Изучение мРНК-связывающего центра рибосомы на стадиях инициации и элнгации трансляции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

■] м8с&>вс|фй ^брдё^а ленина, ордена октябрьской РЕВОЛЮЦИИ, ордена трудового красного знамени государственный университет имени м.В. ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДОКУДОВСКАЯ Светлана Сергеевна

УДК 576.85.48

ИЗУЧЕНИЕ мРНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМЫ НА СТАДИЯХ ИНИЦИАЦИИ И ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

02.00.10 - биоорганическзя химия, химия природных . и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1993 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. МБ. Ломоносова и в Институте молекулярной генетики им. М. Планка, Берлин, Герман;ш.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор АЛ. Богданов, профессор Р. Вримахомб

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор О.О. Фаворова, кандидат химических наук М.Ф. Турчинский

Ведущая организация;' Институт молекулярной биологии им. ВА. Энгсльгарда РАН

Зашита состоится * Г люнл 1993 г. в 16 часов на заседании специализированного Ученого совета Д.053-05.47 при Московском государственном университете им. МЗ. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, Институт физико-хикичесхой биологии имАЛ. Белозерского МГУ, аудитория SOL

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. МБ. Ломоносова.

Автореферат разослан: vti ; (Я 1993 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гроблемы. Биосинтез белка на рибосомах является ключевым этапом процесса реализации генетической информации в клетке. Детальное понимание механизма трансляции невозможно без изучения взаимодействий рибосомы с мРНК, тРНК и факторами трансляции на различных этапах биосинтеза белка. Существенным аспектом этой проблемы является знание пространственного расположения махромолекулярных лигандов относительно компонентов рибосомы в процессе инициации, злоягации, термингыии. Однако, несмотря на большое количество данных, накопленных х настоящему времени, как реальная структура самой рибосомы, так и топография лигандов остается невыясненной. Особенно много разногласий существует по поводу расположения матричной РНК на рибосоме, и из всех предложенных моделей ни одну нельзя считать доказанной. Использование метода фотоаффкнной модификации позволяет приблизится к решению проблемы топографии матричной РНК иа рибосоме.

Цель работы. Изучение расположения матричной РНК на рибосоме в различных инициаторных комплексах, а также в алонгирукмцей рибосоме методом фотоаффинной модификации.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе для изучения топографии матричной РНК были использованы короткие аналоги мРНК, сконструированные на основе сго-мРНК фага А, в которых остался уридина статистически замещали ва его фотоаффинный аналог - 4тяоуридии, расположенный как в иници^торнон облает, так и в заданных положениях от +4 до +16 нухяее-тидного остатка З'-коицевой части мРНК. В отличие от большинства выполненных ранее работ, исследование расположения мРНК проводилось яе только в инициаторных бинарных к тройных хомплехсах, но л в комплексах с двумя тРНК, а также после травслснсацил.

Модификация рибосом фотоаффинными производными мРНК позволила идентифицировать специфические участки 165 РНК, а также рабосомные белки, которые непосредственно сближены с мРНК на различных этапах трансляции.

Полученные результаты поззолшт не только детально охарактеризовать мРНК-связывакший центр рибосомы, но и послужили основанием для пересмотра существовавших ранее представлений о пространстве/той организации малой субчасгицы рибосом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывалась на Международной конференции "Биосинтез белка", Пушино, 1?91 г, Международной конференции * Современная этимология: проблемы и направления", Москва, 1992 г.

Международной конференции "Трансляционный контроль", Колд Спринг Харбор, США, 1992 г., Международной хорференцни Трансляционный аппарат", Берлин, Германия, 1992 г.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен применению метода сайт-специфического мутагенеза для исследования структуры и функции 16S РНК), результаты, обсуждение результатов, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован ' рисунками и таблицами. Библиографический указатель включает цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Для юучеяия топографии матричной РНК ка рибосоме оьш использован набор коротких мРНК-аналогов (рис. 1), которые были получены транскрипцией с сишетических ояигодезохсврибонукаеогидов с поммцыо Т7 РНК-полимеразьт и содержали несколько остатков 4-тиоуридина (S4U). Матрицы была сконструированы на основе мРНК cro-белка фага Л. Они имели протяженную последовательность Шайна-Дальгарно (SD) (8 нуклеспкдов) к довольно короткий (3 нукпеоти-т), \ридин-богатый спейсерный участок между SD-последосателькосгъю и шпщи-з торным AUG галопом. мРНК с таким иквдиаторным районом образуют правильные, стабильные комплексы как с 30S субчастицами, так и с 70S рибосомами в присутствии инициаторам тРНКгЧи, когда AUG кодон находится в рибосом-ном Р-учаспсе. 5*-кокаевая область была одинаковой у всех мРНК. З'-концезая область содержала 1-2 остатка уридияа во всех позиция* от +4 до +16

gggaaggaggutjgoacgoaccaacgcaaaggacag +4

gggaaggaggotjgoacggoacaacggaaaggacag +5

gsgäaggäggitugdaüggadcääcggaacagccag +6,+16

gggaaggaggaogoacggaaoaccggaaaggacag +7

gggaaggacgixoguaüggadüaccggaaaggacag +6,+7

gggaaggaggitoguauggaacüacggoaacgacag +8,+13

gggaaggaggutjgüaoggaaacijcgcaaacgacag +9

gcgaaggaggctcgtobggaaagcpaacgcgacag +10

gggaaggaggoogüaoggaacaagdgaaacgacag +11

gggaaggaggdngtj/jjggaacaacgügaacgacag + 12

gggaaggaggüdgoaüggaacaacgcao +14

gggaaggaggudgoanggaacaacgcaadcgacag +15

Рис. 1. Первичная структура мРНК, использованных в работе.

(положение А в AUG ходоне обозначается как +1). Протяженные двуспиргльные растай в этих матрицах отсутствуют.

В качестве фотоаффинной метки использовали 4-тиоуридин. Выбор данного фотоаффикного реагента обусловлен целым рядом его преимуществ. Кенфор-мация 4-ткоурхдина лршггачеас!! не атличгется от обычного уридана, что в свою очередь не изменяет коиформааию мРНК, имеющей такую модификацию. Кроме того, S4U образует аиизъу "нулевой" длины как с рРНК, так и с рибосомнымн белками, при облученшга мяпс-лм УФ-светом, т.е. при Л>300 им, в условиях, исключающих инактивацию рибосом.

S^U статистически включали в цепь мРНК в процессе Т7 транскрипции в присутствии S4-UTP и a-[32PJUTP. В результате получали мРНК, содержащие в своей последовательности вместо уридаяа либо радиоактивный остаток U, либо S^U (1-2 остатка на молекулу).

1. Модификация рибосом фотоаффинными аналогами «РНК.

Модификацию рибосом аналогами мРНК, содержащими S4U проводили ь составе следующих комплексов:

1. 7öS*mPHK б:гаарт>:й комплекс

2. 70S*MPHK*TPHK[We' тройной инициаторнык комплекс

3. 70S*M?HK*TPHKfMM*aa-TPHK комплекс с двумя тРНК

4. 70S*MPHK*fMetjrPHK|Met,aa-TPHK —■-> транспггпидация

5. 70S*MPHK*fMet-rPHKjMe,*aa-TPHK"EF-G'GTP --> транслокгция

При образовании 70S комплексов вначале инкубировали 30S рибосомы с

мРНК и тРНКГМс< (иди fMet-TPHKfMcl), затем добавляли 50S субчаспщы и, после

соответствующей инкубзпии, остальные компоненты комплексов. Соотношение

между лигандами было следующим:

70S : мРНК : tFHKjM« : аа-тРНК : EF-G = 1: 0.6 : 3 : : 0.4 Полученные комплексы очищали от несвязанной мРНК центрифугированием в градиенте концентрации раствора сахарозы, в буфере, содержащем 10 мМ Mg1*. 80-90% мРНК оставалось связанной с рибосомами (рис. 2А). Затем комплексы облучали УФ-светом с длиной волны Л >300 нм.

Модифицированные 70S рибосомы разделяли на 3OS я SOS субчаспщы в градиенте концентрации сахарозы с низкой концентрацией итог Mg2+ (0,5 мМ). При этом мРНК всегда оставалась стланной только с 30S субчьсгицами (рис. 2Б).

Разделение модифицированных 16S РНК и белков проводили центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы, в буфере, содержащем додецил-сульфат натрия (ДСН) и ЭДТА, в условиях полного разрушения иековалентных

НОМЕРА ФРАКЦИЙ

Рис. 2. Профили сахароанкх градкентов для м?НК +7. А) очистка 703 комплексов ст нссвлзавшейся мРКК; Б) раздглешх модифкцирозаигых 7CS комплексов на 30S к 505 субчаспщы; Б) разделение 30& óyS'iacmm на 16S РНК к белки.

РНК-белковых коллмексов (рис. 2В). Профили градленточ для всех м?НК были илентичлы, однако выход сшиеки е 16S РНК зависел от типа мРНК и 70С комплекса. Так, бо всех бинарных комплексах, независимо от тапа мРНК, выход составлял 5-8%. У тройных шшциаторных комплексах максимальный выход наблюдался для мРНК +? (25-30%), +6,+16 и +4 (7.0-25%). В комплексах 3 я 4 (с дзумя тРНК) выход пргапмкн для мРНК +6,16 :: +4 снихсался до 10-15%, для мРНК +7 .уменьшался незктч!ггелшо, дия оепшыгых мРНК практически не изменялся.

2. Диализ сшивом v.FMK с 16S РНК в тройных икицнатерных комплексах.

Для аналгаа сшгеок мУПК с 16S РКК был исполыован новый подход, осноганный на гидролизе РНКгзои Н 36о РНК, ковалентно связанной с мРНК, в присутетиик двух ьтагидезехскрибснуклеотидов, кошгяементарнък определенным участкам 16S РНК, находящихся на расстоянии 150-200 нталеотидса. Такой гад-ролю приводит к образованию фрагментов 16S РНК равной длины, ксторые ыожно разделить электрофорезом в 4% ПААГ. Таг», например, если 150-члеш1ь;й фрагмент 16S РЖ скажется связанным с радиоактивной мРНК в результате образовании сшивки, то на апггорадцограмме могсио будет бвдш, полос)', соответствую;«^) такому козалеятному комплексу. Использование целого набора илиголуклеотидез позволяет протестировать нал:г;ис ашикс с 16S FHK по всей длине (ск. схему иа рис. 3). Продукты гидролиза для кажсой пары олигоиуклг-отидов наносятся ез гель з отдельную дорожку.

На рис. 3 представлен результат гидролиза 16S РНК РНКазой К для бинарного комплекса с мРНК а также для тройных комплехсоз с мРНК +4;

А. Б.

12349670 1 2 3 4 5 6 7 8

&

И

l

О

о

\

г. Д.

1 234 5 678 12345678

с.

«й».

ta»

ts» \

О

Т Т 'Г 7 Y Г Г 'Г Г -»■■ы1 ""•лп

Риа 3. Гидролиз РПКшой II 16S РНК, сшитой в бинарном комплексе с мРНК ^4 (А) к ■ тройни* иинниаторных комплекса* с мГНК (В), +6.+16 (3), +7 (Г), +11 (Д). Полосы на как;дой дорожке ни црторадгогр&ммо предешьляюг собой результат гидролиза и nmit¡tettHH /туя оЛмилтпкаюнВопухлст 1ШШ (ш. слечу). Стпелклиш овсанвч«11ы фрагменты 105 IHK, сштчг с Ml'IIK,

Рис. 4. Гидролиз РНКазой Н 165 РНК, сшитой с мРНК +7-в тройном ишщиа-торном комплексе (район 1400-го остатка).

-6,т16: "1 и +11. Б бинарпом комплексе наблюдается ашшса с З'-концевым 45 нухлео-птдным фрагментом 16Э РНК, что, по-видимому, отражает взаимодействие между последовательностью Шайна-Дальтарно мРНК и ашги-Шайна-Дальгарно 165 РНК (рис. ЗА, дорожка 8). Кроме того, существует сшивка в районе 660-845 165 РНК (рис. ЗА, дорожка 3). Эти дне пришивки были отмечены в бинарных комплексах всех исследованных мРШС, независимо от их кухлеотздной последовательности.

В присутствии тРНК}Мс1 для м?НК +4 появляется сшивка в учаспсе длиной в 110 нуклесгвдов между остатками 1390 и 1509 (см схему и рис. ЗБ, дорожка 8). Эта сшивка является строго тРНК-зависимой, так как она отсутствует в бинарном комплексе. Аналогично, тРНК-зависимые сновки были обнаружены для мРНК +б,+16 в районе между нуклеогидами 915 и 1055 (см. рис. 33, дорожка 5); для мРНК +7 в районе между нуклеогидами 1390 и 1500 (см. рис, ЗГ, дорожка 8) и мРНК +11 в районе между нуклеогидами 370 и 56" (см. рис. ЗД, дорожка 1). Сшивка с З'-концевым 45 нухлеотидным фрагментом 16Б РНК, которая наблюдалась для всех мРНК, служила ргперной точхой для оценки относительного уровня тРНК-завискмых пришивок.

Для более точной идентификации района 165 РНК, коЕглентно связанного с мРНК, повторяли гадралш РНКазой Н в присутствии ояиголезохсирибонухлео-тидов, хомплементарных области пришивки, уменьшая расстояние между ними ао 15-70 нухлеотидов. На рис. 4 представлен результат такого анализа для мРНК +7. Образование радиоактивного 70-членного фрагмента (дорожка 1), полученного

Рис. 5. Определение нуклеотицгного остатка 16S РНК, сшитого с мРНК +6,+16 (А) и с мРНК +7 (Б) с помощью реакции обратной транскрипции. A,G,C,T - сихвеасыые дорожхи. XI, Х2, X - образцы с пришивкой. С1 и С2 - контрольные образцы, нанесенные в различных концентрациях (А) или имеющие разную дапшу (Б).

после гидролиза в присутствии олигонухлеогвдов, комплементарных участкам "1385" и "1455", говорит о том, что пргашвка находится внутри этого района. С другой стороны, алигояуклеотид 1390-1405 не шбршпоуется с модифицированной 16S РНК, поскольку этому препятствует сшивка, находящаяся в пределах этих 15 нуклеотидлв (дсрожкя 2 и 3). Данный подход позволил ограничить районы сшивки для мРНК +4 нуклеотидами 1400-1415, для мРНК +6,+16 - 1045-1055, для мРНК +11 - 525-535. В бинарном комплексе для всех мРНК сшивка находится в пределах между иуклеогпмами 660 и 690.

Для определения нуклеотида 16S РНК, сшитого с мРНК, использовали метод обратной транскрипции. Для этого фрагмент 16S РНК длиной 150-200 нуклеотидов, сшитый с мРНК, глюировали ю геля после гидролиза РНКазой Н и вводили в реакцию с обратной транскриптазой. Было установлено, что мРНК +6,+16 сшивается с 1052 нуклеотидом 16S РНК, мРНХ +7 - с 1395 и мРНК +11 - с 532 (см. рис. 5). Для мРНК +4 сшивка, по-видимому, происходит с 1402 нуклеоти-

дом. Однако, в этом случае полученный результат нельзя считать однозначным, поскольку в этом месте располагаете! метилированное основание, и обратная транскригттаза останавливается на нем и в контрольном образце, хотя интенсивность соответсгвующех! полосы в контроле ниже, чем в опыте.

Важно отметить, что для идентификации нуклеотида 153 РНК, связанного с мРНК, необходима комбинация обоих описанных выше методов. Дело в том, что терминация обратной транскрипции может происходить и в участках, не соответствующих месту пришивки, например, на метилированных основаниях или в местах скрытых разрывов в 16Б РНК . С другой стороны, если участок 165 РНК в области сшивки не вовлечен в образование уотсон-криковских пар, то фермент может не остановиться в месте пришивки. Поэтому, если тершшация транскрипции проиняила в пределах 20-40 куклеогадов, определенных как участок пришивки с помощью РНКазы Н, то положение сшивки в рРНК можно определить с высокой достоверностью. Ясно, что сшитый остаток З'-концевой части 165 РНК вообще неквможно определить методом обратной транскрипции.

Для идентификации остатка урщшна з мРНК, который сшивается с 16Б РНК, очищенный комплекс мРНК с небольшим фрагментом 16Б РНК, полученный после гидролиза РНКазой Н, подвергали исчерпывающему гидролизу РНэзой Т1. Полученные при этом ояигонухлеотиды разделяли двумерной хроматографией на РЕГ-цеялюлозе. Поскольку мРНК содержит [32Р]и и 4-тиоуридин, а пришивка происходит только при фотоакпшащи из последнего, который не радиоахтизен, то пятно на двумерной хроматограмме, содержащее пришивку к 16Б РНК, должно исчезать, если в соответствующем олигонуклеогиде не содержится радиоактивного фосфата, или изменять свою подвижность, если он есть. В качестве примера на рис. 6 представлены фингерпршгпл гидролизаггов для мРНК +6,+16 в свободном состоянии (А) и после ее сшивания с З'-концевым участком 168 РНК (Б) и нуклеоткдом 1052 (В).

Результаты анализа показывают, что оливка с 532 нуклеотидом 16Э РНК происходит из +11 положения мРНК, с 1052 - из +6 положения, с 1395 из +7 положения. Пришивка к З'-юнцевому району 163 РНК для всех мРНК как в бинарном, так и в тройном комплексах происходит из положений -3 (преимущественно) и -4.

Испошыуя мРНК +5, +6,+16, +14, +15 (см. рис. 1), мы не обнаружили тРНК-зависимые сшивки мРНК с 163 РНК из положений +2, +5, +14, +15, +16. Возможность ошшания из положений +1 и +3 нельзя проверить непосредственно в тройных инициаторных комплексах, однако анализ этих позиций в комплексах после транслокации (см. ниже) показывает, что эти нуклеотиды в мРНК также не образуют сшивок.

СССААССАССииСЦДЦССАиСАЛСССААСиСССАС 12 3 4 5

V ^«V —.¿л»

•г.- • Г • .>:*т

• • . - - +т .

"«г!» ^

Рис. 6. Определение нуклеотидов мРНК +6,+16, связанных с 16Э РНК (фин-герпринты). А: мРНК +4+16 в свободном состоянии. Б: после сшивания с З'-кон-цевым участком 165 РНК В: после сшивания с нухлестидом 1052. Пятна, исчезнувшие или уменьшившиеся по интенсивное™ в результате сшивки с 163 РНК, обозначены стрелками.

' Специфичность тРНК-зависимых пришивок к их относительный выход определяется расположением ясследусммх нуклеотидов в мРНК относительно рибосомных А- и Р- учаспсов. Так, абсолютно специфичными являются сшивки из положений +4 и +6, соотаетственно. с 1402 и 1052 нухлеотхдами 165 РНК. Максимальный выход сшивки с 1395 нуклеотипом обнаруживается для мРНК +7, однако пришивка к этому нуклеотиду наблюдается такие и из положений +6, +8, +9, +10, хотя и с гораздо меньшим выходом. Сшивка с 532 нухлеотидом происходит приблизительно в равной степени из положений +10 - +13.

З.Анализ пришивок & комплексах с двумя тРНК.

Для связывания соответствующей второй тРНК с рибосомным А-участком ее предварительно аминоацилировали. Выход реакции определялся типом тРНК и колебался в пределах от 50% для АзртРНК-^Р до 90% для СТАРИК01". Соответствующую аа-тРНК брали в полуторакратном избытке по отношению к рибосомам и проводили неэнзиматичесхое связывание в буфере, содержащем

В случае мРНК +4 и +6 наблюдалось сильное ингибиров&ние тРНК-зави-симых пришивок (см. рис. 7). Интенсивность пришивки из +7 положения уменьшалась незначительно и практически не изменялась для мРНК +10-+13. Кроме того, добавление второй тРНК увеличивало пришивку к нуклеотиду 1395 для мРНК +9 и +10. Полученные результаты были аналогичны как для комплексов, где в Р-участке находилась тРНК^1, так и для комплексов с Мй-тРИК^'.

ф

<М уОв

,....._____

1052

>000 ) »200

13М 3'

I I

иоо У-*пЛ

Рис. 7. Гидролиз РНКазой Н 165 РНК, сшитой с мРНК +6, +16 в нгаци-аторном тройном комплексе (А) и в комплексе с двумя тРНК (Б).

Подавление гРНК-заиисимых сшивок из положений +4 и +6 связыванием второй тРНК в А-учаспсе происходит, вероятно, из-за того, что эта нуклеотиды мРНК, являющиеся, соответственно, У и З'-хонцевыми куклеоггидными остатками кодона, находящегося в А-учасгке, спарены с соответствующими основаниями антикодона тРНК, п, следотательно, выход сшивки с 165 ГНК уменьшается, когда А-учасгок занят. С другой стороны, при связывании второй тРНК могут происходить также конформадиснные изменения как в 165 РНК, так и в мРНК.

4. Анализ сшизок в элонгирующей рибосоме.

Эксперименты по транслокации были осуществлены прежде всего для того, чтобы выяснить, образуются ли тРНК-зависимые сшивки, описанные ранее для инициаторных комплексов, в соответствующих комплексах, полученных на стадии

элонгации синтеза полипгптидной цепи. С другой стороны, в ряде случаев транслокация мРНК является единственным способом выяснить возможность сшива-, ния с ГНК нуклеотидов в тех положениях мРНК, в которых они не могут быть замещены на Б4и в инициаторных комплексах (в нашем случае положения +1 и +3 мРНК).

При осуществлении транслокации после инкубацин со второй тРНК в присутствии ГМег-тРНК(^е1 реакционную смесь разбавл[яли так, чтобы концентраты Mg2 + снизилась до 6 мМ, добавляли ЕР<3 фактор, ОТР, слермидин и спермин и инкубировали 10 мин при 37°С

На рис. 8 приведен пример использования транслокации для анализа сшивки +6/1052. Так, мРНК +9 не образует тРНК-зависимых сшивок в районе "1050" 165 РНК (рис. 8А, дорожка 5). Однако после транедокгцик, при перемещении Ои-тРКК01" из рибосомного А-участка в Р-учасгок, нуклеотид »9 становится нуклеотидом +6 (если за +1 считать первый нуклестип кедона, находящегося в Р-участке рибосомы). В результате появляется сшивка с 1052 нуклеоггидом 16Б РНК (рис. 8Б, дерожха 5). С другой стороны, после транслокации Я4и из положения +6 в +3 (мРНК +6,+16) указанная сшивка сильно ослабляется (см. рис. 8В, дорожка 5). При этом появляется сшивка с нухиеотадом 532, что соответствует транслока-щш +15->+13 (рис. 8В, дорожка 1). Кроме того, ошткга с З'-концевым 45-нухле-отидным фрагментом сохраняется, что свидетельствует о том, что Ж-игги-Зи взаимодействия хотя бы частично сохраняются после одного "шага" транслскации.

Анализ сшивки мРНК +9 с нуклеотидом 1052 с помощью РНззы Т1 показывает, что после транслокапиа на фингерпринте исчезает радиоактивное пятно, соответствующее олигонуклеотиду АААиСОр, что подтверждает наличие сшивки из нуклеотида, который заяимал положение +5 з »ссшпанной мРНК +9 (рис. 9).

Необходимо отметить, что только с помощью транслокацки можно доказать, что сшивка с нуклеотидом 1402 происходят именно из положения 1-4. Дело в том, что при гидролизе РНазой Т1 мРНК +4 радиоаггивньш фосфат, относящийся к +4 нуклеогиду, будет находиться на З'-конце соседнего олигону-ле-отида иАивр. После тракслокации из +7 в +4 лоложение появлялась сшивка с 1402 нуклеотидом, а на фингерпринтах исчезало пятно ААиАССОр.

При помощи транслокаций из соответствующих положений мРНК Яьшн проверены и подтверждены все тРНК-зависпмые сшизки, описанные ваше. Кроме того, были протестированы положения +1 и +3 (транслскации из положений +4 и +6, соответственно), причем никаких новых тРНК-зависимьи сшивок обнаружено не бьшо. Надо отметить, что хегга мРНК-рибосомный комплекс после транслокации в целом идентичен инициаторному тройному комплексу, наблюдаются также и некоторые отличия. Так, посте транслокации из +9 в +б положение появляется

Рис. 8. Гидролиз РНКазой Н 165 РНК, сшитой с мРНК +9 в комплексе с двумя тРНК (А) и после транслокации (Б), а также с мРНК 46.+16, после трансзюкации (В). '

ССеААОСАССрисудрсСАААСОСССААМ-гсь^аг-12 3 4

1

О

£

«э

г й

Рис. 9. Фингерпрюлы мРНК +? в свободном состоянии (А) и после очистки сшивки с ну-хлеогилом 1052 после трансло-хащш (Б). Местоположение отсутствующего в результате опивки пятна АААСиСЭр отмечено стрелкой.

срм

500-

1—¡— ислли. мали)

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 СуСЧЭСТЩЫ

белки малой

Рис. 10. Анализ пршшшок мРНК +7 к рибосомным белкам в 70Б ини-циаторном комплексе с помощью антител претив индивидуальных рибосомных белков.

сшивка в районе "1200", которая отсутствовала з тройном комплексе с мРЯК +6,+16. Стоит отметить, однако, что во вторичной структуре 165 РНК район "1200" образует двуширальный участок с районом "1050". Кроме того, для всех мРНК обнаруживается сшивка с районом 660-690, которая была специфична для бинарного комплекса.

Посяе разделения 305 субчастиц, сшитых с мРЯК, на 165 РНК и белки, модифицированные белки фракционировали электрофорезом в 10% ПААГ в присутствии ДСН и мочевины.

Белки с ковалентно пришитой мРНК элюировали из геля и анализировали с помощью антител против индивидуальных белков. Пример такого анализа для мРНК +7 показан на рис. 10. Следует отметить, что степень модификации белков можно оценить по их радиоактивности тольхо с помощью электрофореза в 10% ПААГ, поскольку реакция белков с антителами является только качественной вследствие различия констант ассоциации белков с антителами.

Надо сказать, что- спектр модифицированных белков меняется в зависимости от положения радиоактивного аналога в мРНК и от состава исследуемого комплекса. В то же время, количество рибосомных белков, сближенных с мРНК в различных комплексах, весьма ограничено.

Для анализа нуклеотидного остатка в мРНК, который сшивается с белком, использовали препаративное выделение белка с пришитой мРНК из 10% ПААГ, после чего подвергали такой комплекс исчерпывающему гидролизу РНазой Т1.

5. Анализ пришивок к рибосомным белкам.

- а -

ggaaggagguuguapggaaüaccggaaagcacag 12 3 4

4

Рис. 11. Фингерпринты мРНК +7 в свободном состоянии (А) и после очистки пришивки к белку S7 в тройном инидиаторлом комплексе (Б).

В качестве примера на рис. 11 представлены фипгерпринпл мРНК +7 в свободном состоянии (А) и в комплексе с белком S7 (после очистки электрофорезом в 10% ПААГ) (Б). Исчезновение пятна UUGp и снижение количества Gp свидетельствует о том, что пришивка к белку S7 происходит из положения -3 и, чуть в меньшей степени, из положения -4.

Сшивка с белками S18, S21 образована всеми U инициаторной зоны (-4 -+3). Белок S2 сшивается с мРНК, имеющими 4-тиоуришш в положениях от -4 до +7, белок S3 - в положениях +13-+16, белок S5 - в положениях +6-+10.

На рис. 12 показан радиоавтограф 10% ПААГ с ДСН и мочевиной после разделения белков, сшитых с мРНК +7 в различных комплексах. Степень модификации белков значительно изменяется при инициации и элонгации. Так, в бинарном комплексе модифицируются в основном белки S18, S21, а также, в меньшей степени, S2 (дорожка 1). В тройном комплексе с инициаторной тРНК уровень модификации белка S2 повышается и начинает также модифицироваться белок S7 (дорожка 2). При добавлении второй тРНК S? станозится основным модифицируемым белком (дорожка 3). Когда в Р-учасгсе находится Met-tPHKjM", а в А-учзсгке соответствующая аминоацилированная тРНК, происходит реакция транспептидации. В этом случае, наряду с S7 начинают с низким выходом модифицироваться белки S18, S21 (дорожка 4). После транслокации S2, S7, S18, S21 опять становятся доступными для сшивхи с мРНК (дорожка 5), подобно тому, как это бьио в тройном инициаторном комплексе.

1 2 3 4 5

57

1й

1318,221

N комплекс дорожки

1. 2_

3.

4.

5.

70ЭЧ1РНК 705'мРНКЧРНК,м=1 705*мРНКЧРНК(Ме1*аа-тРНК 705*мРНКЧМе1-тРНКгМг<*аа-тРНК 705*мРНК'Ше{-тШКгм="аа-тРНК,ЕР-Гг,СТР 57=558,221 Ж

Рис. 12. Анализ белков, модифицированных мРНК +7 я состава различных комплексов.

модифицированные белки

518,521

513,521>57>52

57

57 »518,821

АРЕ

Рис. 13. Диаграмма сшивок рибосомных компонентов с мРНК в иници-аторноы комплексе, а тахже до тралслокации (с двумя тРНК) и после ■гранслокации.

Таким образом, изменение спектра фотоаффннной модифихацта белков является дополнительным свидетельством в пользу того, что связывание как rPHKfMc!, так я второй тРНК строго специфично. С .'-ругой стороны, при связывании второй тРНК мсодегся конфорканда рибэсомшга комплекса, отражением чего является туг факт, что белки SIS, S21, которые были доступны для модификации в бинарном и тройном инициаторном комплексах, вообще перестают л:одифиц«р02птс: а комплексах с двумя тРНК.

й. Строгкие мРНК-связызагещего центра рибосомы.

.Исходя из полученных данных по пряютвкам, можно утвержпать, что мРНК-скзыьдкшг.ш ггр рибосомы, находашsira на 30S субчастице, сформирован хак 163 РНК. так и рибосамными белкам;!. Так, s:a стадии инициации У-кок-цевая область мРНК принимает участие з SD-aHnt-SD-sani/u действиях и сближена с белком S7. 8 то ;ке время, декодирующий учасгсх рибосомы был локализован ранее в районе нухдестида МСО. В этом же районе находятся места пришивок л!РНК из положении +4 и т7. С другой стороны, З'-концевое основание кодеча, находящегося в А-учаяяе. сшивается г нуклеотадом 1052, осяовгния <-10+13 - с яукяеетидом 522, г З'-конец мРНК ¡ссиода.Н!.-;: +13--И6) - с белком S3. ПГеред трэнслокацигй проигтожгт и ерерз спр елелекке контактов между мРНК и указанными гъгта компонент?.*«! 30S cyiracn-.цы, что еызвгко взаимодействием мРЛК-рибосомного комплекса со второй тРНК, Добг.Елепие Er-G фактора приводит к траислокации, после чего восстанаыкигзотся контакт мРНК практически с теми ¡кг риоосомпымк компонентами, что и в жшциаторном комплексе (рис. 13).

Сотаа.с двум моделям зрггичкой структуры 16S РНК Бриадкемба и Ноллера (ркс. 14), спирали 18, 34 и 44, в которых располагаются, соответственно, нуклеогады 532, 1052 и район 11С0, значительно удалены яруг от друга, Данкы? по опивкам мРНК с 16S РНК, наоборот, говорят о том, что эта районы сближены и находггм в декодирующем центре рибосомы :ми рядом с ним.

Нслучениые намя данные инхгшчтс: s хорошем соотеггстезш с результатами по м'/мичгской модификации р?КК в рибосомах в комплексах с тРНК и аятибиотасами и с результата»® сагсг-калрз&лениого мутагенеза 16S РНК.

Что касается топографии ыРНК на рибосоме, то в настоящее время можно с полкой уверенностью газо'лтхь лтадь о компонентах 30S субчасткцы, которые формируют мРНК-СЕЯзыва;о:ций центр, поскольку необходим существенный пересмотр моделей организации третичной структуры 16S ШК - основного структурного компонента этой субчасгицьг. Важно отметить, что полученные в этой работе данные, наряду с другими результатами изучения структурно-функциональной топографии рибосомы, должны лечь в осноку построения тлкой модели.

Рис. J4. Модели третичной сгрупуры 16S РНК Еримакомба (А) и Ноллсра (Б). Стрелками обаоачены спирали 18, 34, 44.

ВЫВОДЫ

1. В тройном иницчаторном комплексе с тРНК^е1 и 70S рибосомами мРНК с природными ишщирующимм сигналами образуют сшивки из положения -3 с З'-концевым районом 16S РНК, из положения +4 - с нуклеотидом 1402, из положения +6 - снуклеотидом 1052, из положения +7, а также, в значительно меньшей степени, из положений +8-+10 - с куклесгпшом 1395, из положений +10 - +13 - с нуклеотидом 532.

2. В бинарном комплексе для всех мРНК наблюдается сшивка из положений -3, -4 мРНХ с районом "660-69Ü- 16S РНК .

3. Все тРНК-зависимые сшивки мРНК с 16S РНК могут быть воспроизведены при транслокааии мРНК в соответствующие положения мРНК-связы-вакицего центра. SD-aura-SD взаимодействия, по-видимому, сохраняются после одного "шага" рибосомы.

4. В тройном инициаторком комплексе мРНК сшивается с белком S7 из положений -3, -4; с белками £18, £21 - из положений -4, -3, -1, +2; с белком S3 - из

положений +13-+16; с белком S2 - га положений от -4 до +7.

5. Набор модифицированных рибосомяых белков завиогт от типа комплекса: в бинарном комплехсе модифицируются белки S2 и SIS. S21, в тройном комплексе - S2, S7, S18, S21, в комплексе с двумя тРНК - S7, аосле трайслокации модифицируются те же белхк, что и в тройном хомплехсе.

6. Полученные данные по сшивкам мРНК с рибосомой свидетельствуют о том, что сушесгчукмдие модели третичной структуры 16S РНК неверны. Они могут служить основой для пострсезгая новой модели 16S PHIC.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. OADontsova, S-S.Dokadot'skaya, A.MiCopylav, A.A.Bog<1aaov, RJBrimacombe. Gcss-Hnking of thio-U-t.iR.NA analogues to the E.cc!i ribesome.// Abstracts of lecture? and posters presented at the International Conference on the Protein Biosynthesis. -19?! - Pushchino. - p.7l.

2. ODontsova, SJJobidovskaya, AJCopylov, Aj3ogdanov, J. Rfa':e-Appei, N. Junke, and RJJrirnacombe. Three widely separated posidons ia the 16S RNA lie in or close to the ribosomal decoding region; a lite-directed crcss-iinkir.g study with mRNA analogues.// EMBO J.- 1992 - v.ll. - p3l05-3116. - -

3. J.Binke-Appel, NJunke, RJirirascorcbe, OJDontsova, SJDokndwskaya, AJBcgdanov. The path followed by messenger RNA thro-jgh the bactcrial ribosorae; a site-directed cross-linking study.// Abstracts of papers presented at the 1992 meeting on Transladtmal controL - 1992 - Cold Spring Habor, New York.- p2S7.

4. OJDor.isova, SJDckudovskaya, AJCopyiov, A-Bogdaaov, R.Brimacombe. Contacts between mRNA and the riboscite; a cross-linking study.// International conference on The translational apparatus. - 1992 - Berlin. - Abstract book. - p.122.

5. JJfUnke-Appel, NJunke, RJJrimacombc, SJDokudovskaya, OJDontsova, A-Bogdanov. Site-directed cross-linking of mRNA analogues to 16S ribosomal RNA; a complete scan of cross-links front all positions between +1 and +16 on the mRNA, downstream from the decoding site.// Nucleic Adds Res. - 1993 - v21.

- Уфа, 1089. - С. 79.

10. Биешев Я.Х., Свирский С.Э., Вахрушева H.A., MonaitOD ¡О.Б. ¡¡овце инициирующие система для получения жидких хяоропреновцх каучуков //Всес.конф. "Радикальная полимеризация":теэисы докл.- Горький, 1989. - С. 211.

11. Свнрсний С.Э., Биешев ЯД., Вахрусеева H.A., Козлов В.Г., Сигаева H.H., Цонаков В.Б. Эмульсионная полимеризация хлоропре-на, связь условий полимеризации с молекулярной массой и молеку-лярно-массовчм распределением жидкого хлоропреноаого каучука //Всес.кокф. "Радикальная полимеризация":тезисы докл.- Горький, 1989. - С. 211.

12. СвирскиП С.Э., Биешев Я.Х., Монакоэ Ю.В., Козлов В.Г. Получение жидких хлоропреновых каучуков //Всес. научно-техническая конференция "Каучук-09. Проблемы развития науки и производства" :тсзисы докл. - Воронеж, 18-22 сентября 1989 г. - И. ЩШТЭнефтехим, 1989, Ч. I. - G. 11-12.

13. Биешев Я.Х., Ссирский С.Э., Вахрунева H.A., Козлов В.Г., Спгаеаа H.H., Чернова В.А., Монаков Ю.Б. Влияние условий пояи-мэризацки на молекулярные характеристики жидких хлоропреновых каучуков //Производство и использование эластомеров. - 1990. -

- № Р.. -С. 17-20.

14. Вахрушева H.A., Биешев Я.Х., Свирсккй С.Э., {,'юнаков Ю.Б., Сигаева H.H., Козлов В.Г. Энульсионная полимеризация хлоропрена • в присутствии дипроясида //Производство и использование елас-томеров. - 1990. - » 9. - С. 14-17.

ГП «Принт» Зак. № />5 Тираж 100 экз.