Иммобилизация щелочной протеазы и бета-галактозидазы на полимерных носителях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

4 * Национальная Академия наук Украины

"ч- Физико-химический институт им. А.В.Богатского

I На правах рукописи

Кравченко Ирина Анатольевна

УДК 577.152.351;15(088.8)

Иммобилизация щелочной протеазы и р-галактозидазы на полимерных носителях

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Одесса, 1995

Работа выполнена в Физико-химическом институте им. А.В.Богатского HAH Украины

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор

Давиденко Т.И.

Официальные оппоненты - доктор химических наук, профессор

Кинтя П.К.

доктор биологических наук Карасева ТЛ.

Ведущая организация: - Институт химии поверхности HAH Украины

Защита диссертации состоится " 26"" декабря " 1995 г. в " 13 " часов на заседании специализированного совета Д 05.14.02 в Физико-химическом институте HAH Украины по адресу: 270012, Одесса, Люстдорфское шоссе, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Физико-химического института им. А.В.Богатского HAH Украины

Автореферат разослан " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук Л А Литвинова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Существующий арсенал медицинских ферментных препаратов, обладающих высоким некролитическим действием и выполняющих функции препаратов заместительной терапии в настоящее время недостаточен. Кроме того их отличает быстрая инактивация и, в результате, ослабленное воздействие. Поэтому продолжается как поиск эффективных ферментных препаратов, так и разработка их пролонгированных форм на основе новых, либо недостаточно рассмотренных ранее носителей.

Рад проведенных исследований указывает на то, что систематическое изучение влияния свойств носителя и метода иммобилизации на активность ферментов может выявить значительные резервы как в повышении их активности, так и в увеличении эффективности медицинского применения.

Для создания реально работающего ферментного препарата важно учесть конкретные медицинские требования, наряду с экономичностью метода иммобилизации и его компонентов. Общим же во всех случаях остается необходимость получения стабильных препаратов. Все вышеизложенное определяет актуальность данной диссертационой работы, выполненной в рамках проекта ГКНТ 1.02.07./122-97 "Создание новых лекарственных препаратов на основе иммобилизованных протеолитических ферментов" и представляющей собой часть исследований, проводимых в Физико-химическом институте им. А.В.Богатского HAH Украины. Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение методов иммобилизации щелочной протеазы, ß-галактоэздазы и некоторых гидролитических ферментов, рассмотрение свойств полученных препаратов и областей их применения.

Научная новизна. Разработаны способы иммобилизации щелочной протеазы и некоторых протеолитических ферментов на перевязочных средствах с использованием гелей полисахаридов и поливинилового спирта. Активность полученных препаратов составила 92-114% от исходной.

Рассмотрено включение щелочной протеазы в гидрофильные мазевые композиции, основным компонентом которых является полиэтиленоксид, сшитый у-радиацией, при этом наблюдается повышение протеолитической активности до 163-279%. Разработаны способы закрепления комплекса ферментных препаратов для заместительной терапии на пищевых волокнах с исполъзоваием полиэтиленоксида и поливинилового спирта с высоким сохранением протеолитической, амилолитической, липолитической и ß-галактозидазной активностей.

Показана возможность включения щелочной протеазы и Р~ галакгозидазы в радиационно-сшитый поли-М-винилкапролактам, а р-галактозидааы в ПВК, стабилизированный соединениями фенольной природы. На основании данных ЯМР 13С и ИК-спектроскопии доказано, что в последнем случае комплексообразование протекает за счет образования водородных связей между карбонильной группой капролактама и щцроксильными группами фенола и белка.

Изучены свойства иммобилизованных ферментных препаратов: рН- и термооптимум, термо- и рН-стабильность, стабильность при хранении и у-стерилизации, возможность функционирования в реакторе периодического действия, способность к совместной иммобилизации с антибиотиками, антисептическими и меетноанестезирующими препаратами, мочевиной, литическим ферментным комплексом.

Обнаружено, что рН-профиль активности щелочной протеазы, закрепленной на перевязочных средствах, ПВК, гидрофильных композициях, пищевых волокнах расширен и смещен на 1.0-1.5 ед. рН в область кислых значений, а для р-галактозвдааы на 1.0 ед. рН в щелочную область.

Для иммобилизованных препаратов наблюдается расширение термооптимума на 5-10'С наряду с увеличением термостабильности.

Методами ИК- и • ЯМР 13С - спектроскопии, термогравиметрии, вискозиметрии, показано образование модифицированных форм ферментов. Практическая ненность. Показана эффективность иммобилизованной на перевязочных средствах щелочной протеазы при лечении экспериментальных ожогов у кроликов и гнойных ран у крыс, включенной в гидрофильные композиции для лизиса ожогового струпа роговицы, а в сочетании с ультразвуком при лечении костно-суставной системы.

На основе предложенного метода иммобилизации щелочной протеазы на перевязочных средствах с использованием поливгагалового спирта и буры, получен эффективный ранозаживляющий препарат "Проггеим".

Доказано, что в случае экспериментально вызванного у крыс панкреатита комплекс ферментов, закрепленных на пищевых волокнах, способствует восстановлению сниженной ферментативной активности до уровня нормы.

На защиту выносятся следующие результаты исследования: • разработка и оптимизация методов иммобилизации щелочной протеазы, р-галактозидазы и некоторых гидролитических ферментов на природных и синтетических полимерных носителях;

• изучение физико-химических свойств полученных иммобилизованных препаратов;

• эффективность использования иммобилизованной щелочной протеазы при лечении экспериментальных ожогов, гнойных ран, простого пузырькового лишая, в сочетании с ультразвуком при лечении костно-суставной патологии, а также восстановление до уровня нормы сниженной ферментативной активности желудочно-кишечного тракта крыс комплексом ферментов, закрепленных на пищевых волокнах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии л (Минск, 1993), Международной конференции "Перспективы создания и производства лекарственных средств в Украине" (Одесса, 1993), Международной научно-практической конференции "Экология химических производств" (Северодонецк, 1994).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6. статей, тезисы 6 докладов, получено 1 положительное решение по заявке,

Объем работы: Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 40 таблиц, 40 рисунков. Список литературы включает 223 наименования.

Основные результаты

В работе использовались: щелочная протеаза из Bacillus subtilis, для которой характерна высокая активность по казеину, фибрину и эластину при отсутствии воздействия на здоровую ткань. В мультиэнзимных композициях в сочетании с ß-галакгозидазой из Penicillium catiescens, оразой из Aspergillus oryzae и солизимом из Penicillium solutum она восполняет дефицит ферментов в пищеварительном тракте.

В связи с этим работа развивалась в 2-х направлениях:

• иммобилизация щелочной протеазы для разработки ранозаживляющих препаратов;

• иммобилизация щелочной иротеазы в сочетании с ß-галактозидазой для разработки препаратов заместительной терапии

Для иммобилизации применялись носители, обладающие полезными в указанных направлениях свойствами:

• природные - пищевые волокна из пшеничных отрубей, полисахариды -пектин, каррагинан, аубазддан, алъгинат натрия.

• синтешчсскис - поли^-винилкапролактам, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоли, полиэтилен с привитой полиакриловой кислотой, сополимеры стирола и дивинил бензола.

Результаты иммобилизации оценивали по степени связывания белка и сохранению ферментативной активности.

При проведении иммобилизации использовались различные методы, в том числе:

1. Сшивка щелочной протеазы с поливиниловым спиртом и полисахаридами тетраборатом натрия, при которой происходит конденсация гидроксилов полимера и фермента с борной кислотой.

Химическая природа этого комплекса доказана комплексом физико-химических методов в том числе данными ИК-спектроскопии. Анализ И Коспектров позволяет на основании сдвига полос ПВС и фермента в зону более низких частот предположить образование для иммобилизованных препаратов образование комплекса ПВС-бура-фермент:[3450 (IIBC), 3470 (Ф) 3390 (ИФ), 1630 (Ф) -» 1610 (ИФ), 1450 (ПВС), 1440 (Ф) -> 1430 (ИФ), 1390 (ПВС), 1400 (Ф) -> 1380 (ИФ), 1115 (Ф) -> 1130 (ИФ), 1070 (Ф) -> 1055 (ИФ) см"1

2. Иммобилизация ферментов в радиационно-сшитые полимеры: ПВС, ПЭГ, ПВК. Методом вискозиметрии было показано, что для образцов ПЭО и ПВС, которые подверглись у-облучению наблюдается увеличение характеристической вязкости. Увеличение характеристической вязкости свидетельствует об увеличении молекулярного веса полимера вследствие образования дополнительных сшивок под воздействием у-облучения.

3. Закрепление гидролитических ферментов на пшцевых волокнах с помощью радиационно-сшишх полимеров.

4. Ковалентное связывание ß-галактозидазы на полиэтиленах с привитой полиакриловой кислотой и сополимерах стирола и дивинилбензола при помощи глутарового альдегида и карбодгамидов.

5. Иммобилизация ß-галактозидазы в ПВК, с помощью фенольных соединений. Для выяснения характера взаимодействия фермента и фенола с ПВК была изучена структура модельного комплекса, где вместо фермента был использован овальбумин.

При встраивании овальбумина в ПВК в спектре ЯМР 13С наиболее смещены в сильное поле сигналы карбонильных групп капролактамного фрагмента, что свидетельствует об участии карбонильной группы ПВК в образовании водородных связей с белковой глобулой. Это подтверждается

значительным уменьшением подвижности именно карбонильных грушт (вдвое).

Таблица 1.

Включение овальбумина в матрицу ПВК в присутствии

Углерод ПВК ПВК-омльбумна ПВК-омльбумив-фегол ПВК-феаоя

Б, мл ОТ,, с А», м.д т,7г, д8, «Л т,7г, А», МЛ ТЛЯ,

СО 177.50 3.29 -1.56 0.55 -0.98 0.72 -0.45 1.18

СН 46.09 0.228 -0.18 1.0 -0.43 0.83 0.39 1.11

СН2 34.08 0.109 0.92 _ _ . 0.03 1.26

С 42.47 0.129 -0.39 0.97 -0.19 0.79 -0.08

С 37.082 0.126 0.32 0.98 0.37 0.91 -0.13 1.13

ст 22.92 0.153 -0.20 088 -0.16 0.88 -0 06 1.05

с*8 29.42 0.154 0.33 0.84 0.63 0.71 -0.31 1.18

н 2с

н 2с

"С Н —с н

с

5 Г

2~>„

С н

Н оС

• Н о

Г В 1 6 гу^О

сн2 Кл!

При встраивании овальбумина в матрицу ПВК, содержащую фенол, сигналы карбонильных групп уже смещенные в сильное поле из-за образования водородных связей с молекулами фенола, испытывают дополнительный сдвиг и занимают положение, близкое к тому, которое наблюдалось при отсутствии фенола. При этом фрагментарная подвижность карбонильных групп уменьшается не столь значительно, как без фенола.

На основании проведенных исследований можно прийти к выводу о том, что макромолекула овальбумина конкурирует с фенолом за связывание с ПВК, образуя водородные связи с карбонильными группами капродактама.

Данными ИК-спектроскопии было показано, что взаимодействие фенола с ПВК сопровождается вытиснением молекул воды из структуры полимера, что характеризуется отсутствием полосы поглощения в зоне 3400 см"1, в то время как в спектре самого ПВК такая полоса четко выражена.

С использованием рассмотренных методов были получены иммобилизованные препараты.

Иммобилизацией щелочной протсазы на перевязочных средствах с использованием гелей полисахаридов и ПВС, сшитого тетраборатом натрия с последующим у-облучением, получены иммобилизованные препараты с высоким сохранением (до 137%) исходной активности, устойчивые к у-облучению и хранению.

Таблица 2

Включение щелочной протеазы в полимерные гели

Носитель До у облучения После у-облучения

А, ПЕ/г % сохр. от теор. А, ПЕ/г % сохр. от исх.

Карраганаи 320.0 57.0 440.0 137.5

Аубазидан 276.0 114.0 272.0 98.5

Пектин 345.6 113.0 272.0 78.8

Альгинат кальция 240.0 102.0 176.0 74.0

ПВС 280.0 92.0 240.0 86.0

Сравнение кинетических параметров (К™ и V ш,) нативного и иммобилизованного препаратов, близкие их значения (табл. 3) свидетельствуют о том, что при иммобилизации не затрагивается активны]'] центр фермента.

Таблица 3

Кинетические параметры натавной и иммобилизованной в гели _полисахаридов щелочной протеазы_

Носитель К„, мг/ыл У„„, ПЕ/мг

5.9 2.95±0.12

Пектин 9.6 2.08±0.10

Аубазидап 8.9 2.32±0.11

Каррагинан 10.0 2.03±0.13

Альгинат кальция 8.76 2.41 ±0.16

*- нативный фермент

Изучение свойств полученных иммобилизованных препаратов показало, что в результате иммобилизации наблюдается расширение их рН-оптимума функционирования, а также смещение его на 1-2 ед. рН в область кислых значений. На получение более стабильных препаратов указывает также увеличение процента сохранения активности иммобилизованной щелочной протеазы при инкубации ее в течение 4-х часов при рН-5.5. Активность

щелочной протеазы, иммобилизованной в геле ПВС составила - 86%, пектина - 82%, аубазцдана - 76%, тогда как для нативного фермента - 56%.

Подобное поведение иммобилизованной в полимерные гели щелочной протеазы в области кислых значений рН свидетельствует о стабильности ее функционирования в условиях гнойной раны (рис. 1,2).

Зависимость протеолитической активности иммобилизованной и пативной щелочной протеазы от рН инкубационной среды •

Нативный фермент Ими. в гель

альгнаэта кальция Имм. в гель пектина Ими. в гель аубааддана Имм. в гель ПВС

РИС. 1

А, % от

100

Зависимость про теологической активности иммобилизованной я иатганой щелочной протеазы при рН - 5.5 от времени инкубации

-Нативный фермент

- Ими. в гель .

каррагинана -Ими. в гель альпшэта кальция -Ииы. в гель пектина -Ими. в гель аубазцдана -Ним. в гель ПВС

Рис. 2

На основании проведенных исследований был предложен ранозаживляющий препарат "Протеим", полученный иммобилизацией щелочной протеазы на марле с помощью ПВС, сшитого тетраборатом натрия. На данный препарат разработана ВФС.

Данный метод иммобилизации позволяет проводить совместную иммобилизацию щелочной протеазы с полимиксином, декаметоксином й "Сгерилазой" с сохранением 78.9-127.1% исходной активности.

Таблица 4

Иммобилизация щелочной протеазы совместно с полимиксином, _декаметоксином и "Стерилазой"

АнтюшкробныЗ агент До у стермизадми После гсте»>ииг1ждян

А,ПЕ/г % создав* оттеор. А,ПЕ/г % СШфШ. отямоб. % сох;и. от вех.

Полнмиксина В сульфат 280.0 92.0 240.0 85.7 78.9

Декяметоксвн 248.0 81.6 253.6 102.0 83.4

"Сгернлаза" 274.4 91.6 380.8 138.6 127.1

Другим аспектом нашего исследования было включение щелочной протеазы в гидрофильные композиции на основе полиэтиленгликолей и поли-М-винилкапролактама, сшитых у-облучением.

Состав гидрофильных композиций:

• № 1 - полиэтиленгликоли с молекулярным весом 400 и 1500 в соотношении 4:1;

• М° 2 - 40% ПЭГ-1500, 20% ПЗО-400, 30% 1,2 пропиленгликоля и 2% Н20;

• 3 - 18% проксанода-268, 20% ПЭО-400, 30% 1,2-пропиленгликодя и 2% Н20;

• №4-8 частей ПЭО-400, 2 части ПЭГ-1500 и 5% угольного порошка;

• МЬ 5 - 25% ПВС, глицерин и ПЭО-400 в соотношении 1:1:1;

• МЬ 6 - 10% раствор ПВК и глицерин в соотношении 3:1.

Проведение исследования показали, что все исследуемые композиции способствовали сохранению активности иммобилизованного фермента, а в раде случаев повышали се.

Таблица 5.

До г-стерилющин После г-стерыкадш

Композиция А,ПЕ/г % соху11. А,ПЕ/г % сохраа. % сохри.

оттеор. от юшоб. ОТ ИСХ.

1 215.2 179.3 279.2 129.7 232.6

2 229.6 191.3 297.6 129.6 247.9

3 140.0 116.0 317.6 264.5 263.2

4 108.0 254.7 118.4 226.8 279.2

5 156.8 130.5 196.0 125.0 163.1

В результате иммобилизации было определено увеличение рН- и термостабильности иммобилизованных препаратов, смещение рН-области

функционирования фермента с рН - 9.0-10.0 (для нативнога) до рН 6.0-7.0 (для иммобилизованного) (рис.3-5).

Зависимость протеолнтической активности щелочной протеазы, включенной в мазевые основы от рН

Зависимость протеолитнчссмй активности щелочной протеазы, включенной в мазевые основы от температуры

Тсрмостабильностъ щелочной протеазы, включенной в мазевые основы = 55 °С)

А, % от шах

В изученные гидрофильные композиции совместно со щелочной протеазой возможно включать также и другие лекарственные препараты.

Таблица 6.

Комплексное включение щелочной протеазы, антибактериальных препаратов, _тримекаина и мочевины в гидрофильные мазевые композиции._

До г-пернюш! После у-стераякшош

Преяарат А,ПЕ/г % сохраа. А,ПЕ/г % сохраа. % сохраа.

от теор. от яммоб. от вех.

Щелочная аротеаза + 1% 189.6 157.3 332.8 175.5 276.1

диоксидов

Щелочяая яротеаза + 3% 183.2 152.6 246.4 134.5 205.2

тримекакя

Щелочная цотеш + 1% 170.4 141.9 314.4 184.5 261.8

диокевдка + 3% тркнеиия

Щелочаая яротеаза + 140.6 101.6 154.1 109.0 111.4

полихошенн

Щелочаая яротеаза + 20% 176.0 143.1 198.7 И 3.0 161.6

мочежхл

Щелочаая аротеаза + 102.8 192.1 106.4 103.5 198.8

дехаметоссив

Для восстановления сниженной ферментативной активности желудочно-кишечного тракта нами был разработан препарат иммобилизованных гидролитических ферментов (щелочная протеаза, р галактозцдаза, ораза, солизим) на пищевых волокнах из пшеничных отрубей. Иммобилизацию осуществляли методом пропитки ПВ из водных растворов ПЭО-400 и ПВО с последующим закреплением у-облучением.

Тщательный подбор условий имобилизации отдельных ферментов при их совместной иммобилизации, позволил создать комплексный препарат для заместительной терапии.

При изучении свойств полученных препаратов была определена большая устойчивость иммобилизовашгых ферментов к воздействию низких значений рН. В этих условиях (рН-4.0) нативная щелочная протеаза в течение 3-х часов сохраняет 21.0% первоначальной активности, в то время как иммобилизованная от 65% до 85% .

Нативная р-галактозвдаза при рН-3.0 в течение того же времени сохраняет 83%, а иммобилизованная 90-100%.

Сравнение термической инактивации иммобилизованных и нативных ферментов при 55'С показало, что иммобилизация приводит к стабилизации

фермента. Через 3 часа инкубацни иммобилизованная рталакгозидала сохраняет 80-95% своей активности, по-сравнению с нативной, активность которой составляет 30%, для иммобилизованной щелочной протеазы этот показатель составил 38-43% при полной инактивации нативного фермента.

Таблица 7

Активности иммобилизованных на ПВ ферментов _ в комплексном препарате _

Фермеяты ПА, %сохр. АА, %сохр. ЛА, %сохр. р-гал., %сохр.

ПЕ/г ПА Е/г АА Е/г ЛА Е/г _р~гая.

ПВ, пэо

Щелоткм вротеаза 86.4 89.0

Ораэа 2605 88.0

Соянэим 8078 22.0

р-Галактозяаяэа 123.0 52.0

ПВ, ПВС

Шедочжяя кротеаза 83.4 86.4

Ораза 2984 91.3

Солкям 9116 31.0

р-Галактояшаза 83.7 47.4

Включением р-галактозидазы в радиационно-сшитый IIВ К, а также в Г1ВК, стабилизированный фенольнымм соединениями, получен иммобилизованный ферментный препарат.

Таблица 8.

р-галактозидаза

Стабклговрукнцяй РаиеШят сапезсаи Е.соВ

распор 9114 Е/г 600 Е/г 31100 Е/г

А Е/г %сохр ЛЕД %сохр А Е/г % сохр

0.5% раствор резорккка* 32.6 30.0 5.0 16.0 13.3 . 9.0

10% раегмр ПЭГ 40000 44.4 80.0 13.8 44.0 34.0 36.0

10% раствор ПЭГ 6000 23.6 50.0 7.0 42.0_ 33.6 33.0

40% распор ПЭО-400 30.2 103.0 7.7 22.8 -

1% раствор крахмала 16.8 46.0 8.7 28.0

ПВК (у-обл) 17.2 32.9 - - - -

*Во всех остальных случаях использовали 0.5% раствор резорцина приготовленный на растворе полимера (ПЭГ, крахмал).

При иммобилизации фермента в нерастворимые гранулы ПВК целесообразно стабилизационную среду готовить на растворе гидрофильных полимеров, способствующих сохранению исходной активности фермента с 30% до 103%. При определении десорбции фермента и резорцина из полученного комплекса было показано, что и фермеш и резорцин вымываются из гранул постепенно, в тече!гие 2-4 часов, что составляет для фермента - 77.2%, а для резорцина - 17%.

Для полученных препаратов были изучены их свойства.

Дм препаратов иммобилизованной (3-галактоэидазы наблюдается смещение рН-оптимума активности с рН-4.0 до рН 4.5-5.5 (рис.6).

Зшашхп жкптосш шпааай и шмойиюиашшй р-пяяааатш от рП гакубярюнюй среди

А. %ота»

Анализ термозависнмости не выявил заметных различий в поведетпш нативного и иммобилизованного ферментов.

Для иммобилизации р-галактозидазы нами были использованы также сополимеры стирола и дивинилбензола и полиэтилен с привитой полиакриловой кислотой.

Иммобилизация на этих носителях осуществлялась коналентными методами: на сополимере стирола и дивинилбензола с помощью глугаровою альдегида, а на полиэтилене с привитой полиакриловой кислотой водорастворимым карбодшшидом.

В результате подбора условий иммобилизации была показана целесообразность проведения иммобилизации фермента в течение 8-10 часов (для соотношения фермент:носитель 30-50 мг/г, при этом активность полученного препарата составляет порядка 70% ог максимальной).

При иммобилизации р-галактозидазы на сополимере стирола и дивгошлбензоле ее активность составинз 210.5 Е/г нисотеля при 13.5%

сохранении активности и 16.3% связывании белка, а при иммобилизации на ПЭ с ПАК активность составила 105.3% при 10.9% связывании белка.

Таблица 9.

Иммобилизация р-галактозидазы на сополимере стирола и дивтпшлбензола и

ПЭ-ПАК

(Соотношение ферментшоситель 50 мг/г)

Носитель Активность, ЕД %сохраяепш акгажосгя % саазыаата белка Субстрат

* 31100 _____н-ЦФГ п-НФГ

Соаолкмер стирол» я дшопибеазола 210.5 13.5 16.3

ПЭ-ПАК 105.3 6.8 10.9 11-НФГ

* 6043 лактои

Соаалнмер стирола я дяатоибеазола 30.2 10.0 16.3 лактои

* - нативный фермент.

Полученные препараты иммобилизованной (З-галакгозвдазы успешно функционировали на модели реактора периодического действия при 60-65% конверсии лактозы.

Результаты медико-биологических испытаний.

Для полученных препаратов были проведены мсдико-биологичсскис испытания.

Щелочная протеаза иммобилизованная на перевязочных средствах при помощи ПВС, сшитого тетраборатом натрия, успешно использовалась при лечении экспериментальных ожогов Ш-Б степени у кроликов и гнойных ран у крыс. В последнем случае сроки очищения ран сокращались с 12 до 4-х дней.

Таблица 10.

Результаты лечения гнойных ран у крыс протеолитичсскими ферментами

Средине сроки (сутки)

Прсяарят Очищение Пояхлепе Начала Заживления

раа грануляций оютелизацнн раа

Иммобилнзоиипаа телочиая 4.0±0.2 5.2+0.3 6.0+0.3 5.5+0.5

вротеаза

Нятютый трнасии 8.2+1.0 __ 10.0*1.0 П.2±0.9 21.0±1.5

Помзхя с фкиюлогапесхвм 12.0±1.4 18:5±1.7 20.5±1.8 29.0+2.1

раствором

Сопоставление полученных результатов с литературными данными, позволяет прийти к выводу о перспективности использования этого препарата при лечении гнойных ран и ожогов.

Препараты, полученные при иммобилизации щелочной протеазы в гидрофильные мазевые композиции на основе полиэтиленгликолей, также показали свои преимущества перед нативными ферментами. Данные препараты были использованы для гидролиза ожогового струпа роговицы при экспериментальном ожоге глаз у кроликов. Отторжение некротической ткани наступало через 20-25 минут после нанесения препарата, после этого поверхность была готова к пластическому закрытию.

Необходимо отметить положительные результаты, полученные при лечении костно-суставной патологии, включающей в себя остеохондроз грудного и шейного отделов позвоночника и переломы костей.

Комплексный полиферментный препарат для заместительной терапии прошел доклинические испытания в ГНЦЛС (г. Харьков) на модели острого холодового панкреатита. Согласно полученным данным, препарат восстанавливает сниженные в результате патологии ферментативные активности до уровня нормы.

Таблица 11

Активность иммобилизованных ферментов в отрезке тонкой кишки крыс

Группы ЛЛ, мкмод]» % от П.\, врот. ед/мл % от р пл. ахт. %от

животных олеинов. к-ты/мл нормы нормы немоль Глю/час нормы

Норма 2.71±0.31 0.18±0.024 23.92±1.4

Патология 1.08±0.12 39.9 0.11±0.018 61.1 15.35±2.41 64.17

Патология 2.8910.34 106.6 0.167±0.013 92.8 23.56±3.61 98.49

+ннмооил.

ферменты

Выводы

1. Разработан метод иммобилизации щелочной протеазы и некоторых протеолитических ферментов на перевязочных средствах с использованием гелей полисахаридов и поливинилового спирта с сохранением для карралшана - 57%, ПВС - 92%, альгината Са - 102%, пектина - 113%, аубазидана - 114%, исходной активности. Подученные препараты стабильны при у-стерилизации и хранении.

2. Изучено включение щелочной приказы в гидрофильные мазевые композиции, на основе полиэтиленоксида, сшитого /-радиацией, при этом наблюдается повышение ее активности до 163: 279%.

3. Разработан способ закрепления комплекса ферментных препаратов для заместительной терапии на пищевых волокнах с использованием полиэтиленоксида и поливинилового спирта с высоким сохранением протеолитической, амилолитической, липолитической и р-галактошдазной активностей.

4. Показана возможность включения щелочной нртеазы и р галактозцдазы в радиациотю-сшитый поли-М-вннилкапролактам с 90+98% сохранением протеолитической и 45;62% р галактозидазной активности, а также р галактозндазы в нерастворимые гранулы Г1ВК, стабилизироватшые резорцином. Добавление в последнем случае I Г')Г- 4(ХХЮ позволяет увеличить ферментативную активность до 80%.

5. Изучены физико-химические свойства всех полученных иммобилизованных «¡Ферментных препаратов: рН- и термооптимумы, рН- и термоетабильность, а отдельных случаях кинетические параметры. Показано, что рН-оптимум активности щелочной протеазы, закрепленной на перевязочных средствах, ПВК, гидрофильных композициях, пищевых волокнах рас1Ш1рен и оптимум смешен на 1.0:1.5 единицы в область кислых значений рН, а для р-галактозидазы - на 1.0 единицу в щелочную область. Для иммобилизованных препаратов наблюдается расширение термооптимума На 5: КГС. наряду с увеличением термостабильности.

6. Показана эффективность иммобилизованной на перевязочных средствах щелочной протешы при лечении экспериментальных ожогов у кроликов и гнойных ран у крыс; включенной в гидрофильные композиции для лизиса ожогового струтш роговины, а также п сочетании с ультразвуком при лечении костно-суставной патологии. В результате проведенных исследований предложен эффективный ранозажиляющий препарат "И роте им"

7. Доказано, что в случае экспериментально вызванного у крыс панкреатита, комплекс ферментов, закрепленных на пищевых волокнах, способствует восстановлению сниженной ферментативной активности до уровня нормы.

Основное содержание диссертации изложено в работах

I. Кравченко И.А., Давидснко Т.И. Иммобилизована» р-галактозидаза. Деп. 30.09.91. № 3813-В-91. 14 с.

2. Кравченко ИЛ., Даввденко Т.И., Кирш Ю.Э. и др. Иммобилизация р-галактозвдази в поли-Н-вииилкапролактам // Доклады АН Украины. - 1993. - № 3. - С. 142-146.

3. Кравченко ИЛ., Давиденко Т.И. Лечебные пластыри с протеолитическими ферментами // Фармаком. - 1993,- № 10-11. - С. 46-52.

4. Крусир Г.В., Черно Н.К., Кравченко И.А. Иммобилизация ферментов заместительной терапии на пищевых волокнах // Доклады АН Украины, -1994. - N° 5. - С. 146-149.

5. Крусир Г.В., Кравченко И А., Черно Н.К. и др. Иммобилизации ферментов на пищевых волокнах // Прикл. биохим. и микробиол. - 1994. - т. 30, вып. 6. - С. 849-856.

6. Давиденко Т.И., Кравченко ИЛ. Иммобилизация протеолитических ферментов. Деп. 27.05.94. N° 88- хп 94, Черкассы.

7. Даввденко Т.И., Кравченко И.А., Сидорова Т.Г. Способ очищения сточных вод от фенольных соединений. Заявка № 93101186.

8. Кравченко ИА., Даввденко Т.И., Севастьянов О.В. и др. Разработка комплексных методов удаления фенола и его производных // XV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Минск, 24-29 мая 1993 г., т. 2. - С. 416.

Результаты диссертации опубликованы также как тезисы 5 докладов на научных конференциях.

Кравченко 1.А. 1ммобшзащя лужнох протеази та р-галактозвдази на пол1мерних нос1ях.

Дисертащя - на правах рукопису - на здобуття вченого ступеня кандидата х1м!чних наук по спещальносп 02.00.10 - бюоргашчна х1м1я, тия природних та ф13юлопчно активних речовии. Фпико-х1м1чтш шетитут НАН Украши, Одеса, 1995 г.

Захищасться 6 наукових робп, в яких вивчеш основш закономерносп ¡ммобшзаци лужно! протеази, р-галакгозвдази та шших пдролш!чних ферменпв на потимерних ноешх. Вивчеш основш ф1зико-х1м1чш влаешьоеп одержаних ¡ммобшзованих препарата. Розроблено зааб закршлення комплексу фермситних препарапв для замшювально! терапи на харчових волокнах; лужно! протеази на перев'зувальних засобах, а також тпляхом включения 'й в пдрофшьш мазев1 композици. Показана можлишетъ включения

вказаких фермент в радиащйно-зшигий та стабтмований фенолышми сполуками пол1-К-вишпсапролактам.

Доказана ефекгившсть використання ¡ммобшзованих ферменпв при pi3tmx захворюваннях.

Kravchcnko IA. Immobilization of alkaline proteasa and p-galactosidasa on polymer carriers.

Thesis for a master's degree in chemistry specialization 02.00.10 biochemistry, chemistry of naturally and physiologically active substances. Physical-Chemical Institute of NAS Ukraine, Odessa, 1995.

Six scientific papers are presented for defence. They treat the main regularities of immobilization of alkaline proteasa, p-galactosidasa and other hydrolitic ferments on polymer carriers.

A study was made of the main physical-chemical properties of received immobilized preparations.

There was found a method of fixing a complex of ferment preparations on food fibers; of alkaline proteasa on dressing fabric and also by including it into hydrophylic ointment compositions.

There was shown a possibility of including the said ferments into radiation-bound and stabilized by phenol compositions of poly-N-vinilcaprolactam.

There was proved the effectiveness of using immobilized ferments for various diseases.

Ключевые слова: гидролитические ферменты, щелочная протеаза, р-

галактозидаза, полимерные носители, полисахариды, ПЕО, ПВС, ПВК.

Подписано в печать 3.11.95. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. 1,13 усл.печ.Л. 1,05 уч.изд. Тираж 50 экз. Заказ

Одесский Государственный политехнический университет. 270044,Одесса, пр. Шевченко,!