Гликозилфториды в синтезе хромогенных и флуорогенных субстратов гликозидаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01

На правах рукописи

ВОЗНЫЙ Яков Васильевич

ГЛИК03ИЛФТ0РИДЫ В СИНТЕЗЕ ХРОМОГЕННЫХ И ФЛУОРОГЕННЫХ СУБСТРАТОВ ГЛИКОЗЙДАЗ

(02.00.10 — Бноорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва — 1991

.—I

Работа выполнена в лаборатории хим. синтеза Института биохимии АН Арм. ССР.

О ф и ц и альные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. Я. Хорлин, доктор химических наук, профессор И. А. Ямское, доктор химических наук, профессор Е. Н. Звонкова

Ведущая организация: Институт органической химии АН СССР им. Н. Д. Зелинского.

Защита состоится « 3 »ееитяГр? 1991 г. в ^ ч. на заседании специализированного совета Д 063.41.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском институте тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (117571, Москва, пр. Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1).

Диссертация разослана « » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А. И. Лютик

. ОЕШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Ферменты, специфически растопляющие глико-зшдаые связи, широко расгц ютранены в природе и игравт существенную роль в растениях, бактериях, животных и в организма человека. Некоторые из них, нзпрстгер, нейратанидаза, входят в состав вирусного белка.

В настоящее время интенсивно разрабатываются различные средства детекции активности этих ферментов, причем огромное значение имеет химически? синтез, который позволяет создавать структурные аналоги природных субстратов, отличандиеся строением углеводной частя и агли-кона. С помохьа такого рода молекулярных зондов удается екяснить паяные особенности функционирования гликозидаз и решить ряд практических задач.

Опыт применения синтетических субстратов гликозидаз при диагностике заболеваний человека и животных, з генной инженерии я в некоторых других областях требует перехода к новым поколениям субстратов. Необходим поиск, синтез и испытания новых агликонов, проявляющих какое-либо примечательное свойство, например, способность лнминвотировать или легко образовывать ократеннкй продукт. Оятиается необходимость в агликонах, флуоресцнрунгдх в разных спектральных областях п при значениях тК, близких к ¡Я-оптимуму фермента.

С другой стороны, анализ требований, которым должш удовлетворять новые субстраты, приводит к выводу о необходимости фундаментальной разработки основ их синтеза, поскольку возможности известных методов оказались в значительной ?-<ере исчерпанными. Весьма актуальной задачей является поиск новых способоз построения глзкозидной связи, причем остро стоит вопрос о стереоселективностя этих катодов, их пригодности для различных классов углеводов и агллконев.

Настоящая диссертационная работа является часть» плановая яссле-зсезляЯ Института бнохигап АН Арл ССР, выполняемых как вахяейие, В соответствии с координацисканм каюк Научного Совета АН СССР, Номера Государственной регистрации темы: 0.10.С8 и СГЕ .87.0089412.

Сель работы. Основной задачей настоящего несдздозгплл квглась разработка нового поколения субстратов гликозидаз. Эта проблеял поспг комплексны? характер к вглшает проведение исследований по следуют« основным направления!«

- поиск ксзых методов глякознлдронапзя, ггримег-ппли дзхя сгмгых разных классов углеводов п агликонов;

- синтез новых субстратов, направленный на пойклеино э^фектяшос-та обнарузеяия гликозидаз;

- выявление преимуществ я недостатков полученных субстратов.

Научная новизна. В работе формулировано новое направление исследований, заключающееся в использовании гликозилфторидов, считавшихся до начала бС-х годов малореакционносг.эсобными соединениями, в синтезе субстратов гликозидаз. В ражие этого направления разработаны синтезы гликозидов, оснсванныг- на взаимодействии 1,2-транс-гликозилфторидов ро следующими производными:

- фенолами, в присутствии э?ирата трех|тзристого бора и стеричес-ки затрудненного основания;

- фенолятами и тиофенолята!.м в шел очно? среде;

- триметилсилиловыми э|:прами спиртов и ¡енолов;

Определены границы применимости этих методов. 2 помощью последнего из указанных подходов, кэторыГ:, как оказалось, имеет достаточно ■ универсальны"* характер, удалось синтезировать качеств?нно новые субстраты гликозидаз, например, глпкозиды 4-т; и!тор;.'.эт'.и1-7-гидрокс/.кумарина, 3-циан-4-три;т:1рметпл-7-гпдрокС1'.кумарина. впе{зые получить 0-гликозиди окси.мов, значительно упростить синтез труднодоступных х-аномеров :. -ацетплгликозаминидов и ]луорогонных *-;,-идуронидов.

На примере синтеза А-галактзпиранозида люц,: горина впервые осуществлен перг-ход к биолюминесц^-нтным субстратам гликозидаз. Детекцию ферментативной активности гликозидаз в это:.' случае проводят с помощью люцифэразы светляков, которая с высокой эМективностыо окисляет отиепив1!и,,ся лщиферин, генерируя кванты света.

Разработаны пути стсреоселективного введения модифицирующих групп в субстраты гликозидаз по С-2 углеводного остатка. Предложены стереоселективные синтезы {луорогеиных гликозидов 2-дезокси и 2,5-ди-дезоксиальдоз, ведухие к любому из аномеров.

Разработаны новые синтезы гликззилф'Торидов, включающие реакции:

- нуклеофилъного замещения галоида на фтор с помощью гидрофторида 2,4,5-коллидина;

- аном .изапии гликозил1торидов "нестабильного ряда";

- замены ацетильных групп на бензильные в гликозилфторидах;

- бициклических I,2-ортоэ{иров Сахаров с гидроф>торидом 2,4,6-■ коллидина;

- нуклео^чльного замещения при С-2 в гликозилфторицах;

- изменения структуры а стереохимии с помощью восстановительного дебромирования и фотохимического брэмирования.

Предложены методы синтеза новых флуоресцентных фенолов, отлича-ицнхен сдвигом полосы люминесценции з длинноволновую область, например, 4-грк5'Торметил-3-»1ан-7-гицгокспкумарина к 2-ипанкарбэтоксимети-

лен-4-трк£тор.'етил-7-гидрокс;!-2Н-1-бензогирана, строение которых доказало рентгеноструктурным рчализом.

Основные положения, вынчсиуы" на зациту:

- метоты получения гликоз;*л?то;;иов;

- использование гликоэилТторидов лля синтеза хромогенних, ?луороген;шх и л.ч*с.ногпнных субстратов глякозидаз;

- применение фторированных субстратов пгакозитаз для экспресс-диагностики наследственных заболеваний и в йммуно^ерментном анализе.

Научное и практическое значение. В ходе разработки мзтодов синтеза гли:-:оз".1л*торидов и их реакцл/. изучены презлы стабильности и реакционная способность этого класса соединений. Эти данные, наряду с результатами независимых исоледованя?, проводимых преимущественно в лабораториях СНА и Японии, способствовали резкому изменению сложив-иихся приставлена* о ролл гллкозял'торидов в синтезе, помогли полнее раскрыть гх синтетический потенциал.

Рыяснилось, что при\'енение глпк.озид?тор::цов для получения различных субстратов глпкозипаз способствует увеличения выхода известных, широко п~»".'е:чяс'.!ых на прлктике субстратов, напр.:::.: глиг-озидов нитро-$енэлов или 4-,/рт;:лу?.'белл::Тг'рона. Более того, с их поморья удалось осу-пеотгить синтпз субстратов г.тикози-аз нозого поколения. Некоторые из синтезирсваяних ка'.о: субстратов, например, глгкззлдц 4-трл*тор- " метил-7-гидроксику.'арина, вохли впоследствии в каталоги ^нрм ЭЮКА ■ (США), КОЬЗС'ЛЛР. РНОЗЕЗ(ХА), ЬА!ЕМ РНОЗЗЗ(Австрия).

Козне субстраты внедрена в практику научно-ксачедовательскях работ в 'Институте медицинской а биолопгческо? хижл А."/"! СССР, в ЖК! АН ССС? пм. А. п. Баха, в 'Институте биотехнология, в Институте • биохимии АН А~рл ССР, в Диагностическом центре метаболических болезней БССР (г. Могилев), на кафедре хим. эязяг/элогли Ж7 ем. М.В.Ломоносова.

Цветково? У.. 2. л Карповой Е. А. ( Институт кедиплчскоЯ п бисло-глческо?. хеуий А'.Я СССР) установлено» что замена 4-?«ггл-7-гидрояся-кукарг.яа на 4-т?и|чор;.?ет7.л-7-гйдроксяку\арин з некоторых субстратах глякозидаз приводят к значительному ускорении $ерм2Итатззно?. реакции, что позволяет более достоверно диагностировать гетэроззготноэ носи-тельстзо ряда тяжелых заболевания. Сдвиг полосы флуоресценция новых субстратов в дликковатновую область упрощает экспресс-диагностику синдрома Гурлер, вызванного недостаточности сг-ь-ядуронидазн.

5луорогенные субстраты, произвоянке цеялоолигосахарядов и 4-тря-$торлет^-7-гкдрокс-лкут/:ар:!на использовались з КНБК им. к. Н. Баха для решения ряда биотехчологическях проблем, связанных с выявлением

ферментативной недостаточное?;! целлюлазного комплекса, клонирование« отдельных ферментативных активностей и коррекцией комплекса. Здесь важно то, что набор !луорогеняих субстратов позволяет четко да^ерен-цировать близкие еиды ферментативных активностей.

Совместно с А. Н. Маркаряно;.: (/.НЕЛ и:.'. А. Н. Баха) показано, что фторированные.субстраты облегчают скрининг и отбор моноклональных антител, меченних Л-галактозидазо*.

. Изучение т.юмпиогешюго субстрата, ß-галактопиранозида лшиферина, предпринятое H.H. Угаровой, и сотру дннка;л1 ( кафедра хим. знзикэлогии • МГУ) показало его преимущества в сравнении с очень чувствительными <|шуорогенними субстратами.

Данные, полученные 'Л. С. Луксмско," ( У.нститут медицинской и биологической химии АМН СССГ) свидетельствуют об эффективности некоторых синтезированных нами субстратов для диагностики поражения почек.

Перспективно пригенение новых субстратов для диагностики заболевания, связанных с недостаточностью л-шсткл-«-з-галактоза-.ян^цазы, и -аиетил->-г~гексозада;нидаз1;, -ацйт::л->-;^-глюкоза'.^1нп-;аз1: ( болезни Еиндлера, Той-Закса и с'андгоИа, Сал?клкг.по тип В ).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на УН и ТС. Всосоюз-ик конференциях по xu:.si;i и биохимии углеводов ( Пудино, 1Эс2; Тбилиси, I9Q7 ), I Братиславском симпозиуме по углеводам ( Сыолянице, 1231), У Европейском симпозиуме по углеводам ( Прага, 1989), ХУ Международном симпозиума по углеводам ( 'Локагама, 1990), УП Международном симпозиуме по био- п хешлхмикесценции (Кембридж, 1990), У Международном симпозиуме по ранлеГ. амбрионаяьно^ диаг остпке ( Прага, I99C), П Республмканско!1 конференции по проблемам фпз-хим. биологии ( Ереван, 1986), У Всесоюзной конференции по мэтодам получения и анализа биохимических реактивов ( Рига, 1937 ), У1 и УП Всесоюзных симпозиумах во инженерной знзимологии ( Вильнюс, I93Ö; Москва 1991 ).

Публикации. Основной материал изложен в 25 публикациях в отечественных и мездународных изданиях, получено положительное решение по заявке на авторское свидетельство.

■ . . ССНОЗНЭЕ сгц-тлнд: РАБОТЫ

I. Разработка путе? синтеза гликозил£торицов.

ГликозилТториды, ил?, структуры типа I, извеотнд ^с "2С-х голов нашего в°ка. Особенность атома ^тора образовывать-чрезвычайно прочные сачзи с рядом элементов, в том числе и с углеродом, ставят эти соединения в исключительное положение по сравнении с родственными гли'ко-зилхлоридата, броотдамя или иояидамя.

: Многие из Гликозил"£торидов к моменту начала настоящего исследования являлись довольно труднодоступным: соединениями и нязеР первоочередно? задачей явилась разработка методов их получения.

1.1 'С7!|т?ЗгРЛгг»32Л?т0р7Д0В обменом галоида : ¿г аном°рном центре

Для-гатзгч^цгя'тлякозйл^оридов с Т,2-транс-располок°няем заместителе? известен способ, заклича-тли^ся во взаимодействии ацилгликозил-галогг-нпдов с избытком ^о;ида сер=3ра в апетонитриле. Сн приводит к неплохим результатам для гексопигадоз, Однако, в случае некоторых малостабильных асилгалогеноз наблюдается резкое снижение выхода.

Анализируя причины это:' закономерности мы прияли к выводу о том, что ионы серебра аграяг, очевидно, з это? реалии каталятическув роль и предполагала, что их избыток, обусловленный стехиометряческкл , соотношение:.! з составе реагента -|торироваляя, - нокет негативно сказываться на судьбе нестабильных апилгалогенидов.. Представлялось целесообразным разделить ?7пкппя катализатора я источника рторид-кояов п создать систем реагентов, позволяязуз а пгирокгх пределах варьировать

ИХ С00Т7Ю29НИ9.

Нам: предложена система реагентов» вклшаяаая з качестве катализатора соли двухвалентно? ртути в комбинация с гадрофгорядо?.! 2,4,6-коллпгика 2, как источником фторид-конов. В отлггчие от опалогичнызс гядрофторидов других азотистых основания опо оказалось негагросхоплч-нкм кристаллическим веществом, весьма уяоб ам в работе. Его выпуск впоследствии был наяаяен фирмой РЫЖА ( Швейцария).

Замена атома брома на фтор происходит в среде полярного растворителя, при кипячении в течение 1-10 шн.

_ОЛс

сО '—/В

(2), IlgBr-

Br

ОАс

АсО

ОАс

2 3 4

Эта реакция изучалась на ряде примеров, представленных в таблице I. Исходные ацетилгликозилбромиды получены действием раствора НВг/АсОН на сполна ацетилированные производные углеводов. Перацетаты цаллоолигосахаридов получены частичным адетолиэом целлюлозы, выделены препаративной хроматографией и очищены кристаллизацией.

Таблица I. Синтез I,2-транс-гликопиранозилфторидов

Исходное соединение Продукт реакции Выход (%)

Ac^Glc с*Вг (3) Ac^Glc fiF (4) 67

Ac^Gal о£ Вг (5) Ac^Gal/ Г (6) 72

Acallan о< Вг (7) Ас.ИааJ F 4 (8) 66

MeACjGlA tt Br (9) MeAc-jGlA/F (Ю) 72

ACjXyl o* Br (11) Ac^ylPF (12) 86

Ао^Ага^Вг (13) Ac^Are oí F (14) 62

ACjRha К Br (15) AOjRha o( F (16) 63

Ae^Puc e'Br (17) Ao^Fuc^P (18) 53 *

Aa.Glc44Ac.jGlc« Br 4 3 (19) AO^G1cíí4AC jGlc> F (20) 52

Ao^Gal^Ac^Glc* Br (21) Ac^Gal^4Ac jGlc J* P (22) 73

Ac^Glc "fi C4Ac3Glcj8)n- Ac^GlcP (4Ac3GlcP)n-

-4A'- jGlo oí Br -4Ac3Glo } F

n»0 (23) n«0 (24) 71

n>1 (25) n-1 (26) 64

n«2 (27) Па 2 (28) 65

n-3 (29) n-3 (30) . 56

AOjNTP-Gale« Br (31) Ac-jNl'F-Gal / p (32) 50 *

ACjNTP-Glo oi Br (33) ACjHTF-Glo/ Р (34) 54*

Примечания к табл. I. Здесь и далее везде все углеводы - р- . ряда, кроме, арабинозы, ]?,у/озы, ра'яюзы и идуроновэй кислоты, которые имеют ь-конфигурацию. * Выход приведен в расчете на исходный моносахарид. нтг - и-грифгорацетильная защитная группа.

Для получения ,ч -трифторацетилышх производных 2-дезокси-2-амино--с-гликозы и 2-дезокси-2-а!.яно-Б-галактозы разработан удобны* способ, заключали;!йся в действии на гидрохлориды аминосахаров этилтрифтораце-тата. Этот весы/а доступны" реагент, насколько нам известно, ранее не применялся для и-тряфторацетялярования аминосахаров. Его преимуществом в сравнении с ангидридом трифторуксусной кислоты и Б-этилтри-фторацетатом, обычно применяемыми для н-трифторацетилирования являются простота получения и отсутствие побочных реакций, связанных с трифторацетилированием гидроксильных групп аминосахаров.

и, ш

ВГ

гн2нс I гасоср^ ШС0СР3

1: СУ3СОгЕг, МеОН, Е^К И: Ао20, Ру Ш; ЦВг/АсОН

Как видно из таблицы I, предложенный способ позволяет с неплохим

выходом синтезировать I,2-транс-гликозил$ториды гексоз, пентоз, уро-

новых кислот п олигосахаридсз. Соединения 10, 16, 18, 22, 26, 28, 30,

т тя

32 и 34 получены впервые. Их строение доказано с помощью Н и ■ ЯМР спектроскопии. • '

Принципиальное значение имело отнесение конфигурации атома С-1 в производных 32 а 34, поскольку I,2-транс-гликозилфториды 2-дезокси-2-ашносахаров не были описаны ранее, по-видимому, вследствие неус-' тойчивости, вызванной склонностью ацетамидогруппы к реакциям внутримолекулярного нуклеофильного замещения. Можно было полагать, что замена я -ацетильной на н-трифторацетильную защитную группу будет способствовать изменению этой закономерности. Анализ ^С ЯМР спек- | тров соединений 32 и 34 , в которых присутствуют дублеты с константой. J с у 220 Гц, свидетельствовал о наличии атома фтора при С-Т, хотя; и не позволял с полной достоверностью суди ь о конфигурации аномерно-го центра. Напротив, в ЯМР спектрах соединений 32 и 34 отмечены весьма характерные .для 1,2-транс-гликозидов константы щ щ 7-8 Гц, однозначно свидетельствующие в пользу /-конфигурации указанных соединений. ■