеотидах, содержащих последовательности UACAG или CAUAG, UA связь проявляет большую устойчивость к расщеплению, чем прилегающая СА связь. Совпадает так же и характер изменений чувствительности к расщеплению, проявляемой UA связью при замене цитидина 61 на урацил: наблюдается незначительное увеличение скорости расщепления; а при замене цитидина во второй СА связи наблюдается повышение стабильности образуемой UA связи. Наиболее сильное отличие олигонуклеотида и тРНК наблюдается в изменении стабильности оставшейся СА связи при замене C-*U. Если в олигонуклеотиде эти изменения находятся в пределах 30%, то в

тРНК эффективность расщепления оставшейся СА связи меняется в несколько раз. О причине такого влияния урацила в контекстах 11АСА и САиА на обеих моделях остаётся лишь догадываться, однако очевидно, что уридин наиболее сильно влияет на конформацию ближайших соседей. Если урацил проявляет себя как основной дестабилизирующий элемент, то основным стабилизирующим элементом можно назвать гуанин - на обеих моделях его введение вместо аденина приводит к подавлению расщепления по оставшейся СА связи. Наиболее противоречивые данные получены при замене аденина в положении 64 (тРНК) или 13 (олигонуклеотид) на цитидин. В случае тРНК его введение подобно гуанину подавляет расщепление по СА связи, а в случае олигонуклеотида, оставшаяся СА связь проявляет повышенную чувствительность к расщеплению.

Прикладная ценность исследований по влиянию контекста на чувствительность фосфодиэфирных связей в РНК к расщеплению заключается в возможности использования полученных знаний при выборе участка связывания олигонуклеотида сайт-специфичных искусственных рибонуклеаз. С целью подтвердить обоснованность такого подхода мы подвергли расщеплению серию мутантных тРНКРЬе конъюгатом 2В-21т (Рис. 11). При сопоставлении данных расщепления мутантных тРНК искусственной рибонукпеазой АВЬЗСЗ (Рис. 10 Б) и конъюгатом 2В-21т (Рис. 11 Б) видно, что характер расщепления для каждого мутанта совпадает.

Таким образом, во-первых, искусственная рибонукпеаза АВЬЗСЗ является эффективным инструментом для скрининга последовательности РНК при поиске наиболее расщепляемых связей; во-вторых, прогнозирование стабильности фосфодиэфирной связи в зависимости от контекста будет обоснованным для такого типа конъюгатов.

А Б

2в = сатсоаасасасвасст

В N51 N62 аЫ63№4

Рис. 11. А. Конъюгат 2В-21т на основе антисмыслового олигонуклеотида 2В и бисимидазольной конструкции. Б. Эффективность расщепление тРНК с различной последовательностью конъюгатом 2В-21 т. Реакцию проводили с использованием 5' или 3'-[32Р]-меченых тРНК и 10 мкМ 2В-21т в стандартных условиях.

Выводы

1. Проведён детальный анализ функциональной роли доменов в составе искусственных рибонуклеаз серии ABnLkCm, конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]о1сгана и имидазола. Показано, что

изменение длины линкера между РНК-связывающим и каталитическим доменами в пределах от 1 до 5 метиленовых звеньев (2.5 - 7.5 Л) не влияет на рибонуклеазную активность соединений;

- зависимость рибонуклеазной активности соединений от величины суммарного положительного заряда РНК-связывающего домена имеет колоколообразный вид с оптимумом в области заряда +4;

- подтверждено участие в катализе реакции трансэтерификации остатка имидазола каталитического домена, обусловленное его кислотно-основными свойствами; необходимость формирования кислотно-основной пары для расщепления РНК искусственными рибонуклеазами показано 10-кратным ускорением реакции соединением AB2L1C1 в присутствии имидазола в концентрации 150 мМ;

- показано, что увеличение суммарного заряда РНК-связывающего домена соединений приводит к значительному снижению вклада гидрофобного фрагмента А в проявляемую ими рибонуклеазную активность.

2. Исследована рибонуклеазная активность нескольких серий новых соединений, представляющих собой тетрапептиды, различающихся расстоянием между С- и N-концевыми аминокислотами (серии К и R) и аналогичные соединения, но содержащие N-алкилированый остаток 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана у N-концевой аминокислоты (серия K-D и R-D). Показано, что

- соединения, содержащие пару аминокислот Lys...Glu, в целом проявляют значительно большую (в 2 раза) активность, чем соединения содержащие пару Arg...Glu;

- в случае тетрапептидов увеличение длины линкера от 1 до 5 метиленовых звеньев приводит к 1.5 - 2 кратному увеличению рибонуклеазной активности;

- увеличение сродства тетрапептидов к РНК за счёт введения N-замещенного остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана приводит к снижению на порядок концентрации, при которой наблюдается наибольшая рибонуклеазная активность таких соединений с сохранением её высокого уровня.

3. Исследована рибонуклеазная активность соединений, представляющих собой моно-, ди- и трипептиды, соединённые линкером разной степени гидрофобности (серии L1 и L2) и идентифицированы наиболее активные соединения. Показано, что

- рибонуклеазная активность соединений внутри серии определяется их аминокислотным составом: наибольшую рибонуклеазную активность проявляют соединения, пептидные фрагменты которых содержат функциональные группы, способные формировать пары кислота - основание (амино-/карбоксильная группа, аминогруппа/имидазол).

- на основе анализа характера зависимости рибонуклеазной активности соединений L1 и L2 от рН можно утверждать, что расщепление проходит по механизму кислотно-основного катализа с участием функциональных групп пептидных фрагментов.

4. Впервые изучено влияние однонуклеотидных замен на чувствительность фосфодиэфирных связей в линейных и структурированных РНК с гомологичными последовательностями к расщеплению искусственной рибонуклеазой. Показано, что однонуклеотидная замена существенным образом меняет чувствительность близкорасположенных связей к расщеплению. При замене любого из цитидинов в последовательности CACA на урацил, образующиеся UA связи расщепляются значительно медленнее, чем СА, а замена одного из аденинов на гуанин в этой последовательности значительно снижает скорость расщепления оставшейся связи СА. На примере связи CseG57 тРНК (транскрипт полученный in vitro) показано, что однонуклеотидная замена меняет чувствительность к расщеплению связи, расположенной в одноцепочечном участке на расстоянии 6-8 нуклеотидов от точки замены. Изменение эффективности расщепления связи C56G57 вследствие однонуклеотидных замен не коррелирует с изменением пространственной структуры тРНК в результате однонуклеотидных замен.

5. При использовании дрожжевой TPHKPhs дикого типа и серии мутантных тРНК№э, различающихся однонуклеотидной заменой в участке 61-65 CACAG показано, что относительная эффективность расщепления связей в этом участке сохрагяется при переходе от искусственной рибонуклеазы к конъюгату антисмыслового олигонуклеотида и имидазолсодержащей конструкции. Таким образом, соединение AB1L3C3 можно использовать для поиска последовательностей РНК, содержащих связи, чувствительные к расщеплению конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов и РНК-расщепляющих конструкции.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Тамкович Н. В., Белоглазова Н. Г., Зенкова М. А., Власов В. В. Чувствительность фосфодиэфирной связи в РНК к расщеплению искусственными рибонуклеазами // Материалы конференции молодых учённых СО РАН. Часть 2. — Новосибирск, 2004. — С. 6771.

2. Kuznetsova I., Tuzikov F., Tuzikova N., Tamkovich N., Zenkova M., Vlassov V. The role of hydrophobic interactions in catalysis of RNA cleavage by 1,4-diazabicyclo[2.2.2]-octane based artificial ribonucleases // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. — 2004. — V. 23.-№6-7.-P. 907-914.

3. Королева Л. С., Донина А. А., Тамкович Н. В., Ковалев Н. А., Зенкова М. А., Сильников В. Н. Искусственные рибонуклеазы. Сообщение 6. Рибонуклеазная активность тетрапептидов на основе аминокислот, формирующих каталитический центр РНКазы Т1 // Изв. Акад. Наук. Серия химическая. — 2005. — № 11. — С. 2596-2604.

4. Белоглазова Н. Г., Тамкович Н. В., Никитин П. А., Кузнецова И. Л., Зенкова М. А., Власов В. В. Искусственные рибонуклеазы - новый класс соединений для биологии и медицины // Вестник ВОГиС. — 2006. - Т. 10. - №2. - С. 382-395.

5. Тамкович Н. В., Малышев А. В., Коневец Д. А., Сильников В. Н., Зенкова М. А., Власов В. В. Химические рибонуклеазы. VII. Влияние положительно заряженного РНК-связывающего домена и гидрофобного фрагмента конъюгатов на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]окгана и имидазола на их рибонукпеазную активность // Биоорганическая химия. — 2007. — Т. 33. — № 2. — С. 251-260.

Подписано к печати 12 сентября 2008г.

Тираж 100 экз. Заказ № 744. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

1. Глава 1. Функциональные группы природных рибонуклеаз, определяющие специфичность взаимодействия и эффективность расщепления РНК (Обзор литературы).

1.1. Введение.

1.2. Семейство РНКазы А.

1.2.1. Аминокислотные остатки, формирующие активный центр РНКазы А и их функции.

1.2.1.1. Ни>12 и Нк;119.

1.2.1.2.1уэ41.

1.2.1.3. Аэр121.

1.2.1.4. С1п11.

1.2.2. Механизм расщепления РНК под действием РНКазы А.

1.2.3. Структурные элементы РНКазы А, отвечающих за связывание с фосфатными группами субстрата (субсайты связывания Р0, Р2 и РЗ).

1.2.4. Структурные элементы, определяющие специфичность РНКазы А (субсайты связывания В1, В2, ВЗ).

1.2.4.1. Пиримидин-связывающий сайт (субсайт В1).*.

1.2.4.2. Аденин-связывающий сайт (субсайт В2).

1.2.4.3. Другие сайты связывания нуклеотидов.

1.2.5. Структуры активного центра других представителей суперсемейства РНКазы А.

1.3. Семейство рибонукпеазы Т1.

1.3.1. Рибонуклеаза Т1.

1.3.2. Аминокислотный состав и строение активного центра РНКазы Т1.

1.3.3. Механизм расщепления фосфодиэфирной связи РНК под действием РНКазы Т1.

1.3.4. Сайт связывания гуанина РНКазы Т1.

1.3.5. Сайт связывания нуклеотида, следующего после расщепляемой связи (N1 субсайт)

1.3.6. Структуры активного центра других представителей суперсемейства РНКазы Т1.

1.3.7. Сопоставление функционально-структурных особенностей РНКаз А и Т1.

1.4. Химические рибонуклеазы.

1.4.1. Химические рибонуклеазы с интеркалятором в качестве РНК-связывающего домена

1.5.2. Химические рибонуклеазы с поликатионными структурами в качестве РНК-связывающего домена.

1.5.3. Химические рибонуклеазы с олигопептидом в качестве РНК-связывающего домена

1.5.4. Химические рибонуклеазы с циклическими катионными структурами в качестве РНКсвязывающих доменов.

РНК - важнейший участник большинства биохимических процессов, происходящих как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве. Разработка методов направленного воздействия на РНК открывает возможность регулировать различные клеточные процессы, в том числе экспрессию генов, передачу внутриклеточных сигналов и инактивировать геномы РНК-содержащих вирусов. Одним из наиболее простых методов воздействия на РНК является её избирательное разрушение под действием агентов, не затрагивающих ДНК, белки и другие биополимеры. В структуре молекулы РНК уже заложена способность к саморасщеплению: речь идёт о 2'-гидроксильной группе рибозы, которая участвует во внутримолекулярной реакции трансэтерификации. Таким образом, роль катализатора состоит в том, чтобы в нужный момент запустить этот процесс. В природе функцию активаторов или катализаторов реакции трансэтерификации выполняют рибонукпеазы [1-3]. Кроме того, эту реакцию могут катализировать вода [4-6], ионы металлов [7-9], основания [10-12], биогенные полиамины [13, 14] и другие химические соединения, проявляющие кислотно-основные свойства при нейтральных рН или способные влиять на конформацию фосфодиэфирных связей РНК. Однако все эти соединения являются малоэффективными катализаторами. Создание высокоэффективных катализаторов искусственного происхождения является актуальной задачей биоорганической химии на протяжении уже нескольких десятилетий [13, 15-19]. В последние годы в нашем институте и других лабораториях мира было получено большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях [17, 20-23]. По селективности их можно разделить на два класса: химические рибонуклеазы - небольшие соединения, способные расщеплять любую РНК по определённому или по любым типам связей, и сайт-специфичные рибонуклеазы - представляющие собой конъюгаты химических соединений, проявляющих рибонуклеазную активность, с олигонуклеотидами, обеспечивающими направленное расщепление РНК вблизи участка связывания олигонуклеотида [24, 25].

Наиболее эффективные низкомолекулярные искусственные рибонуклеазы построены из нескольких функциональных блоков - доменов, если использовать аналогию с ферментами. Успех создания эффективной искусственной рибонуклеазы определяется: а) удачной комбинацией функциональных доменов в составе соединения и б) оптимальным строением самих функциональных доменов. Однако, на настоящий момент не найден алгоритм получения эффективных катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей, а существующие эффективные химические рибонуклеазы найдены, преимущественно, путём скрининга разнообразных соединений [26].

Давно известно, что фосфодиэфирные связи, находящиеся между цитидином и аденином и между уридином и аденином (СрА, 11рА) наиболее легко подвергаются расщеплению как спонтанному, так и под действием рибонуклеаз, в то время как остальные фосфодиэфирные связи РНК проявляют разнообразную чувствительность к расщеплению [14]. Исследования чувствительности различных фосфодиэфирных связей к расщеплению велись по двум основным направлениям: изучение влияния пространственной структуры РНК на устойчивость к гидролизу определённых фосфодиэфирных связей [27-29] и влияние последовательности или контекста, в котором расположена фосфодиэфирная связь, на её стабильность [14, 30-32]. Анализ накопленных данных по расщеплению РНК позволил сделать вывод, что эффективность расщепления связи в РНК зависит не только от элемента пространственной структуры, в котором она расположена, но и контекста её окружения. Таким образом, фокус исследований сместился от факторов, определяемых макроструктурой РНК, до взаимодействий, определяемых свойствами элементов структуры (нуклеотидов), влияющих на конформацию фосфодиэфирной связи и её устойчивость к расщеплению [27, 33].

На данный момент систематизировать и сравнить имеющиеся данные разных исследователей по расщеплению РНК не представляется возможным, поскольку они получены на разных моделях и в разных условиях, однако актуальность такого анализа несомненна, особенно ввиду перспективы их использования в качестве новых лекарственных препаратов. Для такой систематизации необходим анализ взаимосвязи между различными экспериментальными данными по изменению свойств фосфодиэфирной связи РНК от структуры и последовательности и, с другой стороны, искусственной рибонуклеазы.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов, определяющих эффективность расщепления фосфодиэфирных связей РНК искусственными рибонуклеазами: влияние последовательности и пространственной структуры РНК и структуры и состава искусственных рибонукпеаз.

В рамках заявленной цели решались следующие задачи:

1. Определить функции и оптимальное строение, а так же вклад в рибонуклеазную активность доменов химических рибонуклеаз - конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазолсодержащей группы;

2. Изучить рибонуклеазную активность новых пептидоподобных соединений;

3. Изучить влияние последовательности РНК на эффективность протекания реакции трансэтерификации под действием химической рибонуклеазы АВ11ЗСЗ и конъюгата антисмыслового олигонуклеотида и РНК-расщепляющей группы.

Выводы

1. Проведён детальный анализ функциональной роли доменов в составе искусственных рибонуклеаз серии ABnLkCm, конъюгатов 1,4-дазабицикло[2.2.2]октана и имидазола. Показано, что

- изменение длины линкера между РНК-связывающим и каталитическим доменами в пределах от 1 до 5 метиленовых звеньев (2.5 - 7.5 А) не влияет на рибонуклеазную активность соединений;

- зависимость рибонукпеазной активности соединений от величины суммарного положительного заряда РНК-связывающего домена имеет колоколообразный вид с оптимумом в области заряда +4;

- подтверждено участие в катализе реакции трансэтерификации остатка имидазола каталитического домена, обусловленное его кислотно-основными свойствами; необходимость формирования кислотно-основной пары для расщепления РНК искусственными рибонуклеазами показано 10-кратным ускорением реакции соединением AB2L1C1 в присутствии имидазола в концентрации 150 мМ;

- показано, что увеличение суммарного заряда РНК-связывающего домена соединений приводит к значительному снижению вклада гидрофобного фрагмента А в проявляемую ими рибонуклеазную активность.

2. Исследована рибонуклеазная активность нескольких серий новых соединений, представляющих собой тетрапептиды, различающихся расстоянием между С- и N-концевыми аминокислотами (серии К и R) и аналогичные соединения, но содержащие N-алкилированый остаток 1,4-дазабицикло[2.2.2]октана у N-концевой аминокислоты (серия К-D и R-D). Показано, что

- соединения, содержащие пару аминокислот Lys.Glu, в целом проявляют значительно большую (в 2 раза) активность, чем соединения содержащие пару Arg.Glu;

- в случае тетрапептидов увеличение длины линкера от 1 до 5 метиленовых звеньев приводит к 1.5 - 2 кратному увеличению рибонукпеазной активности;

- увеличение сродства тетрапептидов к РНК за счёт введения N-замещенного остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана приводит к снижению на порядок концентрации, при которой наблюдается наибольшая рибонуклеазная активность таких соединений с сохранением её высокого уровня.

3. Исследована рибонуклеазная активность соединений, представляющих собой моно-, ди-и трипептиды, соединённые линкером разной степени гидрофобности (серии L1 и L2) и идентифицированы наиболее активные соединения. Показано, что

- рибонуклеазная активность соединений внутри серии определяется их аминокислотным составом: наибольшую рибонуклеазную активность проявляют соединения, пептидные фрагменты которых содержат функциональные группы, способные формировать пары кислота - основание (амино-/карбоксильная группа, аминогруппа/имидазол). - на основе анализа характера зависимости рибонуклеазной активности соединений L1 и L2 от рН можно утверждать, что расщепление проходит по механизму кислотно-основного катализа с участием функциональных групп пептидных фрагментов.

4. Впервые изучено влияние однонуклеотидных замен на чувствительность фосфодиэфирных связей в линейных и структурированных РНК с гомологичными последовательностями к расщеплению искусственной рибонуклеазой. Показано, что однонукпеотидная замена существенным образом меняет чувствительность близкорасположенных связей к расщеплению. При замене любого из цитидинов в последовательности CACA на урацил, образующиеся UA связи расщепляются значительно медленнее, чем СА, а замена одного из аденинов на гуанин в этой последовательности значительно снижает скорость расщепления оставшейся связи СА. На примере связи C56G57 тРНКРЬе (транскрипт полученный in vitro) показано, что однонуклеотидная замена меняет чувствительность к расщеплению связи, расположенной в одноцепочечном участке на расстоянии 6-8 нуклеотидов от точки замены. Изменение эффективности расщепления связи C56G57 вследствие однонуклеотидных замен не коррелирует с изменением пространственной структуры тРНК в результате однонуклеотидных замен.

5. При использовании дрожжевой TPHKPhe дикого типа и серии мутантных TPHKPhe, различающихся однонуклеотидной заменой в участке 61-65 CACAG показано, что относительная эффективность расщепления связей в этом участке сохрагяется при переходе от искусственной рибонуклеазы к конъюгату антисмыслового олигонуклеотида и имидазолсодержащей конструкции. Таким образом, соединение AB1L3C3 можно использовать для поиска последовательностей РНК, содержащих связи, чувствительные к расщеплению конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов и РНК-расщепляющих конструкции.

1.6. Заключение

В настоящем литературном обзоре рассмотрено строение природных и искусственных рибонуклеаз и принципы их взаимодействия с РНК. Хотя искусственные рибонуклеазы создаются, главным образом, как искусственные аналоги природных ферментов в большинстве случаев они имитируют фермент только функционально. Само название -рибонуклеазы - показывает, что их функцией является разрушение РНК. Однако адекватно сравнивать ферменты и искусственные рибонуклеазы не совсем корректно, поскольку они и катализируемые ими реакции значительно различаются по физическим, термодинамическим и кинетическим параметрам.

Физические характеристики - это главным образом размер молекулы. По этому параметру искусственные рибонуклеазы значительно выигрывают, так как небольшие размеры молекулы являются существенным достоинством для биологически активных соединений, а молекулярные веса наиболее крупных их представителей искусственных рибонуклеаз редко превосходят 1 кДа. Однако различие в размерах определяющим образом сказывается на других характеристиках, поскольку маленькие молекулы не могут включить широкий спектр функциональных групп, способных функционировать совместно. Сравнение кинетических параметров (Km и kcat) реакции трансэтерификации катализируемой искусственными и природными рибонукпеазами показывает, что kcat ферментов выше в 104 - 108 раза, a Km большинства искусственных рибонуклеаз невозможно определить, что наиболее четко отражает высказанный тезис.

Рассмотрим на основе имеющихся данных, почему различается эффективность связывания с РНК искусственных и природный рибонуклеаз. Как было показано ранее, межнукпеотидными фосфатами связывание РНК ферментом происходит в результате многоточечного контакта и включает несколько типов взаимодействия, при этом в процессе связывания, за счёт определенной геометрии сайта связывания происходит селекция субстрата. В случае искусственных рибонуклеаз связывание, как правило, происходит за счёт одного типа взаимодействия, отличающегося низкой эффективностью. Более того, в силу небольших размеров искусственных рибонуклеаз в них сложно сформировать определённые структуры (субсайты), способные дискриминировать гетероциклические основания. Исключением, пожалуй, является олигонуклеотид-пептидный конъюгат рер-9 эффективно узнающий в РНК остатки гуанина [15].

Причина значительного падения эффективности катализа реакции трансэтерификации, при переходе от природных к искусственным рибонуклеазам не столь очевидны, поскольку искусственные рибонуклеазы содержат в своём составе функциональные группы, способные проводить кислотно-основной катализ по типу РНКаз А и Т1. В работах, направленных на изучение механизма катализа, проводимого ферментами, показано, что высокий каталитический эффект достигается ферментами в значительной степени за счет способности стабилизировать в ходе реакции переходное состояние [3, 6]. Эта стабилизация главным образом осуществляется за счёт обширных электростатических взаимодействий в активном сайте фермента [1, 89, 108], что сложно достичь в искусственных рибонуклеазах. Как уже говорилось, существует два альтернативных механизма протекания реакции трансэтерификации (ДИ- и МИ-механизмы), причём ДИ-механизм считается более предпочтительным для ферментов, так как согласно ему происходит большее перераспределение заряда, что более предпочтительно для фермента [3, 6]. Это происходит вследствие изменения структуры фермента в ходе реакции, позволяющего разрушать старые и формировать новые водородные связи. Искусственные рибонуклеазы неспособны проводить таких изменений в ходе реакции, что, вероятно, способствует проведению катализируемой ими реакции трансэтерификации по МИ-механизму, в частности, триэфирному, как это предполагается для рибозимов и ДНКзимов [227]. В пользу этого предположения свидетельствует термодинамические расчёты, по результатам которых в воде в отсутствие фермента реакция трансэтерификация энергетически более выгодна при формировании моноанионного интермедиата [6].

Другой подход к объяснению причин высокой эффективности ферментативного катализа рассмотрен в работе [227]. Авторы разбили процесс катализа на четыре независимых друг от друга составляющих и назвали их стратегиями катализа на устранение причин препятствующих его эффективному протеканию: невозможность закрепления атомов в благоприятном расположении для формирования пентокоординированного состояния (а катализ, максимальное усиление в 102); большой негативный заряд дианионного состояния ((3 катализ, максимальное усиление в 105); плохая нуклеофильность 2'-гидроксильной группы (у катализ, максимальное усиление в 106); и 5'-оксианион, как плохая уходящая группа (б катализ, максимальное усиление в 106). Такие ферменты как РНКаза А осуществляют все типы катализа, за счёт этого константа скорости расщепления РНК под действием РНКазы А более, чем в 1012 раз выше, чем константа скорости спонтанного гидролиза РНК [35, 227]. Стратегии катализа типа (3, у. и б проводятся за счёт переноса протона, причём в случае (3 и б протон предоставляется катализатором (кислотный катализ), а в случае у - принимается от субстрата (основной катализ). Ввиду указанных выше ограниченных структурных возможностей искусственных рибонуклеаз реализация всех типов катализа в одной молекуле маловероятна, однако спектр комбинаций используемых стратегий катализа обширен и зависит от функциональных групп, входящих в их состав. Условно искусственные рибонукпеазы можно поделить по стратегии катализа на три группы. Наиболее редкая группа проявляет катализ по типу (36 или арб характеризуется смещением оптимума кривой зависимости скорости расщепления РНК от рН в область кислых рН и наличием в составе кластера положительно заряженных функциональных групп [217]. Вторая группа проявляет характерный для ферментов кислотно-основной механизм, заключающийся в комбинациях стратегий ру, 5у или рбу. Как правило, рибонукпеазы из этой группы содержат функциональные группы типа имидазола, способные проявлять свойства как кислот, так и оснований, а кривая рН зависимости имеет оптимум при нейтральных значениях [228]. Искусственные рибонукпеазы третьей группы применяют у или ау стратегии катализа. Соединения, относящиеся к этой группе, могут не иметь функциональных групп, кислотно-основную пару, так как механизм их действия основан на гидрофобных и электростатических взаимодействиях, приводящих к формированию или поддержанию структуры фосфодиэфирной связи РНК, благоприятной для протекания реакции трансэтерификации. Скорость расщепления РНК такими соединениями возрастает с ростом рН [226]. Хотя большинство искусственных рибонуклеаз реализуют ограниченный набор стратегий катализа, причём используя их потенциал не на 100%, они способны ускорять реакцию трансэтерификации на 4 - 8 порядков по сравнению со спонтанным гидролизом [211, 217].

Предложенное разделение на группы искусственных рибонуклеаз основывается на химических свойствах, связанных с процессами протонирования и депротонирования, в то время как а катализ может реализовываться в любой из этих групп, так как его реализация не зависит от рН. Известно, что формирование "in line" структуры фосфодиэфирной связи РНК способно ускорять реакцию трансэтерификации не более, чем в 100 раз [1, 32]. Однако реализация а катализа искусственными рибонуклеазами встречается редко, так как это предполагает прочные взаимодействия молекулы РНКазы с субстратом, способные влиять на конформацию её нуклеотидов. Известно, что большинство искусственных рибонуклеаз расщепляют РНК по CpA/UpA мотивам, являющимеся "горячими точками" РНК в наибольшей степени склонными к спонтанному гидролизу [14, 229], то есть либо их конформация более приближена к "in line", либо эти связи более подвижны, что позволяет им с большей вероятностью принять нужную конформацию. В настоящее время интенсивно исследуются влияние структуры и последовательности РНК на устойчивость отдельной фосфодиэфирной связи к расщеплению. Получение таких данных актуально для дизайна искусственных рибонуклеаз сайт-направленного действия, особенно, при выборе последовательности мишени. Отсутствие у искусственных рибонуклеаз способности менять структуру фосфодиэфирной связи является одним из ключевых их отличий от природных рибонуклеаз и, возможно, достоинством этих соединений. Преодоление этого позволит искусственно создавать молекулы, расщепляющие РНК по любой выбранной связи. Важный шаг в этом направлении сделан авторами работы [217], в которой представлены искусственные рибонуклеазы, проявляющие GpX специфичность и способные формировать фермент субстратные комплексы по типу природных ферментов.

2. Глава 2.

Экспериментальная часть

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и препараты

В работе использовали рибонуклеозидтрифосфаты, акриламид, N-N'-метиленбисакриламид, агарозу, LiCI04l DTT, MgCI2, EDTA, Трис, TEMED, BSA, бромфеноловый синий, ксиленцианол, краситель "Stains-All" производства фирмы "Sigma" (США); глицерин фирмы "Serva" (Германия); SDS, имидазол, формамид, персульфат аммония фирмы "Fluka" (Швейцария); мочевину фирмы "ICN" (США). Прочие реактивы были отечественного производства марки "о.с.ч" или "х.ч".

Ферменты Т4 РНК-лигаза, Т4 полинуклеотид-киназа, РНКаза Т1 фирмы "Fermentas" (Литва); бактериальная щелочная фосфатаза производства "Sigma, США"; эндонуклеазы рестрикции Fok I и SsfêUI производства "Сибэнзим" (Россия), РНК-полимераза фага Т7 производства Лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. у32Р]АТР и [5-32Р]рСр с удельной активностью ~ 4000 Кю/ммоль производства "Биосан" (Россия).

В работе использовали спектрофотометр "Миллихром" (НПО "Научприбор", г. Орел, Россия), вакуумную сушку для акриламидных гелей "LABCONCO" (США), рН-метр "Orion-41 OA" (США), счетчик радиоактивности "Canberra Packard" (США), фосфоримиджер "Molecular Imager" фирмы "Bio-Rad" (США), центрифугу "Eppendorf 5415" (Германия). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС" (Россия).

Искусственные рибонуклеазы, использованные в работе, были синтезированы в Лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН к.х.н. Д. А. Коневцом, к.х.н. Л. С. Королёвой под руководством д.х.н. В. Н.Сильникова.

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали воду, онищенную на установке MlliiQ фирмы Millipore (США). Все буферы подвергали стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм) фирмы Millipore (США).

2.1.2. Плазмиды

Для получения фрагмента HIV-1 РНК и TPHKPhe реакцией транскрипции in vitro использовали плазмиды pHIV1, любезно предоставленую профессором Г. Дж. Гроссом (Лаборатория биохимии, Университет г. Вюрзбурга, Германия), и pYC90, любезно предоставленную к.х.н. H.A. Моор (ИХБФМ СО РАН), ПЦР-продукты, полученные амплификацией плазмиды pYC90 с использованием праймеров, несущих однобуквенную замену, любезно предоставленые м.н.с. А.Н. Зенковым (ИХБФМ СО РАН).

2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК

Олигорибонуклеотиды, представленные в таблице 3, были синтезированы в Группе химии олигорибонуклеотидов ИХБФМ СО РАН фосфитамидным методом на синтезаторе ASM-102U (ТОО "БИОССЕТ", Новосибирск) и очищены ионообменной и обращеннофазовой хроматографией или препаративным электрофорезом в денатурирующих условиях. Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотидов в геле проводили с помощью окраски Stains-All. Природная TPHKPhe из дрожжей была любезно предоставлена проф. Ж. Кайтом, IBCM, Страсбург, Франция.

2.1.4. Олигодезоксирибонукпеотиды

Олигодезоксирибонуклеотиды, представленные в таблице 4, были синтезированы в технологической лаборатории ИХБФМ СО РАН с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

1. Min D., Xue S., Li H., Yang W. 'In-line attack' conformational effect plays a modest role in an enzyme-catalyzed RNA cleavage: a free energy simulation study// Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 4001-4006.

2. Gu J., Wang J., Leszczynski J. Molecular basis of the recognition process: hydrogen-bonding patterns in the guanine primary recognition site of ribonuclease T1// J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 13590-13596.

3. Mignon P., Steyaert J., Loris R., Geerlings P., Loverix S. A nucleophile activation dyad in ribonucleases. A combined X-ray crystallographic/ab initio quantum chemical study// J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 36770-36774.

4. Klahn M., Rosta E., Warshel A. On the mechanism of hydrolysis of phosphate monoesters dianions in solutions and proteins//J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 15310-15323.

5. Oivanen M., Kuusela S„ Lonnberg H. Kinetics and Mechanisms for the Cleavage and Isomerization of the Phosphodiester Bonds of RNA by Bronsted Acids and Bases// Chem Rev.1998. V. 98. P. 961-990.

6. Glennon T.M., Warshel A. Energetics of the catalytic reaction of ribonuclease A: A computational study of alternative mechanisms.// J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 1023410247.

7. Trawick B.N., Daniher A.T., Bashkin J.K. Inorganic Mimics of Ribonucleases and Ribozymes: From Random Cleavage to Sequence-Specific Chemistry to Catalytic Antisense Drugs// Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 939-960.

8. Ciesiolka J., Michalowski D., Wrzesinski J., Krajewski J., Krzyzosiak W.J. Patterns of cleavages induced by lead ions in defined RNA secondary structure motifs// J. Mol. Biol. 1998. V. 275. P. 211-220.

9. Morrow J.R. Artificial ribonucleases//Adv. Inorg. Biochem. 1994. V. 9. P. 41-74.

10. Shinozuka K., Nakashima Y., Shimizu K., Sawai H. Synthesis and characterization of polyamine-based biomimetic catalysts as artificial ribonuclease// Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 117-130.

11. Bashkin J.K., Frolova E.I., Sampath U.S. Sequence-specific cleavage of HIV mRNA by a ribozyme mimic.// J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 5981-5982.

12. Yoshinan K., Komiyama M. Facile cleavage of RNAs by oligoamines. Correlation between amine structure and catalytic activity// Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. P. 23-24.

13. Bibillo A., Ziomek K., Figlerowicz M., Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides. V. The elements affecting the process of self-hydrolysis// Acta Biochim. Pol.1999. V. 46. P. 145-153.

14. Kierzek R. Hydrolysis of oligoribonucleotides: influence of sequence and length// Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5073-5077.

15. Mironova N.L., Pyshnyi D.V., Shtadler D.V., Fedorova A.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. RNase T1 mimicking artificial ribonuclease// Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 2356-2367.

16. Podyminogin M.A., Vlassov V.V., Giege R. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts// Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5950-5956.

17. Zenkova M., Beloglazova N., Sil'nikov V., Vlassov V., Giege R. RNA cleavage by 1,4-diazabicyclo2.2.2.octane-imidazole conjugates// Meth. Enzymol. 2001. V. 341. P. 468-490.

18. Tung C.H., Wei Z, Leibowitz M.J., Stein S. Design of peptide-acridine mimics of ribonuclease activity// Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1992. V. 89. P. 7114-7118.

19. Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides// Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5079-5084.

20. Koroleva L.S., Serpokrylova I.Y., Vlassov V.V., Silnikov V.N. Design and synthesis of metalfree artificial ribonucleases// Protein Pept. Lett. 2007. V. 14. P. 151-163.

21. Власов В.В., Сильников В.Н., Зенкова М.А. Химические рибонуклеазы// Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 62-70.

22. HanerR., Hall J. The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases// Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 423-430.

23. Niittymaki Т., Lonnberg H. Artificial ribonucleases// Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 15-25.

24. Ushijima K., Gouzu H., Hosono K, Shirakawa M., Kagosima K, Takai K., Takaku H. Site-specific cleavage of tRNA by imidazole and/or primary amine groups bound at the 5'-end of oligodeoxyribonucleotides// Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1379. P. 217-223.

25. Сильников B.H., Лукьянчук Н.П., Шишкин Г.В., Жиже Р., Власов В.В. Имидазолсодержащие производные, моделирующие активный центр РНКазы А. Синтез и РНК-расщепляющая активность.//Докл. Акад. Наук. 1999. Т. 364. С. 690-694.

26. Kuznetsova I.L., Zenkova М.А., Gross H.J., Vlassov V.V. Enhanced RNA cleavage within bulge-loops by an artificial ribonuclease// Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 1201-1212.

27. Bibillo A., Figlerowicz M., Ziomek K., Kierzek R. The nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides. VII. Structural elements affecting hydrolysis// Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000. V. 19. P. 977-994.

28. Zagorowska I., Kuusela S., Lonnberg H. Metal ion-dependent hydrolysis of RNA phosphodiester bonds within hairpin loops. A comparative kinetic study on chimeric ribo/2-O-methylribo oligonucleotides// Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3392-3396.

29. Kaukinen U., Lonnberg H., Perakyla M. Stabilisation of the transition state of phosphodiester bond cleavage within linear single-stranded oligoribonucleotides// Org. Biomol. Chem. 2004. V. 2. P. 66-73.

30. Kaukinen U., Lyytikainen S., Mikkola S„ Lonnberg H. The reactivity of phosphodiester bonds within linear single-stranded oligoribonucleotides is strongly dependent on the base sequence// Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 468-474.

31. Soukup G.A., Breaker R.R. Relationship between intemucleotide linkage geometry and the stability of RNA// RNA. 1999. V. 5. P. 1308-1325.

32. Hosaka H., Sakabe I., Sakamoto K, Yokoyama S., Takaku H. Sequence-specific cleavage of oligoribonucleotide capable of forming a stem and loop structure// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 20090-20094.

33. Raines R.T. Ribonuclease All Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1045-1066.

34. Oh B.K., Frank D.N., Pace N.R. Participation of the З'-ССА of tRNA in the binding of catalytic Mg2+ ions by ribonuclease P// Biochemistry. 1998. V. 37. P. 7277-7283.

35. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Фаир-Пресс, 1998, 715

36. Barnard Е.А. Biological function of pancreatic ribonuclease// Nature. 1969. V. 221. P. 340-344.

37. Smith B.D., Raines R.T. Genetic selection for critical residues in ribonucleases// J Moi Biol. 2006. V. 362. P. 459-478.

38. Rutkoski T.J., Kurten E.L., Mitchell J.C., Raines R.T. Disruption of shape-complementarity markers to create cytotoxic variants of ribonuclease A// J. Mol. Biol. 2005. V. 354. P. 41-54.

39. Beintema J.J., Schuller C., Irie M., Carsana A. Molecular evolution of the ribonuclease superfamily// Prog. Biophys. Mol. Biol. 1988. V. 51. P. 165-192.

40. Kartha G., Bello J., HarkerD. Tertiary structure of ribonuclease// Nature. 1967. V. 213. P. 862865.

41. Rico M., Bruix M., Santoro J., Gonzalez C., Neira J.L., Nieto J.L., Herranz J. Sequential 1H-NMR assignment and solution structure of bovine pancreatic ribonuclease All Eur. J. Biochem. 1989. V. 183. P. 623-638.

42. Robertson A.D., Purisima E.O., Eastman M.A., Scheraga H.A. Proton NMR assignments and regular backbone structure of bovine pancreatic ribonuclease A in aqueous solution// Biochemistry. 1989. V. 28. P. 5930-5938.

43. Udgaonkar J.B., Baldwin R.L. NMR evidence for an early framework intermediate on the folding pathway of ribonuclease A// Nature. 1988. V. 335. P. 694-699.

44. Richardson J.S. The anatomy and taxonomy of protein structure//Adv. Protein Chem. 1981. V. 34. P. 167-339.

45. Klink T.A., Woycechowsky K.J., Taylor K.M., Raines R.T. Contribution of disulfide bonds to the conformational stability and catalytic activity of ribonuclease A// Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 566-572.

46. McPherson A., Brayer G., Morrison R. Structure of the crystalline complex between ribonuclease A and D(pA)4// Biophys. J. 1986. V. 49. P. 209-219.

47. McPherson A., Brayer G., Cascio D., Williams R. The mechanism of binding of a polynucleotide chain to pancreatic ribonuclease// Science. 1986. V. 232. P. 765-768.

48. Birdsall D.L., McPherson A. Crystal structure disposition of thymidylic acid tetramer in complex with ribonuclease All J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 22230-22236.

49. Fontecilla-Camps J.C., de Llorens R., le Du M.H., Cuchillo C.M. Crystal structure of ribonuclease A.d(ApTpApApG) complex. Direct evidence for extended substrate recognition// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 21526-21531.

50. Zegers I., Maes D., Dao-Thi M.H., Poortmans F., Palmer R., Wyns L. The structures of RNase A complexed with З'-СМР and d(CpA): active site conformation and conserved water molecules//-Protein Sci. 1994. V. 3. P. 2322-2339.

51. AguilarC.F., Thomas P.J., Mills A., Moss D.S., Palmer R.A. Newly observed binding mode in pancreatic ribonuclease//J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 265-267.

52. Nogues M.V., Vilanova M., Cuchillo C.M. Bovine pancreatic ribonuclease A as a model of an enzyme with multiple substrate binding sites// Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1253. P. 16-24.

53. Pares X., Nogues M.V., de Llorens R., Cuchillo C.M. Structure and function of ribonuclease A binding subsites// Essays Biochem. 1991. V. 26. P. 89-103.

54. Mousaoui M., Cuchillo C.M., Nogues M.V. A phosphate-binding subsite in bovine pancreatic ribonuclease A can be converted into a very efficient catalytic site.// Protein Science. 2006. P. 99109.

55. Barnard E.A. Ribonucleases//Annu. Rev. Biochem. 1969. V. 38. P. 677-732.

56. Hemes D.G., Mathias A.P., Rabin B.R. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. 3. The pH-dependence of the kinetic parameters for the hydrolysis of cytidine 2',3-phosphate// Biochem. J. 1962. V. 85. P. 127-134.

57. Thompson J.E., Venegas F.D., Raines R.T. Energetics of catalysis by ribonucleases: fate of the 2',3-cyclic phosphodiester intermediate// Biochemistry. 1994. V. 33. P. 7408-7414.

58. Trautwein K., Holliger P., Stackhouse J., Benner S.A Site-directed mutagenesis of bovine pancreatic ribonuclease: lysine-41 and aspartate-121// FEBS Lett. 1991. V. 281. P. 275-277.

59. Roberts G.C., Dennis E.A., Meadows D.H., Cohen J.S., Jardetzky O. The mechanism of action of ribonuclease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 62. P. 1151-1158.

60. Gerlt J.A., Gassman P.G. Understanding the rates of certain enzyme-catalyzed reactions: proton abstraction from carbon acids, acyl-transfer reactions, and displacement reactions of phosphodiesters//Biochemistry. 1993. V. 32. P. 11943-11952.

61. Quirk D.J., Raines R.T His . Asp catalytic dyad of ribonuclease A: histidine pKa values in the wild-type, D121N, and D121A enzymes// Biophys. J. 1999. V. 76. P. 1571-1579.

62. Schultz L.W., Quirk D.J., Raines R.T His.Asp catalytic dyad of ribonuclease A: structure and function of the wild-type, D121N, and D121A enzymes// Biochemistry. 1998. V. 37. P. 8886-8898.

63. Veenstra T.D., Lee L. NMR study of the positions of His-12 and His-119 in the ribonuclease A-uridine vanadate complex// Biophys. J. 1994. V. 67. P. 331-335.

64. Lin M.C., Gutte B., Caldi D.G., Moore S., Merrifield R.B. Reactivation of des (119-124) ribonuclease A by mixture with synthetic COOH-terminal peptides; the role of phenylalanine-120// J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 4768-4774.

65. Lin M.C., Gutte B., Moore S., Merrifield R.B. Regeneration of activity by mixture of ribonuclease enzymically degraded from the COOH terminus and a synthetic COOH-terminal tetradecapeptide// J. Biol. Chem. 1970. V. 245. P. 5169-5170.

66. Quirk D.J., Park C., Thompson J.E., Raines R.T. His.Asp catalytic dyad of ribonuclease A: conformational stability of the wild-type, D121N, D121A, and H119A enzymes// Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17958-17964.

67. Watt E.D., Shimada H., Kovrigin E.L., Loria J.P. The mechanism of rate-limiting motions in enzyme function// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 11981-11986.

68. Toiron C., Gonzalez C., Bruix M., Rico M. Three-dimensional structure of the complexes of ribonuclease A with 2',5-CpA and 3',5'-d(CpA) in aqueous solution, as obtained by NMR and restrained molecular dynamics// Protein Sci. 1996. V. 5. P. 1633-1647.

69. Borkakoti N. The active site of ribonuclease A from the crystallographic studies of ribonuclease-A-inhibitor complexes//Eur. J. Biochem. 1983. V. 132. P. 89-94.

70. Wlodawer A., Miller M., Sjolin L. Active site of RNase: neutron diffraction study of a complex with uridine vanadate, a transition-state analog// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 36283631.

71. Burbaum J. J., Raines R.T., Albery W.J., Knowles J.R. Evolutionary optimization of the catalytic effectiveness of an enzyme// Biochemistry. 1989. V. 28. P. 9293-9305.

72. Albery W.J., Knowles J.R. Evolution of enzyme function and the development of catalytic efficiency// Biochemistry. 1976. V. 15. P. 5631-5640.

73. FindlayD., Hemes D.G., Mathias A.P., Rabin B.R., Ross C.A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease// Nature. 1961. V. 190. P. 781-784.

74. Usher D.A., Erenrich E.S., Eckstein F. Geometry of the first step in the action of ribonuclease-A (in-line geometry-uridine2',3,-cyclic thiophosphate- 31 P NMR)// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 115-118.

75. Usher D.A., Richardson D.I., Jr., Eckstein F. Absolute stereochemistry of the second step of ribonuclease action// Nature. 1970. V. 228. P. 663-665.

76. Ladner J.E., Wladkowski B.D., Svensson L.A., Sjolin L, Gilliland G.L X-ray structure of a ribonuclease A-uridine vanadate complex at 1.3 A resolution// Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1997. V. 53. P. 290-301.

77. Warshel A., Sharma P.K., Kato M., Xiang Y., Liu H., Olsson M.H. Electrostatic basis for enzyme catalysis// Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 3210-3235.

78. Ui N. Isoelectric points and conformation of proteins. I. Effect of urea on the behavior of some proteins in isoelectric focusing// Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 229. P. 567-581.

79. Felsenfeld G., Sandeen G., Vonhippel P.H. The Destabilizing Effect Of Ribonuclease On The Helical Dna Structure// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. V. 50. P. 644-651.

80. Jensen D.E., von Hippel P.H. DNA "melting" proteins. I. Effects of bovine pancreatic ribonuclease binding on the conformation and stability of DNA// J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 7198-7214.

81. Record M.T., Jr., Woodbury C.P., Lohman T.M. Na+ effects on transition of DNA and polynucleotides of variable linear charge density// Biopolymers. 1976. V. 15. P. 893-915.

82. FisherB.M., Grilley J.E., Raines R.T. A new remote subsite in ribonuclease A// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 34134-34138.

83. Irie M., Watanabe H., Ohgi K., Tobe M., Matsumura G., Arata Y., Hirose T., Inayama S. Some evidence suggesting the existence of P2 and B3 sites in the active site of bovine pancreatic ribonuclease A// J. Biochem (Tokyo). 1984. V. 95. P. 751-759.

84. Sawada F., Irie M. Interaction of uridine-2'(3'),5'-diphosphate withibonuclease A and carboxymethylribonuclease A//J. Biochem (Tokyo). 1969. V. 66. P. 415-418.

85. Richardson R.M., Pares X., Llorens R., Nogues M.V., Cuchillo C.M. Nucleotide binding and affinity labelling support the existence of the phosphate-binding subsite p2 in bovine pancreatic ribonuclease A// Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 953. P. 70-78.

86. Pares X., Llorens R„ Arus C., Cuchillo C.M. The reaction of bovine pancreatic ribonuclease A with 6-chloropurineriboside 5'-monophosphate. Evidence on the existence of a phosphate-binding sub-site// Eur. J. Biochem. 1980. V. 105. P. 571-579.

87. Cuchillo C.M., Moussaoui M„ Barman T., Travers F., Nogues M.V. The exo- or endonucleolytic preference of bovine pancreatic ribonuclease A depends on its subsites structure and on the substrate size// Protein Sci. 2002. V. 11. P. 117-128.

88. Beintema J. J., Campagne R.N. Molecular evolution of rodent insulins// Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 10-18.

89. Wlodawer A., Svensson L.A., Sjolin L., Gilliland G.L. Structure of phosphate-free ribonuclease A refined at 1.26 A// Biochemistry. 1988. V. 27. P. 2705-2717.

90. Fisher B.M., Ha J.H., Raines R.T. Coulombic forces in protein-RNA interactions: binding and cleavage by ribonuclease A and variants at Lys7, Arg10, and Lys66// Biochemistry. 1998. V. 37. P. 12121-12132.

91. Beintema J.J. Presence of a basic amino acid residue at either position 66 or 122 is a condition for enzymic activity in the ribonuclease superfamily// FEBS Lett. 1989. V. 254. P. 1-4.

92. Anderson C.F., Record M.T., Jr. Salt-nucleic acid interactions// Annu Rev Phys Chem. 1995. V. 46. P. 657-700.

93. Park C., Raines R.T. Catalysis by ribonuclease A is limited by the rate of substrate association// Biochemistry. 2003. V. 42. P. 3509-3518.

94. Haffner P.H., Wang J.H. Chemical kinetic and proton magnetic resonance studies of 5'-adenosine monophosphate binding to ribonuclease A// Biochemistry. 1973. V. 12. P. 1608-1617.

95. Beintema J.J. Structure, properties and molecular evolution of pancreatic-type ribonucleases.// Life Chem.Rep. 1987. V. 4. P. 333-389.

96. Bruenger A., Brooks, C. & Karplus, M. Active site dynamics of ribonuclease.// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 8458-8462.

97. Sorrentino S., Libonati M. Human pancreatic-type and nonpancreatic-type ribonucleases: a direct side-by-side comparison of their catalytic properties//Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 312. P. 340-348.

98. Tarragona-Fiol A., Eggelte H.J., Harbron S., Sanchez E., Taylorson C.J., Ward J.M., Rabin B.R. Identification by site-directed mutagenesis of amino acids in the B2 subsite of bovine pancreatic ribonuclease A// Protein Eng. 1993. V. 6. P. 901-906.

99. Witzel H., Barnard E.A. Mechanism and binding sites in the ribonuclease reaction. II. Kinetic studies on the first step of the reaction// Biochem Biophys Res Commun. 1962. V. 7. P. 295-299.

100. Gilliland GL D.J., Pechik I, Svensson LA & Sjolin L. The active site of bovine pancreatic ribonuclease: an example of solvent modulated specificity.// Protein Pept. Lett. 1994. V. 1. P. 6065.

101. Wodak S.Y. The structure of cytidilyl(2',5')adenosine when bound to pancreatic ribonuclease S// J. Mol. Bio!. 1977. V. 116. P. 855-875.

102. Leónidas D.D., Shapiro R., Irons L.I., Russo N., Acharya K.R. Crystal structures of ribonuclease A complexes with 5'-diphosphoadenosine 3'-phosphate and 5'-diphosphoadenosine 2'-phosphate at 1.7 A resolution// Biochemistry. 1997. V. 36. P. 5578-5588.

103. Jardine A.M., Leónidas D.D., Jenkins J.L., Park C., Raines R.T., Acharya K.R., Shapiro R. Cleavage of 3',5'-pyrophosphate-linked dinucleotides by ribonuclease A and angiogenin// Biochemistry. 2001. V. 40. P. 10262-10272.

104. Hatzopoulos G.N., Leónidas D.D., Kardakaris R„ Kobe J., Oikonomakos N.G. The binding of IMP to ribonuclease A// FEBS J. 2005. V. 272. P. 3988-4001.

105. Seshadrí K, Rao V.S., Vishveshwara S. Interaction of substrate uridyl 3',5'-adenosine with ribonuclease A: a molecular dynamics study// Biophys. J. 1995. V. 69. P. 2185-2194.

106. Irie M., Mikami F., Monma K., Ohgi K., Watanabe H., Yamaguchi R., Nagase H. Kinetic studies on the cleavage of oligouridylic acids and poly U by bovine pancreatic ribonuclease A/I J. Biochem (Tokyo). 1984. V. 96. P. 89-96.

107. Boque L., Gracia Coll M., Vilanova M., Cuchillo C.M., Fita I. Structure of ribonuclease A derivative II at 2.1-A resolution// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 19707-19712.

108. Strydom D.J., FettJ.W., Lobb R.R., Alderman E.M., Bethune J.L., Riordan J.F., Vallee B.L. Amino acid sequence of human tumor derived angiogenin// Biochemistry. 1985. V. 24. P. 54865494.

109. Kurachi K., Davie E.W., Strydom D.J., Riordan J.F., Vallee B.L. Sequence of the cDNA and gene for angiogenin, a human angiogenesis factor// Biochemistry. 1985. V. 24. P. 5494-5499.

110. Mosimann S.C., Ardelt W., James M.N. Refined 1.7 A X-ray crystallographic structure of P-30 protein, an amphibian ribonuclease with anti-tumor activity// J. Mol. Biol. 1994. V. 236. P. 11411153.

111. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen K. Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases// J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 245-251.

112. Liao Y.D. A pyrimidine-guanine sequence-specific ribonuclease from Rana catesbeiana (bullfrog) oocytes// Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 1371-1377.

113. Titani K„ Takio K., Kuwada M„ Nitta K„ Sakakibara F., Kawauchi H., Takayanagi G., Hakomori S. Amino acid sequence of sialic acid binding lectin from frog (Rana catesbeiana) eggs// Biochemistry. 1987. V. 26. P. 2189-2194.

114. Lou Y.C., Huang Y.C., Pan Y.R., Chen C., Liao Y.D. Roles of N-terminal pyroglutamate in maintaining structural integrity and pKa values of catalytic histidine residues in bullfrog ribonuclease 3// J. Mol. Biol. 2006. V. 355. P. 409-421.

115. Leland P.A., Raines R.T. Cancer chemotherapy-ribonucleases to the rescue// Chem. Biol. 2001. V. 8. P. 405-413.

116. Arnold U., Schulenburg C., Schmidt D., Ulbrích-Hofmann R. Contribution of structural peculiarities of onconase to its high stability and folding kinetics// Biochemistry. 2006. V. 45. P. 3580-3587.

117. Acharya K.R., Shapiro R., Allen S.C., Riordan J.F., Vallee B.L. Crystal structure of human angiogenin reveals the structural basis for its functional divergence from ribonuclease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 2915-2919.

118. Nogues M.V., Moussaoui M„ Boix £., Vilanova M., Ribo M., Cuchillo C.M. The contribution of noncatalytic phosphate-binding subsites to the mechanism of bovine pancreatic ribonuclease A// Cell Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 766-774.

119. Liao Y.D., Huang H.C., Leu Y J., Wei C.W., Tang P.C., Wang S.C. Purification and cloning of cytotoxic ribonucleases from Rana catesbeiana (bullfrog)// Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 4097-4104.

120. Russo N., Acharya K.R., Vallee B.L., Shapiro R. A combined kinetic and modeling study of the catalytic center subsites of human angiogeninII Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 804-808.

121. Hartley R.W. Homology between prokaryotic and eukaryotic ribonucleases// J. Mol. Evol. 1980. V. 15. P. 355-358.

122. Sato K., Egami F. The specificity of T1 ribonuclease.// C R Seances Soc. Biol. Fil. 1957. V. 151. P. 1792-1796.

123. Heinemann U., Saenger W. Specific protein-nucleic acid recognition in ribonuclease T1-2'-guanylic acid complex: an X-ray study// Nature. 1982. V. 299. P. 27-31.

124. Osterman H.L., Walz F.G., Jr. Subsites and catalytic mechanism of ribonuclease T1: kinetic studies using GpA, GpC, GpG, and GpU as substrates// Biochemistry. 1978. V. 17. P. 4124-4130.

125. Irie M. A kinetic study on ribonuclease T1 using dinucleoside phosphates as substrates// J. Biochem (Tokyo). 1968. V. 63. P. 649-653.

126. Kanaya S., Uchida T. Purification of ribonuclease T1 by affinity chromatography// J. Biochem (Tokyo). 1981. V. 89. P. 591-597.

127. Jo ChitesterB., Walz F.G., Jr. Kinetic studies of guanine recognition and a phosphate group subsite on ribonuclease T1 using substitution mutants at GIu46 and Lys41// Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 406. P. 73-77.

128. Walz F.G., Jr. Upstream subsite interactions for oligonucleotide binding with ribonuclease T1// Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1350. P. 183-188.

129. Egami F., Oshima T., Uchida T. Specific interaction of base-specific nucleases with nucleosides and nucleotides// Mol. Biol. Biochem. Biophys. 1980. V. 32. P. 250-277.

130. Backmann J., Doray C.C., Grunert H.P., Landt O., Hahn U. Extended kinetic analysis of ribonuclease T1 variants leads to an improved scheme for the reaction mechanism// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 199. P. 213-219.

131. Heinemann U., Saenger W. Crystallographic study of mechanism of ribonuclease T1-catalysed specific RNA hydrolysis// J. Biomol. Struct. Dyn. 1983. V. 1. P. 523-538.

132. De Vos S„ Doumen J., Langhorst U., Steyaert J. Dissecting histidine interactions of ribonuclease T1 with asparagine and glutamine replacements: analysis of double mutant cycles at one position// J. Mol. Biol. 1998. V. 275. P. 651-661.

133. Steyaert J., Hallenga K., Wyns L., Stanssens P. Histidine-40 of ribonuclease T1 acts as base catalyst when the true catalytic base, glutamic acid-58, is replaced by alanine// Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9064-9072.

134. Loverix S., Winqvist A., Stromberg R., Steyaert J. Mechanism of RNase T1: concerted triester-like phosphoryl transfer via a catalytic three-centered hydrogen bond// Chem. Biol. 2000. V. 7. P. 651-658.

135. Sugio S., Amisaki T., Ohishi H., Tomita K. Refined X-ray structure of the low pH form of ribonuclease T1-2'-guanylic acid complex at 1.9 A resolution// J. Biochem (Tokyo). 1988. V. 103. P. 354-366.

136. Ami R., Heinemann U., Tokuoka R., Saenger W. Three-dimensional structure of the ribonuclease T1 2-GMP complex at 1.9-A resolution// J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1535815368.

137. Inagaki F., Shimada I., Miyazawa T. Binding modes of inhibitors to ribonuclease T1 as studied by nuclear magnetic resonance// Biochemistry. 1985. V. 24. P. 1013-1020.

138. Takahashi K. The structure and function of ribonuclease T1. IX. Photooxidation of ribonuclease T1 in the presence of rose bengal// J. Biochem (Tokyo). 1970. V. 67. P. 833-839.

139. Walz F.G., Jr. Spectrophotometry titration of a single carboxyl group at the active site of ribonuclease T1// Biochemistry. 1977. V. 16. P. 4568-4571.

140. Koepke J., Maslowska M., Heinemann U., Saenger W. Three-dimensional structure of ribonuclease T1 complexed with guanylyl-2',5'-guanosine at 1.8 A resolution// J. Mol. Biol. 1989. V. 206. P. 475-488.

141. Sugio S., Oka K, Ohishi H., Tomita K, Saenger W. Three-dimensional structure of the ribonuclease T1 X 3-guanylic acid complex at 2.6 A resolution// FEBS Lett. 1985. V. 183. P. 115118.

142. Kostrewa D., Choe H.W., Heinemann U., Saenger W. Crystal structure of guanosine-free ribonuclease T1, complexed with vanadate (V), suggests conformational change upon substrate binding// Biochemistry. 1989. V. 28. P. 7592-7600.

143. Zegers I., Verheist P., Choe H.W., Steyaert J., Heinemann U., Saenger W., Wyns L. Role of histidine-40 in ribonuclease T1 catalysis: three-dimensionalstructures of the partially active His40Lys mutant// Biochemistry. 1992. V. 31. P. 11317-11325.

144. Koellner G., Choe H.W., Heinemann U., Grunert H.P., Zouni A., Hahn U., Saenger W. His92Ala mutation in ribonuclease T1 induces segmental flexibility. An X-ray study// J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 701-713.

145. Koellner G., Grunert H.P., Landt O., Saenger W. Crystal structure of the Tyr45Trp mutant of ribonuclease T1 in a complex with 2-adenylic acid//Eur. J. Biochem. 1991. V. 201. P. 199-202.

146. Martinez-Oyanedel J., Choe H.W., Heinemann U., Saenger W. Ribonuclease T1 with free recognition and catalytic site: crystal structure analysis at 1.5 A resolution// J. Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 335-352.

147. Malin R„ Zieienkiewicz P., Saenger W. Structurally conserved water molecules in ribonuclease T1// J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 4848-4852.

148. Steyaert J., Haikal A.F., Wyns L., Stanssens P. Subsite interactions of ribonuclease T1: Asn36 and Asn98 accelerate GpN transesterification through interactions with the leaving nucleoside N// Biochemistry. 1991. V. 30. P. 8666-8670.

149. Steyaert J., Wyns L., Stanssens P. Subsite interactions of ribonuclease T1: viscosity effects indicate that the rate-limiting step of GpN transesterification depends on the nature of N// Biochemistry. 1991. V. 30. P. 8661-8665.

150. Zegers I., Loris R., Dehoiiander G., Fattah Haikal A., Poortmans F., Steyaert J., Wyns L. Hydrolysis of a slow cyclic thiophosphate substrate of RNase T1 analyzed by time-resolved crystallography// Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 280-283.

151. Thompson J.E.R., R.T. Value of general acid-base catalysis to ribonuclease A.// J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 5467-5468.

152. Herschlag D. Ribonuclease revisited: catalysis via the classical general acid-base mechanism or a triester-like mechanism?// J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 11631-11635.

153. Breslow R., Chapman W.H., Jr. On the mechanism of action of ribonuclease A: relevance of enzymatic studies with a p-nitrophenylphosphate ester and a thiophosphate ester// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 10018-10021.

154. Wladkowski B.D., Krauss, M. & Stevens, W.J. Transphosphorylation catalyzed by ribonuclease A: computational study using ab initio effective fragment potentials.// J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 10537-10545.

155. Eckstein F., Schulz H.H., Ruterjans H., Haar W., Maurer W. Stereochemistry of the transesterification step of ribonuclease T 1// Biochemistry. 1972. V. 11. P. 3507-3512.

156. Pletinckx J., Steyaert J., Zegers I., Choe H.W., Heinemann U., Wyns L. Crystallographic study of Glu58Ala RNase T1 x 2'-guanosine monophosphate at 1.9-A resolution// Biochemistry. 1994. V. 33. P. 1654-1662.

157. Ding J., Koellner G., Grunert H.P., Saenger W. Crystal structure of ribonuclease T1 complexed with adenosine 2'-monophosphate at 1.8-A resolution// J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15128-15134.

158. Czaja R., Struhalla M„ Hoschler K., Saenger W., Strater N. Hahn U. RNase T1 variant RV cleaves single-stranded RNA after purines due to specific recognition by the Asn46 side chain amide// Biochemistry. 2004. V. 43. P. 2854-2862.

159. Campbell M.K., Ts'o P.O. Binding of purine nucleoside monophosphates by ribonuclease T-1. A model system for protein nucleic acid interaction// Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 232. P. 427-435.

160. Hirono S., Kollman P.A. Calculation of the relative binding free energy of 2'GMP and 2AMP to ribonuclease T1 using molecular dynamics/free energy perturbation approaches// J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 197-209.

161. Lovehx S., Doumen J., Steyaert J. Additivity of protein-guanine interactions in ribonuclease T1// J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 9635-9639.

162. Granzin J., Puras-Lutzke R., Landt O., Grunert H.P., Heinemann U., Saenger W., Hahn U. RNase T1 mutant Glu46Gln binds the inhibitors 2'GMP and 2AMP at the 3' subsite// J. Mol. Biol. 1992. V. 225. P. 533-542.

163. Steyaert J., Opsomer C„ Wyns L, Stanssens P. Quantitative analysis of the contribution of Glu46 and Asn98 to the guanosine specificity of ribonuclease T1// Biochemistry. 1991. V. 30. P. 494-499.

164. Hirono S., Kollman P.A. Relative binding free energy calculations of inhibitors to two mutants (Glu46—Ala/Gin) of ribonuclease T1 using molecular dynamics/free energy perturbation approaches// Protein Eng. 1991. V. 4. P. 233-243.

165. Hubner В., Haensler M., Hahn U. Modification of ribonuclease T1 specificity by random mutagenesis of the substrate binding segment// Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1371-1376.

166. Hoschler K., Hoier H., Hubner В., Saenger W„ Orth P., Hahn U. Structural analysis of an RNase T1 variant with an altered guanine binding segment// J. Mol. Biol. 1999. V. 294. P. 12311238.

167. Czaja R., Perbandt M., Betzel C„ Hahn U. Purine activity of RNase T1RV is further improved by substitution of Trp59 by tyrosine// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 336. P. 882-889.

168. Walz F.G., Jr., Osterman H.L., Libertin C. Base-group specificity at the primary recognition site of ribonuclease T for minimal RNA substrates//Arch. Biochem. Biophys. 1979. V. 195. P. 95102.

169. Yoshida H. The ribonuclease T1 family// Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 28-41.

170. Noguchi S., Satow Y., Uchida Т., Sasaki C„ Matsuzaki T. Crystal structure of Ustilago sphaerogena ribonuclease U2 at 1.8 A resolution// Biochemistry. 1995. V. 34. P. 15583-15591.

171. Breslow R., Xu R. Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1986. V. 90. P. 1201-1207.

172. Fouace S., Gaudin C., Picard S., Corvaisier S., Renault J., Carboni В., Felden B. Polyamine derivatives as selective RNaseA mimics// Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 151-157.

173. Bibillo A., Figlerowicz M., Kierzek R. The non-enzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides VI. The role of biogenic polyamines// Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3931-3937.

174. Vlassov V.V., ZuberG., Felden В., BehrJ.P., Giege R. Cleavage of tRNA with imidazole and spermine imidazole constructs: a new approach for probing RNA structure// Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3161-3167.

175. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1987, с. 584.

176. Walt F., Lima V., Crooke S.T. Highly efficient endonucleolytic cleavage of RNA by a Cys2His2 zinc-finger peptide.// Proc. Natl. Acad. Sei. 1999. V. 96. P. 10010-10015.

177. Mironova N.L., Pyshnyi D.V., Ivanova E.M., Zenkova M.A., Gross H.J., Vlassov V.V. Covalently attached oligodeoxyribonucleotides induce RNase activity of a short peptide and modulate its base specificity// Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1928-1936.

178. Michaelis К, Kaiesse M. Selective cleavage of unpaired uridines with a tyrosine-cyclen conjugate// Chembiochem. 2001. V. 2. P. 79-83.

179. Зенкова М.А., Чумакова Н.Л., Власов A.B., Комарова Н.И., Веньяминова А.Г., Власов В.В., Сильников В.Н. Синтетические конструкции, функционально имитирующие рибонуклеазу А.// Мол. Биология. 2000. Т. 34. С. 456-460.

180. Коневец Д.А., Зенкова M.A., Сильников B.H., Власов B.B. Синтетические молекулы, катализирующие гидролиз РНК// Докл. РАН. 1998. Т. 360. С. 554-558.

181. Burakova Е.А., Kovalev N.A., Kuznetsova IL., Zenkova M.A., Vlasov V.V., Sil'nikov V.N. Polycationic catalysts for phosphodiester bond cleavage on the basis of 1,4-diazabicyclo[2.2.2.octane]// Bioorg. Khim. 2007. V. 33. P. 563-570.

182. Kovalev N., Burakova E„ Silnikov V., Zenkova M., Vlassov V. Artificial ribonucleases: from combinatorial libraries to efficient catalysts of RNA cleavage// Bioorg. Chem. 2006. V. 34. P. 274286.

183. Kovalev N.A., Medvedeva D.A., Zenkova M.A., Vlassov V.V. Cleavage of RNA by an amphiphilic compound lacking traditional catalytic groups// Bioorg. Chem. 2008. V. 36. P. 33-45.

184. Emilsson G.M., Nakamura S., Roth A., Breaker R.R. Ribozyme speed limits// Rna. 2003. V. 9. P. 907-918.

185. Белоглазова Н.Г., Тамкович H.B., Никитин П.А., Кузнецова И.П., Зенкова М.А., Власов В.В. Искусственные рибонуклеазы новый класс для биологии и медицины.// Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. С. 382 - 395.

186. Dock-Bregeon A.C., Moras D. Conformational changes and dynamics of tRNAs: evidence from hydrolysis patterns// Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987. V. 52. P. 113-121.

187. Milligan J.F., Uhlenbeck O.C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase// Methods Enzymol. 1989. V. 180. P. 51-62.

188. England Т.Е., Bruce A.G., Uhlenbeck O.C. Specific labeling of 3' termini of RNA with T4 RNA ligase// Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 65-74.

189. Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A.L., Rajbhandary U.L. Studies on the sequence of the З'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA// Eur. J. Biochem. 1977. V. 72. P. 465-478.

190. Donis-Keller H., Maxam A.M., Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA// Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 2527-2538.

191. Власов A.B., Власов В.В., Жьеже Р. Катализируемый имидазолом гидролиз РНК как реакция для исследования вторичной структуры РНК и комплексов РНК с олигонуклеотидами//Докл. Акад. Наук. 1996. Т. 349. С. 411-413.

192. Ehresmann С., Baudin F., Mougel М., Romby P., Ebel J.P., Ehresmann B. Probing the structure of RNAs in solution// Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 9109-9128.

193. Giege R., Felden В., Zenkova M.A., Sil'nikov V.N., Vlassov V.V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics// Meth. Enzymol. 2000. V. 318. P. 147-165.

194. Endo M., Hirata K., Inokawa Т., Matsumura K., Komiyama M„ lhara Т., Sueda S., Takagi M. Site-specific hydrolysis of yeast tRNAPhe by anthraquinone-glycine and anthraquinone-iminodiacetate conjugates// Nucleic Acids Symp. Ser. 1995. P. 109-110.

195. Zhong M., Kallenbach N.R. Mapping tRNA and 5S RNA tertiary structures by charge dependent Fe(ll)-catalyzed cleavage// J. Biomol. Struct. Dyn. 1994. V. 11. P. 901-911.

196. Komiyama M., Inokawa T. Selective hydrolysis of tRNA by ethylenediamine bound to a DNA oligomer//J. Biochem (Tokyo). 1994. V. 116. P. 719-720.

197. Komiyama M„ Inokawa Т., Shiiba Т., Takeda N., Yoshinari K, Yashiro M. Molecular design of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases// Nucleic Acids Symp. Ser. 1993. P. 197-198.

198. Guan L.L., Totsuka R„ Kuwahara J., Otsuka M., Sugiura Y. Cleavage of yeast tRNA(phe) with Ni(lll) and Co(lll) complexes of bleomycin// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 191. P. 1338-1346.

199. Huttenhofer A., Hudson S., Noller H.F., Mascharak P.K. Cleavage of tRNA by Fe(ll)-bleomycin// J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24471-24475.

200. Isel C., Ehresmann C., Keith G., Ehresmann В., Marquet R. Initiation of reverse transcription of HIV-1: secondary structure of the HIV-1 RNA/tRNA(3Lys) (template/primer)// J Mol Biol. 1995. V. 247. P. 236-250.

201. Riepe A., Beier H., Gross H.J. Enhancement of RNA self-cleavage by micellar catalysis// FEBS Lett. 1999. V. 457. P. 193-199.

202. Wang D.A., Narang A.S., Kotb M„ Gaber A.O., Miller D.D., Kim S.W., Mahato R.I. Novel branched poly(ethylenimine)-cholesterol water-soluble lipopolymers for gene delivery// Biomacromolecules. 2002. V. 3. P. 1197-1207.

203. Thomas M., Lu J.J., Ge Q„ Zhang C„ Chen J., Klibanov A.M. Full deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery efficiency and specificity to mouse lung// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 5679-5684.

204. Da Poian A.T., Carneiro F.A., Stauffer F. Viral membrane fusion: is glycoprotein G of rhabdoviruses a representative of a new class of viral fusion proteins?// Braz. J. Med. Biol. Res. 2005. V. 38. P. 813-823.

205. Breslow R., Labelle M. Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidazole//J. Amer. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 2655-2659.

206. Wilson W.D., Wang Y.H., Kusuma S., Chandrasekaran S., Boykin D.W. The effect of intercalator structure on binding strength and base-pair specificity in DNA interactions// Biophys. Chem. 1986. V. 24. P. 101-109.

207. Досон P., Эллиот Д., Эллиот Э., Джонс К. Справочник биохимика. Пер. с англ. М.: Мир, 1991, 544 (R.M.C. Dawson, D.C. Elliot, W.H. Elliot, K.M. Jones. Data for boichemical research. Oxford; Oxford University Press; 1986)

208. Kaukinen U„ Venalainen Т., Lonnberg H., Perakyla M. The base sequence dependent flexibility of linear single-stranded oligoribonucleotides correlates with the reactivity of the phosphodiester bond// Org. Biomol. Chem. 2003. V. 1. P. 2439-2447.

209. Maglott E.J., Deo S.S., Przykorska A., Glick G.D. Conformational transitions of an unmodified tRNA: implications for RNA folding// Biochemistry. 1998. V. 37. P. 16349-16359.

210. Petyuk V.A., Zenkova M.A., Giege R., Vlassov V. V. Hybridization of antisense oligonucleotides with the 3'part of tRNA(Phe)// FEBS Lett. 1999. V. 444. P. 217-221.

211. Helm M., Brule H., Degoul F„ Cepanec C„ Leroux J.P., Giege R„ Florentz C. The presence of modified nucleotides is required for cloverleaf folding of a human mitochondrial tRNA// Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1636-1643.

212. Serebrov V., Vasilenko K.S., Kholod N.S., Kiselev L.L. Mg2+ ions differently affect the physical properties of tRNA(Phe) and the transcript of its gene.// Mol. Biol (Mosk). 1997. V. 31. P. 894-900.

213. Nagaswamy U., Gao X., Martinis S.A., Fox G.E. NMR structure of a ribosoma! RNA hairpin containing a conserved CUCAA pentaloop// Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 5129-5139.

214. JuckerF.M., Pardi A. GNRA tetraloops make a U-turn// Rna. 1995. V. 1. P. 219-222.

215. Freier S.M., Hill K.O., Dewey T.G., Marky L.A., BreslauerK.J., TurnerD.H. Solvent effects on the kinetics and thermodynamics of stacking in poly(cytidylic acid)// Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1419-1426.

216. Giege R„ Puglisi J.D., Florentz C. tRNA structure and aminoacylation efficiency// Prog Nucleic Acid Res. Mol Biol. 1993. V. 45. P. 129-206.

217. Downs W.D., Cech T.R. An ultraviolet-inducible adenosine-adenosine cross-link reflects the catalytic structure of the Tetrahymena ribozyme// Biochemistry. 1990. V. 29. P. 5605-5613.

218. Branch A.D., Benenfeld B.J., Robertson H.D. Ultraviolet light-induced crosslinking reveals a unique region of local tertiary structure in potato spindle tuber viroid and HeLa 5S RNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985.V. 82. P. 6590-6594.

219. Atmadja J., Brimacombe R., Blocker H., Frank R. Investigation of the tertiary folding of Escherichia coli 16S RNA by in situ intra-RNA cross-linking within 30S ribosomal subunits// Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 6919-6936.

220. Bergstrom D.E., Leonard N.J. Photoreaction of 4-thiouracil with cytosine. Relation to photoreactions in Escherichia coli transfer ribonucleic acids// Biochemistry. 1972. V. 11. P. 1-9.

221. Favre A., Yaniv M., Michelson A.M. The photochemistry of 4-thiouridine in Escherichia coli t-RNA Val1// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V. 37. P. 266-271.

222. Behlen L.S., Sampson J.R., Uhlenbeck O.C. An ultraviolet light-induced crosslink in yeast tRNA(Phe)// Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 4055-4059.

223. Jovine L, Djordjevic S., Rhodes D. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 2.0 A resolution: cleavage by Mg(2+) in 15-year old crystals// J. Mol. Biol. 2000. V. 301. P. 401-414.

224. Norberg J., Nilsson L. Stacking Free Energy Profiles for All 16 Natural Ribodinucleoside Monophosphates in Aqueous Solution //J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 10832-10840.

225. Inners L.D., Felsenfeld G. Conformation of polyribouridylic acid in solution// J. Mol. Biol. 1970. V. 50. P. 373-389.

226. Cannistraro V.J., Subbarao M.N., Kennell D. Specific endonucleolytic cleavage sites for decay of Escherichia coli mRNA// J. Mol. Biol. 1986. V. 192. P. 257-274.

227. Burkard M.E., Kierzek R., Turner D.H. Thermodynamics of unpaired terminal nucleotides on short RNA helixes correlates with stacking at helix termini in larger RNAs// J. Mol. Biol. 1999. V. 290. P. 967-982.

228. Filimonov V.V., Privalov P.L. Thermodynamics of base interaction in (A)n and (A.U)n// J. Mol. Biol. 1978. V. 122. P. 465-470.

229. Suurkuusk J., Alvarez J., Freire E., Biltonen R. Caiorimetric determination of the' heat capacity changes associated with the conformational transitions of polyriboadenylic acid and polyribouridylic acid//Biopolymers. 1977. V. 16. P. 2641-2652.

230. Li Y., Breaker R.R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2-Hydroxyl Group II J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 53645372.

231. Ezra F.S., Lee C.H., Kondo N.S., Danyluk S.S., Sarma R.H. Conformational properties of purine-pyrimidine and pyrimidine-purine dinucleoside monophosphates// Biochemistry. 1977. V. 16. P. 1977-1987.