Иммобилизация уреазы на полимерных носителях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

О Г £ Г I 0 •

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ХИМИИ И ХШИЧЕСКОИ ТЕХНОЛОГИИ

, гт.-ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИИ ИНСТИТУТ иы.А.В.Богатского

.На правах рукописи »

КОШЕЛЕВ СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

УДК 577.152.351:15(088.8)

ИММОБИЛИЗАЦИЯ УРЕАЗЫ НА ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ

02.00.10. - Биооргаюгческая химия, химия природных н физиологически активных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических яйук

ОДЕССА - 1993

Работа выполнена в Физико-химическом институте им. А.В.Богатского АН Украины

Научный руководитель: доктор химических наук

Т.И.Давиденко Официальные оппоненты: доктор химических наук

П.К.Кинтя кандидат химических наук

* Ю.В.Гавсевич Ведущая организация: Одесский технологический институт пищевой промышленности

Защита состоится " ^ " г. в ^^ час. на заседаиш

специализированного совета Д.016.58.02 при Физико-химическом институте им. А.В.Богатского АН Украины (270080, г.Одесса, Черноморская дорога, 86).

О диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Физико-химического института им. А.В.Богатского АН Украины.

Автореферат разослан " .декабря 1993г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат хдаических.авук * Л.А.Литвинова

Актуальность проблемы: Конкретное использование иммобилизованного ферментного препарата принципиально возможно при решении ряда " проблем, связанных с подбором подходящего метода иммобилизации и носителя, с одновременным сохранением активности фермента. Несмотря' на определенный прогресс, достигнутый в этой области, работы по созданию более экономичных типов биокатализатороз на осноЕе довых. либо недостаточно рассмотренных ранее носителей, продолжаются.

В этом плане перспективны синтетические полимерные носители. Это обусловлено широким набором изменяемых физически и химических параметров (размеры частиц, пористость,'функциональные группы на поверхности). Среди них мокко выделить нерастворимые пористые и непористые полимеры, иммобилизация на которых осупествляется за счет адсорбции либо ковалентного связывания или комбинации этих двух процессов, и гелеобразухние полимеры. Каэдая группа имеет свои очевидные преимущества и недостатки и используется в зависимости от практических це- ■ лей применения получаемых иммобилизованных препаратов.

Особый интерес представляют биокатализаторы нз основе уреззы. Уреаза - фермент, гидролизущий мочевину в водных растворах, промшн-ленно выделяется из растительных и микробиологических источников и активно изучается благодаря вирохому спектру возможного применения ее иммобилизованных форм. Это могут быть методы аналитического определения мочевины в биологических и промышленных гздкостях, системы очист- . ки как медицинского.назначения ("искусственная почка"), так и промыш- -ленных стокоз, регенерация в аппаратах замкнутого цикла.

Все вышеизложенное определяет актуальность данной диссертацион- . ной работы, выполненной в рамках темы "Создание систем индивидуального пользования для1 определения мочезикы, глюкозы и ксентина" по программе 5.41.07. Епдсенсорц, и представляющей часть исследований, про-бодишх в отделе'Физико-химических основ биотехнологии 0X11 им. А.В.Богатского АН Украины. •■•'■■■

Цель работы: Целью настоящей работы являлось изучение методов иммобилизации уреазы на полимерных носителях, исследование свойств порченных препаратов и возможностей их практического применения.

Научная новизна: Разработаны способы ковалентнс^ иммобилизации препаратов уреазы ка макропористых сополимерах стирола и дивинилбен-зола и привитых полиэтиленах, а также метода включения фермента в по. ли-Н-винилкапролактам с высоким сохранением активности и связыванием белка. Показано, что эффективность иммобилизации естественно зависит от природы и пористости копользуемых полимерных матриц. Предложено применение сополимеров стирола и диЕ^нилбензола для иммобилизации уреазы из растительного сырья, а привитых полиэтиленов - для связывания фермента из микробного источника.

Изучены свойства иммобилизованных на полимерных носителях препаратов уреазы: рН- и термозависимость активности, кинетические, параметры гидролиза мочевины, стабильность при хранении, возможность использования препаратов в реакторах периодического и непрерывного действия для разложения и анализа мочевины в растворах.

Доказано, что рН-оптимум иммобилизованных препаратов уреазы' имеет тенденцию ц сдвигу в кислую область, повышена термостабильность коЕалентно связанного" фермента.

■ Разработанный метод включения уреазы в ПВК позполяет получить препарат со 100%-ным сохранением активности при иммобилизации к SO- " ЮОЖ-шм сохранением после года хранения исходной активности.

. Методами ШР С13 и ИК-спектроскопии показана гидрофобная приро-.да образования нерастворимого комалекса ПВК при термоосаздении в растворах фенола. ..

Практическая панноом.: На основа ковалентно иммобилизованных на 'стиролдиЕинилбензолышх носителях и привитых полиэтиленах препаратов уреазы показано эффективное разложение растворов мочевины с концентрацией 350мг3 на протяжении 15-20.дней,' ■ ■

. Установлено, что иммобилизованная на СПЯ стирола и двб уреаза позволяет проводить ¿а протяжении 14-18 дней до 150.анализов расТЕора мочевины в диапазоне концентраций 10"4- 10"% с ошибкой ± ,5%. '.•;'■'■

По. /-ченкый термоосаздением в-среде, содержащей рН-индакатор, иммобилизованный в ПВК препарат уреазы позволяет в течение "'3-5 мин тес-., тировать водные растворы мочевины при хсомнатной тегягературе с концентрацией 150мг2 и'выше, что'соответствует патологам содержания мочеви-: ны в плазме крови.

Разработашше на основе в^шочехгсой в ПВК уреазы 2-х и -3-х слой- .

кые индикаторное полоски, позволяйте за 4-8 мин полуколгчествекно определять содержание точевины в прсСе 0,02мл плазмы или крови, прошли успешные мздико-бкологические испытания на крови больных.

Апробация работы: Результаты работы докладывались на IY Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Киев, 1983), Всесоюзной ксн-ференщд "Применение ферментов в биологических анализах" (Вильнюс, . 1984), 2-Я Всесоюзной конференции по гемосорбцни (Тапкент, 1984), Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1936), Международном конгрессе "Сенсорные системы и компоненты" (С.-Петербург, \993).

Публикатш: По материалам диссертации опубликовано 3 ста.тьи, тезисы 7 докладов, 1 статья находится в печати.

Обгон работа: Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит // таблицу, рисункоз. Список литературы включает _2^£^наименовзниЯ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

В работе использованы препараты уреазы, выделенной из семян арбуза (ЕККХТЛС .Харькоз), соевых бобов (марка А, ШО "Биолар",Рига) и Staphylococcus saprophytics ( НПО "Фермент", Вильнюс).

Группы носителей, используемые для козалентной иммобилизации уреазы, включали макропористые сополимеры стирола и дазкнилбензола ( СПЧ стирола с двб) пр-ва ИРЕА, Москва, следующего строения:

- СИ - снг -

сн, - п

- сн - сн2 - сн - сн2 -

О. s 0 .

сн,- р-см сн;, - r I

СН

п = ш

г

II Н = NH(CH2)2NH2

III R = Ш (СН,) 2NH (СН2) 2tiH2

IV Н = N(CH СН,0Н)

V R = 1Ш2 •

VI и'« Ш(СН2)21Шг

а такхз СЕТ стирола с двб Polystyrene Y-58 пр-ва. фирмы VEB Chen.

Comb. Bitterfeld, ГДР и привитые полиэтилена пр-ва КОХ, Черноголовка. Эти матрицы характеризуются высокой механической стойкостью, легкостью химической модификации, для СПЯ стирола с двб характерна также развитая пористость и удобная сферическая форма частиц.

Ковалектную иммобилизацию уреазы проводили на сополимерах стирола, содержащих функциональные первичные аминогруппы с разной длиной алкильной "нонки" с помощью глутарового альдегида. Для лолиэтиленов с привитой полиакриловой кислотой (ПЭ с ПАК) в качестве сгнивающего агента использовали карбодиимиды, осуществляя ковалентное связывание по схеме:

I t • *

NR- ONHEN-E'O HNR

А _ "4. Л II II г л и /

Q00 + С+я -- ]- С-О-С -- |- C-NH -Е + С = О

• юш" i ' HNR" нш"

I - 1-Цшш>гексил-3-(2-морфолкноэтил)карбодиимид-м-п-толуолсульфонат

II - 1-Этил-3(З-диметиламинопропилЖарбодиимид ДЦК - N,N - Дициклогексилкарбодиимид

Следует отметить, что активированные глутаровым альдегидом со- ■ полимеры стирола можно хранить в сухом виде и использовать для иммобилизации ферментов.по мере надобности, тогда кек связывание уреазы с полиэтиленом осуществляется непосредственно в присутствии кзрбодиимида без выделения активированного носителя. •

Активность полученных иммобилизованных препаратов изменялась в широких пределах от 0 до 2000 Е/г и определялась как носителем и 'методом связывания, так и свойствами прапаратов уреазы из разных источников (табл.1). ...

. ■ Путем оптимизации условий иммобилизации методом математического планирования варьируя для сополимеров стирола соотношение фермент: носитель, время и объем буферного раствора, а для полиэтиленов -фермент:носитель, количество карбодиимида и концентрацию спирта получены препараты с активностью до 550 и 520 Е/г для уреазы из St. saprophrticus и-из соевых бобов.на сополимерах стирола и до 2000 Е/г для уреазы из St. зарг. на ПЭ с ПАК'. Эти данные превосходят известные из литературы, например 495 Е/г для уреазы на макропористых угольных носителях и 880 Е/г для непористых силохромов. Оптимальные условия ■ иммобилизации составили 120-200 мг препарата на г носителя, pH 6,8,

б

10-16-часовая инкубация при встряхивании, 60-65 мг кврбодиимида в 35-40Я спирге для полиэтилена.

Таблица 1.

Свойства ковалентно иммобилизованных препаратов уреазы.

а Носитель Увеааа (источник) Активность Е/г Сохранение . активности %

1 СПЛ стирола с двб1 Семена арбуза 0 0

2 СПЛ стирола с дзбП Семена арбуза 170 4,2

3 СПЛ стир. с двбШ Семена арбуза 203 5,1

4 СПЛ стир. с двб IV Семена арбуза 28 0,7

5 СПЛ стир. с двб V Семена арбуза 178 4,3

6 СПЛ стир. с двб VI Семена арбуза 163 4,0

7 СИЛ стир. с двб II Бг.заргорЬуг. 90 0,8

8 СПЛ стир. с двб II Соевые бобы 340 6,1

9 Polystyrene Y-58 31.заргорЬу1. 550 4,2

10 Polystyrene Y-58 Соевые бобы 520 9,4

11 ПЭ с ПАК (карб.1) • Семена арбуза 362 7,6

12 ПЭ с ПАК (карб.1) Б^варгорЬуг. 465 3,2

13 ПЭ с ПАК (карб.П) БГ.эгргсрЬуг. 765 4,9

14 ПЭ с ПАК ( ДЦК ) БГ.заргорйу^ 2000 13,5

Из полученных результатов видно, что удлинение модификационной "нояяи" носителя ведет к увеличению актизнооти препарата (Ш 1-3).

Мокно предложить более целесообразным иммобилизацию препаратов ' уреазы из растительных источников на макропористых сополимерах стирола, а для более активной микробной уреазы использовать привитые полиэтилена. Относительно невысокая степень сохранения активности, характерная для ковалентно 'иммобилизованных ферментов,' компенсируется высокой стабильностью и' многократным использованием.

Для изучения'влияния процесса'иммобилизации на фермент и для оптимального цртенешя 'полученных, препаратов исслэдовалк комплекс биохимических свойств 'фиксированных форм уреазы в сравнении с натив-нш ферментом. На примере1 трех' активах'препаратов : уреазы из St. sàprophytlcus lia Polyalyrénç■ Y~53"и^гголиэпмене, à.'также, уреазы из

соевых бобов на Polystyrerne У-58 ниже представлены характерные свойства иммобилизованных препаратов.

ti

% от max

4.5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5

рН

Рис. 1. Зависимость активности препаратов уреазы из St.sapr.

(1) и из соевых бобов (2). иммобилизованных на Polystyrene (3), ПЭ с ПАК (ДЦК) (4) и на Polystyrene (5), соответственно, от рН инкубационной среда.

При изучении зависимости активности препаратов от рН (рис.1) можно сделать вывод о стабилизации ковалентно иммобилизованных форм уреазы в кислой среде, что отражается расширением рН-оптимума. Это можно объяснить тем,.что при гидролизе мочевины уреазой выделяющий« аммиак защелачивает микросреду вокруг активного центра фермента, cbj занного на поверхности и в порах носителя, а закислэкие инкубационн< среды компенсирует это инакгивирушее воздействие.

Термооптимум активности (Рис.2) уреазы, лежащий для фермента и; St. saprophytics в интервале 45-55°С, для фермента из соевых бобов 55-65°С, для иммобилизованных препаратов повышается. Повышение стабильности препаратоз при высоких температурах, характерное для фикс: розенных форм ферментов,- подтверждается как данными по снижении эне гии активации процесса гидролиза мочевины с 10 кДк/моль для натизно фермента до 4,3 кДа/моль для иммобилизованной на ПЭ уреазы, так и ' результатами изучения термоустойчивости ковалентно связанных препар

тов при S0°C . Показано сохранение В6% и 77% исходной активности иммобилизованных препаратов уреазы из St. saprophytlcus после 5-ти часовой инкубации против 50% для наганного фермента.

А,

% от тах 100

75

50

25

25 37 45 55 65 75

Т. °с-

Ркс. 2. Зависимость активности препаратов уреазы из St.3apr.

(1) и из соевых бобов (2), иммобилизованных на Polystyrene (3), ПЭ с ШК (ДЦК) (4) к на Polystyrene (5), соответственно, от температуры инкубационной среда.

Изучение кинетики гидролиза мочевины нативной и иммобилизованной уреазой методом рН-статирования показало большее сродство препарата из соевых бобов к субстрату, чем у фермента из семян арбуза и St. saprophytlcus, для которых значения Ка на порядок выше (Табл.2).

Линеаризацией экспериментальных данных по методу наименьших квадратов в пределах двух участков - при низких и высоких концентрациях субстрата с высокой корреляцией для препаратой, иммобилизованных на носителе III и привитых полиэтиленах определены два значения константы Михазлиса. Подобное наличие второго, на порядок большего значения Ко при высоких концентрациях мочевины, описано для уреазы, иммобилизованной на пористых оргвнокремнеземах и объясняется с одной стороны, стерическим влиянием матрица носителя на активный центр ковалентно связанного фермента, о с-другой стороны.

диффузионными ограничениями носителя по субстрату.

Таблица 2.

Кинетические параметры ковалентно иммобилизованных препаратов

Jí Уреаза Носитель V ,о3м К^д» 106М Р

1 Соевые бобы • - 0,11 22,3 0,997

г 3 Соевые бобы Соевые бобы СПЛ стир. с ди-винилбенз.Ш Polystyrene Y58 -,0.04 (10 7*10 г) 1,68 (10 г- 1 М) 0,10 8,1 12,2 8,2 0,99 0,987 0.991

4 Семена арбуза - 5,29 2,8 0,999

5 Семена арбуза СПЛ стир. с ди-винилбенз.Ш -,11.5 _а (10 3- 2*10 2) Л17 (10 г- 1 М) 5,94 6,13 0,989 0,999

6 Бг.заргорЬу1 12,3 33,8 0,987

т Бг.заргорЬут; Polystyrene У58 8,6 21,6 0,99

8 Бг.заргор!^ ПЭ с ПАК ( I ) л23*6 (10 э- 2*10 1) 212 (10"т- 1 М) 31 ;2 48,1 .0,998 0,986

9 Бь.заргорЬуг ПЭ с ПАК (ДЦК) -,Ю,5 (10 2*10 г) J 31 (10 1 М) 46,4 67,7 0,999 0,999

Незначительное изменение Кп при иммобилизации на Ро1узгугепг. свидетельствует о более мягком,.не затрагивающем активный центр уреазы, характере связывания фер.мента.

Возможность практического применения полученных препаратов, изучена в условиях проточного колоночного реактора периодического и непрерывного действия при концентрациях субстрата 350 мгй. Для периодического реактора показано, что после потери исходной активности за первые 20-25 циклов то 100 мл раствора, работа колонки стабилизируется и в дальнейшем на протяжении 10-14 суток (50 циклов) активность сохраняется на уровне 35-402 исходной. При непрерывном гидролизе мочевины в колоночном реакторе ковалентно иммобилизованное препараты показали высокую активность .и стабильность (Рис.3).

s.s 100

75

50

25

' 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 "

y.jt

Рис.3. Разложение мочевины в реакторе непрерывного действия препарата:® уреазы из St. saprophyticus, иммобилизованной на Poly-atyrene (1) и на ПЭ с ПАК (ДЦК) £2) и уреазы из соевых бобов, иммо-Зилизованной на Polystyrene (3);

S' - степень конверсии мочевины, % от .полной.

Колонка с 1г препарата на сополимере стирола и с ,200мг препарата на полиэтилене после пропускания 8-1 Ол раствора мочевины сохрз-зяла 25-30%-нум степень конверсии субстрата при исходной в 76-345 идя сополимера _стирола и'.ЮОЖ для полиэтилена. За этот период коли-. jecTBO гидролизованной в пересчете на г г иммобилизованного препарата мочевины составило от 14 до 100 грамм.

Изучена возможность применения полученных препаратов для гнализа тонцентрашп! мочевины в водных растворах. О этой целью через коленку ; 200мг иммобилизованной на сополимере стирола уреазы пропускали прозы 10мл раствора мочевины в диапазоне концентраций 4-Ю"4 - 10~гМ, зпределяя фотометрически с помощью реактива Кесслера количество аммиака на выходе. Построенная по полученным данным калибровочная прямая мела коэффициент корреляции 0,94-0,99. Уровень конверсии мочевины ¡оставлял 46-785'для разных концентраций субстрата, а количество шолизируемых в течение 14-18 суток без нарушения достоверности проб

составило от 58 до 150 для препаратов с разной активностью, что соотносится с описанными в литературе анализаторами.

Полученные препараты обладают высокой стабильностью при хранении как в стабилизированном фосфатно-глицеркновом буфере, так и в сухом виде, сохраняя от 70 до 100% исходной активности после года хранения.

Ковалентные методы иммобилизации позволяют получить стабильные препараты, устойчивые к рН- и-термовоздействиям и способные к длитель ной периодической и непрерывной работе. Однако относительно невысокая степень сохранения активности при подобных методах, фиксации ферментов обусловливает внимание исследователей к гелеобразупщ-м и пластифицирующимся полимерам, для которых возможно 100Ж-кое включение фермента в структуру получаемых препаратов. В качестве подобной матрицы для иммобилизации уреазы нами исследован поли-Л-винилкапролактам, способный к термоосавдению из водных растворов.

Процесс включения уреазы в ПВК включал растворение фермента в водном растворе полимера с последующим термоосавдением полученного .раствора в фосфатном буфере,-содержании■фенол или резорцин при 45°С.

-'он

»

.м

сн2-

0Н2

)Н2

О^-ОНз

-.13

с=о С-ОН

1,753 16,98

•1,926 .9,324

пвк

Лвк> __ --- .

фенол . уи

ЗбООсй1

.Методами ЯМР О13 по увеличению времени релаксации карбонила ПЁК и уменьшению времени релаксации гкдроксилэ фенола, а также ИК-спектроскопии по уменьшению интенсивности поглощения содержащейся в'фенольном комплексе ПВК воды показана гидрофобная природа взаимодействия фенола с ПВК, вытесняпдзго молекулы вода из сферц сольватации карбонильной группы поли-К-винилкапролактама, что ведет к упрочнешш структуры полимера и образованию стабильных гранул.

Полученные гранулы,, содержащие включенную уреазу, промывали, высушивали и хранили при 3-5°0.

Изучение влияния фенола и резорцина на активность уреазы в пре-

делах используемых для термоосзжления концентраций (0,05-0,555) показало, что фенол ингибирукце воздействует на фермент, тогда как резорцин не снижает активности уреазы. Поэтому з дальнейших исследо- • взкиях использовали для термоосаздения ПВК буферные растворы резорцина.

Таблица 3.

СВОЙСТВА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПВК ПРЕПАРАТОВ УРЕАЗЫ

.4 Иммобилизованный препарат Активность ¿охранение

Уреаза Добавка Уреаза:ПВК Е/г активности^

1 St.saprophyt. - 1 : 16 1625 ЗГ

2 St.saprophyt. 103 ПЭГ 1 : 16 1725 45

3 St.saprophyt. 20% ПЭГ 1 : 16 1700 58

4 St.saprophyt. 103 ПЗГ 1 : 32 1394 65

5 St.saprophyt. 103 ПЭГ 1 : 64 990 100

6 St. saprophyt. 405 глиц. 1 : 16 1087 . 71

7 St.saprophyt. 10% жел. 1 : 16 1100 27

3 Соевые бобы ЮГ» ПЭГ 1 : 11 1150' 66

Иммобилизацией уреазы з ГВК при весовом соотношении фермент:ПВК равном 1:6,4 получены препараты с активностью 1300 Е/г для урзззы из -St. sapropiiyticu3 и 510 Е/г для фермента из соезых бобов. Путем оптимизации соотношения фермэнт:ПЗК и введения в среду термоосааденяя • добавок потаэтиленглихоля,' глицерина или желатина (ТаОл.З) получены препараты о активностью-до 1725 Е/г и степень» сохранения активности до 100%.

Введение добавок-в-среду термоосакдения увеличивает актив-кость получаемых препаратов,' вероятно, з силу повышения еязкости среды, что препятствует выходу фермента' в раствор из образуются гранул. Снижений весового' соотношения фермент:ПЗК с 1:16 до 1:64 приводит к уменьшению удельной вктизностк препарата с 1725 до 990 Е/г, даако степень сохранения-активности при этом возрастает с

•i3

45% до 100%.

Для полученных препаратов уреазы исследован комплекс биохимических свойств. При определении зависимости активности от рН (Рис.4), показано, что включенная в ГОК.уреаза имеет более широкий, оптимум рН - от 5,5 до 7,0, чем нативная.Большую стабильность иммобилизованных препаратов как в области кислых, так и щелочных рН помимо компенсирующего влияния закисления среды на защелачивандее воздействие гидролиза ■субстрата, квк в случае ковалентно иммобилизованных препаратоз, можно связать с буферными свойствами окружающей фермент полимерной матрицы.

А,

% 01 шах 100 •

75

50

25

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8",5

РН

Рис. 4. Зависимость активности препаратов уреазы из Бизарг. .(1) и из соевых бобов (2), иммобилизованных в ГОК (3), 11ВК с добав- • кой ПЭГ (4), и в ПВК с ПЭГ (5), соответственно, от рН инкубационной среды.

Исследование термооптимума и термоустойчивости активности иммобилизованной в ПВК уреазы показало близость-свойств нативного и включенного ферментов, что свидетельствует о мягком, нековалентном ■ характере иммобилизации в поли-И-винилкапролактам, поскольку при ковалеитной иммобилизации термостабильность возрастает.

Возможность использования полученных гранул с уреазой для разло-

кения мочевины изучена в реакторе проточного типа. Показано, что 1репарат эффективно гидролизует субстрат лишь на начальном этапе, затем степень конверсии резко падает. 'Причиной столь резкого падения активности является вымывание фермента из гранул ПВК. Специально про-зеденными экспериментами показано (Рис.5), что ухе через полчаса в раствор из гранул переходит от 20 до 50% исходной активности. Через 3 часа в растворе опреде ено от 30 до 85% исходной активности.

А,% эт исх

100 -

75 -

50 -

25

Л ДОБАВКА ' К^* 10"3М

- 19,4.

1 20% ПЭГ 43,3

2 1095 ПЭГ 49,2

3 1056 же л. 59,2

4 4035 глиц. 79,0

0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

Г, час

Рис. 5. Вымываемость активности уреазы из Б1:. заргорЬуИсиз кз гранул иммобилизованных в ПВК в среде 20% ПЭГ (1), 10$ ПЭГ (2), 10% желатина (3) и 402 глицерина препаратов.

Для полученных препаратов методом рН-статирования при 50°С и рН 3,0 определены кинетические параметры. Увеличение Кв-при включении уреазы в ПВК (Рис.5) объясняется возникновением диффузионных затруднений для проникновения субстрата в структуру полимера, а также разной скоростью выхода фермента из ПВК в раствор. Это подтвервда-втся тем, что наибольшее значение Ки (79 мМ) наблюдается для препарата, содержащего глицерин, и для этого же препарата установлено ааибольыее включение фермента в гранулы (71Ж сохранения активности) и наименьшая вымываемость.

Для препарата уреазы из соевых бобов такое увеличение К не,

наблюдается. Это связано с более низкой активностью фермента, для которого скорость диффузии мочевины в ПВК и скорость выхода уреаз1 из гранул обеспечивают осуществление разложения мочевины в кинетическом режиме. Полученные препараты сохраняют при хранении в тече! 10-12 месяцев почти 100Ж исходи:й активности.

Высокая активность полученных препаратов, 100Ж-яое сохранение активности при хранении и гидрофильность ПВК делают возможным испс зование таких препаратов для анализа мочевины в растворах и биоло: ческих жидкостях. Иммобилизацией уреазы в ПВК в среде, содержащей рН-индккатор, получен оригинальный-препарат, способный изменять це при инкубации в растворе мочевины. При этом, изменяя индикатор, ар тивность препарата и его количество можно тестировать различи :з растворы субстрата.'Например, 5 мг. препарата с активностью 1500 Е/ содержащего феноловый красный, позволяют,за 5 мин определять пробу 0,1-0,2 мл раствора с концентрацией, 150-200мг55 к выше при рН 6,8 -7,1, что соответствует патологии содержания мочевины в плазме.

Для экспресс-анализа уровня мочевины в плазме и крови разрабо метод, использующий 2-х и 3-х слойные индикаторные полоски. Для ак лизе крови на 2-х слойную полоску наклеизалэсь полимерная мембрана препятствующая окранизанио индикатора кровью. При проведении анали за проба исследуемой жидкости (С,02 мл) наносилась на верхнюю поло ку, содержащую уреазу в стабилизированном растворе ПБК (в случае крови - на мембрану.). Время анализа составляло 4-10 мин, по интенс: ности развивающейся на нижней полоске, содержащей индикатор, окрас; определялся уровень'мочевины в анализируемой пробе, нижний предел чувствительности 50 мгЖ.

Разработанный нами метод тестирования патологии содержания мо' вины в плазме и крови имеет ряд существенных преимуществ перед используемыми, например индикаторными полосками "Уреатест" пр-за НПО "Биолар'.\ в которых применяется газовый метод анализа, требующий 30-ти минутной инкубации в термостате в закрытой пробирке, кроме го развизающаяся бледно-голубая окраска малоконтрастна, а срок хра нения полосок "Уреатест" всего 6 месяцев.

Индикаторные полоски для определения мочезины в плазме и кров] прошли успешные медико-биологические испытания на крови больных и рекомендованы к применению в амбулаторных условиях и на скорой noi.it

л для экспресс-анализа уремических состояний. .

Разработанные нами индикаторные системы стабильны при хранении ■ сохраняют исходные параметры после года хранения.

выводи

1. Разработаны и оь.имизированы методы ковалентной иммобилк-ации уреазы на стиролдивияилбензольных носителях и на привитых по-кэтиленах, при этом получены препараты с активностью до 2000 Е/г

100%-ным сохранением активности после года хранения. Предложено спользование сополимеров стирола и дивинилбензола для иммобили-вции уреазы из растительных источников, а привитых полиэтиленов -ля получения фиксированных форм фермента из Staphylococcus sap-ophytlcus.

2. Разработаны и оптимизированы методы включения уреазы в оли-Ы-винилкапролактам термоосакдением в среде, содержащей резор-т и различные добавки, при этом получены препараты с активностью о 1725 Е/г, 100%-ным сохранением активности при иммобилизации и табильные при хранении в течение года.

3. На основании изучения физико-химических свойств полученных' репаратоз показано расширение рК-оптимума и стабилизация уреазы в целой.среде, увеличение термостабильности и возростание значения

при ковалентной'иммобилизации фермента за счет диффузионных вли-ний носителя. . .

4. Установлено, что иммобилизованные на сополимерах стирола и ивинил&ензола и на привитых полиэтиленах препараты уреазы гидроли-уют в колоночном реакторе непрерывного действия в течение 15-20 уток раствор М0Ч5ИВШ с концентрацией 350 мг% при максимальной гепени гидролиза до 100%, а при периодическом использовании гозво-яют осуществлять до 150 анализов раствора мочевины с концентра-ией Ю"4- Ю'гМ.

5. На'основе включенных в ПВК форм уреазы разработаны индика-зрные системы в виде гранул и полосок, позволяющие в течение 4-Ю ¡шут тестировать содержание мочевины.50 мг% и вше в промышленных биологических жидкостях.. Индикаторные полоски для определения

этологии содержания мочевины в плазма и крови прошли успешные мелко-биологические испытания на- крови больных, их применение ёозмож-

но в амбулаторных условиях и на скорой помощи для экспресс-внвлн уремических состояний.

Основное содержанке дис: стации изложено в следующих публик

циях:

1. Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В., Кошелев С.А., Картель Н.Т.-и др. Адсорбция' уреазы на углях.// I Белорусская конферэнци по гемосорбции "Сорбционные методы детоксикации в клинике": Тез. докл..Минск, 1983.- С. 26.

2. Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В., Кошелев С.А., Андронат С.А. и др. Иммобилизация уреазы для гидролиза мочевины в б: логи ческих растворах. // IV Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимол гия": Тез. докл., М,, 1983,- С. 34.

3 Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В., Кошелев С.А., Глемжа А и др. Применение иммобилизованной уреазы для сточных вод и биоло: ческих жидкостей.//Всесоюзная конференция "Применение ферментов ; биологических анализах": Тез. докл., Вильнюс.- 1984.- С. 72.

4. Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В., Кошелев С.А., ^зрковска; H.A. и др. Применение иммобилизованной уреазы для очистки биологических жидкостей.//II Всесоюзная конференция по гемосорбции.: Тез. докл., Ташкент.- 1984.- С. 244-245.

5.Давиденко Т.И., Севастьянова Е.В., Кошелев С.А. Стабилизация уреазы.// Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии.: Тез. докл., Махачкала.- 1986.- С.110.

6.Давиденко Т.И..Севастьянова Е.В., Кошелев С.А., Морозова A.A., Ставицкая С.С. Стабилизация иммобилизованной уреазы.// Конференция "Новые средства и сферы клинического применения сорбцио! ной детоксикации организма".: Тез. докл., Днепропетровск,- 1985.-С. 246-247.

7. Давиденко Т.И., Кошелев С.А., Макарова С.Б. Иммобилиизат уреазы на стиролдившшлбензольных матрицах.// Химия природ, сое-дин.- 1986,- Х5.~ С. 624-629. ' .

8. Давиденко Т.И., Кошелев С.А. Иммобилизация уреазы на при* тых-полиэтиленах.У/ Биотехнология.- 1983.- 4, Js2.- С. 225-230.

9. Кошелез O.A., Давиденко Т.Н. Иммобилизация уреазы.// Деп. 3 ВИНИТИ, Л 3699-В91.- 1991.- 20с.

10. Кошелев O.A., Давиденко Т.И. Биосистемы индивидуального пользования для определения мочевины в биологических и промышленных жидкостях.// Международный конгресс "Сенсорные системы и компоненты". :Тез. докл., С.-Петербург.- 1993.-; 0. 238.

11. Кошелев O.A., Давиденко Т.И., Кирш Ю.Э., Пашкин И.И. и др. Иммобилизация уреазы в поли-И-винилкапролактам.// Прикл. биохимия и микробиол. (в печати).

л2йп'5'пп5чати 2I-12.93г. Формат 60x84 Т/Тб.

®м °.7уч-изд.л. Г,0п.л. Заказ № 2099. Тираж 50экз. I ортипография Одесского управления по печати;цехКЗ.

Ленина 49.