Исследование протеиназы А и её ингибитора из семян хлопчатника тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

и б 0/1

" 8 ОКТ Щ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА САДЫКОВА А. С.

На правах рукописи

МЕЖЛУМЬЯН ЛАРИСА ГАЙКОВНА

УДК 577.156

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕИНАЗЫ А И ЕЕ ИНГИБИТОРА ИЗ СЕМЯН ХЛОПЧАТНИКА

1

02.00.10. — Био^пганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕ PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТАШКЕНТ — 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамен»: Институте химии растительных веществ АН РУ.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор ЮЛДАШЕВ П. X.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

профессор АЗИМОВА Ш. С.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник САГДИЕВ Н. Ж.

Ведущая организация; Институт биохимии АН РУ.

Защита состоится « 1996 г. в /в »

на заседании специализированного совета Д 015.21.01 при Институте биоорганической химии имени академика Сады-кова А. С. АН РУ (700143, Ташкент, ул. X. Абдуллаева, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБОХ АН РУ.

Автореферат разослан «

/9 » 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор химических наук, профессор БАРАМ Н. И.

Актуальность исследования. Исследование протеолитических Фер-

ментов в растении представляет интерес в связи необходимость» выяснения закономерностей процессов нетаболизма белка. Прорастание семян характеризуется быстрой мобилизацией запасных веществ, в частности запасных белков. Участие протеолитических Ферментов в этом сложном, многоступенчатом процессе очевидно. Вопросы, связанные с изучением протеолиза запасных белков, представляют значительный интерес, т. к. эти белки служат источником азотистых соединений для растений на начальных этапах прорастания.

Однако, несмотря на большое число работ, посвященных изучению распада запасных белков семян растений при прорастании, до сих пор остается неясным, какие протеолитические ферменты и в какой последовательности участвуют в этом процессе, и каковы механизмы его регуляции. Нет единого мнения и о том, какая протеиназа инициирует протебЬиз: присутствующая в покоящихся семенах или синтезируеная de novo в процессе прорастания.

Проблема иммунитета растений к болезням также принадлежит к числу наиболее интересных и сложных биохимических проблем. Известно, что растения способны противопоставить возбудителям болезней целую систему зашиты, названную Вавиловым "суммой из множества слагаемых". Все копмоненты этой суммы переплетены и взаимно дополняют друг друга. Это и высокоспениФичрские ингибиторы пгстеиназ, и антибиотические вещества типа Фитоалексинов, и лектини. участвующие в процессах распознавания растением патогена, и многие другие.

Поскольку ингибиторы протеиназ являются одним из важных компонентов естественной защитной системы растений от вредных насекомых и патогенов, то в настоящее время начаты работы по переносу генов ингибиторов протеиназ для.получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к грибам и вредителям.

Цель и задачи исследования, основной целью настоящей работы

явилось выделение и изучение сериновой протеиназы А покоящихся семян хлопчатника и ее роль в протеолизе глапкого запасного белка семян хлопчатника - ИЭ глобулина при прорастании, а также исследование собственного ингибитора протеиназы А. В соответствии с этим были поставлены и решались следующие экспериментальные задачи:

- выделение и очистка сериновой. протеиназа иэ покоящихся семян хлопчатника;

-изучение Физико-химических свойств, субстратной специфичности выделенной протеиназы А;

- выделение и характеристика высокоочишенного препарата ингибитора протеиназы А. изучение его свойств, изменение активности при прорастании и влияние на протеолитические Ферменты Фитопатоге-на - УеШсППша <1аЫ1ае.

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна определяется следующим: впервые из семян хлопчатника получен гомогенный Фермент - сериновая протеиназа А, изучены его физико -хинические свойства, субстратная специфичность и сделано заключение о возможной Физиологической роли Фермента. Установлено, что протеиназа А осуществляет ограниченный протеолиэ главного запасного белка семян хлопчатника - 11Б глобулина на первой стадии его деградации при прорастании семян.

Из покоящихся сенян хлопчатника получен новый гомогенный белок - ингибитор собственной протеиназы А. изучены его свойства, изменения активности при прорастании, высказано предположение о возможной Физиологической роли ингибитора.

впервые показано, что покоящиеся семена хлопчатника содержат белки, способные ингибировать активность протеолитических Ферментов Фитопатогена - т/елюиишп азЬИае.

Проведенные исследования позволили сделать заключение о том, что в покоящихся семенах хлопчатника существует регуляторная система "протеиназа-ингибитор-субстрат", контролирующая начальный этап протеолиза главного запасного белка-ив глобулина при прорастании семян.

Впервые разработан количественный иммунохимический метод определения вилтоустойчквости новых селекционных сортов хлопчатника. Метод основан на анализе содержания ингибитора протеиназы А в- семенах хлопчатника реакцией иммунопреципитании. Показано, что устойчивость хлопчатника к заражению патогеном Еертиииллиум прямо пропорционально зависит от количественного содержания в семенах ингибиторов протеолитических Ферментов.

■ Выводы диссертационной работы о существовании в семенах хлопчатника регуляторной системы "протеиназа-ингибитор-субстрат" имеют значение для детального обоснования механизмов протеолиза.

Изучение функциональных свойств ингибиторов протеиназ в семенах хлопчатника, основанное на установленной взаимосвязи содержания ингибиторов и вилтоустойчивости, позволяет однозначно говорить о вполне определенной роли ингибиторов в механизмах зашиты растений.

Апробация работы, основные положения диссертационной работ!

были доложены и обсуждены на II Всесоюзной симпозиуме . по химии

протеолитических Ферментов (Углич, 1979); на Всесоюзном симпозиуме

по химии белка (Тбилиси, 1990); на V Международном симпозиуме по

вертшшллиуму (Ленинград. 1990); на IX всесоюзном совещании по им-

о

мунитету растений к болезням и вредителям (Нинск, 1991): на IV Международном симпозиуме "Protein structure Function Relationship" (Карачи, Пакистан, 1995).

Публикации. По натериапаи диссертации опубликовано 14 печат-

ных работ в виде статей и тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 94 стра-

ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, экспериментальной части, выводов, списка литературы. (140 источников). Работа иллюстрирована 5 таблицами. 16 рисунками и 1 схемой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и свойства серяновой протеиназы

из покоящихся семян хлопчатника.

Разработанная нами схена выделения и очистки протеиназы А включала: экстракцию обезжиренных сенян о,1 м фосфатным буфером рн 7,4, осаждение белка сернокислын аммонием при бо г - ном насыщении, обессоливание диализом, ионнообменкую хронатограФию на колонке с КН-' и ДЭАЭ-целлюлозой. Протеолитическую. активность полученного Фернента устанавливали по методу Ансона, используя в качестве субстрата азо-казеин. Протеолитическую активность определяли при 20и, 40и, бох и 80* осаждении сульфатом аммония. Максимальная прбтеолитическая активность была обнаружена при бои-ном осаждении. ;Для дальнейшей очистки использовали колоночную хроматографию на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах. Хроматография и рехроматография на КМ-целлюлозе. уравновешенной 0,01 н апетатнын буфером (рН 5,4),-дала возможность сконцентрировать суммарный белок, а также провести хроматограФирование (рис. 1). при электрофорезе после хроматографии на кн-целлюлозе, обнаруживали примеси (белки) кислого характера... Поэтому далее Фермент хроматограФировали на дэаэ-аеллоло-

- б -

Рис. 1. I - ионообменная хроматография протеиназы А семян хлопчатника на колонке (5x35 си) с км-пеллюлозой, рН 5,4: 1- белок; 2- протеолитиче екая активность. II - рэхроматограФия протеиназы А семян хлопчатника на колонке (2,5x14 сн) с км-целлххдозоя, . рН 5,4

зе, уравновешенной 0,001 К фосфатным буферон (рН 7,4). При этих условиях белок сорбировался узкой полосой и при наложении линейного градиента от 0 до о, 2 и Nací выливался во второй фракции, совпадающей с пиком активности (рис. 2). Кроме того, ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-пеллзолозе достигнуто отделение пигментных

О 20 40 60

Рис. 2. Ионообменная хроматография протеиназы А семян хлопчатника на колонке (1.5x14 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, РН 7,4: 1 - белок; 2 - протеоли-тическая активность.

примесей. Результаты всех этапов очистки приведены в таблице 1. Гомогенность очищенного Фермента (выход О, 2И) устанавливали электрофорезом в полиакриланидном геле в присутствии ддс-На и методом изоэлектрофокусирования в борат-полиольной системе. Иэоэлектри-ческая точка протеиназы а - р1 равна 4,9.

Молекулярну© массу Фермента определяли методой гельФильтрашш через колонку с сефадексом С-200, откалиброванную белкани-иетчика-

ми с известной нолекулярной массой, для протеазы А молекулярная масса определена 60 кда.

Диск-электрофорез полученного Фермента в 7,5х геле при рН в.9 в присутствии ддс-На и в н ночевины давал 2 интенсивные полосы. Следовательно, нолекула Фермента состоит из двух субьединиц с молекулярной массой 40 и 20 кда. условно названных нами X ~ и , которые связаны между собой дисульФидным мостиком. Для препаратив-

Таблипа 1.

Данные по выделению и очистке сериновой протеиназы А из семян хлопчатника

Этап очистки Объем (нл) Общий белок (нг) Активность обшая (ед) удельная (ед> Выход, х

по белку по активности

1. Экстракт 0,1 К ФосФ. бУФер, рн 7.4 1500 6000 24000 4 100 100

г. Осаждение сульфатом аммония (60-/.) 150 1748 20970 12 29 87

3. Хроматография на КН-пеллюлозе 100 200 11200 56 3. 3 46

4. РехронатограФия на КН-целлюлозе 60 52.5 4305 82 0.87 18

5. Фракционирование на ДЭАЭ-" целлюлозе 20 12 • 1224 102 0.2 5.0

ного разделения субьединип ны использовали гельфильтрапию через колонку с сефадексом Е-50 (рис. 3). Чистоту полученных ¿С и^-субь-единип проверяли методом электрофореза в ПААГ и определением Н-конпевых аминокислот. Дансильным методой установлены н-конпевые аминокислоты: для -субъединицы - аспарагиновая. для ^ - глута- ■

миновая кислоты. С-концевые аминокислоты определяли гидразиноли-зом. В качестве с-конпевых аминокислот протеиназы А идентиФипиро-

260

О, в О. 7

О. 5

0.3

О. 1

С—л_■_■_■_I_1_

го

ад

60

во н Фракции

Рис. 3. Гель-хронатограФия восстановленной и карбоксинетили-рованной протеиназы А на колонке (1,5x95 см) с сефадексом 6-50.

ваны аргинин и гистидин. Для Фермента и полученных субьединиц определены аминокислотный и углеводный составы (таблица 2). Углевод! обнаруживали только в -субьединипе.

Дальнейшее сравнительное изучение протеиназы А и ее субьединиц продолжили методом пептидных карт (рис. 4). Как видно и: рис. 4. пептиды были кислого, нейтрального и основного характера, и было получено меньше пятен, чем ожидали получить. Увеличена вренени гидролиза не влияло на количество пептидов, следовательно е этих условиях некоторые связи основных аминокислот в молекул Фермента устойчивы к действию трипсина. Возможным объяснением-дан ного Результата может служить образование "коровых" пептидов.

Для энзиматической характеристики выделенного Фермента опре деляли тенвературный (35 - 40° С) й рН-оптимумы (6.4-7,4) действи протеиназы. Оптимум активности Фермента по расшеплению эндогенног субстрата - иг глобулина обнаружен при рН 6,4-7,4. Это значени близко к величине рН оптимума сериновых протеиназ семян гречихи семян вики, следует отметить, что для многих изученных сериновы протеиназ характерен гН оптимум от 6 -7, 5.

для выяснения природы функциональных групп активного иента выделенной протеиназы проводили ингибиторный анализ. Было показа но. что фермент не активировался сульфгидрильными реагента* (цистеин и ^ - меркаптоэтанол) и не ингибировался п-хлормерю ркбензоатом. что исключает его принадлежность к труппе тиоловь протеиназ. Протеиназа А не ингибировапась ЭДТА и теряла активное*]

Аминокислотный и углеводный составы протеиназы А и ее субьединип из семян хлопчатника

Аминокислоты СУбъединипы

(моль/моль белка) протеиназа А

' >

Аспарагиновая

кислота зт 18 18

треонин 35 21 15

Серии 49 31 15

Гдутаминсвая •

кислота 96 54 25

Пролин 46 26 ■ 18

Гдилин 39 15 20

Алании 60 34 25

цистин 2 1 . 1 .

Валин 25 12 15

Нетионин б 2 4

Изолейдин 22 12 8

Лейцин 40 27 15

тирозин 19 И 9

Фенилаланин 27 17 9

Гистддин 5 г 2

лизин 13 9 7

Аргинин 30 16 12

Углеводы Соотношение моносахаров + . -

Арабиноза 8 а

Ксилоза 4 4

Нанноза 1 1

Галактоза 1 1

Глюкоза 3

Сумма моносахаров-

10 - 12Х ....

в присутствии диизопропилфторфссфата. таким образом, полученные данные по влиянию ингибиторов на активность изучаемого Фермента

указывали на его принадлежность к трипсиноподобнын сериновын про-теазам.

Изучение субстратной специфичности выделенного Фермента дока-

а ¿о О

"'О О

О ♦ о О ОсГ

электроФорез

Рис. 4. Пептидные карты востановленной и карбоксиметилирр-ванной протеианазы А (а),^- (б) и ^ ~ субъединицы (в).

зало, что он не обладает карбоксипептидазной активностью в отношении синтетических пептидов карбобензокси-глидил-тирозин, карбобен-зокси-аланил-валин. карбобензокси-глутамил-глшшн. а также амино-пептидазной активностью по" отношению к наФтиламидолейцину. что позволило отнести Фермент к эндопептидазам.

Данные по субстратной специфичности были дополнены результатами имнунохимического анализа, часто используемого для определения структурного сходства гомологичных белков. С целью обнаружения обпшх структурных элементов протеиназы А и трипсина проводили двойную иммунодиФФузию между трипсином и антисывороткой к протеи-назе А. Образование полос преципитации сведетельствовало о присутствии общих структурных элементов у протеиназ.ы а и трипсина, что служило дополнительным доказательством того, что протеиназа А - тридсиноподобный Фермент.

Известно, чтр критерием- участия протеиназы А в распаде запасных белков, является ее способность . гидролизовать последние.

Методом тонкослойной хронатограФии нами было установлено, -что про-теиназа А действует на нативные запасные белки - 7s и lis глобулины. в результате чего происходит ограниченный протеолиз глобулинов, и лишь после соответствующей модификации последние подвергаются полной деграданид другими Ферментами, иными словами, протеи-наза А является иниаиируюшин гидролиз Ферментом.

При определении содержания lis глобулина в прорастающих семенах хлопчатника, используя метод Лоури, мы выявили его снижение уже в первые 24 часа прорастания (рис. 5);

С делью получения дополнительных данных мы провели злектроФо-ретические исследования lis глобулина в ПААГ. Исследовали lis гло-

Рис. 5. Содержание 11S -глобулина в прорастающих семенах хлопчатника.

булин с 1 по 13 день прорастания, а также lis., обработанный проте-иназой А (рис. б).

Как видно из рисунка 6, при электрофорезе lis глобулина из

— « mm ЯК- Щ * ШЬ 777И

- двя та. «V

I'liii nut 8S2?

а б в г д е ж з и

Рис. 6. электрофореграмны препаратов ИБ глобулина из покоящихся (а), обработанных протеиназой А (б), и прораставших в течение 1-го (в). 3-х <г>, 5-ти (дК 7-ки (е), 9-ти (ж), И-ти (з) и 13-ти (и) дней семян.

покоящихся семян хлопчатника, обработанного протеиназой А, и препарата US глобулина, выделенного из семян хлопчатника, в 1-й и 3-й дни прорастания, получились сходные картины, эти результата можно рассматривать как доказательство предположения о тон, что протеиназа А является инициирующим Ферментом в процессе прорастания семян. Ограниченный характер протеолиза подтвержден также отсутствием изменений в злектроФореграмме в случае увеличения количества добавляемого Фермента и вренени инкубации.

Кроме того, из результатов электрофореза видно, что после 5-го дня прорастания наблюдается исчезновение высокомолекулярных фрагментов растепления lis глобулина и появление низкомолекулярных. Такие же результаты изненения молекулярных весов были получены при ультрапентрифугирований обработанного протеиназой a lis глобулина из покоящихся семян хлопчатника (67 кДа) и 11S глобулина из одно-, трех-, пятидневно пророшенных семян хлопчатника (67 кДа, 63 кда и 35 кДа соответственно). Особенно хотелось отметить совпадение молекулярных масс 11S глобулина из покоящихся семян хлопчатника, обработанного протеиназой А, и 11S глобулина из однодневно-пророшенных сенян хлопчатника (67 кДа).

Используя метод иммунохимического анализа, электрофореза и ультрапентрифугироеания. мы установили, что гидролиз lis глобулина начинается почти одновременно с началом прорастания, протеиназами, присутствующими в покоящихся семенах, и завершается в первые 4-5 дней прорастания, при этом первые 3 дня происходит только ограниченный гидролиз запасного белка. Таким образок, нами из семян хлопчатника сорта т-l выделен гомогенный Фермент - протеиназа А, разработана схема ее выделения, и очистки. Показано, что протеиназа А гидролизует ссобственные запасные белки семян хлопчатника 7S и lis глобулины, подвергая их первичной, модификации путем ограниченного протеолиза.

2. Выделение и изучение ингибитора сериновой

протеиназы А из семян хлопчатника.

Интерес к специфическим белковым .ингибиторам из растений, действующих на протеазы микроорганизмов, в значительной мере связан- с той важной ролью, которую эти белки играют.в регуляции процессов протеолиза. а также защите растения от поражения Фитопато-генныни микроорганизмами. Было показано, что в семенах Фасоли содержатся белковые ингибиторы протеаз. подавляющие активноеТ1 трипсина, химотрипсина и лротеаз м;1КРОбного происхождения. Кроме

того, ингибиторы микробных протеиназ были выделены из некоторых других растений - ячменя, кукурузы, пшеницы.

В последнее время появились работы о взаимодействии ингибиторов с собственными протеолитическими Ферментами. Такая' способность подавлять активность собственных протеаз была выявлена у ингибиторов протеаз из Фасоли, пшеницы и сои.

В ходе нашей работы были получены данные о существовании в покоящихся семенах хлопчатника ингибитора, подавляющего активность исследуемой нами сериновой протеиназы А. В связи с этим представляло интерес выделить этот ингибитор из сенян хлопчатника и изучить его физико-химические свойства.

В процессе работы нани была . разработана схема выделения и очистки ингибитора, " которая включала следующие1 этапы: экстракцию обезжиренных семян 0.05 м трис-НС1 буфером рн 8,0. аффинную хроматографию на колонке с протеиназой А - сеФарозой 4В, гельФильтрацию через колонку с сеФадексом G-150.

Электрофорез в Ю'/.-ном полиакриламидном геле при рН 8, 3 давал одну белковую полосу, что свидетельствовало о гомогенности выделенного белка. Этот препарат подавлял активность протеиназы А, а так*- ингибировал активность трипсина. По данным ультрацентрифугирования, гельфильтрации на колонке с сеФадексом G-150 молекулярная масса ингибитора составляла 22 кДа. Рассчитанное значение молекулярной массы при электрофорезе в полиакриламидном геле составляло го кДа. Опыт по инактивации пепсином подтверждал, что ингибитор имеет белковую природу. Далее был изучен аминокислотный состав выделенного ингибитора. Данные приводим в таблице 3. для сравнения приведен состав ингибитора Кунитпа из сои. видно, что по молекулярной массе и по составу они близки, каждый из «их содержит по 2 остатка метионина и не содержит остатки цистеина.

Для изучения сУбьединичной структуры белок подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии в н мочевины. ДДС-натрия после обработки^- меркаптоэтанолом. При зтон на злек-троФорегранме проявились две полосы, соответствующие белкам с молекулярной нассой 12 кДа и 8 кДа. Из этих данных следует, что молекула состоит из • 2-х субьединиц с различными значениями молекулярной массы. Остатки иистеина не были обнаружены при анализе аминокислотного состава, что свидетельствало о тон, что отдельные субьединшш в молекуле белка не могут быть соединены дисульфидными связями. Пептидные карты нативной и KH-нолекулы были идентичны, что подтверждает отсутствие S-S ностиков в молекуле. Высокое содержание аспарагиновой и глутаминовой . кислот, а также ароматических и гидрофобных аминокислот, позволяет предположить, что взаимодействие между отдельными субъединицами осуществляется в ре-

аминокислотный состав ингибитора протеиназы к из семян хлопчатника

Аминокислота (моль/моль белка) ингибитор протеиназы А Ингибитор Кунитаа

Аспарагиновая кислота 26.62 (27) 26

Треонин 10.7 <11) 11

серин - -

Глутаминовая кислота 36.3 (36) 18

Пролин 12.9 (13) 10

глишш 10.7 <11) 10

Алании 8,7 (9) 8

Цистин - ■ • -

•Валик 8, 9 (9) 14

Кетионин 2 2

Изолейцин 4.05 (4) 14

Лейцин 10,5 (11) 14

Тирозин 4. 5 (5) 4

Фенилаланин 10.6 (11) 9

Гистидин 4, 9 "(5>- 2

Лизин 6.32 (б) 10

аргинин 6. 1 (8) 9

зультате ионных и гидрофобных взаимодействий.

Изучение действия ингибитора на протеолитическую активность белков верпшиллиума показало, что протеолитическая активность подавлялась практически полностью.

Таким образом, из покоящихся семян хлопчатника был выделен белковый ингибитор протеолитического Фермента -сериновой протеи-пазы А. На основании изученных свойств ингибитора - молекулярно? массы, особенностей аминокислотного состава, характера действия на трипсин, выделенный белок может быть отнесен к группе высокомолекулярных ингибиторов протеиназ типа ингибитора кунитца.

3. функциональные свойства ингибитора сериновой

протеиназы А из сенян хлопчатника.

В связи с обнаружением ингибитора в семенах хлопчатника дальнейшая работа была посвяшена выяснению, с одной стороны его воз

ножной защитной Функции в растении от поражения вилтом. с другой стороны, в регуляции активности сериновой протеиназы А; инициирующей протеолиз главного запасного белка, в процессе прорастания семян хлопчатника.

Известно, что при внесении в питательную среду ингибиторы угнетают процесс прорастания спор и развития мицелия. В нашен случае в контрольных колбах в отсутствие ингибитора рост гриба был интенсивным. В колбах, где проращивание вилта вели в присутствии ингибитора протеиназы А. практически не наблюдался рост грибницы. Этот результат и тот факт, что ингибитор протеиназы А подавлял протеолитическую активность белков вертициллиума. в совокупности с литературными данныни по Физиологической роли ингибиторов протеи-наз позволили нам предположить, что ингибитор протеиназы А играет важную роль в защите растений от поражения вилтом.

Кроме этого, ны провели сравнительное исследование содержания ингибиторов вилтоустойчивого и восприимчивого сортов семян хлопчатника. В результате были установлены принципиальные различия в содержании ингибиторов у семян' здоровых и инфицированных растений двух сортов, контрастных по степени устойчивости к вертиичллезному вилту. Нами были выявлены резкие различия в соотношении белка и липидов. Суммарная ингибируюшая фракция (СИФ) здорового устойчивого сорта была в 1,7 раза больше суммарного белка по сравнению с СИФ восприимчивого (таблица 4). .Что касается содержания суммарных липидов, то обшии для двух сортов является снижение липидов под влиянием еилтовой инфекции.

В связи с вышеизложенным, нами разработан иммунохимическия метод оценки устойчивости хлопчатника к этому грибу, т. е.' ны воспользовались наиболее чувствительным методом анализа для количественного определения ингибитора протеиназы А в вилтоустойчивом и восприимчивом сортах.

Для этого было проведено выделение ингибитора протеиназы а из вилтоустойчивого сорта 175-Ф, а также выделение СЯФ из имевшихся з нашем распоряжении сортов хлопчатника Т-1, Т-б, С-4727, 175-Ф и из восьми селекционных, образцов семян хлопчатника, предложенных нам Институтом селекции и семеноводства. Были получены сыворотки к ингибиторам протеиназы А из сорта 175-Ф, а также к СИФ из этого вилтоустойчивого сорта.

Принцип метода инмунопреципитации заключается в следующем: исследуемый белковый антиген, диффундируя из лунки, образует в агаровой геле, содержащем моноспецифические антитела, преципитат в виде кольца, диаметр которого пропорционален концентрации этого антигена, с помощью микроденситометра измеряли диаметры колец со стандартными растворами ингибиторов из сенян сорта 175-ф, т-б.

состав суммарной ингибирлошей фракции ядра сенян здорового и инфицированного хлопчатника двух сортов (нг/г а. с. в.)

Компонента Сорт 175-Ф . Сорт С-4727

I II I II

липиды: а) связанные б) прочносвязанные в) остаточные 100'. 0 285.7 100,0 107, 1 200, 1 100. 0 94.3 33, 3 625,0 431.4 20,0 250,0

суммарные 485. 7 407.2 752,6 ' 701,4

Белки: а) гидролизованный б) негидролизованный 71,4 257. 1 100.0 300.0 166,7 20, 0 164,7 13,2

Суммарный •328,5 400, 0 186.7 177, 9

^липидов Соотношение - ]$£белка 1. 48 1.02 4.03 3. 84

Т-1. с-4727 (рис. 7). Затем строили график зависимости этих вели-

\ 5 б Т 3

Ьнс. т. Реакция кольце преципитации.

чин (ни) от концентрации раствора (рис. 8). Измерив диаметры пре-дипитадионных колец восьни исследуемых образцов, с помощью полученной калибровочной прямой ны определяли концентрацию анализируемого белка. По содержанию ингибитора протеиназы А расположили восемь Образцов в ряд устойчивости.

Кроме метода кольпепреципитадии существует более чувствительный метод, метод градиента концентрации антител по Фейнбергу. Наибольшее разведение антигена, при котором еше наблюдается реакция преципитации, является его титром, в нашем случае для пораженных

ч

60 -

40

го

66 - IV/

—. ■" ♦

50 и У

/

10

15 О. им

Рис. 8. Зависимость диаметров колеи от концентрации

ингибитора (1-04727. 11-Т-6. 111-Т-1. 1У-175-?>)

семян титр в сорте т-1 равен 1/1024, а в случае С-47Е7 - 1/64 (рис. 9). Это говорит о том. что в устойчивых сортах наблюдается резкое увеличение содержания ингибитора в ответ на поражение.

разработанный нами иммунохимический метод оценки устойчивости хлопчатника однозначно подтверждает зависимость устойчивости растения к вилту от количества ингибиторов, синтезируемых в нем в ответ на внедрение патогена. Кроме того.' результаты разработанного нами количественного метода получили положительную опенку у селекционеров и могут быть использованы для ускорения селекционных исследований по выявлению устойчивых сортов к данному патогену.

Из литературных данных известно; что протеолитические Ферменты и запасные белки семян хлопчатника локализованы в белковых телах. Локализация сериновой протеиназы А. ее природного субстрата -115 глобулина и ингибитора протеиназы А в белковых телах указывает на возможность существования в сененах хлопчатника регуляторной системы "протеиназа - ингибитор - субстрат", играющей важную.роль в утилизации запасных белков при прорастании.

Наличие регуляторной системы в семенах хлопчатника" подтверждается также данными но изменению протеолитической активности и

,с"0^-/0.....

.о **

л-т-1 (1/1024)

'512

1-С-4727 (1/64)

Рис. 9, Раститровка исследуемого антигена .(1-С-4727, 11-Т-1)

активности ингибитора во время прорастания семян хлопчатника. Уве личение протеолитической активности к первому дню прорастания кор релирует с уменьшением активности ингибитора (рис. Ю). Исслэдова кия протеинам растений на различных объектах латуке, горохе, ячме не, кукурузе показало общую закономерность в изменениях их актив ностей при прорастании. Было отмечено, что падение активности ин гибитора коррелирует с повышением активности эндогенных протеиназ

П. А.

100 80 60 40 20

1

Дни прорастания

Рис. Ю. Изменение протеолитической активности протеиназы А (I) и ингибитора (II) в процессе прорастания семян хлопчатника.

По-видиному, в покоящихся семенах хлопчатника протеиназа находится в виде неактивного комплекса-с ингибитором. При измене

яии физиологических условий в начале прорастания комплекс распадается и протеиназа А подвергает ограниченному протеолиэу US глобулин.

В результате проведенного исследования в семенах хлопчатника обнаружен ингибитор протеиказы А, подавляющий активность протеиназ гриба Verticil Hum daiiliae. Кроме того, выявлено увеличение содержания исследуемого ингибитора в ceMenàx устойчивых сортов в ответ на поражение вилтон. Эти данные, на наш взгляд, являются существенным доказательством Факта участия белковых ингибиторов в формировании вилтоустойчивости хлопчатника.

выводы

1. Из покоящихся семян хлопчатника сорта Ташкент-1 выделен гомогенный препарат - сериновая протеиназа А, разработана схема выделения и очистки фермента, определена его молекулярная масса 60 кДа, рн - оптимум действия б, 4-7,4 и температурный оптимум 35-40е С. • '

2. Установлено, что протеиназа а состоит из двух субъединиа -и jb с молекулярной массой 40 и 20 кДа. соединенных дисульфнд-

ным мостиком. Определены аминокислотный и углеводный составы, я- и С- концевые аминокислоты протеиназы А и ее субьединиц.

3. Установлено, что протеиназа А - протеолитический Фермент из покоящихся семян хлопчатника, гидролизуюиий нативные запасные белки, присутствует при прорастании семян.

4. Показано, что гидролиз lis глобулина начинается на самых ранних этапах прорастания семян хлопчатника и завершается в первые 4-5 дней. Первые 3 дня происходит только ограниченный гидролиз.запасного белка и лишь на 4-й день - его глубокий пиролиз, после чего белок не обнаруживается ни иммунохимическими методами, ни методами электрофореза и аналитического ультрацентрифугирования.

5. Разработана схема выделения ингибитора протеиназы А семян хлопчатника с использова ием аффинной хроматографии на прстеина-зе А - сефарозе 4В с последующей гель-Фильтрацией на сефадексе G-150. Молекула белка имеет молекулярную массу 20 кДа и состоит из двух субъединиц, с молекулярной массой 3 и 12 кДа.

6. Показано, что покоящиеся семена хлопчатника содержат белки - ингибиторы протеиназ, способные ингибировать активность протео-литических Ферментов , Фитопатогена - Vert ici lllura dahllae Kieb. Впервые разработан количественный метод оценки устойчивости хлопчатника к этому грибу, результаты которого ногут быть использованы для ускорения селекционных исследований по выявлению устойчивых сортов к данному патогену.

- го -

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Нежлумьян л. Г.. Кученкоза Н. А.; . Юлдашев П. X. Выделение протеазы а из сеиян хлопчатника. //Химия природ, соедин. - 1985.

- Н. 2 - С. 275-276.

2. Нежлуньян Л. Г.. Кученкова н. А., Юлдашев П. X. протеаза А из сенян хлопчатника. Выделение и очистка Фермента. /Химия, природ, соедин. - 1986. - Н. б - С. 738-741.

3. Нежлумьян Л. Г.. Кученкова н. А., Юлдашев П. X. физико-химические свойства цротеазы А из сенян хлопчатника. //Химия природ. соедин. - 1986. - Н. 6 - С. Т41-744.

4. Нежлумьян Л. Г.. Юлдашев п. X, Иммунохиническая характеристика протеолитического фермента протеазы А из семян хлопчатника. //Химия прород. соедин. - 1991. т Н. 1 - С. 109-110.

5. Нежлумьян Л. Г.. Редина Э. ф., шдашев П. X. О модификации запасных белков при прорастании семян хлопчатника. //Химия природ. соедин. - 1993. - Н. 3-С. 444-447.

6. Нежлумьян Л. Г.. Редина Э. ф., шдашев П. X. Выделение и изучение ингибитора собственного протеолитического Фермента семян хлопчатника. '//Химия природ, соедин. - 1994. - К. 2-е. 274-277.

Т- Нежлумьян Л,'Г-'. Редина Э. ф., Касымова Г. А. . Юлдашев П. X. . Ходжибаева С.Н. функциональные свойства ингибитора сериновой про-теаз А из семян хлопчатника. //Химия природ, соедин. -1994. - н. 4

- С. 533-537.

8. Гусакова с. д.. Хомова Т. в., Нежлумьян Л. Г.. Юлдашев П. X. Сравнительное исследование состава ингибитора протеаз вилтоустойчивого н восприимчивого сортов хлопчатника, //химия природ, соедин. 1994. - Н. 4 £ 474-480.

9. Касымова Т.Д.. Петросян л. г.. Кученкова Н. А.. Юлдашев П. X. Протеазы семян хлопчатника.. //Тезисы II Всесоюзного симпозиума "Химия протеолитических ферментов". 1979, 9-11 Окт., Углич.

10. Нежлуньян л. Г. г Шдашев п. X. Протеаза А и ее ингибитор из семян хлопчатника. //Тезисы Всесоюзного симпозиума "Химия белков". 1990. 21-26 мая. Тбилиси.

и. Касымова т. Д.. Нежлумьян Л. Г.. Юлдашев П. X. Исследование ингибиторов протеаз семян хлопчатника. //Тезисы V-ro Международного симпозиума по вертшшллиуму. 1990, 25-30 июня. Ленинград.

12. Касымова Т. Д. >- Нежлумьян Л. Г.. Юлдашев П. X. Исследование ингибиторов протеаз семян хлопчатника, зараженного вилтом. //Материалы IX Всесоюзного совещания по имнунитэту растений к болезнян и вредителям. 1991. сент., Минск.

13. МегЫитгап L. G.. Kasyraova Т. D., Vuldasbev Р. Юг. cotton seeds proteinases.- //Abstr. of 4th. International Symposium "Pro-

tein structute Function Relationship". 1995, Jan. 27 - Feb. z, PaKlstan.

14. Yuldashev F.Kh., Kasymova T.D. Hesiilumyan L.G- AbduraKh-nianova X.T. Inhibitors of the cotton seeds protenases. //Abstr. of 4th International Symposium " Protein Structure Function Relationship". 1995. Jan. 27 - Feb. 2, PaKistan.

Хулоса

лг. Нежлумьян

"Пахта чигитидан ажратиб олинган А протеиназаси ва унинг ин-гибиторини тадкик этиш" иавзусидаги диссертадион шли бУйича.

пахта чигитидан биринчи бор янги гоноген оксиллар - протеоли-тик Фермент А протеазаси ва унинг ингибитори ажратиб олинган. уларнинг Физик - кимевий ва функционал хоссалари урганилган. оксилларни ажратиб олиш ва тозалаш схеналари ишлаб чикилган. А протеиназасининг трипсинсимон серинли протеиназа эканлиги, унинг рн оптимуми 6,4 -7.4, температура оптимуми 35 - 40° с, молекуляр массасининг киймати 60 кД га тенг экандиги аникланган.

А протеиназа молекуласининг молекуляр массалари 20 ва 40 кД га тенг 2 та суббирликдан иборат эканлиги. иккинчи суббнрликда уг-леводларнинг борлиги аникланган.

Турли усублар ерамида А протеиназасининг пахта чигитидаги захира оксилларининг протеолизини инициация этувчи фермент эканлиги курсатилган.

А протеиназаси ингибиторинннг молекуляр массаси 20 кд-га тенг булиб, 2 та суббирликдан ШМ 8 ва 12 кД) иборат. А протеиназасининг ингибитори вертипиллиум Фитопатоген микроорганизмлари протеи-назаларининг Фаоллигини бостиради.

Вилт касалигига чидамли пахта сортларининг чигитларида. касалликка чалинувчан сортларникига нисбатан А протеиназа ингиби-торининг иикдори куплиги аникланган. Ушбу авипяанган богланишга асосан турли сорт пахталарнинг вилтга чидамлилигини бахолевчи мик-дорий услуб ишлаб чикилган ва ундан селекдияда Фойдалоаниш мумкин-лиги курсатилган.

sunsnary

L.G. HezhlumJan

Study of Proteinase A and Its Inhibitor from cotton Seeds.

For the first time there were isolated new homogeneous proteins from resting cotton seeds proteolytic ferment proteinase A and its inhibitor, studied their physicochemicaland functional properties. Isolation and cleaning methods have been worKed out. It was established that proteinase A is trypsm-liKe serine proteinase with pH optimum 6,4-7,4. temperature optimum 35-40° c. moleKular mass 60 KD. Molecule consists of two subunits with molecular mass 40 and 20 KD and the last of them has carbohydrates.

It was shown that proteinase A. is ferment initiating the proteolysis of storage proteins from cotton seeds.

The second part of investigation is devoted to isolation and cleaning and character of proteinase A own inhibitor. Molecular mass of the inhibitor comes to 20 KD. Inhibitor molecule consist of two subuhits with molecular mass 8 and 12 KD. It was shown that proteinase A inhibitor, suppresses the activity of phvtopathogen verticillium proteinases. It was discovered that in seeds of cotton stable varieties the content of protease A inhibitor is higher as compared with susceptible varieties. On the base of revealled dependence there was worKed out quantitative method of stability estimation for cotton different varieties that can be used in selection.