Физико-химические свойства механокомпозитов бетулина и его диацилов с водорастворимыми полимерами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Маляр Юрий Николаевич

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕХАНОКОМПОЗИТОВ БЕТУ ЛИНА И ЕГО ДИАЦИЛОВ С ВОДОРАСТВОРИМЫМИ ПОЛИМЕРАМИ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Красноярск - 2014

005557683

005557683

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: Кузнецова Светлана Алексеевна - доктор

химических наук, главный научный сотрудник Институт химии и химической технологии СО РАН

Официальные оппоненты: Фабинский Павел Викторович — доктор

химических наук, доцент, ФГБОУ ВПО Сибирский государственный технологический университет (г. Красноярск)

Панкрушина Наталья Алексеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории терпеновых соединений Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН (г. Новосибирск)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт проблем переработки углеводородов Сибирского отделения Российской академии наук (ИППУ СО РАН)

Защита диссертации состоится «16» декабря 2014 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.041.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, 50, стр. 24, конференц-зал ИХХТ СО РАН; (факс+7(391 )249-41 -08. e-mail: dissovet@icct.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института химии и химической технологии СО РАН, адрес сайта: www.icct.ru.

Автореферат разослан « 5 ъ/сай^Я 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета о" Павленко Н.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы. Бетулин и его производные, получаемые из бересты березы, являются уникальными природными веществами с широким спектром фармакологической активности: противоопухолевой, противовирусной, гепатопротекторной и др. Одним из основных препятствий, ограничивающих использование бетулина и его производных в медицине и ветеринарии, является их низкая биологическая доступность, связанная с плохой растворимостью. Известным способом улучшения растворимости лекарственных веществ является механическая активация в присутствии носителей. Механическая активация лекарственных веществ приводит к диспергированию и разупорядочению их кристаллической структуры вплоть до полной аморфизации, что способствует увеличению скорости растворения и растворимости субстанций. Добавление при этом полимерного носителя может стабилизировать разупорядоченное состояние лекарственного вещества. Поэтому получение механоактивированных композитов бетулина и его диацилов с водорастворимыми полимерами, обладающих улучшенной биодоступностью и изучение их физико-химических свойств является актуальной задачей.

Цель работы — разработка способов синтеза механокомпозитов бетулина и его эфиров, обладающих повышенной растворимостью в воде; изучение их физико-химических свойств и фармакологической активности. Для достижения данной цели решались следующие задачи: -установление закономерностей формирования механокомпозитов бетулина, диацетата и дипропионата бетулина с синтетическими полимерами — полиэтиленгликолем, поливинилпирролидоном и природным полимером арабиногалактаном с помощью комплекса физико-химических методов;

-разработка оптимальных условий синтеза стабильных механокомпозитов бетулина и его эфиров с указанными полимерами, обладающих повышенной растворимостью в воде;

-изучение фармакологической активности механокомпозитов бетулина и его диацилов с полимерами. Научная новизна.

Впервые установлено, что механохимическая активация смесей бетулина с полиэтиленгликолем и поливинилпирролидоном приводит к образованию композитов, обладающих повышенной растворимостью в воде.

Впервые разработаны способы получения механокомпозитов диацетата и дипропионата бетулина с природным полисахаридом арабиногалактаном с повышенной растворимостью в воде.

Установлено, что в результате механической активации смесей бетулина с полиэтиленгликолем и поливинилпирролидоном, а также диацетата и дипропионата бетулина с арабиногалактаном происходит диспергирование, аморфизация и гомогенизация исходных веществ в матрице носителя.

Впервые установлены улучшенные гастропротекторные и противоопухолевые свойства композитов бетулина и его диацилов с полимерами по сравнению с чистыми веществами.

Практическое значение работы.

Полученные композиты бетулина и его диацилов с биосовместимыми полимерами, обладающие повышенной растворимостью в воде, биодоступностью и улучшенной гастропротекторной и противоопухолевой активностью по сравнению с исходными веществами, могут быть использованы при разработке новых фармакологических препаратов для медицины и ветеринарии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Закономерности формирования механокомпозитов бетулина с синтетическими полимерами — полиэтиленгликолем и поливинилпирролидоном путем механической активации.

2. Результаты физико-химического исследования новых механокомпозитов бетулина и его диацилов с полимерами.

3. Методы получения композитов диацилов бетулина с природным полимером арабиногалактаном, обладающих повышенной растворимостью в воде и улучшенными фармакологическими свойствами.

Личный вклад автора. Эксперименты, обработка и анализ результатов, подготовка и оформление публикаций выполнены лично или при непосредственном участии автора.

Апробация работы. Результаты, изложенные в работе, докладывались и обсуждались на следующих международных и российских научных конференциях: Международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (Санкт-Петербург, 2011); VII International Conference on Mechanochemistry and Mechanical Alloying «INCOME 2011» (Herceg Novi, Montenegro, 2011); 12th International Conference on Pharmacy and Applied Physical Chemistry «PhandTA 12» (Graz, Austria, 2012); III Международной конференции «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 2012); IV International Conference «Fundamental Bases of Mechanochemical Technologies» (Новосибирск, 2013); VIII International Conference on Mechanochemistry and Mechanical Alloying «INCOME 2014» (Krakow, Poland,2014); V и VI Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012, 2014); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (Красноярск, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2012); научной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2012, 2013); конференции молодых ученых КНЦ СО РАН. Секция «Химия» (Красноярск, 2012- 2014).

Работа проводилась в соответствии с планами НИР ИХХТ СО РАН, а также в рамках интеграционных проектов СО РАН - проект № V.46.4.3. «Развитие физико-химических основ биотехнологической и термохимической конверсии твердого органического сырья в связующие и гуминовые вещества, наноструктурированные углеродные материалы»; программы фундаментальных исследований Президиума РАН № ФНМ-03 «Получение новых форм лекарственных веществ с использованием нанотехнологий»; по проектам,

поддержанным Красноярским краевым фондом поддержки научной и научно-технической деятельности (доп. соглашение от 05.09.2012 г. № 08/12); по проектам РФФИ № 14-03-31900_мол_а и № 12-03-31433-мол_а.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, включая 5 статей в рецензируемых журналах, 2 патента, 10 тезисов докладов и материалов конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 116 страницах и включает 30 рисунков, 10 таблиц и библиографический список из 208 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи диссертационной работы, показаны научная новизна и практическая значимость работы, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен обзор литературы по методам получения и свойствам тритерпеноидов коры березы. Проанализированы способы получения бетулина и его диацилов, их физико-химические и фармакологические свойства. Показано, что основным препятствием, ограничивающим использование бетулина и его производных является их низкая растворимость. Представлены известные методы улучшения растворимости бетулина и его производных путем химической модификации с получением соединений с полярными реагентами, циклодекстринами и их производными; образованием комплексов с амфифильными полимерами и включением их в состав липосом или жировых эмульсий. Рассмотрена механохимическая активация лекарственных веществ, позволяющая улучшать как растворимость, так и их фармакологическую эффективность. На основании анализа литературы сформулированы задачи настоящего исследования.

Во второй главе описаны исходные материалы, методы и методики, используемые в экспериментальной работе, а также приведены условия физико-химических исследований.

В качестве исходных материалов использовали перекристаллизованные из этанола бетулин, диацетат бетулина (ДАБ), дипропионат бетулина (ДПБ) высокой чистоты, полученные по разработанным оригинальным методикам; в качестве носителей - полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон (ПВП), арабиногалактан (АГ) и аэросил. Структурные формулы используемых веществ представлены на рисунке 1.

Механическую активацию (МА) смесей проводили в ударно-шаровой мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США) в стальных барабанах объемом 40 мл, с использованием в качестве мелющих тел — стальных шаров диаметром 6 мм, общей массой 30 г. Масса загружаемой смеси составляла 2 г, продолжительность обработки - 5-К30 мин. Соотношение компонентов бетулин (диацетат или дипропионат бетулина) к полимеру составляло 1 : 3 и 1 : 9 (по массе). Для

сравнения были приготовлены физические смеси простым перемешиванием исходных или механически активированных компонентов.

I СНг СИ j

и,С \н3 Бетулии

Поливинилпирролидон

Полизтиленгяиколь

и он

H¡c Щ

Диацетат бетулина, R ('II,

„ _ „ /А он Арабиногалактаи

Дипропионат бетулина, R=CH,CH, / г

Рис. 1. Структурные формулы используемых веществ.

Физико-химические исследования осуществляли с помощью методов электронной микроскопии на микроскопе ТМ-1000 HITACHI (Япония); атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом мультимодовом микроскопе Solver Р47 (НТ-МДТ, Москва); дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на калориметре DSC-204 (Netzsch); монокристальной и порошковой дифрактометрии на дифрактометре D8 DISCOVER GADDS с двухкоординатным детектором Hi-Star (Bruker, Германия), и детектором STADI MP (STOE & Cié GmbH, Германия); высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «МилиХром А-02» (ЗАО «Эконова», Россия); гель-проникающей хроматографии на хроматографе Agilent 1200 с рефрактометрическим детектором 1260 Infinity (США); ИК-спектроскопиии нарушенного полного внутреннего отражения в диапазоне частот 4000-500 см"1 на Фурье ИК-спектрометре Digilab Excalibur 3100 (США).

Исследование растворимости композитов в воде проводили в тестере растворимости Varian 705 DS. В сосуд с водой помещали навески композитов 200 мг и выдерживали при постоянном перемешивании при 37°С в течение 2 суток, затем раствор отфильтровывали с помощью фильтров с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтраты подвергали выпариванию при пониженном давлении и температуре 35-40 °С в ротационном испарителе ИР-1М (Россия). Сухой остаток массой 9-10 мг подвергали трехкратной экстракции хлороформом, затем хлороформные

экстракты объединяли и выпаривали, твердый остаток после выпаривания растворяли в 1 мл этанола. Содержание бетулина и его диацилов (активных веществ) в этанольных растворах определяли хроматографически с помощью хроматографа Милихром А-02 (Россия).

В третьей главе описаны результаты исследования механокомпозитов

бетулина с синтетическими полимерами: поливинилпирролидоном и

полиэтиленгликолем, а также механокомпозитов диацилов бетулина с арабиногалактаном и аэросилом.

1. Физико-химические свойства механокомпозитов бетулина с поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем

Механохимическую обработку бетулина с поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем проводили в ударно-шаровой мельнице.

На рис. 2 представлены электронно-сканирующие изображения бетулина, а также его механоактивированных композитов с ПВП и ПЭГ. Кристаллы бетулина имеют игольчатую форму с размерами от 10 до 100 мкм, а после механической обработки измельчаются до 5-10 мкм. Механическая обработка бетулина с полимерами приводит к тому, что бетулин теряет кристалличность, смесь гомогенизируется в результате диспергирования и перемешивания компонентов, и образуются агрегаты частиц размерами 5-30 мкм (рис. 2). Анализ механически активированных образцов бетулина с помощью ВЭЖХ показал, что механическая активация не приводит к его химическим превращениям.

а)

в) г)

Рис. 2. Электронные микрофотографии: бетулина, перекристаллизованного из этанола; б) механоактивированного бетулина; в) механоактивированного композита бетулин - ПВП; г) механоактивированного композита бетулин - ПЭГ.

Разупорядочение кристаллической структуры механоактивированного бетулина подтверждается снижением интенсивности и уширением рефлексов на рентгеновской дифрактограмме (кривая 2, рис. 3). После нагревания механоактивированного бетулина при температуре 130 °С в течение 30 минут наблюдается восстановление рефлексов, присущих исходному бетулину, что говорит о частичной рекристаллизации образцов. На дифрактограмме механически активированной смеси бетулина с ПВП наблюдается наличие лишь слабых рефлексов бетулина по сравнению с соответствующей физической смесью (кривая 4, рис. 3). При нагревании механически активированной смеси при температуре 130 °С в течение 30 минут, в отличие от механоактивированного бетулина, на дифрактограммах наблюдаются лишь слабые рефлексы, присущие бетулину, что свидетельствует о стабилизации разупорядоченной кристаллической структуры и аморфизации.

28, град

Рис. 3. Рентгеновские дифрактограммы: исходного бетулина (1), механоактивированного бетулина (2), физической смеси бетулина и ПВП (3), механоактивированной смеси бетулина и ПВП (4).

В ИК-спектрах смесей бетулина с ПВП после механической активации наблюдаются изменения в области валентных колебаний гидроксильных групп (3200 - 3500 см"'), максимум полосы поглощения сдвинут в сторону низкочастотной области примерно на 60 см"1 по сравнению с полосой поглощения в спектре физической смеси компонентов, изменяется контур полосы поглощения в области 1020 см"1, соответствующей связи у(С-О) в молекуле бетулина. Это свидетельствует о взаимодействии бетулина с ПВП при механической активации с образованием водородных связей между гидроксильными группами бетулина и карбонильными группами ПВП. Взаимодействие компонентов смеси является возможной причиной отсутствия кристаллизации бетулина при нагревании механически активированной смеси. В ИК-спектрах механоактивированных смесей бетулина с ПЭГ не наблюдается каких-либо изменений, свидетельствующих об образовании водородных связей между молекулами

8

бетулина и носителя. Однако это не исключает взаимодействия между компонентами смеси, например, за счет Ван-дер-Ваальсовых сил.

Растворимость чистого бетулина в воде составляет -1,9 мг/л. Растворение механокомпозитов бетулина с ПЭГ в воде в течение 24 часов показало увеличение содержания бетулина в растворе почти до ~12 мг/л, а с ПВП до ~50 мг/л (рис. 4). Повышение растворимости может быть связано как с аморфизацией бетулина, так и с солюбилизирующим действием полимеров. При этом с увеличением количества полимера в смеси, при соотношении бетулина к полимеру 1:9 процесс образования композитов происходит более полно, что облегчает последующее растворение бетулина. Влияние ПЭГ, не образующего водородные связи с бетулином, может быть связано с образованием композита в результате распределения бетулина в полимере при механической активации, что также способствует улучшению растворимости.

Рис. 4. Концентрации бетулина, полученные при растворении его смесей с

полимерами в воде.

2. Физико-химические свойства механокомпозитов диацетата бетулина с арабиногалактаном

Механическая обработка ДАБ и ДПБ с ПВП и ПЭГ не привела к повышению их растворимости, поэтому для улучшения растворимости диацилов бетулина были получены механокомпозиты диацетата бетулина с природным полисахаридом арабиногалактаном путем совместной механической активации.

Кристаллы исходного диацетата бетулина имеют пирамидальную форму с размерами от 10 до 100 мкм, а после механической обработки ДАБ с АГ кристаллы диацетата бетулина измельчаются до размеров 5-10 мкм, смесь гомогенизируется в результате диспергирования и перемешивания компонентов и образуются агрегаты размером 5-30 мкм (рис. 5).

а б

Рис. 5. Электронные микрофотографии: а) исходный ДАБ; б) механоактивированная смесь ДАБ-АГ.

Исследование механокомпозитов диацетата бетулина с арабиногалактаном методами дифференциальной сканирующей калориметрии и рентгенофазового анализа также показало значительное разупорядочение кристаллической структуры ДАБ при увеличении продолжительности механоактивации с 5 до 30 минут (рис. 6).

ИК-спектры механоактивированных смесей диацетата бетулина с ПВГТ схожи со спектрами физической смеси механически активированных компонентов. Возможно, отсутствие в молекуле ДАБ функциональных групп, которые могли бы принимать участие в образовании водородных связей с ПВП, является причиной отсутствия взаимодействия компонентов при механической обработке. При этом в ИК-спектрах смесей ДАБ с АГ наблюдаются полосы поглощения в области 1250-1230 см"1, 1150, 1100-1000 см"1, соответствующих валентным колебаниям (СО) в диацетате бетулина и арабиногалактана (рис. 7).

20, град

Рис. 6. Дифрактограммы ДАБ (1),

смесей ДАБ с АГ, механоактивированных в течение: 5 мин (2), 15 мин (3), 30 мин (4).

щ

¡1»

ь

41»

л

ш

о

о

С

од

0.«

ft VI r o t.) 1 \\ ^ H\

VC-OO) Ш A

vC-

rf ®

1700 "500 150Я 1400 1300 1200 1100 1000 900 вой

Волновое число, см''

Рис. 7. ИК-спектры смесей ДАБ с АГ: физическая смесь (1), механоактивированная смесь (2), механоактивированный АГ(3), пленка (4).

Уширение полос поглощения в ИК-спектрах диацетата бетулина связано с разупорядочением его структуры, вероятно связанной с аморфизацией.

Гель-хроматограмма АГ имеет основной максимум с ^ М = 4,2 и небольшой пик с ^ М = 2,8 (рис. 8а). Механическая активация в течение 10 мин приводит к расщеплению основного пика вследствие появления нового максимума с

М = 3,9 и увеличению интенсивности минорного пика. При этом значительного сдвига основного максимума исходного АГ не наблюдается. Механическая активация в течение 30 мин приводит к полному сдвигу максимума с ^ М = 4,2 до ^ М = 3,9, что свидетельствует об уменьшении молекулярной массы с -16000 до -8000 у некоторой части молекул АГ. Соотношение площадей пиков ^ М = 3,9 / ^ М = 4,2 после 10 и 30 мин механической активации составляет 1,2 и 6,3, что соответствует «степени превращения» АГ в низкомолекулярное состояние — 55 и 87 %, соответственно. Растворение механоактивированных образцов АГ в воде с последующим испарением растворителя приводит к частичному «восстановлению» молекулярной массы. В случае смесей АГ с ДАБ хроматограммы механоактивированных образцов после растворения их в воде и выпаривания растворителя приобретают вид хроматограмм исходного АГ (рис. 86).

Рис. 8. Гель-хроматограммы АГ и его смесей с ДАБ а) исходный АГ (1), АГ, механоактивированный в течение 10 мин (2), 30 мин (3); б) АГ, механоактивированный в течение 10 мин, растворения в воде и последующего испарения растворителя (1), механоактивированная смесь АГ с ДАБ после растворения в воде и последующего выпаривания фильтрата (2).

Восстановление молекулярной массы после растворения в воде связано, по-видимому, с конформационной подвижностью цепей в растворах и образованием клубков, содержащих две полимерные цепи. Для подтверждения этого предположения использовали ультразвуковую обработку, чтобы разбить образующиеся в растворе клубки. Действительно, в случае ультразвукового воздействия на образцы в среде элюента молекулярная масса АГ в пленках механоактивированных смесей АГ с ДАБ не восстанавливалась.

Можно отметить, что в пленках механоактивированных образцов АГ улучшается степень полидисперсности М„/М„ за счёт более значительного «восстановления» среднечисловой молекулярной массы.

После выпаривания водных растворов смесей АГ с ДАБ при пониженном давлении и температуре были получены слабоокрашенные (желтоватые) прозрачные плёнки толщиной около 10 мкм, легко растворимые в гораздо меньших объёмах воды, нежели было использовано для их получения, с образованием вязкого раствора. Поверхность пленок ДАБ-АГ состоит из однородных частиц, имеющих сферическую либо продолговатую форму и поперечные размеры 100 — 200 нм (рис.9). Рентгенофазовый анализ показал, что пленки являются аморфными и стабильными по отношению к кристаллизации.

а б

Рис. 9. АСМ изображения пленок ДАБ-АГ, полуконтактная мода: а) рельеф; б) фазовый контраст.

Обнаружено, что ДАБ не извлекается из водного раствора смеси ДАБ с АГ при экстракции хлороформом и другими растворителями. Это говорит о том, что в водном растворе, по-видимому, образуется прочный межмолекулярный комплекс ДАБ с АГ. Аналогично, в случае пленок, полученных выпариванием водных растворов смесей ДАБ с АГ, не происходит экстракции диацетата бетулина этиловым спиртом, в котором АГ не растворим. Тем не менее, в ИК-спектрах плёнок, полученных выпариванием фильтратов, присутствуют полосы поглощения, относящиеся к ДАБ (рис. 7, кривая 4). При этом не наблюдается существенного сдвига полос в ИК-спектрах, что свидетельствует об отсутствии водородных связей между компонентами. Молекулы ДАБ, вероятно, находятся внутри полисахаридной оболочки и связаны с молекулами АГ за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий.

Известно, что чистый ДАБ практически нерастворим в воде. После механической активации ДАБ с АГ наблюдается увеличение содержания ДАБ в растворе в 10 раз по сравнению с чистым веществом и в 2 раза по сравнению с физической смесью компонентов. Содержание диацетата бетулина в пленках ДАБ - АГ, определенное с помощью ВЭЖХ анализа экстрактов, составляет 2-2,5 мас.%. При растворении пленки в воде были получены растворы с высокой концентрацией ДАБ- 150-180 мг/л.

3. Физико-химические свойства механокомпозитов дипропионтата бетулина с аэросилом и арабиногалактаном

Аналогично диацетату бетулина были получены композиты дипропионата бетулина с арабиногалактаном. Методом ВЭЖХ показано, что химический состав образцов дипропионата бетулина, так же как и диацетата бетулина, после механической активации не изменяется.

В ИК-спектрах смесей дипропионата бетулина с АГ после механической активации наблюдаются изменения в области полосы поглощения 1150 см"1, соответствующей колебаниям связи v(C-O) в молекуле ДПБ, и контур полосы в области 1720 см"1, соответствующей связи (С=0). Это свидетельствует о взаимодействии ДПБ с АГ при механической активации с образованием водородных связей между гидроксильными группами арабиногалактана и С=0 группами дипропионата бетулина (рис. 10).

Mv(C-О)

: v(c=o) i á

3Jw— -1-'-1-1-

1800 1600 1400 1200 1000 800

Волновое число, см"'

Рис. 10. ИК спектры смесей ДПБ с АГ, механоактивированных в течение: 5 минут (1), 15 минут (2), 30 минут (3).

ИК спектры механоактивированных смесей ДПБ и аэросила практически не изменяются с увеличением продолжительности обработки от 5 до 30 минут. Вероятно, при механической активации ДПБ с аэросилом не происходит существенных изменений структуры ДПБ и не образуется водородных связей.

При растворении механокомпозитов дипропионата бетулина с аэросилом в воде в течение 24 часов концентрация ДПБ в растворе возрастает в 4 раза по сравнению с физической смесью, а в случае растворения дипропионата бетулина с арабиногалактаном концентрация в растворе возрастает в 8 раз по сравнению с физической смесью исходных веществ (рис. 11).

С, мг/л

<¡0 50

Время, ч

Рис. 11. Динамика изменения концентрации ДПБ в растворе при

растворении: физической смеси ДПБ с аэросилом (1), физической смеси ДПБ с АГ (2), механоактивированной смеси ДПБ с аэросилом (3), механоактивированной смеси ДПБ с АГ (4).

На дифрактограммах

механокомпозитов ДПБ с АГ так же, как и в случае механокомпозитов ДАБ с АГ, наблюдается исчезновение рефлексов, присущих кристаллическому ДПБ, уже при продолжительности

механоактивации 15 минут (рис. 12).

Исчезновение рефлексов ДПБ может свидетельствовать об аморфизации ДПБ, что подтверждается с помощью дифференциальной сканирующей

калориметрии (рис. 13). На кривой ДСК механокомпозита ДПБ с АГ имеются лишь «следы» слабого пика плавления

30 40

20, град

Рис. 12. Дифрактограммы: чистого ДПБ (1); смесей ДПБ с АГ, механоактивированных в течение: 5 мин (2); 15 мин (3); 30 мин (4).

ДПБ с максимумом около 160°С. Большой эндотермический пик на кривой ДСК, который начинается практически при комнатной температуре и заканчивается около 150 °С, соответствует удалению воды из арабиногалактана. Дипропионат бетулина так же, как и диацетат бетулина не извлекается из растворов его смесей с АГ при экстракции хлороформом и другими растворителями.

125 150 175

0.0

О 50 100 150

Temperature / °С Рис.13. Кривые ДСК механокомпозита ДПБ с АГ. На врезке - пик плавления ДПБ.

Четвертая глава посвящена фармакологическому исследованию механокомпозитов бетулина и его диацилов с полимерами.

Проведенное токсикологическое исследование на базе аккредитованного испытательного центра г. Красноярска показало, что механокомпозиты бетулина и его диацилов с полимерами в дозе 2000 мг/кг не являются ядовитыми и, согласно международной токсикологической классификации, их можно отнести к 4 классу малотоксичных веществ.

Исследование гастропротекторной активности бетулина и его механокомпозитов с ПВП

Исследование противоязвенного действия бетулина и его механокомпозитов проводили в экспериментах in vivo согласно требованиям Фармакологического комитета МЗ и CP РФ в соответствии с методическими указаниями. Экспериментальная модель язвообразования осуществлялась путем введения через металлический зонд в желудок 4,5 мл 0,1 н HCl. Животных методом случайной выборки распределяли на 5 групп по 6 животных в каждой группе: контрольная группа; по 2 гастропротекторных и лечебных группы, получающите бетулин и механоактивированный композит бетулина с ПВП. Испытуемые вещества (бетулин и механоактивированный композит бетулина с ПВП (1:9) - в дозе 50 мг на 1 кг животного в виде взвеси в 3 мл физиологического раствора) вводили через металлический зонд в желудок животных за час до введения раствора соляной кислоты - для реализации гастропротекторной модели, либо через час после введения соляной кислоты - для лечебной модели. Контрольной группе животных за 1 час до введения HCl вводили внутрижелудочно 3 мл физиологического раствора.

Результаты проведенных экспериментов показали, что механическая активация бетулина с поливинилпирролидоном способствовала улучшению как гастропротекторных, так и лечебных свойств бетулина, но в большей степени повысились гастропротекторные свойства. В гастропротекторных группах животных введение механоактивированного композита бетулина в желудок животным привело к снижению образования количества крупных язвенных дефектов в 18,8 раз, а получающих бетулин - в 5 раз, по сравнению с контрольной группой. С учетом индекса Паулса противоязвенная активность механоактивированного композита бетулина была выше и составила 3,81 единиц, а у бетулина - 2,52 единицы.

Исследование противоопухолевой активности композитов бетулина и его диацилов

Противоопухолевую активность бетулина, его диацилов и их механокомпозитов определяли на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) в экспериментах in vitro, оценивая долю апоптотических и некротических асцитных клеток после воздействия препаратов. В таблице 1 представлены показатели выживаемости клеток АКЭ под воздействием диацетата и дипропионата бетулина и их механокомпозитов.

Таблица 1. Влияние исходных веществ и механокомпозитов ДАБ с АГ и ДПБ с АГ на уровень элиминации асцитных клеток карциномы Эрлиха._

Показатели выживаемости клеток АКЭ Контроль Исходные образцы МА композиты

АГ ДАБ ДПБ ДАБ + АГ ДПБ + АГ

Некроз, % 7,3±0,5 6,6+0,8 5,0±0,6 3,9±0,3 6,6±0,9 5,4±0,7

Апоптоз, % 3,1±2,8 16,7+1,8 23±2,5 25,0±3,1 36±3,8 41±5,4

Общая доля элиминирующи хся клеток, % 10,4±1,3 23,3+2,8 28,0+3,0 28,9+3,4 42,6+5,8 46,4+6,1

Достоверность отличий от контроля, Р<0,05.

Показано, что под влиянием всех исследуемых веществ общая доля элиминирующихся клеток АКЭ увеличилась в основном за счет увеличения апоптических клеток опухоли, причем в присутствии механокомпозитов ДАБ с АГ на 52%, а ДПБ с АГ - на 60% по сравнению с чистыми ДАБ и ДПБ. В присутствии механокомпозитов бетулина с ПВП общая доля элиминирующихся клеток АКЭ была существенно выше, чем в присутствии исходного бетулина. Таким образом, механокомпозиты бетулина и его диацилов проявили ярко выраженные противоопухолевые свойства к клеткам АКЭ.

Дополнительно была изучена противоопухолевая активность диацетата и дипропионата бетулина и их композитов с АГ в том числе в виде растворимых пленок на культуре клеток аденокарциномы легкого человека (А549) и на здоровых эпителиальных клетках легкого (МЯС5) (Табл. 2 и 3).

Таблица 2. Показатели выживаемости здоровых (МИС5) и раковых (А549) клеток легкого после 3-х-часовой инкубации с ДАБ и его композитами с АГ в сравнении с контрольным экспериментом.

Показатели выживаемости здоровых и раковых клеток легкого Контроль ДАБ Смеси ДАБ с АГ

Физическая Механоакт. Пленка

Некроз, % А549 0,3±0,05 0,4±0,04 0,5±0,04 0,3±0,07 0,4±0,04

МЯС5 0,2±0,03 0,2±0,03 0,2+0,03 0,3±0,03 0,2±0,02

Апоптоз, % А549 2,1±0,08 28,3±0,7 27,7±2,1 18,8±1,1 82,3±3,9

МЯС5 0,1±0,00 0,9±0,07 0,2±0,01 0,6±0,02 0,4±0,03

Достоверность отличий от контроля Р < 0,05

Таблица 3. Показатели выживаемости здоровых (МЯС5) и раковых (А549) клеток легкого после 3-х-часовой инкубации с ДПБ и его композитами с АГ в сравнении

Показатели выживаемости здоровых и раковых клеток легкого Контроль ДПБ Смеси ДПБ с АГ

Физическая Механоакт. Пленка

Некроз, % А549 0,3±0,05 0,4±0,09 0,5±0,09 0,4±0,07 0,4±0,06

MRC5 0,2±0,03 0,2±0,03 0,2+0,03 0,3+0,03 0,2+0,02

Апоптоз, % А549 2,1±0,08 66,2±3,1 25±2,4 12,6±1,4 85,7±4,4

MRC5 0,1+0,03 2,03±0,06 3,03+0,03 0,72+0,04 0,3+0,01

Достоверность отличий от контроля Р < 0,05

Установлено, что диацетат и дипропионат бетулина, а также их физические и механоактивированные смеси с арабиногалактаном, обладают ярко выраженным адресным противоопухолевым действием по отношению к раковым клеткам легкого, вызывая апоптоз в раковых клетках и не влияя на здоровые клетки эпителия легкого. Наибольшую активность проявили композиты ДАБ и ДПБ с АГ, полученные в виде полностью растворимых в воде пленок.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены закономерности формирования механокомпозитов бетулина с синтетическими полимерами - поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем, диацетата и дипропионата бетулина с арабиногалактаном.

2. Установлено, что при механической активации смесей бетулина и его диацилов с полимерами происходит аморфизация и разупорядочение их кристаллической структуры и образование молекулярных комплексов бетулина с поливинилпирролидоном, диацетата и дипропионата бетулина с арабиногалактаном.

3. Впервые установлено, что механохимическая активация смесей бетулина с полиэтиленгликолем и поливинилпирролидоном приводит к образованию композитов, обладающих повышенной растворимостью в воде

4. Впервые разработаны способы получения механокомпозитов диацетата и дипропионата бетулина с природным полисахаридом арабиногалактаном, обладающих повышенной растворимостью в воде.

5. Впервые установлено, что механоактивированный композит бетулина с поливинилпирролидоном проявляет улучшенные гастропротекторные свойства, а механокомпозиты диацилов бетулина с арабиногалактаном — улучшенные противоопухолевые свойства.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

Статьи в рецензируемых журналах: 1. Kuznetsova S.A., Skvortsova G.P., Malyar Yu.N., Sokolenko V.A., Kuznetsov

B.N. Synthesis of the betulin dipropionate from the upper birch bark //Russian

Journal of Bioorganic Chemistry. 2012, Vol. 38, No. 7, pp. 743-748.

2. Кузнецова С.А., Скворцова Г.П., Маляр Ю.Н., Скурыдина Е.С., Веселова О.Ф. Выделение бетулина из бересты березы и изучение его физико-химических и фармакологических свойств// Химия растительного сырья. 2013. №2. С. 93-100.

3. Кузнецова С.А., Маляр Ю.Н., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Дребущак В.А., Болдырев В.В. Механохимическое получение композитов эфиров бетулина с арабиногалактаном и изучение их физико-химических свойств// Химия в интересах устойчивого развития. 2013. Т.21, № 6. С. 663-668.

4. Drebushchak V. A., Mikhailenko М.А., Shakhtshneider Т.Р., Drebushchak T.N., Kuznetsova S.A., Malyar Yu.N. Thermal properties of betulin dipropionate and its mixtures with polymers // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2014. Vol. 115, N. З.рр 2521-2525.

5. Shakhtshneider T.P., Mikhailenko M.A., Kuznetsova S.A., Malyar Yu.N., Zamai A.S., Boldyrev V.V., Boldyreva E.V. The pharmacological activity of composites of Betulin esters with arabinogalactan// Farmacevtski Vestnik. Vol. 65. Special Issue. September 2014. P. 32-33.

Статьи в научных сборниках и материалы конференций:

6. Кузнецова С.А., Михайленко М.А., Шахтшнейдер Т.П., Маляр Ю.Н., Скворцова Г.П., Веселова О.Ф., Болдырев В.В. Композиты бетулина и их противоязвенные свойства// Сб. тез. международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина». Санкт-Петербург, 21-24 июня 2011г, с. 118-119.

7. Маляр Ю.Н., Кузнецова С.А. Влияние механической активации дипропионата бетулина с арабиногалактаном на растворимость// Материалы конференции-конкурса молодых ученых КНЦ СО РАН-2012. Секция «Химия». Красноярск, 28 марта 2012г. С. 52-56.

8. Маляр Ю.Н., Кузнецова С.А., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Болдырев В.В. Композиты бетулина и его производных и их фармакологические свойства// Сб. тез. научн. конф. «Фундаментальные науки - медицине». Новосибирск, 11 — 15 сентября 2012г. С. 36

9. Кузнецова С.А., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Маляр Ю.Н., Скворцова Г.П. Получение и физико-химические свойства композитов дипропионата бетулина с аэросилом и водорастворимым полимером арабиногалактаном// III Международная конференция «Техническая химия. От теории к практике» Сборник статей. Том 3 — Полимеры и композиты. Пермь, 15-19 октября 2012 г. С. 236-238.

Ю.Маляр Ю.Н., Кузнецова С.А., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Скурыдина Е.С., Болдырев В.В. Новый способ переработки бересты березы с получением диацетата бетулина и улучшение его растворимости с помощью механохимической активации// Всероссийская научно-практическая конференция «Лесной и химический комплексы — проблемы и решения», Сборник статей. Красноярск, 25-26 октября 2012г. С. 98-102.

11.Маляр Ю.Н., Кузнецова С.А. Разработка способов получения новых композитов бетулина и его производных с синтетическими и природными полимерами и изучение их свойств// Материалы конференции-конкурса молодых ученых КНЦ СО РАН-2013. Секция «Химия». Красноярск, 20 марта 2013г. С. 45-49.

12.Kuznetsova S.A., Маляр Ю.Н., Shakhtshneider Т.Р., Mikhailenko М.А., Skvortsova G.P., Boldyrev V.V. Mechanocomposites of betulin esters with arabinogalactan and their properties// Book of abstr. IV International Conference "Fundamental Bases of Mechanochemical Technologies". Novosibirsk, Russia, 25-28 June 2013. P. 151.

13.Маляр Ю.Н., Кузнецова C.A. Физико-химические свойства механокомпозитов бетулина и его диацилов с водорастворимыми полимерами// Материалы конференции-конкурса молодых ученых КНЦ СО РАН-2014. Секция «Химия». Красноярск, 26 марта 2014г. С. 41-45.

Н.Кузнецова С.А., Маляр Ю.Н., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Дребущак В.А., Болдырев В.В. Механохимическое получение композитов эфиров бетулина с арабиногалактаном и изучение их физико-химических свойств// Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» Барнаул, 22-24 апреля 2014 г. С. 166-168.

15.Mikhailenko М.А., Shakhtshneider Т.Р., Kuznetsova S.A., Маляр Ю.Н., Zamay A.S., Boldyrev V.V. Use of mechanical activation methods for preparation of composites of betulin and its esters with polymers// VIII International Conference on Mechanochemistry and Mechanical Alloying (INCOME 2014). Book of Abstracts. Krakow, Poland, June 22-26, 2014. P. 36.

Патенты

16.Пат. 2469043 РФ. Способ получения дипропионата бетулинола/ Кузнецова С.А., Скворцова Г.П., Маляр Ю.Н., Кузнецов Б.Н.- заявка № 2011149829/ 04; заявл. 07.12. 2011; опубл. 10.12.2012. Бюл. № 34.

17.Пат. 2517157 РФ. Композиция на основе диацетата бетулина / Кузнецова С.А., Шахтшнейдер Т.П., Михайленко М.А., Маляр Ю.Н., Замай А.С., Болдырев В.В. Заявка №2013116148/15; заявл. 09.04.2013; опубл.27.05.2014, Бюл. № 15.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю работы, д.х.н. С. А. Кузнецовой за нео11енимую помощь в подготовке диссертации, Кузнецову Б.Н. и Чеснокову Н.В. за помощь в работе, а также благодарность за помощь в проведении синтезов и исследований Г.П. Скворгрвой (ИХХТ СО РАН), сотрудникам КР ЦКП СО РАН (г. Красноярск), Т.П. Шахтшнейдер, М.А. Михайленко, В.А. Дребущаку (ИХТТМ СО РАН, г. Новосибирск); а также О. Ф. Веселовой, А. С. Замай, Т.Н. Замай (КрасГМУ, г.Красноярск) - за помощь в проведении фармакологических исследований.

Подписано в печать 22.10.2014. Печать плоская Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,1 Тираж 100 экз. Заказ № 2807

Отпечатано полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82, стр.1 тел.: +7(391) 206-26-49, 206-26-67 E-mail: print_sfu@mail.ru