Физико-химические закономерности изменчивости пероксидазы льна а динамике раннего развития тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Тверской государственный университет

Лапина Галина Петровна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ ЛЬНА В ДИНАМИКЕ РАННЕГО РАЗВИТИЯ

Президиум ВАК Гссс.

(решение от"" МШгл N2. 9

'еская химия

присудил ученую степень Д^ОЖШ.04 - биохимия

^^ШЛМШМ^^____________ т;;."т;,'." |І

'Начальник управления БАК Росс:;.:: ;'

а.

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Тверь 1999

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................ Ю

ГЛАВА 1. Пероксидазы растений............................................................................^

1.1. Исторические этапы.......................................................................................

1.2. Локализация в растениях. Особенности выделения и стабилизации. 12

1.3. Строение и физико-химические свойства пероксидазы........................15

1.4. Особенности ферментативного катализа пероксидазы.........................21

1.5. Физиолого-биохимические функции пероксидазы................................28

ГЛАВА 2. Изучение проблемы роста растений....................................................30

2.1. Участие пероксидазы в ростовых процессах.............................................. ^ 2

ГЛАВА 3. Пути и способы регуляции активности ферментов растений........

ГЛАВА 4. Исследования в области биохимии и биотехнологии льна............. 4 ^

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................... 45

5.1. Объекты исследования.................................................................................. 4

5.1.1. Проращивание семян льна........................................................................

5.1.2. Экстракция фенольных соединений из семян и проростков льна.... 46

5.1.3. Экстракция пероксидазы из проростков льна....................................... 47

5.1.4. Экстракция суммарных белков семядолей льна для проведения электрофореза в ПААГ..........................................................................................................................................................................47

5.1.5. Экстракция суммарных белков проростков, гипокошлей и корней льна для проведения электрофореза в ПААГ.......................................................................... 48

5.1.6. Экстракция свободных аминокислот семядолей и гипокотилей льна

49

5.1.7. Регуляторы активности пероксидазы проростков льна.......................50

5.1.7.1. КомплексонатК-4-РеЗ+.......................................................................... 50

5.1.7.2. Хлорорганические гербициды глин и 2М-4Х................................... 50

5.1.7.3. Четвертичные аммониевые соли.......................................................... 51

5.2. Методы исследования................................................................................... 51

5.2.1. Количественное определение фенольных соединений...................... 51

5.2.2. Гель-фильтрация экстракта пероксидазы проростков льна............... 53

5.2.3. Электрофоретический метод получения изоферментаого спектра пероксидазы проростков льна в столбиках ПААГ.................................................................. 54

5.2.4. Метод тонкослойного электрофореза в ПААГ для получения элекгрофоретических спектров пероксидазы проростков, семядолей, гипокотилей и корней льна...................................................................................................................................... 55

5.2.5. Определение молекулярной массы пероксидазы проростков льна. 5 7

5.2.6. Определение оптимумарН действия пероксидазы проростков льна 58

5.2.7. Определение температурного оптимума пероксидазы проростков льна.................................................................................................................................................... 58

5.2.8. Определение субстратной специфичности пероксидазы проростков льна.................................................................................................................................................... 58

5.2.9. Определение параметров ферментативной активности пероксидазы проростков льна..............................................................................................................................................................................................59

5.2.10. Разделение свободных аминокислот семядолей и гипокотилей льна методом восходящей бумажной хроматографии.................................................................... 60

5.2.11. Количественное определение свободных аминокислот.................. 60

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 6. ВЬЩЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФЮИКаХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕРОКСИДАЗЫ ПРОРОСТКОВ ЛЬНА............................ 63

6.1. Изучение динамики содержания фенольных соединений в проростках на ранних стадиях развития льна................................................................................................ 64

6.2. Изучение динамики количественного содержания пероксидазы в проростках на ранних стадиях развития льна.......................................................................... 67

6.3. Выделение и очистка суммарной пероксидазы 5-дневных проростков льна.................................................................................................................................................... 68

6.4. Определение физико-химических свойств пероксидазы 5-дневных проростков льна.............................................................................................................................. 74

6.4.1. Определение молекулярной массы пероксидазы проростков льна.

6.4.2. Электрофоретические свойства пероксидазы проростков льна....... 78

6.4.3. Влияние рН на активность пероксидазы проростков льна................ ^

6.4.4. Субстратная специфичность пероксидазы проростков льна.............

6.4.5. Оптимум температурного действия пероксидазы проростков льна 84

6.4.6. Кинетические характеристики ферментативной реакции, катализируемой пероксидазой проростков льна..................................................................... 8 5

6.4.6.1. Порядок реакции...................................................................................... ^5

6.4.6.2. Константа скорости пероксидазной реакции..................................... 87

6.4.6.3. Энергия активации пероксидазы проростков льна........................... 91

6.4.6.4. Стандартные энтальпия и энтропия пероксидазы проростков льна 91

6.4.7. Кинетические ферментативные параметры пероксидазы проростков льна.................................................................................................................................................... 97

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОВЕДЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ПРОРОСТКОВ, ГИПОКОТИЛЕЙ И КОРНЕЙ ЛЬНА.......... 104

7.1. Динамика ферментативных параметров пероксидазы проростков льна

на ранних этапах роста.................................................................................................................. 104

7.2. Влияние комплексоната К-4-Ее3+ на ферментативные параметры пероксидазьшроростков льна в раннем онтогенезе......................................................................110

7.3. Изучение влияния хлорорганических гербицидов глин и 2М-4Х на ферментативные характеристики пероксидазы проростков льна в раннем онтогенезе............................................................................................................................................................................................113

7.4. Сравнительный анализ ферментативных параметров пероксидазы проростков льна, выращенных на средах, содержащих дистиллированную воду, К-4-БеЗ+, гербициды Ъшн и 2М-4Х................................................................................................ 118

7.5. Сравнительное изучение влияния комплексонатаК-4-РеЗ+, гербицидов глин и 2М-4Х на ферментативные параметры пероксидазы хрена в модельных системах ............................................................................................................................................................. 122

7.6. Ферментативные параметры пероксидазы гипокагилей и корней льна, выращенных на дистиллированной воде, в раннем онтогенезе.......................................... 129

7.7. Сравнительная характеристика ферментативных параметров пероксидазы гипокотилей и корней льна, выращенных на дистиллированной воде... 134

7.8. Влияние четвертичных аммониевых солей на ферментативные параметры пероксидазы корней и гипокотилей льна в раннем

онтогенезе..................................................................................................................................137

7.8.1. Влияние четвертичных аммониевых солей на динамику ферментативных параметров пероксидазы гипокотилей в раннем развитии льна.... 137

7.8.1.1 .Влияние четвертичной аммониевой соли С-16 на ферментативные параметры пероксидазы гипокотилей льна в раннем онтогенезе.... 138

7.8.1.2. Влияние четвертичной аммониевой соли С-11 на ферментативные параметры пероксидазы гипокотилей льна в раннем онтогенезе..... 140

7.8.1.3. Влияние четвертичных аммониевых солей С-1 и С-7 на ферментативные параметры пероксидазы гипокотилей льна в раннем развитии.... 141

7.8.2. Влияние четвертичных аммониевых солей на ферментативные параметры пероксидазы корней льна на ранних стадиях роста............143

7.8.2.1. Влияние четвертичных аммониевых солей С-16 и С-11 на ферментативные параметры пероксидазы корней в раннем развитии льна............. 144

7.8.2.2. Влияние четвертичных аммониевых солей С-1 и С-7 на ферментативные параметры пероксидазы корней льна в раннем онтогенезе................147

7.9. Сравнительная характеристика влияния четвертичных аммониевых солей на ферментативные параметры пероксидазы корней и гипокотилей льна............

7.10. Исследование ферментативных параметров модельных систем.. 156 ГЛАВА 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСЬСИХ СПЕКТРОВ ПЕРОКСИДАЗЫ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ (СЕМЯДОЛЕЙ, ПРОРОСТКОВ, ШПОКОТИЛЕЙ И КОРНЕЙ) НА РАННИХ ЭТАПАХ РОСТА ЛЬНА...................................................................................... 166

8.1. Динамика изоферментных спектров пероксидазы семядолей в условиях прорастания семян льна................................................................................................................ 166

8.2. Динамика изоферментных спектров пероксидазы проростков льна на ранних стадиях развития............................................................................................................... 168

8.3. Сравнительный анализ динамики изоэнзимных электрофоретических спектров пероксидазы семядолей и проростков льна............................................................ 172

8.4. Динамика изоферментных спектров пероксидазы гипокотилей в раннем развитии льна.................................................................................................................... 174

8.5. Динамика изоферментных спектров пероксидазы корней в раннем онтогенезе льна...............................................................................................................................

8.6. Сравнение изоэнзимных спекіров пероксидазы части проростков (без семядоли) корней и гипокотилей льна в условиях их раннего роста................................. * 79

8.7. Сравнительный анализ динамики электрофоретических спектров пероксидазы семядолей, гипокотилей и корней льна в раннем онтогенезе...................... 1

ГЛАВА 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ С ЕМЯДОЛЕЙ И ГИПОКОТИЛЕЙ ЛЬНА НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА......................................................................................................... 187

9.1. Динамика свободных аминокислот семядолей в процессе прорастания семян льна........................................................................................................................................

9.2. Динамика свободных аминокислот гипокотилей льна в условиях начального роста............................................................................................................................. 191

9.3. Сравнительный анализ динамики свободных аминокислот семядолей и

гипокотилей льна............................................................................................................................ 194

ОБСУЖДЕНИЕ ИОЛУЧЕННБІХ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................. 199

ГЛАВА 10. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ НА РАННИХ ЭТАПАХ РОСТА ЛЬНА......................................... 199

10.1. Изоферментный состав пероксидазы льна............................................. 199

10.2. Динамика количества пероксидазных молекул в гипокогилях, корнях

и проростках льна в его раннем развитии................................................................................. 207

10.3. Изменения ферментативных параметров пероксидазы льна............. 214

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................... 222

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................... 224

ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................................................................... 253

ВВЕДЕНИЕ

Важность исследования ферментов и механизмов их регуляции связана лрежде всего с их центральной ролью в изменении функциональной 1ктивности всех живых организмов. Благодаря лабильности конформаций, наличию разнообразных, но мало исследованных механизмов регуляции качественного и количественного составов, а также особенностям каталитических свойств, ферменты способны влиять на многие аспекты протекания важнейших метаболических процессов, включающие их направленность и интенсивность.

К настоящему времени собран обширный экспериментальный материал, на основе которого описано влияние различных факторов (фитогормонов, :вета, минеральных солей, разных химических веществ, концентраций кислорода, функционального состояния биомембран, компартментализации метаболитов и т.д.) на активность ферментов растений (Chance, 1954; Galstone, Davis, 1969; Рубин, 1975; Scandalious, 1977; Gaspar, 1982, 1985; Кулаева, 1982; Hanson, 1984; Hooley, 1984; Avigliano, 1985; Zhu Yu Sheng, Kaplan, 1985; Dubravka et al., 1994; Aleksander et al., 1995; Rasmussen Christine Brinin et al., 1995, Odushima Yoko, Koizumi Noromu, 1997 и др.). Тем не менее научные исследования по разработке конкретных механизмов модулирования активности ферментов не завершены.

Одной из недостаточно разработанных проблем энзимологии и частной биохимии растений является изучение особенностей изменений ферментативных параметров пероксидазы (ПО) на ранних этапах роста льна, а также путей формирования спектра изозимов ПО и их роли в функционировании фермента. Полученная при этом новая информация важна для создания представлений о специфике взаимодействия пероксидазы растений с окружающей средой и способствует созданию предпосылок для целенаправленной регуляции ростовых процессов такой ценной сельскохозяйственной культуры, как лен.

Среди многочисленных ферментативных систем окислительно-восстановительного действия именно пероксидазе принадлежит немалая роль в поддержании молекул в восстановленном состоянии, что является основным v/ требованием всего живого. Повсеместное присутствие этого фермента в растительных и животных тканях, а также в составе метаболитов грибов и бактерий дает основание считать пероксидазу жизненно важным соединением высших и низших организмов (Андреева, 1988). .

Пероксидаза привлекает особое внимание исследователей благодаря широкой субстратной специфичности (Siegel, Galston, 1967а; Gaspar et al., 1982; Cochran Andrea G.,Schultz Peter С., 1990), молекулярной гетерогенности (Голдовский, 1972; Gaspar et al., 1982), связи практически со всеми окислительно-восстановительными системами растений (Рубин, 1975),

индуцибельности (Андреева, 1988) и биохимическому полифункционализму (Иевиньш, 1987).

Последние десятилетия пероксидазу изучали в связи с различными функционально-биохимическими показателями. Получен обширный экспериментальный материал, свидетельствующий о связи пероксидазы с целым рядом метаболических превращений, происходящих в клетке. Пероксидаза обладает широким спектром действия в пределах pH от 3 до 14. Установлено, что фермент, как правило, активируется при различных изменениях метаболизма (Andreev, Shaw, 1965; Паду и др., 1983; Иевиньш, 1987; Андреева, 1988, Лозовая и др., 1990; Yubfa, 1990 и др.).

В то же время сведения о пероксидазе различных растений характеризуются несистематичностью, фрагментарностью,

противоречивостью. Результаты, полученные разными исследователями, часто не сопоставимы. Причины этого в значительной мере связаны с использованием при определении ферментативной активности различающихся химической природой субстратных молекул. Существуют расхождения и в способах оценки, как правило, одной ферментативной характеристики -удельной активности энзима. В связи с этим не однозначны и требуют дальнейшего развития научные представления об участии пероксидазы в первичных процессах роста.

Особой неполнотой сведений о физико-химических свойствах и их изменениях на начальных этапах роста отличается пероксидаза льна, для которого набор средств и способов регуляции процессами роста и развития крайне ограничен. Это сужает возможности широкого практического использования разнообразных путей и способов эффективной регуляции процессами роста растений льна в сельскохозяйственной практике на основе экспрессных пероксидазных тестов. Выше указанное определяет актуальность разработки новых научных подходов и представлений, основанных на экспериментальном исследовании динамики ферментативных и электрофоретических характеристик пероксидазы на начальных этапах роста льна.

Углубленное изучение изменений важнейших ферментативных параметров пероксидазы в различных тканях льна на ранних этапах их роста может послужить основой для разработки новых способов направленного воздействия на ростовые процессы и управления ими. Особую актуальность приобретает выявление закономерностей регуляции активности энзима при использовании разнообразных рострегулирующих средств с целью выявления наиболее эффективного вещества. Это обусловило выбор данной проблемы в качестве темы специального исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей изменений физико-химических характеристик пероксидазы различных тканей льна в раннем онтогенезе и путей их регуляции. Дополнительной задачей исследования явилось изучение динамики пула свободных аминокислот семядолей и гипокотилей льна на ранних фазах его роста.

6

В качестве основных обьектов исследования были взяты различные ткани пьна культурного (Ьтшп ш^аизБщшт Ь.) - важнейшей технической культуры, выращиваемой в Тверской области.Они послужили моделью для изучения изменчивости пероксидазы на начальных этапах роста льна.

В работе были поставлены следующие задачи:

• выделить очищенный препарат перокс