Исследование пространственной организации трансмембранных фрагментов бактериородопсина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГА1ШЧЕСКОЙ ХИМИИ им.М.М. ШЕМЯКИНА .

На правах рукописи УДК 577.352.332.4:547.963.

АЕДУЛАЕВА Галина Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТРАНСМЕМВРАННЫХ ФРАГМЕНТОВ БАКТЕРИОРОДОПСИНА

02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-ТЭЭО

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина Академии наук СССР

Научный руководитель:

доктор химических наук, вед.н.с. В.И.Цетлин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, вед.н.с. Ц.П.Кирпичников

кандидат химических наук, ст. н.с. Б.И.Мицнэр

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии п

биохимии им. И.Ы.Сеченова АН СССР

Защита состоится "/О " Ол7$ОпА 1990 г. в 10 часов на заседании специализированного сов^а Д^002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени'"доктора наук при Институте Оиоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу:117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химии' им.М.М.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан " 0 " 19Э0 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат наук В.А.Несмеянов

Актуальность проблем. В изучении проблем фоторецепции - процесса преобразования энергии света в электрический импульс -важную роль играют исследования интегральных мембранных белков, которые при поглощении кванта свата осуществляют перенос ионов через мембрану против градиента их концентрации. В результате такого переноса на мембране генерируется электрический потенциал, энергия которого расходуется клеткой для разнообразных метаболических процессов.

Простейшую природную модель фотосинтезирукщей системы представляет собой бактериородопскн ( БР ) - ретинальсодержащий хро-мопротеид пурпурных мембран галофильных микрооргаотзмов Н.Ьп.1о-Ыит. По особенностям функционирования БР является светозависи-мой транслоказой протонов. Кроме того, по ряду свойств он близок к пигменту сетчатки глаз - зрительному родопсину. Все это делает бактериородопсин чрезвычайно интересным объектом исследований.

В настоящее время БР является достаточно хорошо охарактеризованным белком. Однако, многие вопросы, касающиеся специфических особенностей его строения и функционирования, нуждаются в уточнении. Это, прежде всего, выяснение структурной и функциональной роли отдельных аминокислотных остатков ( и/или отдельных участков полипептидной цепи ), а также детализация пространственной организации БР.'

Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение особенностей строения БР в растворе на основании исследования его модифицированных аналогов и фрагментов, полуденных путем специфической модификации молекулы белка ( биосинтеза на средах с фтср-содержащими аминокислотами и введения спиновых меток, ферментативного и химического расщепления ). Основными методами для этого служили КД, ИК, 19Р- и 22 1Н-ЯМР спектроскопии.

Научная новизна и практическая зтчи.косгп.ъ. Епэрвке получены и исследованы с помощью оптических методов,а также методами 2Б 'ни 19р-ЯМР в ряда систем, моделирующих мембранное окружение.крупные трансмембранныэ фрагменты БР. Показано, что в этих системах отдельные фрагменты БР обладают пространственной организацией, характерной для них в составе интактного бежа.

С использованием фтлрмеченых производных, содержащих спиновые

1-124/у

метки, получена информация о пространственной структуре целой молекулы ЕР в органических растворителях.

Разработанные мотоды препаративного получения серии фрагментов нативного и модифицированного БР являются принципиально ванными для последующих детальных структурно-функциональных исследований этого мембранного белка

Апробация работы, и. публикации.. Результаты работы доложены на IS Американском пептидном симпозиуме по структуре и функции пептидов ( Торонто, 1985 ), на VII Есесошном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Таллин, 1987 ), V Советско-пшейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" ( Рига, 1988 ), VII СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков ( Ди-лижан, 1989 ), на XIII Международной конференции по магнитному резонансу ( Мэдисон, 1988 ), 18 UCLA симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Парк-Сити, 1989 ). По материалам диссертации опубликованы два статьи.

Объели райоггсы. Диссертация изложена на 1ЧЧ страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуадения и списка литературы, включающего {Sí наименований. Работа содержит }L рисунков и ¿ таблицы.

I. ПОЛУЧЕНИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БР И ЕГО ФРАГМЕНТОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ.

К началу настоящей работы были'разработаны методы химических и ферментативных методов расщепления как нативного, так и денатурированного БР (рис 1).Эти расщепления проводились на аналитическом уровне и имели целью получение информации о первичной структуре. Необходимым этапом настоящей работы явилось получение препаративных количеств высокоочищенных пептидов для исследования их конформацконных параметров^спекгральншш(совместно с C.B. Сычевым) и-радиоспектроскопическими (совместно с А.С.Арсеньевым, И.Л. Барсуковым и А.Г. Соболем) методами.

Получение фрагментов. Для получения фрагмента 1-36 проводили расщепление связи Asp Зб-Рго 37 предварительно делипидированного БР. За основу фрагментации был взят метод Инглиса ( 1983 ), согласно которому связь Азр-Рго в белках и пептидах должна разры-

А В С О Е Р С

р аеаре vi

м

ЧГ.1 5 Е

ро

Н А«

л б

АпО

А1МС |бт

Чт

ф

рУ«-^¡А уМТ

уб1-

К-4' 1а1\'-

оАООс

ГГ'Т

№ а0;;

Ш.Х

XI м р

а т / т ч

р

р<}а<?

Ж

с Р

кт

вчЧ ^ СрЛ

V'

1У

л

р'7в 131у_$-ш

ь

г—ьЬ и^Г

VI' У .

А®®

урЧ

и«

-Аб

-i

198

гя1

Vе с А

О"

Л?

««г

Рис. I. Расположение участков расщепления в полипептидной цепи БР (указаны стрелками и буквами: С - для химотрипсина, V - для протеиназы 78 З.аигеиз, В - для боргвдрзда натрия,СрА - для кар-бокешшгаидазы А, Т - для трипсина и К - для ограниченного кислотного гидролиза). Прямоугольниками выделены трансмембранные сегменты А-в.

з

ваться в 10% сн3соон, содержащей 7М хлоргвдрат гуанидина (Си»НС1), рН 2.5 ( 40°,96 ч ). Отличия от оригинальной методики заключались в использовании более жестких условий гидролиза (70% НС00Н/7М й1*НС1) к более высокой температуры ( 45°С). Одним из условий, принципиально важных для полного расщепления, оказалось изменение температуры реакционной среды:при 3?°С гидролиза связи Аер-Рго в БР практически не было, напротив, расщепление при 45°С проходило почти на 100%. Фрагмент 1-36 выделяли с помощью гель-фильтрации в системе СНС13 - СН30Н (1:1 ), 0.1 М ЫС10Д на колонке с сефадексом 1Н-60 (рис.2).

Рис. 2. Препаративная гель-фильтрация БР, расщепленного по связи Asp Зб-Рго 37. Колонка 2*75 см с сефадексом ЬН-60 в системе хлороформ-метанол (1:1), О,IM L1C1. Скорость элюции 24 мл/ч. Количество наносимого материала - 40 мг.Заштрихованная фракция-фрагмент 1-36.

Пептид 163-231 получали в 2 этапа. Сначала пурпурные мембраны подвергали обработке боргидрздом натрия по известной методике (Цетлин, 1983; Корана, 1984), с тем отличием,что реакцию проводили 3 раза.Затем мембраны обрабатывали папаином в течение 2.5 ч в растворе,содержащем 10 мМ NaClJ, 2;.'М ЭДТА, 0.5 М NaCl.pH 7.0, в соответствии с методом (Абдулаев, 1978), за исключением нагрузки фермента: вместо соотношения фэрмент:белэк 1:200 использовали соотношение 1:20. Реакцию останавливали подкислением 0.1 Н HCl до pH 4.О,мембраны промывали центрифугированием в буфере для папаинолиза и в воде и лиофилизовали. 35-40 мг лиофилизованных мембран растворяли в 2 мл системы СНС13:СН30Н (1:1), 1М L1C1 и разделяли гель-фильтрацией на колонке с Ifl-бО (рис. 3).N-h С-Ко-нцевой анализы и деградация по методу Эдоана низкомолекулярного фрагмента (рис.2, заштрихованная фракция) показали, что он является смесью двух пептидов Met 163- Gly 231 и Pro 165-Gly 231, причем содержание последнего в смеси было не более 20%.

NaBH^ и папаина. Колонка 2*75 см с сефздвксом ЬН-60 в системе хлороформ-метанол (1:1), О,IM L1C1.Скорость злющш 24 мл/ч.Количество наносимого материала - 35 мг.

2-124/у

з

■Пептида 1-20, 33-56, 72-118 и 164-209 йромцианового гидролиза БР, химотршггические фрагменты I-7I, 72-248, фрагменты I-I55 и 156-248 получены по известным методикам ( Абдулаев, 1978; Корана, 1984; Цетлин, 1983 ).

КД фрагментов Б? в трифпюрэпаноле. в таблице I представлены результаты определения вторичной структуры пептидов в трифтор-этаноле ( ТФЭ ) по 4 параметрам ( а, р, р, t ). Анализ проводили с использованием реперных спектров ( Болотина, 1980 ), полученных по "жесткому" критерию, имеющему четкий алгоритм отнесения остатков к конформациям a-спирали, антипараллельной (II) б-структуры и р-изгибов. Поскольку, согласно этому критерию, фиксированными б конфэрмации р-изгиба считаются только 2 остатка, а искаженные концевые участки о-спирали и p-структуры относятся к неупорядоченной структуре, процент последней во всех исследованных пептидах оказывается довольно высоким.

Данные КД свидетельствуют о том, что в ТФЭ доминирующим типом вторичной структуры у фрагментов БР является а-спираль ( как и для БР в водных суспензиях пурпурных мембран ). Для пептидов I--36, I-7I и 156-248 содержание a-спирали составляет ~45-60%, что согласуется с возможностью образования одной и двух спиралей, каждая из которых включает ~ 20 остатков. Можно предположить. что информация, содержащаяся в аминокислотной последовательности данных пептидов, достаточна для того, чтобы и в мембране они могли образовывать а-спирэлъные участки. В пептидах I--20, 33-56, 164-209 содержание a-спиралей ниже ( ~12-29 % ) и имеется p-структура ( 8-21% ). Сопоставление всего ряда данных (табл. I) свидетельствует о том, что при включении этих пептидов в более длинные последовательности ( I-7I, 163-231 и 156-248 ) их вторичная структура изменяется: p-структура исчезает, вклад a-спирали увеличивается.

Наш проведенб 'сопоставление поведения пептидов в растворе ТФЭ ( табл. I) с профилем гидрофобности БР, рассчитанного по методу Кайта и Дулитла (1982) с сегментом в 4 остатка ( рис.3,а ). Из профиля гидрофобности ( рис.4,а ) видно, что в пределах последовательности 1-36 находится одна четко выраженная гидрофобная зона ( фрагмент 10-31 ), а в пределах последовательности I-7I -

Таблица 1. Вторичная структура фрагментов БР в ТФЭ.

Пептид 1-20 1-36 1-71 33-56 72118 164209 156248 163231

Число остатков 20 36 71 24 47 16 93 69

Содержание «-спирали, X 26,5 59 61 29 39 12,5 45 45

Число остатков в а-стара ли 5 22 43 7 18 6 42 31

Удержание р-стру-ктуры, % 8,5 0 0 17,5 3,5 21 0 3

Содержание р-изги- бов () № % 14,5 7 7,5 14 II 18 10 9

Число р-изгибов по данным кд 1.3 1,3 2,8 1.7 2,6 4 4,7 3.1

ЧИСЛО р-изгибов, полученное по методу Чоу-Фасиана X Т X 3 I 4 3 ' 5-6 2

Содержание неупорядоченной структуры (р), X 50,5 31 31,5 39,5 46,5 48,5 45 43

Номер остатка

Рис. 4. а -профиль гидрофобности БР с усреднением то 4 остаткам, рассчитанный по методу Кайта и Дулитла: "—"-последовательности изученных фрагментов БР, —- внутримембранные фрагменты согласно модели (Овчинников,1982); 0 - вероятность образования р-изгибов в БР, расчитанная по методу Чоу-Фасмзна (штриховая горизонтальная линия "соответствует порогу 1,5 х 1СГ4). Числа у пиков указывают *' номер * первого остатка в р-изгибе, скобками отмечены кластеры р-изгибов.

две ( Ю-31 и 41-68 ). с другой стороны, согласно данным КД в пептидех 1-36 и 1-71, соответственно, 22 и 42 остатка находятся в а-спиральной конформации, причем образование а-спиральных

структур в ТФЗ в пределах последовательностей 1-36 и 37-71 является независимым. Полученные результаты дают основание для предположения о том, что и в составе БР на участке 1-71 реализуются 2 а-спиральных фрагмента протяженностью в 21-22 остатка.

Если же в состав исследуемого пептида входит лишь часть дискретной гидрофобной области, то у нее . неполностью реализуется способность к формированию а-спирали (см. данные КД для пептидов 1-20, 33-56, 72-118 и рис. 4,а).

На участке 165-225 тлеется болыгое число коротких гидрофобных последовательностей,однако нет четко выраженных протяженных гидрофобных зон. Область 165-225 целиком входит в пептид 156-248, в котором, согласно данным КД, ~ 42 остатка находятся в а-спкраль-ной конформации ( в мембране для этого пептида следует окидать образования 2 трансмембранных а-спиральных фрагментов длиной 21-22 остатка ). Однако в укороченном пептиде 164-209 в а-спира-льной конформации находится всего лишь ~ 6 остатков (данные КД в ТФЭ). По-видимому, столь резкое уменьшение степени спирализации, носящее своего рода кооперативный характер, обусловлено исключением из состава пептида 156-243 сравнительно короткой гидрофобной зоны 210-225.

Таким образом, в пределах последовательности 156-243 на основании только профиля гидрофобности нельзя строго предсказать число внутримембранных а-спиральных фрагментов и установить их границы.

Полученные результата подтверндают корректность предсказашм а-спиральных трансмембранных сегментов для тех участков полипёп-тидной цени'БР, на профиле гидрофобности которых есть дискретные гидрофобные зоны длиной но менее 20 аминокислотных остатков. В тех случаях, когда на профиле гидрофобности имеется чередование коротких гидрофобных и гидроф:1лышх участков, нельзя корректно предсказать границы и число трансмембранных тяжей.

Число р-изгибов (~12), рассчитанное на основании данных КД БР в ТФЭ,хорошо согласуется с теоретически предсказанным (14-15) по методу Чоу-Фасмана для полной полипептидной цепи БР (рис.4,б ). Такое соответствие между экспериментальными д&нными и предсказаниями указывает на то,что образование р-изгибов определяется почти исключительно природой входящих в них аминокислотных остат-

3-124/у

9

ков и не зависит от длины пептида или полярности среды, йз сопоставления рис. а и 0 видно, что, как правило,участки, для которых наиболее высока вероятность образования р-изгибов, совпадают с наиболее гидрофильными областями на профиле гадрофобнос-ти.В целом же совместный анализ двух профилей в сочетании с данными НД позволяет более достоверно наметить 1'раницы внутримемб-ранных а-спиральных фрагментов и уточнить число и локализацию 6-изгибов в молекуле БР.

Структура фрагментов БР в мицеллах додацилсулъфата натрия (SDS). Для моделирования окружения полипептидных цепей в биологических мембранах используются мицеллы детергентов. Была оценена способность пептидов к встраиванию в мицеллы SDS и формированию в них регулярных структур. О встраивании пептидов в мицеллы судили по спектрам флуоресценции. Максимум эмиссии остатков Тгр, входящих в состав пептидов 1-36 и 156-248, в присутствии sds лежит в области 325-330 нм, что обусловлено их гидрофобным окружением и свидетельствует о том, что пептиды встроены в мицеллы. Не все пептиды удалось встроить в мицеллы SDS. В трех исследованных пептидах ( табл.2 ) сохраняется довольно высокое содержание а-спирали ( 42-50% ). По-видимому, a-спиральные фрагменты достаточно стабильны и реализуются не только в ТФЭ, способствующем образованию спиралей, но и в мицеллах SDS. Пептиды имеют ( по сравнению с растворами в ТФЭ) меньшее содержание неупорядоченной структуры и более высокое - ^-изгибов.

Данные ИК-спежроскопии для фрагментов БР в ТФЭ и SDS. В ТФЭ и в мицеллах sds максимум полосы Амид I в ИК-спектрах пептидов 1-36, I-71 и 156-248 ( табл.3) сдвинут относительно нормальной частоты колебаний амидкой группы в канонических а-спиралях ( 1650 ом"1) в область аномально высоких частот ( 1657см"1), характерных для спиралей мембрапных^белков, находящихся в гидрофобном окружении."Частоты Амид i пептидов 1-36 и I-7I в гн~форме такхе выше обычной гК-частоти для а-с.пирали ( I637-I64I см-1). Одним из всзмокных объяснений такого отклонения может быть присутствие а1:г-спирэли, отличающейся от обычной с^-спирали отклонением плоскости амидаых связей от оси спирали. Поглощение спирального компонента в БР имеет еще более виражинный высокочас-

ю

Таблица 2. Вторичная структура фрагментов БР, солюбилизированных в ЗГЕ.

Пептид 1-Зв 1-71 156-248 !

Число остатков 36 71 93

Х.-эмиосии Тгр ЗЗС ЗЛО 329

Содержание а-сснралн,* 50 51 42

Число остатков в а~спир«ли 18 -36 ЗЭ

Содержание 0-сгруктуры,Л 2 20,5 10

Содержание р-изгибов 12 14,5 15

Число Э-взгавоз но доншм КД 2,2 5.1 6,98

Число р-изгвбов, голучвпнсв по мятоду Чоу-Фэсмааа I 3 5-6

Содвряаств нэусорадочвнноа структуры (р),* Зв 14 33

Таблица 3. Положение максимума полосы Мид I в Ж-спектрах фрагментов БР.

Пептид Содэржаггае а-ош-р&ли по деннии КД, % V ^^полосы А«яд трифгорвтааол -т I, см 1 8БЗ*

1-36 50-60 1655 1658(Н)

1651(В)

1-71 50-60 1653 1652(0)

156-248 42-45 1656 ' 1648(0) _________

' Н и В - протовировашов и дейтерярованноа состояния п6птздсн08 грулгг^

тотшй сдвиг (I662-I667CM-1 ). Однако сам факт такого сдвига у отдельно взятых спиралей свидетельствует о том, что он не является результатом сборки третичной структуры бежа, а обусловлен необычной для "нормальной" а-спирали аминокислотной последовательностью.

Полученные при исследовании фрагментов БР спектральными методами результаты означают, что определенные крупные фрагменты этого белка сохраняют ту вторичную структуру, которая им присуща в составе кнтактной цепи, и свидетельствуют о перспективности детального исследования изолированных фрагментов методом ЯМР с последующей реконструкцией трехмерной структуры всей молекулы.

II.ИССЛЕДОВАНИЯ ФРАГМЕНТОВ БР МЕТОДОМ 2D 1Н-ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ

В качестве объектов исследований были взяты пептиды 1-36, I-

-71 и 163-231. ТФЭ оказался непригодным для приготовления образцов из-за сильного уширения сигналов в спектрах 2D 1Н-ЯМР. Поэтому для этой цели Использовали систему СНС13-СН30Н(1:1), 0.1 M LIC104, в которой отдельные фрагменты БР сохраняют по данным 19Р-ЯМР ( Арсеньев, 1987 ) структуру, присущую им в составе ия-тактного БР. Спектроскопия 2D ^-ЯМР позволила исследовать детальную структуру а-сютральных участков в этих фрагментах. В пептиде 1-36 формирование правой a-спирали происходиг на участке 10-32. Имеется значительное подобие структуры изолированного фрагмента 1-36 со структурой этой части полипептидной цепи в составе более длинного пептида' T-7I. В пределах последовательности 163-231 формируются 2 правые достаточно протяженные а-спирали ( рис.5 ) на участках полипептидной . цепи Ala 168- Ile 191 и Азр 202- Arg 227 (24 и 26 а.к. остатков,соответственно ). N- и С-концевые области пептида имеют подвижные конфоркации.

III. ИССЛЕДОВАНИЯ ФГОРСОДЕРЖАЩХ АНАЛОГОВ БР МЕТОДОМ 19Р-ЯМР

с целью установления взаимной ориентации отдельных участков полипептидной цепи БР проведен поиск внутримолекулярных контактов между удаленными, по последовательности бежа аминокислотными остатками. Известно, что селективное введение в белок спиновой метки позволяет определять внутримолекулярные расстояния между спиновой меткой и 19Р-репортерныш грушами. Для этого методом

Œ

)

МИРЕ

(IpNlU-H

<u-

dowli.»-« doht.mi

Им*-

Рис. 5. Аминокислотная последовательность фрагмента 163-231 БР и d-связи. Толщина линий приблизительно соответствует интенсивности кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера. Кружками обозначены d-связи, идентификация которых затруднена. Справа указаны d-связи, ожидаемые для правой регулярной а-сгшрали. Зачерненными квадратами отмечены остатки с амидными связями, медленно обменивающимися со средой. Цилиндры соответствуют а-спиралышм участкам.

19F-iîMP исследованы аналоги БР, полученные с помощью "двойного" мечекия: сначала биосинтезом на средах, содержащих фторированную аминокислоту, в молекулу БР включали атомы фтора (по методике, разработанной в ИБХ им. М.М. Шемякина АН СССР), а затем с помощью химической модификации вводили спиновую метку.

Получение и исследование спин-меченого БР, содержащего остатки. 5-FTrp. БР, содержащий остатки 5-гтгр (Тгр(Р)БР), получали культивированием H.halobtum на средах, содержащих 5-фгортрип-тофан (включение "90-95% ). Для получения селективно меченного спиновой меткой препарата Тгр(Р)БР использована модификация хро-мофорсвязыващего остатка Lys 216.В пурпурных мембранах он защищен ретиналем. Это позволяет провести исчерпывающую модификацию остальных 6 остатков лизина молекулы белка, а затем, после удаления хромофора, селективно ввести необходимую репортерную группу на освободившийся остаток Ьуз 216.

Для блокирования е-ин2-групп 6 свободных остатков лизина использовали восстановительное метилирование ( Абдулаев, 1984 ). Полноту модификации проверяли обработкой метилированного Тгр(Р)БР избытком 1-оксил-2,2,6,б-тетрачетил-Д-изотиоцианатопи-перидина (SL1). Такая обработка показала отсутствие включения каких-либо количеств мотки в молекул!' белка, что свидетельствовало в пользу полного дамотюирования Е-шг~груип всех 6 свободных остатков лизина. Анализ включения метки SI1 проводили методом ЭЛР. Посла восстановительного метилирования препарат был подвергнут фотаиндуцированному гидроксиламинолпзу для удаления ретиналя. Освободившуюся е-Ш^-группу lys 216 модифицировали с помощью SL2. Свободную метку удаляли диализом и центрифугированием. степень модификации остатка Lys 21G 80%) рассчитывали, определяя дол» ^модифицированных е-аминогрушт по концентрации пурпурного комплекс г ( eS6Q=6.3 х -S04 Н~1х см-1 ), образующегося при добавлении ретиналя.

ЭПР-исоледованив метилированного аналога БР, содержащего одновременно нитроксильную и фторсодержащие группы (JSL-Trp(F)EO ) показало, что спиновая метка в системе СЙС13-СН30Н (1:1), 0.1 M 1,1С10Д ( рас. Б ) имеет относительно высокую подвижность (т~5хЮ1° о).

Рис. G. ЭПР-спэктр диметилированного препарата [SLIl-Trp(P)BO в смеси CB30D-CBC13 (1:1), O.IM LiC104, рН 4.Э, 30°С.

Спектры 19F-HMP Trpi?)ВР и его днметииироввнного производного практически идентична (рис. 7).

Рис. 7. Спектры 15Р~ЯМ? производных Тгр(Р)БР в смеси СНСЦ-CD3OD (1:1), 0,1 М ЫС104, pH 4.96: а - 2гр(Р)БР; б - димегали-рованннй Trp(F)BP; в - диметилированный спил-меченый tSL1]-Trp(F)BO, г - tSLI]-Trp(F)BO после добавления аскорбиновой кислоты (2 моля кислоты на I моль белка). .

Сравнение этих спектров со спектром спин-маченого аналога показало,что в спектре последнего сигналы 3 и 7,отнесонные ранее при исследовании немодифицированного Тгр(Р)БР (Арсеньев, 1987) к ос-

56

■ „•II--->-1-—г--в

1.6 1,4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 о м.д.

таткам Тгр(Р) 137 и 138, уширены (уширение ~15 Гц). Восстановление спиновой метки аскорбиновой кислотой вызывает их обужение (рис.7). Данные результаты свидетельствуют о сближенности ( расстояние не более 12 2 ) иминоксильного радикала и остатка Тгр(Р) 137 или 138. Полученное расстояние сопоставимо с моделью взаимного расположения а-спирзльных сегментов в молекуле БР (Энгелглан, Хендерсон,1Э80).

Получение и исследовсише спин-меченого БР, содержащего остатки З-РРТге. Остатки Тгр распределены вдоль полипептидной цепи БР неравномерно и, согласно моделям укладки бежа в мембране, почти все находятся вблизи одной из ее поверхностей (рис. 1). Поэтому информация, получаемая на основе исследования БР, содержащего остатки фтортриптофана, не достаточна для характеристики взаимной ориентации сегментов молекулы. В связи с этим методом 19Р-ЯМР исследован аналог БР,содержащий в качестве репортерных груш остатки З-РРйе ( РЬе(г)БР ). Р'яе(Р)БР (степень включения Р1ш(Р) 20-3056) получали, как и Тгр(Р)БР, с помощью биосинтеза на синтетических средах.

В спектре 19Р-ЯМР Р1ге(Р)БР, солюбилизированного в смеси СНС13~ -СН3ОН (1:1), 0,1м Ъ1С104 (рис. 8,а) имеется 4 отдельно стоящих сигнала ( обозначены цифрами 1-4 ) и группа перекрытых сигналов. Соотношение интегральной интенсивности всего спектра к таковой любого отдельно стоящего сигнала- приблизительно равно 13. Это согласуется с аминокислотной последовательностью БР и свидетельствует о равномерном включении Р11е(Р) в 13 соответствующих положений БР. Наличие в спектре узких (8-12 Гц) сигналов (сигналы 3. 4, 6 или 7 и 2 сигнала из группы 8-11) можно с большой долей вероятности интерпретировать как экспонирсвадаость соответствующих остатков Р11е(Р) в растворитель.

Спектры 19Р-ЯМР Р1ге(Р)БР и соответствующего ретинильного производного Нег-РЬе(Г)БО ( рис. 3,а-в) похожи; наиболее существенным отличием является сдвиг сигнала 2 в сильное поле при восстановлении альдимикной связи.

Для отнесения сигналов 19Г-ЯМР мы воспользовались продуктами расщепления ретинильного производного химотрипсином по связи Р1ге71-С1у72 на фрагменты 1-71 и 72-248,папаином по связи С1у231-Ии 232 с образованием фрагмента 1-231, ЫаВНд по связям С1у 155-

н

8-11

-1-.. I 1 i-1

1,5 : 1.0 0,5 0.0 mg

Рис. 8. Спектры 19F-flMP [3-FPheJBP и его производных в системе CHC13-CD30D (1:1), 0,111 ЫСЮ4: а - Phe(F)BP, pH* 7.25; б-Phe(F)BP, pH* 5.02; в - Ret-Phe(F)B0, pH* 4.9G.

Phe 156 и Arg 164 - Pro 165 на смеси фрагментов I-I55 + I-I64 и 156—248 +165-248.При отнесении сигналов использовали таете фрагменты 1-36 и 163-231 ( см. раздел I "Получение фрагментов").

Расщепление полипептидной цепи слабо влияет на химические сдвиги сигналов остатков Phe(F), за исключением случаев, когда остаток Phe(F) был близок к ыесту расщепления. Анализ спектров 19F-flMP фрагментов ( результаты анализа сведены в табл.4 ) и сопоставление этих спектров со спектром Ret-Phe(F)B0 позволили отнести (рис.9) сигналы 2,3 и 4 остаткам Phe 219,Phe 230 и Phe 27, соответственно.Для остальных сигналов получено отнесение к груп-

Таблица 4. Влияние химической модификации Р1ге(Р)БР и расщепления полипептидной цепи на спектры 19Р-ЯМРа.

( сигнал

образец I 2 3 4 5 6 и 7 8-11 6 12 13

йе1-РЬе(Р)ВО + > + + + + + + + + + +

Нег-Рйе<Р)ВО»(1-231) + > < + + + + + ♦ + + + +

Рйе(Р)ВР-(1-231) + + < + + * + + + + + + +

РЬе(У)ЕР-(1-36) - - - + - - - - - - -

РЬе(Р)БР-{1—71) - - - + - - - - < + - +

йег-РЬе (Р )БО- {72-248) + > + - + + + - - + - +

Иег-РЬе (Р )В0-(1--155)в + - - + + - < + + - + +

Нег-РЛе(Р)ВО-(1-164;) + - - + + - - - + + < + +

йег-РЬе(У)ВО-(156-2ЭД)в - > + - - + + - - - > - -

Ее^РЬй(Р)В0-<165-248) - > + - - + >

РЬе(Р)ВР-(163-231) - < - - ■о •р - - - - - -

Варианты отнесений. 88 21Э 230 2? Х35 Ш 208 154 71 54 156 42 153

сигнала 135 83 208 171: 156 42 154 54 135

. к остатку РЬе 153 153 33

а

В таблице использованы обозначения: "+" - сигнал сохранил характерный для РЬе(?)БР химический сдвиг; - сигнал отсутствует; н<иили ">" - сигнал сдвинулся в слабое или сильное поле, соответственно.

^В 19?-ЯМР спектрах ГЬе(Р)БР и Нег-Р1ге(?)В0 сигналы 8-11 перекрыты и могут рассматриваться как один объединенный сигнал. Тем не менее, используя химические сдвиги сигналов в спектрах фрагментов Р11е(Р)БР,можно упорядочить сигналы в этой группе, приписав находящемуся в слабом поле сигналу меньший порядковый номер.

вДля сигналов 8 и 11 приведены два варианта, так как при расщеплении Еег-РЬе(Р)В0 боргидридом натрия эти сигналы изменили свое положение одновременно..

1В

пан остатков Рйе 171 и 208; Рпе аз, 135 и 153; РЬе 71, 154, 156 и 54 или 42; РЬе 42 или 54.

Рис. 9. Отнесение сигналов в спектре 19Р-ЯМР Ие1;-Р11е(Р)Б0, рН* 4,96. Цифры соответствуют номерам остатков РЬе в аминокислотной последовательности БР (см. рис. I).

Спин-меченый аналог БЬ -Ее1;-Р]1е(Р)Б0 получен в результате химической модификации лиофильно высушенного препарата Р.е^Рйе^во М-(окСил-2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидил)иодацетамвдом (ЗЬ'ТТ) в эфире согласно методике (Цётлин, 1984), приводящей к модификации остатков метиокина в БР.Спектр ЭПР спин-меченого аналога(рис.10) в смеси СНС13-СН30Н (1:1),0.1М Ь1С10Д гомогенен и характерен для спиновых меток с быстрым анизотропным вращением относительно макромолекулы. Сопоставление спектров 193?~ЯМР препаратов -РЬе(Р)Б0 и БЬ:зС1-КеЬ-РПе(Р)БО (рис. 11) показывает, что в спектре последнего произошли существенные изменения: амплитуда сигнала 3 (отнесен нами к остатку РЬе230 ) уменьшилась, а его полуширина увеличилась в 2 раза (ушрение ~ 12 Гц). Изменения произошли в группе сигналов 6 и 7 остатков 171 и 208. Восстановле-

Рис. 10. Спектры ЭПР спин-меченого Ret-Phe(F)EO в смеси CDjOD--СНС13 (1:1), 0,1 М ЫС104, pH* 4,97 , 30° С.

8-11

10 0:5 0,0м д

Рис. 11. Спектры 19У-ЯМР ИеЪ-РЬе(Р)БО и его спин-меченых производных в смеси СНС13-СЮ30В (1:1), 0,1М ЫС104: а - 11е1;-Р11е(Р)Б0, рН* 4,96;б-спин-меченый Йе1;-(Р)Б0 ([БЬ113-Пе 1-Р1ге(Е )Б0 ,рН* 4,97.

ниа нитроксильного радикала в SLi;r-Ret-Phe (F )БО аскорбиновой кислотой приводит к обучению сигнала 3 до величины, сопоставимой с шириной сигнала 3 в спектре Ret-PUe(F)EO.Следовательно, изменения в спектре спин-меченого образца обусловлены взаимодействием неспаренного электрона нитроксильного радикала с ядрами фтора.

Для локализации спиновой метки в аминокислотной последовательности получен радиоактивный препарат [14C]SLi;r-Ret-Phe(F)B0 (содержание метки ~ 0,9 моля метки/моль белка). Локализация проведена на основании сопоставления удельных радиоактивностей фрагментов, полученных при трех типах расщепления [14C]SbTI-Ret--(F)BO: химотрипсином, протеиназой V8 и NaBH4. После расщепления химотрипсином радиоактивного препарата на фрагменты I-7I и 72-248 ~80% радиоактивности найдено во фрагменте 72-248.Это означало, что остатки Met 20, 32, 56, 60 и 68 не подверглись существенной модификации . Протеиназа V8 полностью расщепляла [14C]SLJI-Ret-(F)Б0 на фрагменты I-I66 и 167-248, из которых только фрагмент I-I66 был радиоактивным, т.е. единственный во фрагменте 167-248 Met 210 модификации не подвергается. Из сопоставления полученных данных с аминокислотной последовательностью БР следует, что метка находится на участке полипептидной цепи 72-166, содержащем 3 остатка Met (Met 118, 145 и 163). После трехкратной обработки [14G]SLix-Ret-Phe(F)BO с помощью ЛаВНд и галь-фильтрации радиоактивность распределилась поровну между фракциями BI и В2, которые представляют собой, соответственно, экви-молярные смеси пептидов (I-I55 + I-I64) и (156-248 + 165-248). В свете представленных выше данных радиоактивность фракции BI • может быть обусловлена любым остатком Met 118, 145 или 163, тогда как радиоактивность фракции В2,с учетом отсутствия радиоактивности во фрагменте 167-248, убедительно свидетельствует о модификации Met 163.Поскольку исходное содержание меток ~0,9 моля/моль белка,а однородное уширение сигнала Phe 230(рис.11) и гомогенный характер спектра ЭПР(рис.Ю) указывают на полную модификацию одного остатка Met, можно сделать вывод, что модифицированным остатком является Met 163.

Расстояние между наспаренным электроном спиновой метки Met t63 и ядром фтора остатка Phe 230 рассчитано по уравнению Соломона-Бломбергена и равно 12-14 8. Качественно оно согласуется с мо-

делью пространственной структуры белковой цепи БР в мембране: Ме1. 163 и Р1ге 230 экспонированы на одной стороне мембраны (рис.1) и находятся в соседних по аминокислотной последовательности а-спмральшх ткжах. ,

Совокупность представленных выше донных подтверждает наличие у БР в использованной нами системе органических растворителей специфической трехмерной структуры, близкой к структуре нативно-го БР.Полученные результаты также означают, что селективное введение во фтор-меченые преизводныз БР спиновых меток по другим остаткам пэлипептадаой цени и определение расстояний позволят установить взаимную ориентацию траксмемОраншх фрагментов БР. Совместно с данными 2Ъ 1Н-ЯМР о конформации последних, эта информация должна, привести к установлению полной пространственной структуры БР в растворе.

вывода

1. На примере бактериородопсина показана принципиальная возможность выяснения пространственной организации полипептидной цепи мембранного балка в системе органических растворителей, моделирующих мембранное окружение, путем анализа отдельных крутых фрагментов и последующей реконструкцией целой молекулы на основе определения расстояний между группировками, принадлежащими разным фрагментам.

2. с использованием химической и ферментативной деградации в препаративных количествах получена серия фрагментов бактериородопсина.

Методами КД- и ИК- спектроскопии показано, что в трифтоэтано-ле доминирующим типом вторичной структуры в крупных фрагментах бактериородопсина является а-сштоаль.

Получено экспериментальное подтверждение возможности образования а-спиралънкх фрагментов теш участками полипептидной цепи, которым на профиле гидрофобности бактериородопсина отвечают протяженные гидрофобные зоны.

3. Методом 22 1Н-ЯМР в системе СНС13-СН30Н/ИС10Д установлено,

что расположение а-спиральных участков во фрагментах 1-56,1-71 и 163-231 и юг. относительное содержание согласуются с моделью топографии бактеруородоясана и данными КД.

4. С помощью биосинтеза и химической модификации получено производное бактериородопсина, содержащее остатки фтортриптофана и спиновую метку на остатке Lys 216. Методом 19?-ЯМР показано, что наиболее близко к спиновой метке находится остаток Тгр 137 или 133 ( R < 12 S ).

6. Исследованы спектры 19Р-ЯЫР биоеинтетического производного бактериородопсина, содержащего остатки 3-FPhe. Показано, что крупные фрагменты,как правило, сохраняют пространственную структуру, которую они тлеют в составе штатной полипептидной цепи. Получено производное, содержащее спиновую метку на остатке Met 163, и определено расстояние до ближайшего остатка Phe 230 ( R ~ 12-14 2 ).

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Kozhich А.Т., Sychev S.V., OvechKina (Абдулаева) U.V. Spectral studies of baateriorhodop3ln fragments and their relevance to its secondary structure. Peptides.Structure and. Fun-otion. Proceedings of the Ninth Anerioan Peptide Symposium (Eds. C.M.Deber, V.Y.Hruby, K.D.Kopple), Pierce Chemical Company, Rookford, Toronto, 1985, p.895-698.

2. Абдулаева Г.В., Сычев С.В., Цетлин В.И. Исследование спектральных свойств трансмембранных фрагментов бактериородопсина в модельных системах. VII Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Таллин, 1987, тез. докл., с. 15.

3. Абдулаеза Г.В., Сычев С.В., Цетлин В.И. Вторичная структура бактериородопсина и его фрагментов в модельных системах по данным КД- и ИК- лтектрсскогми. - Биологические мембраны,1987, Т.4, N 12, С. 1254-1268.

4. Абдулаева Г.В., Сычев С.В., Цетлин В.И. Спектральные исследования бактериородопсина и его фрагментов в модельных систе-

мах. v Советско-швейцарский симпозиум "Биологические мембраны: структура и функции", Рига, 1988, тез. докл., с.85-

5. Arseniev A.S., Sobol A.C., Äbdulaeva G.V., BaTBUkov 1.1., Kozhloh А.Т., Maslennikov I.V., Bystrov V.P. NMR study of baoteriorhodopsin spatial structure. VII USSR-FRG Symposium on Chemistry of 'peptides and Proteins, Dilizhan, 1989, Abstraots, p. 9.

6. Arseniev A.S., Sobol A.G., Maslennikov I.V., Äbdulaeva G.V., Barsukov I.L., Byetrov V.P. High-resolution HMR approaoh to spatial struoture of baoteriorhodopsin. 18 Annual UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology(colloquim "Frontiers of NMR in moleoular biology").Park-City,1989, Abstraots,p.37.

7. Arseniev A.S., Sobol A.G., Maslennikov I.V., Äbdulaeva G.V., Kozioh A.T..Bystrov V.P.Hight-resolution NMR approaoh to вра-tial struoture of baoteriorhodopsin. XIII International Conference on Magnetic Resonanoe In Biological Systems, Madison, 1988, Abstracts, p. 19-6.

8. Barsukov I.L., Äbdulaeva G.V., Arseniev A.S., Bystrov V.P. Sequence speoifio 1H-NMR assignment and conformation of proteolytic fragment 163-231 of baoterioopsin. - Eur.J.Bioohem. 1990 , v. , N , p

T-11031 от 16.07.90.г,Ферм.изд.60X84 1/16.

Объем 1,5 п.л.Зак.124/у.Тир.100.

/ 1Ш"Пвчаяник"Айосгорпечавь.Н.Краснохолмская д.!