Фосфотриэфирный метод синтеза олигодезоксирибонуклеотидов с использованием о-нуклеофильного внутримолекулярного катализа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА 'ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БМООРГАНМЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

УДК 547.963.32 : 577.113.6

ПОЛУНИН Николай Николаевич

аОСМУГРИЭФИРЧЬИ МЕТОД СИНТЕЗА ОЛИГОДЕЗОКСЙ?ИБОНУ*ЛЕОТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ О-НУКЛЕОФИЛЬНСГО ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТАЛИЗА

02.00.10 - Бкоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации ка соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация-

доктор химических наук В.А.Ефимов

доктор химических наук

B.К.Потапов

кандидат-химических наук

C.В.Виноградов

Кэкфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и баосрганичэской химии км. А.Н.Белозерского МГУ им. М.М.Ломоносова

Защита состоится " 1991 г. на ссседанки

Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871. Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

Р

сне?

С диссертацией кожно ознакомиться в библиотеке ИБХ АН СССР

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

Актуальность проблемы. Химический синтез фрагментов нуклеиновых кислот относится к числу важнейших проблем биоорганической химии. Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды сегодня стали универсальными инструментами для решения широкого круга задач молекулярной биологии, генетической инженерии, биотехнологии. Поэтому разработка эффективных методов синтеза, выделения и очистки олигонуклеотидов привлекает внимание широкого круга исследователей. Известен ряд методов синтеза олигонуклеотидов: фосфодиэфирный, фосфотриэфирный, фосфитамидный и гидрофосфорильный (Н-фосфонатный). Исторически первый фосфодаэфирный метод гмел целый ряд недостатков, куда прекде всего следует отнести низкие выхода и утомительную процедуру очистки интермедиатов, и в настоящее время не используется для синтеза олигонуклеотидов. Фосфотриэфирный, фосфитамкдпый и Н-фосфонатный метода активно•применяются в практике слигонуклеотид-ного синтеза, причем каждый из этих методов имеет свои специфические- особенности, которые обуславливают выбор исследователем того или иного метода синтеза. Фосфитамиднчй метод является предпочтительным при синтезе протяженных фрагментов ДНК. Н-фэсфонатный метод незаменим при получении широкого спектра аналогов олигонуклеотидов с модифицированными меянухлеотидными фосфатными группами. Фосфотриэфирный метод, в его классическом исполнении, уступал фосфитамидному и К-фссфснатному в скорости образования межнуклэотидаой связи, однако он имеет ряд привлекательных черт. Это простота получения и стабильность мономеров, высокая надвп-ность. Кроко того, фосфотриэфирный метод в отличие от фосфит-амидного и К-фосфотатного, которые используются только в твердофазном варианте, в одинаковой степени эффективно работает как в растворе, так и на полимерных носителях. Таким образом, дальнейшее совериэнотвовапзе фосфотриэфирного метода представляется нам весьма актуальной задачей.

Цель работы. Настоящая работа является частью исследований в области химического синтеза олигояуклеотидоЕ, проводимых з лаборатории биогашенерии генов Института биоорганической химии им. Н.М.Шемякина АН СССР. Цель работы заключалась в создании новой высокоэффективной модификации фосфотриэфирного метода синтеза олигонуклэотйдоз с использованием внутримолекулярного 0-нуклео-фильного катализа, а таете в разработке эффективного способа полного деблокирования получаемых олкгодезоксирибонуклеотидов

Научная новизна к тактическая ценность работа. Показано, что

использование новых фосфатзашитных груш, являющихся производными N-окиси пиридина и лутидана, которые одновременно выполняют роль внутримолекулярного О-нуклеофильного катализатора, привода'!' к резкому увеличена*) скорости образования межнуклеотиднсЯ: фосфотш--афирной связи, а также позволяет снизить уровень протекания побочных реакций. Применение О-нуклеофильных каталитических -фосфатзащкт-v;;x груш позволяло существенно повысить эффективность фосфотри-эфирного метода синтеза олигонуклоотидоз и довести скорость посадка го (в его твердофазном исполнении) до скорости, обеспечиваемой наиболее распространенным в настоящее время фосфктамкдаам методом. Разработанная методология пригодна для работы с большинством современных автоматических синтезаторов.

Разработан такз® эффективный способ полного удаления защитных групп с синтетических олигонуклеотидов.

Практическая ценность разработанных методов была продемонстрирована на примере успапшого синтеза большого числа олпгсвуклеоти-дов, предсташишцвх собой фрагменты генов ряда пептидов и белков и регуляторных участков ДНК, а такке праймеры • для установления первичной структуры нуклеиновых кислот.

Структура диссвртащш. Диссертация состоит . из введения, литературного обсора (глава I), обсуждения результатов (глава II), экспериментальной части (глава III), вывода к списка датируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. фосфотриэфиркыя метод синтеза олигснуклеоткдос с испольяс-ваниех внугрилслекуляркого 0-яуклег$илького катализа.

В фосфэтриафарном способе создания мекауклеотидасй связи сгромную роль играет нуклеофильный катала, поскольку фосфор нуклеотидного компонента находится в данном случав в малоактивном пятивалентном состоянии. Механизм действия нуклеофопьного катализатора состоит в том, что он образует посредством конденсирующего реагента высокоре экционносгю с обшй интермедиат с нуклеотйдьым компонентом. Этот интермедиат затем немедленно вступает з реакцию с нуклеозидным компонентом, образуя необходимую фосфотризфарную меж-нуклеотидауэ связь.

Одним из первых в качество эффективного нуклеофильиого катализатора стал! использовать К-метилимидазол, предложенный в нашей лаборатории в начало 80-х годов. Позднее были предложены значительно более эффективные кис лоро дну кле офильны в катализаторы — 4-алкокси- производные К-окиси пиридина и хинолина. Применение этих катализаторов в сочетании с различными конденсирующими реагентами позволяет уменьшить время реакции конденсации в растворе до 1-2 минут, а на полимере — до 4-5 минут.

Дальнейшее усовершенствование фосфотриэфирнсго метода синтеза олигонуклеотидов связано с применением внутримолекулярного куклео-фильного катализа, когда защитная группа мезагуклеотидного фосфата выполняет одновременно и каталитическую функцию. Так, Фроэлер и Матуччи показали, что использование в качестве фосфатзащитной группы 2-(1-мэтилимидазол-2-ил)фэнильной группы приводит к резкому (в сравнении с меэлолекулярным катализом Л-метилимидазолом) увеличению скорости реакции конденсации (до 5-7 минут в твердофазном варианте вместо 10-15 минут в случае И-метил-имидазола).

Следующим логичным шагом явилась разработка новой модификации фосфотркзфирного метода с использованием высокоэффективного внутримолекулярного О-нуклеофильнсго катализа.

1.1. Синтез О-нуклеофильных катализаторов.

Первый этап работа состоял в синтезе О-нуклеофильных катализаторов, имеэдих оксимэтиленовув "ножку", необходимую для связывания с атсмом фосфора нуклестидного компонента. В качестве ИСХОДНЫХ СС-'ДШ 19ЕИЙ для о то Л цели были взяты 2-ликолин (йа) и 2,6-лутидии (аб). Общая последовательность химических реакций, приводящих к целевым продуктам, представлена нз схеме I.

Окисление 2-пвколина и 2,6-лутвдина до соответствующих Н-оксидов (га,о') осуществляли действием перекиси водорода в присутствии уксусной кислоты . Полученные таким образок Л-оксиды подвергали пктровзнию, используя для этого смесь кенц. азотной ^ конц. серной кислот . Поскольку ¡{-оксидная функция является более сильны;.?, чем метальная функция ориентаитом 1-го рода, нитрогруппа вводилась преимущественно з 4-е положение пиридинивЕого кольца. 4-алкокси-

N03

a ^ A—

i i

О P

E Э 0Л1 к ОД1 i

Лк — XX лХн *

•Г tf Ъц, rr V CHaOAe tf >CH3OA*

i В .1

с 0

CAI к

I

УГч R- H : -u;3

'1 s С

I ' "

производные (43,0) получалы действием на 4-штро-цроЕ.?водные (за, б) раствора гцдроксвдэ калж? в соответствующем спирте . Нагревание 4-алжокси-2-йетидпцрида:-1-оксвда (4а) с укоусаым ангидридом давало 4-алкокск-2-ацзтокскмэтилтаридин (sa), который затем окислял: до соответствующего F-сксида и ,1п situ обрабатывали щелочью с целью полного удаления ацетильной группы со спиртовой функции . Структура полученного 4-мета^си-2чжсиметилтфидак-1-оксада (7а > была под-тверздена методами АК-ЯМР- к масс-спектромзтриа. Те?апературз плавления (I34-I3S°C) соответствует литературным даннкы (135-137°С) .

4-МГТОКСК-2 оксиотил-6-мзтзшдфидаи-1-окс:1д (76) получал;! насколько иначе.Скачало нагреванием 4->ятоз:о:о-2,6-дкьютклп!ридан-1-оксидайб) с укоускэл акгвдрадш » послецуздей обработке;": щелочью получали 4-мзтокск-2-оксз®эткл-в-мэтклв1р11Дкн (в). Структуру (е) подтверждали методами а-н-Я?>'Р- к масс-спэктрометрил. (с) действием хлористого ацетила переводили ъ ^-Мйтскси-г-эцетоксшэтил-б-метиляиридин (56) (эта, казалось бы, лишняя процедура необходима, т.к. спирт (в) окисляется, значительно хуке, чем ацетат (5б)). Батем соединение (56) охисляли действием смеси конц. перекиси водорода, уксусного ангидрида и уксусной кислстн и полученный N-оксид (аб) омыляли щелочью до 4-ыетокси-2-оксшетил-6-ме,пш1;фидин-1-оксида (76). Структуру (7б) подтверждали методам;: 1 н-ЯЗ«?- и масс-спектроскопш.

1.2. Синтез нономерных нуклзотидов.

Нуклеозидфосфодиэфиры (1-4) получали из соответствующих полностью защищенных нуклеозидфосфэтриэфиров (13), селективно удаляя некаталитическую арильную фосфат-защитную группу (сх.2).

2

в« Ьхд; Ьжс; ¡ьа кт т

А- -^^-ио,

Синтез нуклеозидфосфотриэфиров. (13) был осуществлен двумя способами. Первый (схема 2) включал фэсфорилированке Я'-гидроксильной функции дезоксирибонуклеозида л-нитрсфенилфосфодштриазолидом (э) с последующим переводом полученного фосфотриазолид диэфира (и) в желаемый тризфир (13). Альтернативная процедура получения фосфотри-зфира (аз) заключалась в обработке предварительно полученного нуклеозидфосфодиэфира (1г) соответствующим производным 2-пиридил-метансла в присутствии триизопропилбензолсульфснилхлорида (трзс!) и К-метилимидазола. Исходный нуклеозидарилфосфздкэфир (12) получали фэсфорилирсзакием защищенного нуклеозида бис(триазолил)-гг-нитрофэнилфэсфатом (э) с последующей обработкой промежуточно образующегося соединения (и) водным триэтиламмонийбикзрбонатом (теаз) или действием на защищенный нукяеозид п-вгарофэнзглфоофопиридйажекгм

производным (ю)

п-Нитрофенилфосфотриэфир (13) без выделения с высоким выходом был переведен в желаемый фосфодиэфир fi-t) действием спиртового растворя гидроокиси лития.

Полу ч еьгыь вышеописанными способами мономерные нуклеотидные компоненты (14) выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле и охарактеризовывали методами 1 н и 31 р-ЯМР спектроскопии. В соответствии о о писанными выше процедурами получали также 2-пиридилметиловыб эфиры (i4a,r) всех четырех

5'-диметокситритшшуклэозид-3*-фосфатов. Некоторые физические характеристики и данные о выходах синтезированных мононуклеотидоз (14) представлены в таблице I.

Табл.1.Выходы и некоторые физические характеристики ггшиценннх мононуклеотидов (14).

Соединение Защитная группа (r) Выход, % Молек. вес3 ЗАр-ЯМ? *Гб

СМТгТ-(й) 4-ыетокск-2-пико.пил 82 84S.92 -0.12 0.25

dmtrt-(r) 1-ОКОИДО-2-ПИКОЛКЛ 80 832.90 0.14 0.15

dmt.-t-(r) 1-окоидо-4-метокси- 2-пиколил 80 862.92 0.28 ОЛО

dmtrt-(r) 1-оксидо-4-атокси- 2-шисолил 83 876.£5 0.26 0.10

dktrab=-(r) 1-сксидо-4-метокси- 2-пиколил 76 976.05 0.40 0.17

dmtrcbz-(r) 1-оксвдо-4-метохси- 2-гшколил 80 952.02 0.31 0.16

dmtrg,b-(r) Х-оксидо-4-кетокса-2-Еаколил 72 958.03 0.34 0.14

^Молекулярные вгса даны для триетиламмониевых солей нуклеотидов. Система хяорофоры-метанол-триэтила'.и&'вЭ^О:!,v/v).

1.2. Реакция мехнуклестидкоя конденсации с внутримолекулярным нуклеофильным катализок (исследование кинетики, предполагаемый механизм).

Исследование кинетики реакции образования мекнукле отидной фосфотриэфирной связи проводили на примере получения динуклеотвда ((Ив0)3тр]тр(в)т(дс) (схема 3).

■OR

dmtn

DMTrO—| ^.O^ KO—| ^0^ [ 0

I

r0~V'cS^ »ys

or

0 OAc |

1 15

0 OAc

14' r- см. схему 2 la

В реакцию вводили I мольный эквивалент мономерного Р-компонента (1*') и I мольный эквивалент ОН-компонента (15). В качестве конденсирующего реагента использовали трэа (2-х кратный избыток по отношению к Р-компоненту). Результаты представлены на Рис.1.

Рис.1. Скорости реакций образования динуклеотида

[(ИеО)2Тг)Тр(я)т(Ас). Реакции проводили з I мл. пиридина при 0.05 М концентрации нуклеотидкого (141) и нуклеозид-ого (1з) компонентов и 0.1 М концентрации ТРЗС1. В случае О-хлорфзнильного производного концентрация 4-метокси-гшридин-1-оксидз составляла 0.2 М.

Из Pzc.I видно, что наибольшая скорость образования меннуклео-тидно» фосфотриэфирной сеязи наблюдалась, когда в качестве Р-

компонента использовали 1-оксидо-4-алкокси--2-пи::олильшс производные (а4'а). В этом случае для полного завершения реактш требовалось меньше одной минуты (кривая I на РисД).

1-оксидо-4-метокси-6-метил-2-пиколильяая защитная группа также проявляет высокую каталитическую активность в реакции образования мехнуклеотидноЯ фосфотриафирной связи, хотя из-за сторического затруднения, вызванного наличием дополнительной метальной группы в 6-ом положении пкркдиниввого кольца, скорость конденсация несколько снижается в сравнении с производными пкколпн-Ы-охскда (14'а). Однако и в этом случае (в качестве Р-компононта выступает нуклеотид (и'г)) реакция кондэнсации в растворе полностью завершается за 1.5 мин. (кривая 2 на Рис.1).

Помимо (трбс1) б качестве конденсирующих реагентов били также использованы мезитиленсульфошжлорид (н®с1) и 1-мсзктиленсульфо-нил-З-нитро-1,2,4-триазол (нзмт). Как и следовало ожидать, в случае пространственно ненео затрудненных (м<*с;|) и (нзмт) скорость конденсации оказалась несколько выио, чем е случае (трбс!). Так, если в реакцию конденсации вводили нуклеоткдпый компонент (14'а), в присутствии (нес;) или (мзкт) реакция завершалась ухе за 0.5-0.75 мин.(Рис.2).

<Выход юо-1*

(7п

Рис.2. Скорости реакций образов&чкя дичук-яе^тида t(MeC)aTr3Tp(R)T(Ac). Реакции проводили а I мл пиридина при 0,05 М концентрации нуклеотлциого (i4") и куклео-эидкoro (¿s) компонентов к ОЛ И концентрации кскденои-руюцего реагента (tpsci (1)» __MaNT(2) или М»С1 (3)>.

•0.5 1 Г.5 2

До сиг. пор речь шла о реакции конденсации, протекающей в растворе. В случав ке протекания реакции на полимерном носителе, скорость ее из-за стерических затруднений нестолько уменьшается. Так, если в качестве Р-компонента выступает фосфодиэфир (i4'a), а в качестве конденсирующего реагента- (mecí) или (msnt), 97-96% выхода достигя-

лтся за 1-1.5 мин.(реакцию проводили в пиридине при 10-ти кратном избытке Р-компонента по отношению к ОН-компоненту, локализованному на полимере). В тех же условиях, но в присутствии (трэс;) конденсация заканчивается за 2 мин.

Следует особо подчеркнуть, что использование для защиты нуклеотидного фосфата каталитической защитной групп« но основе 4-алксксипроизвг'дных Н-оксида пиридина, позволяет резко снизить степень образования побочного 5'-сульфонилированного продукта. Это, очевидно, связано с различием з механизме катализа реакций фосфори-лирования и сульфонилирования. В первом случае мы имеем дело с внутримолекулярным процессом, когда в роли нуклеофильного катализатора выступает сама фосфат-заациная группа (катализатор находится в непосредственной близости с субстратом). В случае же реакции сульфонилирования 5'-гидроксильпзй группы куклеозидного компонента имеет место внешний нуклеофильный катализ. Причем катализатором служит пиридин, который является значительно менее эффективным нуклеофильным катализатором, чем 4-альоксипроизводныо П-оксида пиридина. Так, при использовании в качестве фпсфат-блокируюш.ей группы 1-оксидо-4-метокси-2-пиколильной группы за время, необходимое для полного завершения реакции конденсации (I мин.), образуется меньше 0.2% побочного 5;-оульфонилированного продукта.

Предполагаемый механизм внутримолекулярного нуклеофильного катализа показан на схеме 4.

Ранее в нашей лабораторж с помощью р-ШЛ'-спектроскопии был изучен механизм образования фосфотриэфирнсй связи в присутствии О-нуклеофильных каталкзатороз . Зыло показано, что высокорэакцион-носпособный промежуточный продукт, образующийся при действии на фосфодизфир конденсирующего рзагента в присутствии 4-димзтиламино-пиридот?-!-оксида, представляет собой Ы-фосФорилоксютридиниевую соль. По аналогии с этам иокно предположить, что Еысскореакциопко-с~особным промекуточнкм ■ продуктом з случае 1-оксидо-4-алкскси-2-ШЧОДИЕЬКВХ ЩЮЛЗВОД&й: (143,Г) Я2ЛЯ8ТСЯ циклическая К-фосфорил-окстагоклкЕиевзя СОЛЬ (1?).

ОНТгО—; А. "

I

£>=."—0 ' -сн2-<0)

""СА! к

1Л0.Г

Р--И, — СНа

а г

к- - —с,н.

Длч того, чтобы мвжнуклоотидная фосфат-занятная группа могла быть использована в синтезе олкгонуклеоткдов, она должна быть устойчива г. условиях осуществления реакции мекчуюшотидной конденсации, не должка удаляться з кислых условиях, необходимых для удаленил диметокситритильной защитной группы. Кроме того, должик существовать метода достаточно мягкого л селективного (без разрыва мекнуклеотидной связи) удаления данной защитной группы.

Всем эти?.? требованиям удовлетворяет 1-оксидо-4-метокси-2-таколильная (1-оксидо-4-метокси-6-м9тил-?-газолильная)' защитная хруппа. Тш:, с помощью ТСХ нами было установлено, что динуклеотид Г(кво)-тг]тр(п)т(В2) (где к=1-оксидо-4-метокси-2-пиколил) устойчив в растворе ш.ридина в присутствии трбс) в течение, по крайний мере, 3-х чассв, а .динуклеотид н0-тр(й)т(вг) не разлагается 3% дихлор-уксусной кислотой в дихлорэтане за время большее, чем 3 часа. Вместе с тем 1-оксидо-4-метокси-2-пиколильнзя защитная группа может быть селективно удалена с динуклэотида [(Меа)атг]тр(я)т-0Н в течение 2-х часов обработкой пиперидином при комнатной температуре

1.4. Твердофазный синтез олигонуклеотидов с применением О-иуклеойильных фосфат-зацитных групп.

Защищенные мономеры (на), несущие О-нуклеофильные каталитические фосфатзащитше группы , были с успехом использованы для твердо-

разного синтеза ряда олигодезоксирибонуклеотидов с длиной цепи 10-30 нуглеотидных звеньев. В качестве полимерного носителя использовали стекло с контролируемым размером пор (СРО-стекло, "посадка" нуклеозидпого компонента составляла 30-40 мхмоль/г). Наращивание олигонуклеотидной цепи осуществляли в направлении от 3'-конца к 5'-концу. На стадии конденсации применяли 10-ти кратный избыток Р-компонентг (14а) по отношению к ОН-компоненту, локализованному на полимерном носителе, и 3-х кратный избыток конденсирующего агента (трбс! ) по отношению к Р-компоненту. В качестве растворителя для Р-компонента и конденсирующего агента использовали пиридин. Растворы защищенных нуклеотидов (14а) в пиридине устойчивы при кош. температура в течение по крайней мере 3-5 дней.

Этапы реакционного цикла, необходимого для элонгации олигонуклеотидной цепи на одно нуклеотидное звено, представлены в таблице 2

Время, необходимое для осуществления одного цикла наращивания, составляет 7-8 минут в зависимости от используемого конденсирующего реагента. Зыходы после какдого цикла, рассчитанные по поглащеяию диметоксктритильного катиона, составляли 95-98%.

Табл.2.Последовательность операций в одном цикле нараицгаания при синтеза олигонуклеотидов на полимерных носителях.

Номер Название Реагенты и раствсрители Время

стадии

I. Промывка I,2-дихлорэтан 0.5

2. Удаление (исо)2тг группы 35? дихлоруксуснзя кислота в 1,2-дихлорэтане 1.5

3. Промывка 1,2-дихлсрэтэя 0.5

4. • Промывка Пиридин 1.0

5. Конденсация Реакционная смесь3 1-2

е. Промывка Пиридин 0.5

7. Кэпироваяие Пиридин-метапимидазол-уксусный ангидрид (8:1:1,v/v) 1.5

8. Промывка Пиридин 0.5

Нуклеотиднкй компонент (0.1 М, 100 мкл) прибавляли к раствору конденсирующего реагента (трэс! ) (0.3 М, 100 (жл) и полученную реакционную смесь немедленно прибавляли к 30 иг полимера на основе СРО-стехгла с иммобилизованным нуклеозидом (30-40 мкмоль г).

В таблице 3 приведены структуры некоторых слигонуклеотидсв, с;п1тезкроЕэнных по разработанному методу, и еыходы, с которыми они были получены.

Табл.3.Общие еыхсдк олигонуклостидов, синтезированных

с помощью фосфотриэфирного метода с внутримолекулярным О-нуклеофильным катализом.

Номер соедилзкия Последовательность(длина} Общий 2ых0дд3

После синтеза После6 выделения

20 ¿(сссгссстассатта) (15) 52 18

21 ¿(ТСТТССААТТСАТССАТСССССТСС)(25) 50 21

22 с! (еСААССОТАЬДСАТСТСТААОСТТ-ТААТ) (28) 32 12

23 с|(СТАТ6САТЗ&ТТССТТСЗТТАДСТТ- стлсттт) (31) 29 11

аВыходч рассчитаны по отношении к исходному нуклеозиду, иммоби-пизованному на полимерной" матрице.

бПосле удаления защитных групп с оснований и мекауклеотиджи. фосфатных групп и НГЬО на обращенной фазе.

Удаление защитных групп с олигонуклеотидных последовательностей после завершения синтеза осуществляли в три этапа.

1.Полимерный носитель (СРС-стекло) с иммобилизованной на нем олигонуклеотидной последовательностью обрабатывали пиперидином, чтобы удалить 1-оксидо-4-метокси-2-пиколильные защитные группы с атомов фосфора (6-12 часов, комн. температура).

2.После удаления пиперидина полимерный носитель обрабатывал:: концентрированным водным раствором аммиака (6 часов, БиРс). При этом происходит разрыв слокноэфирной связи с полимером и удаление защитных групп с азотистых гзтероциклов.

3.Наконец, длл удаления терминальной б'-диметскситриткльной защитной группы олигонуклеотидный материал (после упаривания) обрабатывали 80%-сй уксусной кислотой (10 кинут, комн. температура).

Целевые олигонуклеотидные последовательности выделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Чистоту полученных олигонуклеотидных последовательностей проверяли с помощью аналитической НРЬС кз обращенной фазе. На Рис.3.4 показаны НРЬС- профили. двух олигонуклеотидных последовательностей (го) и (гз), полученных до и после удаления концевой димэтоксптри-тильной защитной группы. ■

^280

Тг-15-мэр (20)

Тг-31-мер (гэ)

зо ю го зо до мин

Рис.З.Ш'/О-ааализ олигонуклеотидов с кснцевсй даметоксигритльной яай{ктн'ой группой после удаления защитных груш: оснований и фоефатоЕ (колонка ЫсЬгоеогЬ ЯР-18).

во шш

Ри.С.4.НРЬС-анализ целевых олигонуклеотидов после выделения с помощью электрофореза в 'ШАГ (колонка гсгЬах С-0).

Структура олигонуклоотидсв (зо), (гз) была подтверждена сечвени-розанием по методу Максача-Гилберта.

1.5. Автоматический синтез олигонуклеотидов.

Автоматический твердофазный синтез олигонуклеотидов имеет ряд особенностей в сравнении с ручным вариантом. Наиболее существенное отличие состоит в том, что б подающих коммуникациях синтезатора существует некоторый "мертвый" объем (длина коммуникационных линий между колонкой с твердофазным носителем и резервуаром с данным химическим реагентом) , и, поэтому, смешивание нуклеотидного

компонента и конденсирующего реагента происходит до их попадания на колонку с полимерным носителем, т.е. имеет место стадия преда::ти-вацки Р-компонента конденсирующим реагентом.

Когда в качестве нукяеотидных компонентов использовали дкэфиры (í-ta) (с 1-оксидо-4-метокси-2-школильной защитной группой), выходы после каждого цикла наращивания' не превышали 95% (даже если на конденсацию отводили.2 минуты). Было установлено, что е присутствии конденсирующего реагента нуклеотидный компонент с 1-оксидо-4-метскси-2-пиколильной защитной группой (14а) достаточно быстро (реакция полностью завершается в течение 1-го часа) превращается в нереакционноспособные побочные продукты. И поэтому еще до попадания на колонку с полимерным касителем (т.е. до начала конденсации) реакционная смесь загрязняется побочными продуктам*: и теряет часть своей активности (не исключено, также, что образующиеся побочные продукты могут в некоторой'степени ипгибировать реакции конденсации).Мы исследовали два пути решения проблемы продакткзации Р-компонента конденсирующим реагентом.

Первый состоял в применении вместо пиридина в качестве растворителя пространственно более затруднениях оснований - 2,6-лутидк::а к 2,4,6-коллидана, что приводит к значительному увеличению устойчивости 1-ОКСВДО-4- алкокси-2-пиколильной защитной группы в составе активированного Р-компонента (17а) (см. схему 4) к нуклеофильной атаке атомом азота пиридина.

Второй предполагал использование в качестве фосфатзыцктных групп производных N-оксида 2,5-лутидана. Устойчивость эт;гс защитных групп в условиях предактивацик с конденсирующим реагентом значительно зышэ (результат блокирования реакциопноспособнсго a-положения пиридинкевого кольца защитной группы и стерического затруднения, вызванного введением дополнительной метидьной группы). Так, при использовании 1-оксвдо-4-метокси-6-метил-2-пиколильной защитной группы даже 2-3-х минутная предактивапия не приводахj к заметным падениям выходов межнуклеотидных конденсаций.Хотя скорость реакции конденсации немного уменьшается (примерно в 1.5 раза) при переходе от нуклеотидннх компонентов (14а) к нуклеотидным компонентам (14Г) (см. Рис.1.), при том избытке Р-компонента, который обычно используется в твердофазном синтезе (10-20 кратный) эта разница скоростей практически нивклируется. Ранее, при ручном твердофазном синтезе в качестве растворителя для проведения реакции конденсации мы использовали'пиридин. Однако, для автоматического етктеза

пиридин как растЕоритыль не очень удобен вследствие довольно высокой вязкости. Поэтому мы попытались провести реакцию конденсации не в чистом пиридине, а в смеси зцетонитрил-пиридин в соотношении 9:1. При этом оказалось, что скорость реакции в последнем случае примерно вдвое выше. 'Так, если в качестве Р-ксмпонента использовали фосфодаэфир (14Г) (Схема 3, в=т,), а в качестве конденсирующего реагента- (tpsci), реакция конденсации полностью заканчивалась за 0.5 мин. при проведении т в растворе и за I-I.2 мин. па полимерном носителе (условия осуществления реакции конденсации аналогичны описанным ранее).

Для автоматического синтеза олигснуклеотидов ш использовали 0.05-0.06 М растворы нуклеотидпых компонентов (14Г) в. с.меси ск3сн:ру^Э:1 и 0.1-0.15 М раствор (tpsci) в смеси сн3сы:Ру^Э:1. 3 качестве растворителя для промывок использовали ацетонитрил и смесь ch3cn:pv:dhfa=T:I:I (однократная промывка после конденсации). Следует заметит!, что растворы нуклеотидных компонентов (14Г) в смеси cH3CN:py=S:I стабильны в течение по крайней мере 2-3 недчль. Этагм цикла наращивания на одно нуклеотидное с-взно представлены в табл.4. Синтез осуществляли на синтезаторе фирмы Applied Biosystem, модель 381 А,в масштабе 0.2 мкмоль (использовали стандартные колонки фирмы Applied Biosystem).

Табл.4.Последовательность операций в одном цикле наравдшания при автоматическом синтезе олигснуклеотидов.

Номер Название Реагенты и растворители Время

стадии с

I. Промивкз Ац^тснитрия 20

2. Удаление (МеО)2Тг группы 2% трихлоруксуская кислота 2 дихлорметаке 80-100

3. Промывка Ацетонитрил 70-100

Конденсация Реьхцжэннгя смесь 45-60

5. Промывка Ацетонитрил 30

6. Промывка CH3CN:ру:DMFA=I:I:I 20

7. Промывка Ацетонитрил 30

8. Капироваяие Фивмеяная рецептура3 15

9. Промывка Ацетонитрил 30

аРаетэор А: ДсаО;лутвдин:тнР (10:10:80); Раствор Б: I-Метштимидазол: THF (16:84).

Из табл.4 видно. что Еремя одного цикла наращивания составляет

(5.7-в.9 мин.). Временная вилка дана е зависимости от длины синтезируемой олигонуклеотидной последовательности. Минимальные значения мы задавали при синтезе более коротких олигонуклеотидных последсва-тельностей (20-25 зв.).

Время, необходимое для осуществления одного цикла наращивания на синтезаторе фирмы Applied Biosystem (модель 38IA), несколько превышает вышеприведенные значения за счет операций, не связанных напрямую с синтезом (промывка коммуникаций и др.), и составляет 8.5-9.5 мин. Выходы после каждого цикла составляли 96-99.5%.

Нами было синтезировано более 50-ти олигонуклеотидных последовательностей с длиной цепи 14-43 зв., представляющих собой фрагменты искусственного гена IgG-связивающего , фрагмента белка А Staphylococcus aureus, модифицированного гена р-галактозидазы Escherichia coli, олигонуклеотиды для направленного мутагенеза гена проинсулина человека, а также праймеры для 'установления первичной структуры нуклеиновых кислот. '

Удаление концевой 5'-диметокситритильной группы синтетических олигонуклеотидов осуществляли на . синтезаторе. Остальные защитные группы удаляли по разработанной нами методике (см. раздел II). Целевые олигонуклеотидные последовательности выделяли с помощью электрофореза в ПААГ.

Электрофорез в полиакриллмидном геле (Рис.5) и высокоэффективная жидкостная хроматография полученных олигонуклеотидов (Рис.6) свидетельствуют об их хорошем качество и высокой эффективности разработанного мэтодч. Сиквенс объектов, в состав которых зходили синтетические олигонуклеотиды, полностью подтвердил структуру последних.

12 3 4

. 6

'СВ

в-Q О'

©Ö

Ii:

¿'i « ! ;

< J- ! .

с-г ■"О t „5 С - 1 |

г>

Рис.5. '

Злзктрофорез з !1ААГ 5'-32р-;.'.зчекних

них олигонуклеогЕДОв. ■

1- IG-мер (24), реакционная смесь.

2- IS-Елгр (24), очкдешо помощью елзктрофорезь н- iiAAT.

3- 22-¡¿ер (£5) , пслучеккй £асф;:т-амидам ms то до:/., ре-г;;ц. смесь.

4- 23-ыср (25), реакакокаая смесь.

5- 23-ыер (ss)! omaieKriLÄ с по^оцью ржктрс/'рр^за 3 ПААГ.

6- 30-тр ) • o'-sicsKssü о ао^зцьк!

1б-мер (24) gtaatcatggtcatag

8) | "1 - » | г)

J L

23-мер (г,5) f taaattgctcgagcagtcag&c.

а) ~ tf) в! ri

30-мер (га) tacacatacgattta

ggtgacaoгата5аа

43-мер (г-')

caagctttaatacgactcacta tagtatttttacaacaattac

» в)

Рис.6. НРЬС-анапиз олитонуклеотидов (24), (25), (гв) (громатогра-фяческая система FPLC (Pharmacia), колонка hr-5/2)

а) с концевой б'-диметокситритяльной группой,

б) до елехтрофореза в ПЛАТ,

в) после електрофореза в ШАГ,

г) полученных фосфгаамидным способом, до електрофореза в ШАГ.

II. Разработка эффективного метода полного удаления защитных групп с олигодезохсирибонуклеотидов.

В настоящее время, с появлением высокоэффективных синтезаторов химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов сам по себе перестал быть трудоемким и утомительным процессом. Узким местом в олигонуклеотидном синтезе стали теперь постсинтетические процедуры, а именно: полное удаление защитных груш с синтетических олиго-нуклеотидов и выделение целевого олигонуклеотида из "сырого" олиго-нуклеотидного материала.

Для деблокирования олигонуклеотидов, получаемых наиболее распространенными О-цианэтильным фосфитамидным и Н-фосфонатным методами, повсеместно используют концентрированный водный раствор аммиака. Водный аммиак, будучи сильным основанием, эффективно разрушает сложноэфирную связь между 3'-концевым нуклеозидом и полимерным носителем (за 15 'минут при комнатной температуре), а также почти мгновенно удаляет щелочелабильнуа О-цианэтильную фосфат-защитную группу. Одноко данный реагент достаточно медленно (за 5-12 часов при 55°С) удаляет бензоильную и изобутирильную защитные группы, обычно используемые для защиты аминофункций гетероциклических оснований.

Миллер и сотр. показали, что этилендиамин (ЭДА) значительно более эффективно, чем водный аммиак, удаляет защитные группы гетероциклических оснований ацильного типа, а также способен эффективно разрушать сложноэфирную связь олигонуклеотида с полимерным носителем. Но применение ЭДА для деблокирования синтетических олигонуклеотидов невозможно из-за протекания в значительной степени (до IOS) побочной реакции при.'дебзнзоилировании К4-бензоилирован-ного цитозинового остатка (атака по атому С4-цитозинового кольца).

Вместе с тем, мы обнаружили, что моноэтаноламин (МЭА), являясь почти таким жэ сильным как ЭДА • деацилирующим реагентом, не дает вышеупомянутой побочной реакции. По крайней мере, при удалении бензоильной защитной группы с 5'-0-диметокситритил-К4-бензоил-2'-дезоксицитидина единственными . регистрируемыми методом ТСХ продуктами были Б'-О-диметокситритил-й'-дезоксицитидин и Н-бензоил-зтаноламин.

Эти данные побудили нас исследовать возможность применения МЭА для деблокирования синтетических олигонуклеотидов. С- этой целью мы

использовали смесь M3A:eloh=I:I (v/v), а для интенсификации процесса деблокирование проводили при 7СРС. МЭА является высококипящей жидкостью (Ткш1= 171°С), поэтому повышение температуры до 7iPc ке приводит к неудобствам, связанным с необходимостью строгого соблюдения требований по герметизации рабочего сосуда, как в случае деблокирования водным растзором аммиака.,

II.1. Удаление различных занятных групп, используемых в олиго-куклеотидисш синтезе, спиртовым раствором МЭА.

Кинетику удаления эпильных защитных групп нуклеиновых оснований испледовали на примера б'-диметокслтритил-И-ацил-З'-дезокси-куклесзидпч. Мы установили, что при 7СРС смесь МЭЛ:еюн=1 :1 полностью удаляет наиболее медленно удаляемую .изобутирильную защитную группу С DMTrG,B<J ЗЭ 15 минут ('1j/2~ 'ЛИН.). В'этих ке успсзиях удаление бензоильной защитной группы с пмтга62 и с dmt.-cbz завершается в точение 10 минут. Во всех трех случаях с псмошыэ ТСХ нам не удалось обнаружить никаких побочных продуктов.

Спиртовой раствор МЭА бистро .разрушает и сложноэфирную связь мекду 3'-концевым нуклоозидом и полимерным носителем (стекло с контролируемым диаметром пор). ПРИ 70°С для полного разрыва сложно-эфирной связи смесью МЭА:еюн=1 :1" требуется 15-20 минут.

Мы обнаружили также, что спиртовой раствор МЭА селективно удаляет наиболее часто используемые в олигонуклеотидном синтезе 0-циан-этильнуа и О-метильную фосфат-защитные группы, а также предложенную наьн I -оксидо-4-мэ токси-6 -ме тил-2-ттколильную (0ММП-) фосфат-защитную группу . Кинетику удаления фосфат-защитных групп изучали на примере трлэЗира пнТгТр(R)тон (r- соответствующая фосфат-защитная группа), обрабатывая последняя 25%-ным спиртовым раствором МЭА при 70=6 (Ptre.7). В этих условиях щелочелабильная О-циачэтильная группа удаляется уже в течение 2-х кинут. Для удаления О-кетильной фосфат-защитной группы требуется 30 минут 6.5 мин.). Наконец,

снятие ОММП-защитной группы с межнуклзотидного фосфата завершается за 70 минут ("Cj^- IS мин.). Во Есех случаях единственным продуктом реакции нуклеотидкой природа был диэфир омтгтртон, который идентифицировали метод™ ТСХ со свидетелем.

Все вышеприведенные данные говорят о возможности использования МЭА в качестве реагента для полного деблокирования синтетических слигонуклеотидов, полученных различными методами.

1- удаление О-цианэтильной группы.

2- удаление О-метильной группы.

3- удаление 1-океидо-4-ме токси-6-ме гил-2-пиколильной грушш."

IX.2. Полное удаление защитных групп с синтетических олигонуклеотидов.

Заметим сразу, что удаление концевой б'-диметокситритильной группы осуществляли на синтезаторе.

II.2.а. Деблокирование олигонуклеотидов, полученных фосфотри-эфирным методом с применением ОШП-фосфат-заищаюй группы.

В этом случае лимитирующей стадией является процесс удаления ОММП-защитных групп с межнуклеотидных фосфатов. Основываясь на вышеприведенных данных и принимая во Енимание, что эти данные верш для нуклеозидов и динуклеотидсв, мсино предложить следующий вариант полного деблокирования синтетических . олигонуклеотидов с ОММП-фэсфат-защитной группой:

обработка полимерного носителя с прикрепленным к нему олигонуклеотидным материалом' смесью МЭА:еюн=1 :1 при 70°С в течение 80-100 минут (80 мин. при длине олшадукпеэткднсй . последовательности до 30 нукл. зв., 100 мин.- при длине, близкой к 60 нукл. зв.).

На. Рис.8 приведен ЫРЬС-профиль неочищенного деблокированного олигокуклеотида (24). полученный после обработки защищеннного олигомэра (24) смесью МЭА:е1Сн=1:1 в течение 80 минут при Неэффективность предложенного Еыае метода деблокирования ' можно'

Рис. 8.

Н?ЬС-про£иль олигонуклеотида (24) после деблокирования смесью M3A:eloh=I:I, 70 С, 80 ьшн. Хромагографичеекая система iTLC (Pharmacia), колонка НН-Ь/2.

несколько погасить, если использовать не смесь M3A:floh=1:1, а чистый ноноэтанолйкш. В этом случая время обработки составляет 60 минут при длине олигонуклеотидных последовательностей до 30 нукл. ЗЕеньев к 80 минут при длине около 50 нукл. згеньез. Данный метод был применен для деблокирования ряда олигодезоксирибонуклеотидсв, синтезированных на синтезаторе фирмы Applied Binsystem, модель 38IA по тркзфчрной схеме с внутримолекулярным О-нуклеофильным катализом (см. Рис.5).

II.2.б. Деблокирование олигокук.'.есг>аидо8, получениях Q-цшн-ззялыаш фос.фитпа.к'.'Зкыл и Н-фосфонатшя летодсиш.

Из Рис.7 видно, что О-цианэтильнея фосфат-защитная группа удаляется при 7С°С спиртовым раствором Шк почта мгновенно. Скорости кз удаления защитных групп с нуклеиновых оснований л разрыва слогшоэёнрной связи мевду 3' -конце вш нуклеозидсм и полимерным носителем смесью МЭА:еюн=1:1 примерно одинаковы. В обоих случаях для полного завершения процесса требуется 15-20 минут тгрл 70°с (см. раздел II. 1.). Это и есть минимальное Ере?^я, необходимое для полного деблокирования дккзроз. Для полного удаления защитных групп с олпгснуклестидов следует увеличить время обработки на IG-20 минут.

Таким образом, оптимальным вариантом полного деблокирования синтетических олигонуклеотидов с О-цианэтильной фосфат-защитной группой будет обработка полимерного носителя с иммобилизованным олигонжлеотидным материалом смесью МЭА:еюн-1 :1 в течение 50-40 минут при 7CPC (30 мин. при длине олигонуклеотидной последовательности до 40 нукл.гв., 40- при длине до 70 нукл.зв.).

При синтезе олнгонуклеотидов Н-фосфонатным методом после заключительной стадии окисления мы уже имеем природные диэфирные меж-

нуклеотидные связи. Следовательно, процедура удаления защитных групп в данном случае сводится к удалению защитных групп остатков нуклеиновых оснований и разрыву сложноэфирной связи с полимерным носителем. Поэтому полное деблокирование олигонуклеотидов, полученных Н-фосфонатным способом, осуществли по методу, предложенному для олигонуклеотидов с О-цианэтильными фосфат-защитными группами.

Данным методом был деблокирован целый ряд олигонуклеотидов, полученных О-цианэтильным фосфитамидным и Н-фосфонатным методами на синтезаторе фирмы Applied Biosystems модель 38IA. Сравнение HPLC- профилей олигонуклеотидов, полученных после деблокирования стандартным (обработка конц. водным раствором аммиака) и разработанным нами методом (Рис.9) говорит о полной их идентичности. Деблокированные новым методом олигонуклеотиды после очистки с помощью электрофореза в ПААГ использовали для различных генно-инженерных целей. _ Структура1 олигонуклеотидов была подтверадена сиксонсом фрагментов ДНК, в состав которых они входили.

II.2.в. Возможность деблокирования олигонуклеотидов, полчен-кых О-летилънил фосфитакидн&м методом.

При деблокировании этого класса синтетических олигонуклеотидов смесью МЭА:еюн=1:1 скорость определяющим процессом будет удаление О-метильных защитных групп с межнуклеотидных фосфатов. Принимая ео внимание, что для полного удаления защитных груш с димера при 70°С требуется 30 минут (см. раздел II.1.), можно рекомендовать следующий вариант полного деблокирования. олигонуклеотидов с О-метильБыми фосфат-защитными группами: обработка полимерного носителя с иммобилизованным. олигонуклеотидным материалом смесью M3A:eloh=1:1 при 70°С з течение 40-60. минут (в зависимости от длины олигонуклеотидной последовательности).

40-,мэр (27)

ДАТТССАСАТСТТОАТСТСГ Д— ■^ССДТТТСАСССССТСТТСТ

о; й) 1

1 < Л

24-мер (гэ) ССОСССАССТТСТССТТЕСССАСС

г а) • (!) |

1

53-мер (ге)

ТСеДСТТААТТЛАТТАДДААСССТДТ-ССАСДАТСАААСЗААТССАТАбСССТС а) б)

20-мэр (зо)

СЗСССССАТССАССТТСАССССАТССАСС

а) | : е) 1 ! |

РИС.9. КРЬС-анализ олигонукдеотидов (27), (23), полученных

б-цязнэтильннм-фосфитамидным методом, и олигонуклеотидов (29), (зо), полученных Н-фэсфонатным методом. Хроматогра-фическая система И'ЬО (РЬагтао1а), колонка Нй-5/2. а) после деблокирования водным раствором аммиака. . б) после деблокирования смесью МЭА:еюн-1 .

ВЫВОДЫ

I.Осуществлен синтез ряда нуклеофильных катализаторов- производных К-окоида пиколина и. дутидина, имеющих злектронодонорный О-алккльяый заместитель в 4-ом положении пиридипиевого кольца и оксиметпленовую группу во 2-ом положении.

2.Получены защищенные нуклео-гиды с 0-яуклео$илышмп фосфат-защитными группами. Показано, что наличие этих груш, выполняющих одновременно роль внутримолекулярного нуклеофильного катализатора, приводит к значительному увеличению скорости реакции мекнуклеотид-ной конденсации, а также резко снижает степень образования побочных б'-сулъфонилированккх продуктов.

3.Разработана схема скоростного фосфотриэФирного твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов с использованием внутримолеку-

лярного О-нуклеофильного катализа в ручном и автоматическом вариантах. Эффективность предложенного метода доказана синтезом более 50-ти различных олигонуклеотидных последовательностей длиной до 43 звеньев, использовавшихся для целей генетической инженерии.

4.Предложен эффективный метод полного удаления защитных групп с синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, основанный на применении моноэтаноламина в качестве деблокирующего реагента.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях :

1. V.A.Efimov, A.A.Buryakova, I.Y.Dubey, H.N.Polushin, O.G.Chakhmakhcheya and Yu.A.Oychinnikoy. Application of new catalytic phosphate protecting groups ior the highly efficient phosphotriester oligonucleotide synthesis. - Nucl. Acids Res., 1986, V.14, î^-16, p.5525-6540. '• *

2. V.A.Efimoy, O.G.Chakhmakhcheya, N.N.Polushin and I.Y.Dubey. Nucleophilic catalysis in the oligonucleotide synthesis. - Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 198T, №18, p.213-216.

3. V.A.Efimoy, A.A.Buryakova, N.N.Polushln, I.Y.Dubey, O.G.Chakhmakhcheya and Yu.A.Ovchinnikov. Phosphotriester synthesis of oligonucleotides with the use of N- and 0-nucleo-philic intramolecular catalysis. - Nucleosides & Nucleotides, ¡937, 7.6 (1&2), p.279-282.

4. Ефимов В.А., Мирских O.B., Бурякова А.А., Пашкова И.H., Полушга H.H.Чахмахчева О.Г. Конструирование промоторпробных векторов на основе модифицированного гена (З-галактозидазы Eschericyia coll. - Биоорган, химия, 1989, т. 15, №l, с.90-103.

5. Ефимов В.А., Буряковэ .А.А., Полуиин Н.Н., Пашкова И.Н., Дмитракова Е.В., Чахмахчева O.P. Синтез и экспрессия искусственного гена IgG-связывающего фрагмента белка А Staphylococcus aureus.- Биоорган, химия, 1989, т. 15, №4, с.499-507.

6. Ефимов В.А., Бурякова А.А., Пашкова И.Н., Полушин Н.Н., Чахмахчева О.Г. Конструирование, семейства искусственных генов, инсулина человека. - Биоорган, химия, 1989, т.15, №8, с.1070-1077.

7. Ефимов-В.А., Полушик Н.Н. Быстрый метод полного деблокирования синтетических олигонуклоотидов.- Биоорган, химия, 1991, т.17 (в

печати ).