Фотофизические и фотохимические свойства 5-фторурацила в водных растворах и твердом состоянии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

СУЛТАНБАЕВ МИХАИЛ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ И ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 5-ФТОРУРАЦИЛА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук 15 г; г] 2(Щ

Уфа - 2014

005557505

005557505

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук. Научный руководитель; Остахов Сергей Станиславович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Зимин Юрий Степанович

доктор химических наук, профессор, профессор кафедры физической химии и химической экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Асфандияров Наиль Лутфурахманович

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией физики атомных столкновений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физики молекул и кристаллов Уфимского научного центра Российской академии наук.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук (г. Уфа)

/л Js 00

Защита диссертации состоится « февраля 2015 года в /V? ч на заседании диссертационного совета Д 002.004.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии УНЦ РАН по адресу: 450054, Башкортостан, г. Уфа, проспект Октября, 71; факс (347) 2356066, e-mail: chemorg@anrb.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте: http://www.chem.anrb.ru/.

Автореферат разослан декабря 2014 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор химических наук, профессор / Валеев Ф.А.

ОГ.ЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность паботы. Уникальная комплементарность пиримидиновых и пуриновых оснований ДНК позволяет на протяжении многих поколений передавать информацию при репликации ДНК. Однако известны многочисленные случаи спонтанных и индуцированных мутаций, обусловленных нарушением последовательности цепочки ДНК. Среди причин спонтанных мутаций немаловажную роль играет образование анионных и таутомерных форм пуриновых и пиримидиновых оснований, а индуцированные мутации могут инициироваться фотохимически. Один из главных вопросов в фотобиологии - о первичных механизмах воздействия излучений на основные биохимические компоненты живых клеток- еще далек от разрешения и не теряет своей актуальности. Ощущается явный дефицит сведений о фотофизических (излучательный и безызлучательный перенос энергии) и фотохимических (фотоиндуцированный перенос электрона (ФПЭ) и протона (ФПП)) процессах, протекающих в электронно-возбужденных состояниях пиримидиновых оснований в растворах. Прояснить же сложную картину физико-химических процессов, протекающих под действием света в водных растворах пиримидиновых оснований, позволяют исследования ФПП и ФПЭ урацилов в твердой фазе, когда короткоживущие интермедиаты стабилизируются кристаллической матрицей.

Известно, что пиримидиновые основания обладают флюоресценцией (ФЛ) и высокая информативность спектрально-люминесцентного метода открывает новые возможности для решения поставленных в работе актуальных проблем таутомерного и кислотно-основного равновесий, фотофизики и фотохимии производных урацила в растворах и твердом состоянии.

Результаты, изложенные в диссертации, являются частью исследований, проводимых в ИОХ УНЦ РАН по темам: «Хемилюмикесценция ионов и 5Г- элементов в конденсированной фазе», «Химия возбужденных молекул и комплексов металлов и реакции, сопровождающиеся излучением света» (номера государственной регистрации 0120.0601534, 0120.0801445). Настоящая работа выполнена при финансовой под держке гранта Республики Башкортостан молодым ученым и молодежным научным коллективам (№ 20, 29 мая 2012 г.), программы У.М.Н.И.К. (Проект X» 14242, 2011 г.), ОХНМ РАН (№ 1-ОХ).

Цель работы. Установление закономерностей фотофизических и фотохимических процессов протекающих в водных растворах и твердом состоянии урацилов.

Достижение указанной цели предусматривает решение следующих научных задач: - спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных и анионных форм 5-фторурацила (ГО) и тегафура (ТР) в водных растворах;

- исследование ФЛ и процессов ФПП и ФПЭ в кристаллическом 5-фторурациле;

- изучение ФЛ из высоковозбужденных синглетных состояний урацилов;

- исследование спектрально-люминесцентных свойств и комплексообразовашгя 5-фторурацила с ß-циклодекстрином (ßCD).

Научная новизна и практическая значимость.

Зарегистрированы индивидуальные спектры ФЛ таутомерных и анионных форм FU в водных растворах, определены их процентное содержание и квантовые выходы люминесценции.

Обнаружен ФПП и ФПЭ в кристаллическом FU, приводящие к образованию его кето-енольных форм и радикалов.

Обнаружено редкое явление излучательного перехода ряда урацилов в водных растворах со второго синглетно-возбужденного Бг-уровня на основной (нарушение закона Вавилова), которое объясняется ультракороткими временами жизни ФЛ (~ 100 фс) первого синглетно-возбужденного Si-уровня.

Результаты исследования комплексов включения противоопухолевого средства 5-фторурацила с ß-циклодекстрином практически значимы, поскольку в клатратах значительно увеличивается растворимость и фотостабильность фармпрепарата.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: VII Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (Уфа, 2009), XXVII Всероссийском симпозиуме молодых ученых по химической кинетике (Москва, 2009), V Региональной конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2010), I Республиканской конференции молодых ученых «Химия в интересах человека» (Уфа, 2011), Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых веществ и материалов», (Сыктывкар, 2011), Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2011), Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), VIII Республиканской конференции молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» (Уфа, 2011), ХХП1 Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2011), VI Съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, 2011), VI конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2011), VI Всероссийской научно-практической конференции «Обратные задачи химии» (Бирск, 2011), XV молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), VII Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2012), 3-rd International Symposium «Molecular Photonics» (Repino, St. Petersburg, 2012), XXIV

Конференции «Современная химическая физика (Туапсе, 2012), IX Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия координационных соединений» (Туапсе, 2012), XXV конференции «Современная химическая физика» (Туапсе, 2013), XXVI конференции «Современная химическая физика» (Туапсе, 2014).

Публикации. Основные научные результаты диссертации опубликованы в 8 статьях в научных журналах, входящих в перечень ВАК, 1 статье в сборнике статей по материалам конференции, а также тезисах 19 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), обсуждения результатов (главы 3), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 141 странице, включает 46 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 216 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР В главе представлен литературный обзор физико-химических свойств и ФЛ пирими-диновых оснований, люминесценции органических соединений из высоковозбужденных еннглетных состояний, а также комплексообразующих свойств циклодекстринов.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В главе приведены характеристики объектов исследований, способы приготовления растворов и твердых образцов, описание экспериментального оборудования и установок, методики проведения измерений.

Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1 Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных и анионных форм 5-фторурацпла и тегафура в водных растворах 3.1.1 Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных таутомеров 5-фторурацнла и тегафура в водных растворах Теоретически 5-фторурацил может существовать в 6 таутомерных формах (рисунок 1.1). Однако экспериментально индивидуальные таугомерные формы ГО ранее не регистрировались.

В Б С £

Рисунок 1.1. Таутомеры 5-фторурацила

На рисунке 1.2 приведены спектры поглощения, скорректированные спектры возбуждения (длина волны регистрации (Лет) 470 нм) и флуоресценции Ш (длина волны возбуждающего света (Лет) 265 нм) в нейтральных водных растворах.

/, отн.ед

Рисунок 1.2 - Спектры Р1Т: 1 - поглощения; 2 - возбуждения ФЛ (Лет = 470 нм); 3 - ФЛ. (с(ри) = Ш4 моль/л, = 265 нм, Н20,^Н 6.5, 298 К).

Обращает на себя внимание несоответствие спектров поглощения (спектр 1) и возбуждения ФЛ (спектр 2) 5-фторурацила. Такие различия возможны лишь в том случае, если мы наблюдаем излучение нескольких эмиттеров с существенно отличающимися квантовыми выходами ФЛ и перекрывающимися спектрами поглощения. Это предоставляет возможность спектрально-люминесцентного обнаружения редких таутомерных форм при их селективном фотовозбуждении в максимумах и перегибах в спектре возбуждения ФЛ 5-фторурацила. Тщательное сканирование по частотам возбуждающего света с шагом в 1 нм позволило впервые экспериментально зарегистрировать излучение четырех таутомерных форм Ш, с максимумами ФЛ (Ад) при 340, 378, 414 и 434 нм (рисунок 1.3).

/, отн.ед.

Рисунок 1.3 - Нормированные по максимуму скорректированные спектры ФЛ FU при л„: 1 - 265 нм, 2-305 нм, 3 - 320 нм и 4 - 345 нм (c(FU) = 10^ моль/л, Н20,/Ш 6.8, 298 К).

350 400 450 500 550 600 А, нм

Спектр 1 с Хп - 340 нм (спектр 1) соответствует известной из литературы ФЛ таутоме-ра А, а полосы с Ли = 378,414 и 434 нм были предположительно отнесены к таугомерам В, D и С 5-фторурацила. С целью доказательства корректности высказанного предположения было исследовано производное FU - тегафур. Для TF возможно существование только А, D и С таутомеров (рисунок 1.4), ФЛ которых (рисунок 1.5) практически совпадает с излучением FU при 340, 414 и 434 нм (рисунок 1.3).

'Измерения проведены на оборудовании ЦКП «Химия» ИОХ УНЦ РАН.

Рисунок 1.4 - Таугомеры тегафура.

Рисунок 1.5 — Нормированные по максимуму скорректированные спектры ФЛ ТБ при Ае*: 1 - 265 нм, 2 - 320 нм, 3 - 345 нм (с(ТР) = 10" моль/л, Н20,рН 6.8, 298 К).

600

350 400 450 500 550 Я, нм

Из полученных данных, ФЛ FU с максимумом 378 нм (спектр 2, рисунок 1.3) с полной уверенностью можно отнести к таутомеру В. Однако, при том, что излучение при 414 и 434 нм вне всяких сомнений принадлежит D и С таугомерным формам FU, тем не менее, однозначное отнесение к тому или иному таутомеру требует дополнительного экспериментального доказательства, которое приведено в разделе 3.2.

Квантовые выходы ФЛ таугомеров ГО и TF (таблица 1.1) определяли с использованием внешнего стандарта - триптофана (Тгр) по уравнению (1.1):

<Р\ = ¥Tipx №*ЛтфУ№ф*ло (1-1)

где (р{ - квантовый выход ФЛ таугомеров FU и TF, <?тф - квантовый выход ФЛ Тгр равный 0.14, S, и А{ - светосумма под полосой ФЛ и оптическая плотность поглощения таугомеров ГО и TF на длине волны возбуждающего света, соответственно, 5гФ и Лтгр- то же для Тф. Квантовые выходы ФЛ таугомеров В, D, С 5-фторурацила и D, С тегафура на порядки превышают tp ФЛ диксто-таугомера А (таблица 1.1). Именно этим обусловлена возможность регистрации индивидуальных спектров люминесценции редких таутомерных форм FU.

Располагая данными по квантовым выходам ФЛ таугомеров FU и TF из уравнения 1.2 определено их процентное соотношение (таблица 1.1).

S.

-х 100%

<Р;

(1.2)

где ЦЯ/р) - сумма отношений интегральной площади под полосой излучения к квантовому выходу ФЛ таугомеров 5-фторурацила и тегафура.

Таблица 1.1 - Люминесцентные характеристики и процентное соотношение таутомеров 5-фторурацила и тегафура.

ки

Таутомеры А В О С

Ад, нм 340 378 414 434

<р, хЮ4 2.2 33 380 3400

с,% 99.5 0.4 0.03 0.008

ТГ

Таутомеры А - Б С

лп, нм 340 414 434

Ч>, хЮ4 1.6 85 470

с,% 99.7 0.25 0.05

Погрешность — ±10%.

Таким образом, спектрально-люминесцентные методы исследования позволили впервые экспериментально зарегистрировать индивидуальные спектры ФЛ четырех из шести теоретически возможных таутомеров Ш и трех таутомеров Тр, определить их квантовые выходы ФЛ и процентное содержание.

3.1.2 Спектрально-люминесцентное исследование анионных форм 5-фторурацнла и

тегафура.

Спектры поглощения анионов Ш в водных растворах хорошо изучены, однако их ФЛ ранее не исследовались. Диссоциация РЬ1 на первой ступени (рН 8) может происходить с образованием анионов АШ НАГО", на второй (рН 13)-АМ1,32" (рисунок 1.6).

Р ? ?

0 Рисунок 1.6 - Анионные фор-

N || Нг4 N ТТ

1 ! 1 ^ ^ ^ мы Би.

О^п О^М о^к

Не©

АГО" АМ" АМ^2'

На рисунке 1.7 представлены УФ-спектры водных растворов ГО при/>Н 11 и 14.

При рН 11 регистрируется спектр 1 РЬГ с максимумом 269 нм и перегибом в области 300 нм (рисунок 1.7 а). В результате его покомпонентного разложения получены спектры 2 и 3, отнесенные к моноанионам АМЗ и АМГ, с максимумами поглощения 269 и 300 нм, соответственно. При рН 14 максимум поглощения дианиона АК1,32 - 284 нм (рисунок 1.7 б).

А 1.0

0,8 0,6 0.4 0.2 0.0

1\ л \

\у/ / 1 ? / - / / Ч \ * \ т \ У \д

Рисунок 1.7 - Спектры поглощения ГО при: (а) рН 11: 1 - исходный спектр, 2 и 3 - результаты покомпонентного разложения спектра 1; (б) рН 14 (с(ГО) = 10"* моль/л, Н20, 300 К).

210 240 270 300 к, км

240 270 300 им

При фотовозбуждении в максимумы поглощения анионных форм ГО впервые зарегистрированы спектры ФЛ моноаннонов АШ~, ANГ и дианиона АШ,32' 5-фторураципа с максимумами Яп = 358,372 и 366 нм, соответственно (рисунок 1.8). /, отн.ед.

Рисунок 1.8 - Спектры ФЛ ГО при: (а) рН 11 (1 - А„ = 269 нм; 2 - = 300 нм) и (б) рН 14 (/.„ = 284 нм) (с(ГО) = Ю-4 моль/л, Н20, 300 К).

350 400 450 500 350 400 450 500

Л. нм л, ям

Спектрально-люминесцентные характеристики анионных форм ГО приведены в таблице 1.2.

Таблица 1.2 - Спектральные параметры и квантовые выходы ФЛ анионных форм ГО.

рН Поглощение Флюоресценция

¿а*, НМ е=< 10"3, лхмоль"1хсм"1 Ал, нм рхЮ4

АЮ" 11 269 8.8 358 11.2

АМЗ2" 14 284 6.5 366 26.5

А1ЧГ И 300 7.4 372 35.1

Погрешность - ±10%.

Батофлорный и батохромный сдвиги в спектрах люминесценции и поглощения ГО, а также рост квантового выхода ФЛ анионных форм 5-фторурацила в ряду А > АКЗ > АШ,32 > АНГ, обусловлены увеличением степени сопряженности связей в гетероциклс, что подтверждается данными квантово-химических расчетов .

' Все квантово-химические расчеты выполнены на кластерном компьютере ЦКП «Химия» ИОХ УНЦ РАН д.х.н., проф. Х}реаном С.Л., к.х.н., н.с. Овчинниковым М.Ю.

3.2 Фотохимия кристаллического 5-фторурацпла.

Ранее было принято считать, что в кристаллической решетке дегидратированный 5-фторурацил существует только в дикетотаутомерной форме. Однако, при фотооблучении кристаллических образцов ри в длинноволновом максимуме поглощения Б] <— Эо перехода (265 нм) обнаружено изменение спектрального состава флюоресценции (рисунок 2.1 а). В процессе фотолиза наблюдается уменьшение интенсивности ФЛ дикето-таутомера А (334 нм) и появление новых полос излучения при 375, 415, 455 нм в коротковолновой и 530, 555 нм в длинноволновой областях спектра (рисунок 2.1 а, спектры 2 и 3). /, отед.

10 8 6

4 2 0

5 4 3 2 1 0

0,3

9Д

0,1 •

0,0

/V2 \ 1 а

Irs?

б

1Г\ в

Рисунок 2.1 - (а) Спектры ФЛ кристаллического FU: 1 — необлучен-ный; 2-2 мин облучения; 3-20 мин облучения (А« = 265 нм, интенсивность светового потока 1.5х1014 квантуем2хс), 300 К), (б) Результаты покомпонентного разложения спектра 3 а. (в) Спектры ФЛ таутомеров FU в ШО: 1 - А (Аи = 265 нм); 2 - В (Яех= 305 нм); 3-D (Яех= 320 нм); 4 -С = 345 нм) (с (FU) = 10"4 моль/л, рН 7, Г = 300 К).

350 400 450 500 550 600 Д. нм

Полученные результаты интерпретированы с позиций ФПП, приводящего к образованию кето-енольных форм FU (An = 375, 415, 455 нм) и ФПЭ с генерацией радикалов 5-фторурацила (лп= 530, 555 нм).

Фотоиндуцированный перенос протона в кристаллическом 5-фторурациле Доказательством наличия ФПП может служить образование кето-енольных таутомеров. На рисунке 2.1 б, приведены результаты покомпонентного разложения спектра ФЛ фо-толизованного в течение 20 мин кристаллического FU (спектр 2, рисунок 2.1 а). На рисунке

2.1 в приведены индивидуальные спектры ФЛ четырех таутомеров ГО в водных растворах. Максимумы ФЛ фотолизованного кристаллического ГО при Дя = 375, 415, 455 нм (спектр 3, рисунок 2.1 а) удовлетворительно коррелируют с таковыми для его минорных таутомеров В, О и С (см. раздел 3.1) в водных растворах Дя = 378, 414, 434 нм (рисунок 2.1 б), что однозначно указывает на фотоиндуцированное образование кето-енольных таутомеров.

Кристаллические структуры ГО имеют димериые фрагменты, в которых существуют две водородные связи, и ФПП в димерах может приводить к образованию кето-енольных форм В, Б и С 5-фторурацила по реакциям 2.1,2.2 и 2.3, соответственно.

у

H-N А Х-

И

а р

H-fcS

Н

' о

I

<

А К—II

(ч

м

о

V

F—(а ^=0 F—/р^=0

СО Н-^ hv О \

i О-^ "

Н О* \ О

А N-H 0=/ с N~"H

О О

bv

■7 А

"И v<

H-N Л V=0 H-N' С )=0

(2.1) (2.2) (2.3)

Фотоиндуцщюванный перенос электрона в кристаллическом 5-фторурациле На основании литературных данных при радиолизе кристаллического ГО возможно образование радикалов II1 и 1*2 (рисунок 2.2).

Н \

о о

17 ТГ X V

Рисунок 2.2 - Радикалы 5-фторурацила.

R1 R2

При фотооблучении кристаллического FU регистрируется появление полос ФЛ при 530, 555 нм (рисунок 2.1), которые мы связываем с генерацией радикалов R1 и R2 (рисунок

2.2) в результате ФПЭ. Такая фотореакция может быть обнаружена по люминесценции, обусловленной рекомбинацией радикальных пар, которая действительно наблюдается при растворении фотолизованных образцов FU, появлению окраски - поглощение в видимой области 450 - 550 нм после фотолиза, и сигналу ЭПР (рисунок 2.3). Для фотооблученного в атмосфере аргона поликристаллического ГО наблюдается сигнал ЭПР сложной формы (рисунок

2.3). В спектре ЭПР можно выделить два слабых триплета, которые соответствуют сигналу радикала R1. Центральная часть сигнала ЭПР представляет собой суперпозицию сигналов от R1 и R2 радикалов. После перекристаллизации облученного FU сигнал ЭПР не обнаруживается вследствие рекомбинации радикалов при растворении.

|g = 2,0068

Рисунок 2.3 - Первая производная спектра ЭПР в Х-диапазоне, фото-облученного в течение 120 мин поликристаллического 5-фторурацила. Окружностями выделены два слабых триплета. Облучение ри и регистрация спектра ЭПР при 300 К в атмосфере аргона.

Генерация радикалов Ш и 112 возможна как из дикето-таутомера А, так и из кето-енольных форм В и О 5-фторурацила. Исходя из структуры таугомеров НЛ радикал К( может образоваться из форм А и В в результате ФПЭ с дальнейшим отщеплением протона:

А.,

j ri-А/

ABJ

О N Н с?

(2.4) (2-5)

Образование радикала R2 возможно протекает вследствие присоединения электрона, а затем протона к таутомерам А и D 5-фторурацила по реакциям:

н н к н

\ \ \ \

по О ООО

I —^ ±Юк 1DI -- i 1 I —- Г*

и „ „ O^N^H O^N-^H O^N^Sl O^N^H O^N ..

Ill III

н н н H И н

(2.6) (2.7)

В то же время, фотоионизация таутомера С 5-фторурацила не может привести к образованию радикалов R1 и R2.

Процессы ФПП и ФПЭ при облучении кристаллического FU взаимосвязаны и последовательность их протекания, может быть установлена из кинетических измерений интенсивности ФЛ в максимумах 334, 375, 415, 455 и 530, 555 нм, соответствующих излучению А, В. D и С таугомеров 5-фторурацила, а также радикалов R1 и R2 (рисунок 2.4). Как можно видеть из кинетики ФЛ при 334 нм (рисунок 2.4 а), от времени фотооблучения наблюдается снижение концентрации таутомера А, которое происходит вследствие ФПП и ФПЭ, приводящих к образованию кето-енолытых таугомеров и радикалов 5-фторурацила, что подтверждается ростом интенсивности их ФЛ (рисунок 2.4 б, в, г и рисунок 2.4 д, е). Кинетические зависимости интенсивностей ФЛ представленные на рисунке 2.4 б и 2.4 в, характерны для

последовательных реакций, в которых промежуточными продуктами являются енольные формы таутомеров В и В 5-фторурацнла, соответствешю. Уменьшение интенсивности ФЛ после достижения экстремума (рисунок 2.4 б и 2.4 в) обусловлено процессами ФПЭ в тауто-мерах В и Б 5-фторурацила по реакциям 2.5 и 2.7, приводящими к образованию радикалов Ш и К2. Таутомер С 5-фторурацила в процессе фотолиза не расходуется (рисунок 2.4 г), что свидетельствует о невозможности, как предполагалось выше, его фотоокисления с образованием именно Ш и И2 радикальных пар.

1.0

0.5

0.0 1.0

ч

ч> к н

° 0.5

0.0 1.0

0.5

0.0

О 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 /, мин.

Рисунок 2.4 - Изменение интенсивностей ФЛ в максимумах 334 нм (а), 375 нм (б), 415 нм (в), 455 нм (г), 530 нм (д) и 555 нм (е), соответствующих излучению А, В, Б и С таутомеров ри, а также радикалов К1 и Я2 при фотооблучении кристаллического 5-фторурацила (/.„ = 265 нм, 1.5х1014 квант/(см2хс), 300 К).

Кроме того этот факт является доказательством правильности отнесения полос ФЛ Ри при 414 и 434 нм в водных растворах к таутомерным формам Б и С соответственно (раздел 3.1).

Таким образом, установлено, что при фотооблучении ри осуществляются ФПП и ФПЭ, приводящие к образованию трех кето-енольных таутомеров и ион-радикальных пар, которые стабилизируются кристаллической матрицей.

3.3 Сверхбыстрые излучательные вг—»во переходы урацилов в водных растворах

Ранее возможность наблюдения, так называемой «аномальной» Эг—»Эо ФЛ при переходе со второго синглетно-возбужденного уровня на основной (нарушение закона Вавилова),

А^334НМ И. X, М 1— 1 ' ,т-,»=т455нм « ' но^к^н н

Лот= 375нм н 1 , (5). ГЧ. х^х I Т*^ ОН N II

связывали с большой величиной энергетической «щели» между Эз- и Бг уровнями органических флуорофоров. Мы предположили, что ультракороткие времена жизни ФЛ нуклеиновых оснований (~100 фс) также могут привести к реализации излучательных Эг—^о переходов.

На рисунке 3.1, приведены спектры поглощения урацила (и), тимина (Т), 5-фторурацила (ГО), 5-хлорурацила (СШ), тегафура (ТК) и тиетаноксиметилурацила (ТОМи) в нейтральных водных растворах.

/. ши.сд.

Рисунок 3.1 — Спектры поглощения урацила и его производных, нормированные по длинноволновому максимуму (Н20, рН = 6.8, / = 1 см, 298 К).

200 220 240 260 280 300 320 Л, ну

Фотовозбуждение исследованных урацилов в спектральной области поглощения <— Бо-перехода (Асх > 240 нм) сопровождается ФЛ, которая соответствует излучательному в! —> Яо-переходу (рисунок 3.2 а.). отн.ед.

Рисунок 3.2 - Спектры ФЛ U, Т, ГО, C1U, TF и TOMU, полученные при возбуждении светом: (а) в длинноволоновый максимум в спектрах поглощения (с(урацилов) = 5х10"5); (б) в полосу S2<— S0 перехода Яех = 226 нм (с(урацилов) = 10~5) (Н20,рН = 6.8,298 К).

При прямом фотовозбуждении в полосу поглощения вг <— Эо перехода (рисунок 3.1) для всех урацилов наблюдается ФЛ с максимумом 292 нм, которая, предположительно, была отнесена к "аномальному" излучательному Бг—>5о-переходу (рисунок 3.2 б). Спектрально-люминесцентные параметры и квантовые выходы 8]—<-8о и Бг—»Бд ФЛ урацилов приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1 - Параметры 81—и Эт—>Эо излучательных переходов урацилов в водных растворах и твердом состоянии.

Водный раствор

Эг т, фс

п. Лй.2, Ааь <РУ<!>\ Gii.Uav.sson, Г. е/. а1. //МСЗ.

нм хЮ4 нм 2005. V. 128. N. 2. Р. 607

и 29 292 0.32 313 90.6 96

сю 7.6 292 0.9 342 8.4 155

Т 8 292 1.1 329 7.3 195

ГО 10 292 2.2 340 4.5 694

10.5 292 4.1 340 -

томи 9.4 292 0.94 371 -

Погрешность - ± 5%

Корректность отнесения коротковолновой полосы ФЛ, изученных соединений к Эг—»Эо излучательному переходу, требует экспериментального доказательства, поскольку она может быть обусловлена, в том числе, и присутствием примесей. С этой целью было изучено влияние частоты возбуждающего света на спектры ФЛ водных растворов урацилов. В интервале А).гх = 220 - 240 нм наблюдается перераспределение интенсивностей Э] —> Эо и "аномальной" Бг —> Эо ФЛ урацилов. При прямом фотовозбуждении Эг-уровня (Асх = 220 нм) доминирует Бг —► 8о ФЛ урацилов. В спектрах ФЛ урацилов в отсутствие возбуждения Эг-состояния (Аех > 240 нм) наблюдается только —> Бо люминесценция.

Общеизвестно, что в твердом состоянии квантовый выход и время жизни ФЛ флюорофо-ров значительно выше, чем в растворах. Очевидно, что если коротковолновая ФЛ (Хв~292 им) обусловлена наличием примеси, то при переходе в твердую фазу должно наблюдаться увеличение интенсивности как длинноволновой Э] —► Эо ФЛ урацилов, так и люминесценции примеси. Однако в отличие от водных растворов при фотовозбуждении Эг-уровня (Аех = 220 нм) всех исследованных урацилов в твердом состоянии коротковолновая ФЛ (л,; = 292 нм) не регистрируется (рисунок 3.3). Отсутствие ФЛ в коротковолновой области спектра в кристаллическом ри можно рассматривать в качестве прямого доказательства, что излучение с максимумом 292 нм в водных растворах обусловлено именно аномальной ФЛ урацилов, а не фотолюминесценцией примесей, поскольку последняя, ожидаемо, также должна возрасти в твердом состоянии. В то же время, отсутствие Бг —► Эо ФЛ в твердых об-

разцах урацилов подтверждает правомерность предположения о том, что возможность обнаружения так называемой "аномальной" —> Бо люминесценции определяется, наряду с величиной разности энергий синглетно-возбужденных Эг- и Б [-уровней, в том числе, и высокой скоростью внутренней Б] —» Эо конверсии производных урацила в растворах. {, отн.ед.:

Рисунок 3.3 - Спектры ФЛ урацилов в твердом состоянии, нормированные по максимуму 8[—»Эо перехода (Яех = 220 нм, 300 К).

Если гипотеза, что возможность Бг —► Эо ФЛ урацилов определяется их ультракороткими временами жизни 81 —► Бо ФЛ верна, то отношение квантового выхода "аномальной" 82-1► Бок 81 —» Б о ФЛ (^2/рО должно зависеть от времени жизни 81 —* 8о флюоресценции (г) пиримидиновых оснований (таблица 3.1). Действительно, из рисунка 3.4 следует, что чем меньше т 8| —> 8о ФЛ, тем больше отношение <рг!<Ри отражающее вероятность 82 —► 8о излу-чательного перехода.

Рисунок 3.4 — Зависимость (р21<р 1 от т ФЛ уращшов: 1 - и, 2 - СЮ, 3 - Т, 4 - ГО (с(урацилов) = 10"5, Н20, 298 К).

6 100 2<3р 300 400 500 609. ?0р «00 т. фс

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что для органических молекул с экстремально короткими временами жизни Эгсостояния, излучательные переходы со второго синглетно-возбужденного уровня на основной (нарушение закона Вавилова) являются скорее закономерностью, нежели исключением.

3.4 Спектрально-люминесцентное исследование комплексов включения 5-фторурацнла с р-цнклодекстрнном в нейтральных и кислых водных растворах

В последние годы широкое применение в фармацевтике находят цилодекстрины для фотостабилизации, улучшения растворимости, пролонгации, и повышения биологической активности лекарственных препаратов. В данном разделе проведено спектрально-люминесцентное исследование комплексообразования 5-фторурацила с Р-тщкло декстрином

Образование комплексов включения 5-фторурацила с р-циклодекстрином [ТОрСО] отчетливо проявляется в спектрах ФЛ (рисунок 4.1), а именно, с ростом концентрации оли-госахарида наблюдается увеличение интенсивности ФЛ 5-фторурацила.

1/[рСО], л х моль'1

Рисунок 4.1 - Спектры ФЛ ГО в присутствии рСБ (1). Направление стрелки указывает рост концентрации РСБ (с (РСБ) = 2х10"3 -10"2 моль/л). 2 - Зависимость <р ФЛ ри от концентрации РСБ в координатах уравнения 4.1 (Яи = 265 нм, с (РЦ) = 10"4 моль/л, рН 6.5, Н20, Т= 300 К).

Поскольку измерения проводились при большом избытке РСР, а полоса ФЛ комплекса [ри-рСБ] перекрывается с полосой излучения ГО, то определение состава комплекса и константы равновесия были проведены графическим методом Бенеши-Гильдебранда с использованием модифицированного уравнения Кетелаара:

= --1_, (4.1)

где <ро, <рх - квантовые выходы ФЛ ри в отсутствие и присутствии РСГ), соответственно, - квантовый выход ФЛ комплекса [ри-рСО], [РСО] - концентрация р-ццклодекстрина, К— константа устойчивости комплексов включения Ри с Р-циклодекстрином.

Линейная зависимость (р Ри в широком интервале концентраций рСБ в рамках уравнения 4.2 (зависимость 2, рисунок 4.1), свидетельствует об эквимольном соотношении компонентов в комплексе [ТОрСО]. Квантовый выход ФЛ комплекса [ГО"РСП], определенный из отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат равен: <рк = 3.6*104. Увеличение квантового выхода ФЛ при комплесообразовакии (<ра — 2.2 х 10"5) объясняется экранированием включенного в полость рСЭ электронно-возбужденного ри от "тушащего" влияния растворителя.

Значение константы устойчивости супрамолекулярного комплекса включения ри с (КЮ, определенное из тангенса угла наклона зависимости 2 на рисунке 4.1 составило 44 л/моль. В насыщенном растворе рСО растворимость ри составила 1.4 г/100 мл, что в 14 раз превышает растворимость свободного 5-фторурацила (0.1 г/100 мл). Такое увеличение растворимости может быть использовано для улучшения фармакокинетических параметров противоопухолевого средства 5-фторурацила.

При пероральном применении в кислой среде желудка возможно изменение свойств клатратов ГО с рСО, что послужило поводом для исследования их комнлексообразования при низких значениях /;Н. Аналогично нейтральным водным растворам, при />Н 3 образование комплексов включения ри с (5СО сопровождается увеличением квантового выхода ФЛ 5-фторурацила (рисунок 4.2).

1/[ЭСО]2х 10"4,л2х моль"2 0.5 1.0 1.5 2.0

Рисунок 4.2 - Спектры ФЛ Ри в присутствии рСБ (1). Направление стрелки указывает рост концентрации [!СО (с(рСБ) = 2х10"3— Ю-2 моль/л). (2) Зависимость <р ФЛ ГО от концентрации рСО в координатах уравнения 4.2 (Я«, = 265 нм, с(ГО) = 10"4 моль/л, рН 3, Н20, Г=300К).

Однако в отличие от нейтральных водных растворов, при рН 3 линейная зависимость (р ФЛ 5-фторурацила от содержания рСО (рисунок 4.2) описывается уравнением 4.2, что указывает на соотношение компонентов комплекса 1:2 (ГО:2рСО):

1 _ 1 _1__

<Р;-<Р. ~ <Р, -<Р. + К-(?>, -«».МвСЮ]2 * ^

Значение константы устойчивости комплекса [ГО*2рСВ], определенное из тангенса угла наклона зависимости 2 на рисунке 4.2 составило 9800 л2/моль2. Квантовый выход ФЛ [ГО'2рСО], определенный из отрезка, отсекаемого прямой 2 на оси ординат 1 /(/р, —<р0) (рисунок 4.2): <рк= ЮЛ

Таким образом, в результате спектрально-люминесцентных исследований установлено, что 5-фторурацил образует с р-циклодексгрином флюоресцирующие супрамолекулярные комплексы включения эквимольного состава 1:1 при /;Н 6.5 и 1:2 при рН 3. Определены их константы устойчивости и квантовые выходы флюоресценции.

ВЫВОДЫ

1. Впервые экспериментально зарегистрированы индивидуальные спектры ФЛ четырех таутомеров Ри и трех таугомеров ТБ, произведена оценка их процентного содержания и квантовых выходов флюоресценции.

2. Впервые обнаружена ФЛ двух моноанионов (рН 11) и дианиона (рН 14) 5-фторурацила в водных растворах, определены их спектральные параметры и квантовые выходы флюоресценщш.

3. Методами спектрально-люминесцентной спектроскопии и ЭПР установлено, что при фотооблучении Ии осуществляются ФПП и ФПЭ, приводящие к образованию кето-енольных таутомеров и ион-радикальных пар, которые стабилизируются кристаллической матрицей.

4. Впервые обнаружено, что в водных растворах урацила, тимина, 5-фторурацила, тегафура, 5-хлорурацила и тиетаноксиметилурацила ФЛ осуществляется не только с первого синглетно-возбужденного Б г уровня, но и при переходе со второго Эг-уровня на основной (нарушение закона Вавилова).

5. Установлено, что 5-фторурацил образует с р-циклодекстрином флюоресцирующие супрамолекулярные комплексы включения состава 1:1 в нейтральных (рН 6.5) и 1:2 в кислых (рН 3) водных растворах. Определены константы устойчивости комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ганцев, Ш.Х. Флюоресцентное титрование 5-фторурацила в крови и спектрально-люминесцентное исследование его кето-енольной таутомерии / Ш.Х. Ганцев, В.П. Казаков, С.С. Остахов, Ф.А. Халиуллин, М.В. Султанбаев, Р.Ш. Ишмуратова, Г.В. Хамитова // Креативная хирургия и онкология. - 2010. - №2. - С.12-16.

2. Султанбаев, М.В. Флюоресцентное исследование кето-енолыюго равновесия таутомеров 5-фторурацила в водных растворах / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, Ш.Х. Ганцев, Ф.А. Халиуллин, В.П. Казаков //Химия высоких энергий. -2010.-Т.44, №5. -С.415-418.

3. Остахов, С.С. Флюоресценция 5-фторурацила при переходе со второго синглетно-возбужденного Бг-уровня на основной / С.С. Остахов, Ш.Х. Ганцев, В.П. Казаков, М.В. Султанбаев, Г.В. Хамитова, Р.Ш. Ишмуратова // Химия высоких энергий. - 2011. - Т.45, №2. -СЛ 59-161.

4. Султанбаев, М.В. Флюоресцентные свойства и содержание таутомеров 5-фторурацила в водных растворах / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев // Буглеровские сообщения. - 2011. -Т.25, Л»5. - С. 101-104.

5. Султанбаев, М.В. Комплексообразование таутомеров 5-фторурацила с Р-щпслодекстрином / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, C.JI. Хурсан, Ш.Х. Ганцев // Бутлеров-ские сообщения. - 2011. - Т.25, №6. - С. 66-70.

6. Ostakhov, S.S. Photoinduced oxo-hydroxo tautomerization in crystalline 5-fluorouracil / S.S. Ostakhov, M.V. Sultanbaev // Mendeleev Commun. - 2012. - V.22, №1. - P. 23-24.

7. Остахов, С.С. Флюоресценция 5-гидрокси-6-метил-(1-тиетанил-3)-пиримидин-2,4(1//,3//)-диона при переходе со второго синглетно-возбужденного 82-уровня на основной в растворах ацетонитрила / С.С. Остахов, В.А. Катаев, С.А. Мещерякова, М.В. Султанбаев // Оптика и спектроскопия. - 2012. - Т.113, №1. - С. 56-5S.

8. Остахов, С.С. Фотофизика и фотохимия кристаллического 5-фторурацила / С.С. Остахов, М.В. Султанбаев, C.JI. Хурсан, Н.М. Шишлов, Ю.А. Лебедев, P.P. Кинзябулатов // Химия высоких энергий. — 2014. - Т.45, №2. - С. 159-161.

9. Султанбаев, М.В. 5-Фторурацил - противоопухолевый препарат. Взаимодействие таутомеров 5-фторурацила с сывороткой крови, исследованное по флюоресценции / М.В. Султанбаев, С.А. Мещерякова, С.С. Остахов, Ш.Х. Ганцев, М.А. Браженко, В.А. Лиходед, Ф.А. Халиуплин, В.П. Казаков // Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009: Сб. тезисов VII Все-рос. науч. конф. с Молодеж. Научн. шк. / ИОХ УНЦ РАН [и др.]. - Уфа, 2009. - С. 275-276.

10. Султанбаев, М.В. Флюоресцентное определение противоопухолевого препарата -5-фторурацила в плазме крови / М.В. Султанбаев, С.А. Мещерякова, С.С. Остахов, Ш.Х. Ганцев, В.А. Лиходед, Ф.А. Халиуллин, В.П. Казаков // XXVII Всерос. симп. молод, уч. по хим. кинетике: материалы конф. / Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова [и др.]. - Пансионат "Березки" Московская обл., 2009. - С. 42.

11. Султанбаев, М.В. Флюоресцентное исследование кето-енолыюй таутомерии и комплексообразования 5-фторурацила с триптофаном и компонентами крови / М.В. Султанбаев, Ш.Х. Ганцев, С.С. Остахов, В.П. Казаков // Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем: V Регион, конф. молодых уч.: материалы конф. / Институт химии растворов РАН [и др.]. - Иваново, 2010. - С. 105.

12. Султанбаев, М.В. Фотоиндуцированная оксо-гидроксо таутомерия 5-фторурацила в кристаллическом состоянии / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов // Научное и экологическое обеспечение современных технологий: VIII Респ. конф. молод, уч.: материалы конф. / УГА-ЭС.-Уфа, 2011.-С. 102-103.

13. Султанбаев, М.В. Флюоресцентное исследование кето-енольной таутомерии 5-фторурацила и его комплексов с p-циклодекстршюм / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев, Г.Х. Ахмадеева // Химия в интересах человека: I Респ. конф. молод, уч.: материалы конф. / ИОХ УНЦ РАН [и др.]. - Уфа, 2011. - С. 3 9-40.

14. Остахов, С.С. Исследование состава и устойчивости супрамолекулярных комплексов включения таугомеров 5-фторурацила с Р-циклодекстрином методом флюоресценции / С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев, М.В. Султанбаев, Г.Х. Ахмадеева // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: материалы конф. / РАН [и др.]. - Волгоград, 2011.-С. 597.

15. Султанбаев, М.В. Спектрально-люминесцентные параметры и содержание редких таутомерных форм 5-фторурацила в водных растворах / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев // Современная химическая физика: XXIII Симпозиум: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН [и др.]. - Туапсе, 2011. - С. 267.

16. Султанбаев, М.В. Межмолекулярный фотоперенос протона в кристаллическом 5-фторурациле / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов // Современная химическая физика: ХХШ Симпозиум: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН [и др.]. - Туапсе, 2011.-С. 268.

17. Остахов, С.С. Фотоника 5-фторурацила и его комплексов с р-циклодексгрином / С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев, М.В. Султанбаев // VI Съезд Российского фото-биол. общества: материалы конф. / МГУ им. Ломоносова [и др.]. - пос. Шепси, Краснодарский край, 2011. - С. 191.

18. Султанбаев, М.В. Квангово-химическое и спектрально-флюоресцентное исследование оксо-гидроксо таутомерии и комплексообразования 5-фторурацила с Р-циклодекстрином / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан // Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем: VI конф. молод, уч.: материалы конф. / Ивановский государственный химико-технологический университет [и др.]. - Иваново, 2011. - С. 162.

19. Султанбаев, М.В. Состав, устойчивость и флюоресцентные свойства комплексов включения таугомеров 5-фторурацила с р-циклодекстрином / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев, Г.Х. Ахмадеева // Химия и технология новых веществ и материалов: Всерос. молод, науч. конф.: материалы конф. / Институт химии КомиНЦ УрО РАН [и др.]. - Сыктывкар, 2011. - С. 56.

20. Султанбаев, М.В. Спектрально-флюоресцентное и квантово-химическое исследование комплексообразовашш 5-фторурацила с р-циклодекстршюм / М.В. Султанбаев, Э.М. Хамитов, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан // Обратные задачи химии: VI всерос. науч.-практ. конф.: материалы конф. / БирГПИ [и др.]. - Бирск, 2011. - С. 59-69.

21. Султанбаев, М.В. Спектрально-флюоресцентные свойства и устойчивость супрамолекулярных комплексов включения таугомеров 5-фторурацила с р-циклодекстрином / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Ш.Х. Ганцев, Г.Х. Ахмадеева // Успехи хими-

ческой физики: Всерос. молод, конф.: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН. - Черноголовка, 2011. - С. 198.

22. Султанбаев, М.В. Фотоника 5-фторурацила в растворах и твердом состоянии / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан // XV молодежная школа-конференция по органической химии: материалы конф. / ИОХ УНЦ РАН [и др.]. - Уфа, 2012. - С. 71-72.

23. Султанбаев, М.В. Сравнительное спектрально-люминесцентное исследовагаге ке-то-енольного равновесия 5-фторурацила и тегафура в водных растворах / М.В. Султанбаев, Ш.Х. Ганцев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан, Г.Х. Ахмадеева // XV молодежная школа-конференция по органической химии: материалы конф. / ИОХ УНЦ РАН [и др.]. - Уфа, 2012. - С. 239-240.

24. Sultanbaev, M.V. Photonics of 5-fluorouracil and 5-hydroxy-6-methyI(t-thietany1-3)pyrimidine-2,4(l#,3#)-dion in solutions / M.V. Sultanbaev, S.S. Ostakhov, S.L. Khursan, Sh.Kh. Gantsev // Molecular photonucs: 3-rd International Symposium dedicated to academician A.N. Terenin / Saint-Petersburg National Research University of Information Technologies. - Repino, St. Petersburg, Russia, 2012. -P. 129.

25. Sultanbaev, M.V. Comparative spectral-luminescent study of keto-enol equilibrium of 5-fluorouracil and tegafur in water solutions / M.V. Sultanbaev, S.S. Ostakhov, S.L. Khursan, Sh.Kh. Gantsev // Molecular photonucs: 3-rd International Symposium dedicated to academician A.N. Terenin / Saint-Petersburg National Research University of Information Technologies. — Repino, St. Petersburg, Russia, 2012. - P. 130.

26. Султанбаев, М.В. Теоретическое и экспериментальное спектрально-люминесцентное исследование водных растворов и кристаллического состояния 5-фторурацила / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, М.Ю. Овчинников, С.Л. Хурсан // Современная химическая физика: XXV Симпозиум: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН [и др.]. - Туапсе, 2012. - С. 287.

27. Султанбаев, М.В. Сверхбыстрые излучательные S2—>So переходы урацилов в растворах / М.В. Султанбаев, С.С. Остахов, С.Л. Хурсан // Современная химическая физика: XXV Симпозиум: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН [и др.]. -Туапсе, 2012.-С. 288.

28. Остахов, С.С. Фотохимия кристаллического 5-фторурацила / С.С. Остахов, М.В. Султанбаев, С.Л. Хурсан // Современная химическая физика: XXVI Симпозиум: материалы конф. / Институт проблем химической физики РАН [и др.]. - Туапсе, 2013. - С. 295.

Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 02.12.2014 г. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1. Уч.-изд.л.1. Тираж 120 экз. Заказ №105

Типография ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА» 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3