Изучение первичной структуры аланиновой субъединицы рицина Т семян RICINUS COMMUNIS L. аминокислотная последовательность триптических пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА А. С. САДЫКОВА

На правах рукописи

АЛИМОВ Хайрулла Гаппарович

УДК 665.117.4.093.5

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АЛАНИНОВОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ РИЦИНА Т СЕМЯН RICINUS COMMUNIS L. АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ТРИПТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

02.00.10—Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТАШКЕНТ — 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте химии растительных веществ АН УзССР.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор ЮЛДАШЕВ П. X. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ХАШИМОВ Д. А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук ЮНУСОВ Т. С. доктор биологических наук, профессор ЮКЕЛЬСОН Л. Я.

Ведущая организация: Ташкентский Государственный университет им. В. И. Ленина.

Защита состоится «.¿О 19^'г? г. в /¿?^часов на заседании

специализированного совета Д 015.21.01. при Институте биоорганической химии АН УзССР (700143, г. Ташкент, проспект М. Горького, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБОХ АН УзССР.

Автореферат разослан » /-¿О?*

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

МУХАМЕДХАНОВА С. И.

Научная новизна работы. Впервые из семян среднеазиатской клещевины выделена высокотоксичная изоформа рицина - рицин Т. Изучены физико-химгческие свойства и структурные характеристики. Для аланиновой субъединицы (B-цепь) установлены строение всех трвптичоских пентодов.

Изучение первичной структуры аланиновой гуйъодиницы рицина Т позволило впервые обнаружить отличия в строения B-цепей рицина Д, рицина Е и представить продпологаему» аминокислотную последовательность аланиновой субъединицы рицина Т.

Практическая значимость работы. В ходе исследования были разработаны способ получения рицина и антирициновой сыворотки,разработаны лабораторные и технологические регламенты производства этих препаратов. Составлены ТУ на препарат рицина и иммунную сыворотку. Иммунная сгазоротка затем была использована при определении остаточного содержания рицина в клещевинном шроте на Маслозкстракцион-ном заводе в г.Белореченске.

Апробация работы. Материалы исследования доложены на : УН Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов,Таллин,1987; I Республиканском конференции посвященном к 100-летию открытия первого лектина в г.Тарту,1988 г., и Международном симпозиуме " Интерлект-П гг.Таллин - Тарту, 1989.

Основное содержание диссертации изложено в 9 публикациях.

Объем работы. Диссертация изложена наi so страницах и состоит из введения, трех глав и выводов. Список используемой литературы содержит наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I.Выделение и очистка рицина Т

■ Рицин Т выделяли из обезжиренной муки семян клещевины,путем гел фильтрации на колонке с сефадексом Г-75 с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах (рис.1,2 и 3).

При исследовании токсичности выделенных г>р кции наедено, что Фракция Т-2 имеет иокспчность ЛДБ0-Б0 мкг/кг, а после очистки её на ДЭАЭ-пеллгаозе- наиболее активной била фракция ДЕ-2, JUI5q которой была равна 20 мкг/кг.

Для окончательной очистки материал основного пика,обозначенный нами ДЕ2-ЫЛ-1 .полученный* с выходом 83%,хроматограф-повали на ДЭАЗ-цоллплозе (рис.4).Виход Фр£_ши ДЕ2-КГЯ-ДЕ-1 рэвоя 88;?,что составляет в расчете на снрзц рицина'11%.-

Актуальность работы. Лектяны - это белки, обладающие свойством обратило, избирательно связывать углеводк, не вызывая их химичео- .'. кого превращения. Они обладаят способностью агглютинировать эритроциты и лейкоциты крови человека и животных, вызывать митоз лимфоцитов и взаимодействовать с некоторыми типами опухолевых клеток.

В настоящее время лектины выделены из животной, бактериальной и растительной ткани. Особый интерес представляет растительные лектины, часть из которых являются сильными токсинами.

Большой интерес к исследователей привлекают свойства изоформ , рицина,встречающихся в семенах клещевины.До настоящего времени было выделено три изоформы рицина: рицин Д, рицин Е й рицин-вариант, отличающиеся по физико-химическими и биологическими свойствами. Эти бе. :и состоят из двух субъединиц - А и В, которые соединены между собой дисульфидной связью. Токсическое действие рицина на клетку заключается в блокировании белкового синтеза на уровне трансляции. А-субъединица рицина является собственно токсином,тогда как В-субъедкница необходима для взаимодействия о плазматический мембраной клетки и, по-видимому, для.проникновения субъединицы А в цитоплазму.

Значительный интерес к исследованию первичной структуры токсичных лектинов обусловлен валкостью их бисшогячеокой функцией и возможностью применения в различных областях биотехнологии»иммунологии , онкологии и микробиологии.Раскрытие химического строения способствует выяснению механизма действия токсичных ле тинов, взаимосвязи структуры и функции, возможности создания.на их основе оригинальных препаратов противоопухолевого типа действия.В связи с этим поиск новых высокоспецифичных токсичных лектинов, изучение структуры и механизма.действия с целью применения их в качество "инструментов" для исследования функционально важных компонентов биологических мембран, является весьма актуальным^

Цель работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований, проводимых в Институте химии растительных веществ АН УзССР по изучению структур и функции токсичных лектинов из семян среднеазиатской клещевины.

Основной целью диссертационной работы явилась разработка методов щцеления, изучения физико-химических свойств и установление аминокислотной последовательности триптических пептидов аланиновой субьединипы рицина Т из семян ¡ио1ииа оопшш1з Ь.

Рис.1. Гель-фильтрация сырца рицина на колонке (4 х 100см) с сефадексом Г-75 в 0.05 М трис-HCI, pH 8,0.

Рис.2. Конообменлая хроматография фракции Г-2 на колонке (2,5 х 30 см) с ДЭАЭ-целлшозой. Элюент - 0,005 М трис-HCI йуфер с рН 8,5,. содержащий 0,01 М(1),0,015 М(2),0,025 ЩЗ), 0,04 м(4) и 0,2 М(5) NaCl. Скорость элюции. 20 т/ч. б) Электрофорез фра—дии ДЕ2 з ПЛАТ при рН 8,3.

1000

2000

3000 mi

Рис.3, а)Ионообменная хроматография Фракции ДЕ-2 на колонке (2,5 х 30 см) с КМ-целлюлозой.Элюент 0,005 М нвфосфатный буфер,рИ.6,5 содержащий . 0,01.Щ1) ,0,02 М(2) и 0,2 М(3) ИаСХ. . Скор'отъ элюции 20 мл/ч.

б)Электрофорез фракций ДЕ2-КМ-1 б ПАЛГ при рН 8,3.

2S0

1.5

1.0

0.5

DS2KM1-D31

рШ.З J рН .4.0

-ÍÍ-

1000

2000

3000 ral

Рио.4.а)Ионообменная хроматография Фракции ДЕ2-КМ-1 на колонке (2,5 х 30 см) с ДЗА?-целлюлозой. . Элюект 0,005 М трис-HCI буфер рН 8,5,содержащий 0,015 М(1) я 0,025 М(2) ИвС1. Скорость элюыив 20 мл/ч.

б)Электрофорез ссиовнсго пика в ГШГ при рН 8,3 К 4,0. •

Гомогенность выделенной франции ДЕ2-КГЯ-ДЕ-1 доказана методами диск-слектрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (рис.46), изо&лектрического фокусирования,ультрацентрифугироЕания и анализом Л -концевой аминокислоты.Фракция ДЕ2-КМ1-ДЕ-1 обладала высокой токсичностью,её ЛД5д равнялась 10 мкг/кг веса мышей. В дальнейшем эту токсичную фракцию обозначали "рицан Т".

В таблице I приведены сравнительные данные по некоторым г&изико-химическим и биологическим свойствам рицина Т а других известных, рицинов.

Таблица I

Физико-химические свойства л токсичность пзотоксинов семян клещевины

Рицины

Свойства. Т д "вариант" Е

Молекулярная масса 58000 60000 57000 Ь4000

Р1 7.0-7.1 7.34 7.25 8.8

Коэффициент седиментации 4.603 4.64Э 4.603 4.453

Токсичность

-ДД50,мкг/кг 10 18* 31*. 18* :

* - согласно литературным данным. •

Рицин Т, как и другие рицины,имеет две N -концевых аминокислоты - изодейцин и аланин. Наличие у молекулы двух И -концевых аминокислотных остатков и проявление её в воде одной полосы яра электрофорезе в ПААГ в дезагрегирующих условиях свидетельствовали о сложном строении рицина Т,который,как и другие рицины,состоит из двух ковалентно связанных субъединиц,

2.Разделение и характеристика двух субъецяьпц рицина Т

Для разделения двух субъединиц рицина 7 провели восстановительное и окислительное расщепление.Восстановление проводили 2-мер-каптозтанолом в присутствии 8 ГЛ мочевины в щелочной среде с последующим карбоксиметшшрованием моноиодуксусной кислотой,

ЮЛ-субъедияицы обессоливали на колонке с сефадексом Г-25,зате?' разделяли на колонке а ДЭАЭ-целлзалоэе при рН 7 (ряс.о).

Для окончательной очистки субъединиц использовали метод аффинной хроматографии на колонке с сефарозой 4В. Сорбцию проводили в 0,005 М натрий фосфатном буфере, рН 7,4 содержащем 0,2 И ИаС1, а десорбцию - этим ке буфером, содержащим 0,1 М галактозн (рис.6),

б

Ü200 я 1.5

1.0

0.5

/

О.зм liad

- 0.2

0.1

1С0 200 ml

Рис.5. а) Разделение восстановленных и карбоксиметили-ровакных ^убъедикиц рицина Т на колонке (2.5x30 см) с ДЭАЭ-целлмозой в градиенте концентрации líaCl. Стартовый буфер - 0.005 U трис-НС1,рН 7.0.содержащий 8 М мочевину. Скорость потока 20 мл/ч. б) Электрофорез в ПЛАТ при pH 8.3.

I),

200 1.5

1.0

0.5

л

-I

0.1 и галактоза . б

100

200

300 к1

Гпо.6. а) АМдшная хроматография фракция Б-ДЕ-3 на колонке с сефарозой-4В. б) Электрофорез полученных фракций в ПААГ при pH 8.3. I. Пе-цепь; 2. Ala-цепь.

+

Субъедшищн рицина Т разделяли также после окислительного расшепления надмуравьиной кислотой путем ионообменной хроматограф фиа на колонке с ДЭАЭ-целлшозой в присутствии 8 М мочевины. Субъединицы элюировали линейным градиентомкаС1 в 0,005 М трио-HGI буфере при pH 7,0 (рис.7).

280

1.0

0.5

- а

0.3 ц líaOl

о.г ои

100

200

ml

Рис.7, а) Разделение окисленных субъедиииц рицина Т на колонке (2,5x30 см) с ДЭАЭ-целлшозой. Скорость потока 20 мл/т.

б) Элэктро&орез в ПАЛГ при pH 8,3.

Каждую фракцию диализовапи против воды и лиэфялизировалп.Гомогенность выделении* фракции оценивали методом диск-электройороза в присутствии додецилсульфата натрия и анализом л -концевых аминокислот.Во фракциях восстанозлешшх и окисленных субъединиц рицинаТ найдены едлнствеш:ы2 и -концевые аминокислоты - Не и Ala.

Полученные данные однозначно сведетельствовали о сус^единичном строении рицина Т и о .наличии между субъединицами коваяентной дисульфвдной связи.

Частичную н -концог-ую аминокислотную последовательность субъедиииц определяли сочетанием метода Эдмана и дансилированкя.С-конце-вую последовательность субъединиц определяли путем гидролиза субъединвп с помощью карбоксипептвдазн А.и последующего аминокислотного анализа продуктов реакции.

В таблицах 2,3 и 4 приведены аминокислотный состав, физико-химическио параметр« и частичные и - и С-концевне последовательности аминокислотных остатков субъединиц рицина Т в сравнении с таковыми для других рицинов.

Как видно дз таблиц,пзолейцяновне суоъединицн рицина Т, Д, Е и "вариант" ;:;1зюг одинаковый аминокислотный состав и идентичные U - и C-¡:omi>v;>:íe не. ледовптелшости. Г1о рТ иэлленгиновя! субъ-ьдиница ранят Т пгппакова о лзоле.'тптгоБгЛ iv< . --""-.ьвпеЛ рпцпл-

d

Таблица 2

Аминокислотный состав субъединиц изоформ рицина

Рицин Т I Рицин Д Рицин-! пвариант"| Рицин Т Рицин Д Рицин- "вариант"

Амино- Пе-цепь кислота т ( I А1а-иепь

кар 24 24 24 35 35 38

т1п- 17 17 15,2 19 19 18,4

Зег 18 19 18,8 21 49 19,2

в1и 29 30 27,3 . 19 22 19,0

Рго 14 15 13,6 13 13 11,4

01у 17 17 18,2 21 21 20,1

А1а 24 24 22,1 13 18 14,1

1/гСув 2* 2 0,77 8* 8 6,59

Уа1 15 15 12,6 14 15 14,4

МеЬ 3 3 2,78 3 3 2,83

Но 22 22 17,0 16 17 13,2

Ьеи 22 22 13,0 25 24 21,7

Туг 14 14 11,9 10 9 8,26

РЬе 13 14 11,2 4 6 3,В7

ьуа 2 2 3,79 7 7 7,13

Н1я 3- 4 3,91 3 3 1,75

Аге 20 20 17,9 14 14 10,0

Тгр т»« 1 - +** 6

Сумма остатков 260 265 240,7. 246 260 227,5

* - Цистеин определяли в виде карбоксиметшщистеина.

** -Триптофан ипролгляди качественно при помощи реактива Ррлиха.

Таблица 3'

Физико-химическая характеристика субъединиц рицина Т, Д, Е и рицин-"варианта"

Пе-цепь |. Ala-цепь,

Т Т ! Д ! S ¡вариант) т j д ! "¡~J вариант

М°ЛмассаРНаЯ!:30000 30000 31000 30000 28'000'300С0 33000 27000 Коэффициент

седиментации 3,42s 3,45з 3,563 3,523

pi 7,8 7,42 7,1 7,8 4,5 5,17*8,4

Н-Конце ая

аминокислота lia Не Но На Ala Ala Ala Ala С-концевая

аминокислота Phe Plie Phe Pha Ser Pho Phe Ser

Таблица 4

Частичные н - и С-концевые последовательности шлинокислотных остатков субъедпялц рицина Т,Д и Е

Рицин | Пе-цепь i ! • ! А1а-цепь -,

Т KHa-He-^e-Pro-Lys- -ain-ïyr-... 1Ш2- -Ala-Aap-Val-Cya-ket-Aan'

Д ' IJIíg-Xle-Phe-Pró-bya- -Gln-Tyr-... нн2. -Ala-Asp-Val-Cya-Met-Aep.

Е Не определено ЯН,- -Âla-Asp-Val-Cya-Ue fc-Anjj-

т ... -Pro-Ser-Ser-Oln-Phe-COOH .. .-Pro-l'ha-iau-GXy-Ser-CGOU Д ...-Pro-ïro-Ser-Sеr-Gln-Phe-CООН . .-ïrp-Lou-Pro-Iieu-Pfte-OOOIJ Е Не определено ...-Trp-Iau-Pro-Lau-Phe-COüü

варианта и основнеб соответствующих субъединиц рицинов Д.и Е. Учитывая сходство составов,различия в изоэлектрических точках можно объяснить разным содержаниями амидных группировок у дикарбо-иових аминокислот,

Аланииовые еубъедгшицы различных рицинов имеют одинаковые Н -концевые последовательности и отличаются по своим С-концевкм аминокислотами а С-концевым последовательностьям,из оэлектрическим точкам, общему числу и содержанию отдельных аминокислотных остатков в состава молекул.

• Таким образом, на основании результатов,полученных для натяз-ного рицина Т и его субъединиц, и сравнения с физико-химическими свойствами нагивных иолекул я субъединиц рицинов Д, Е и "вариант"а можно предположить,что изслейциновая субъединица является общей для всех рицинов.Различия же между рицинами Т, Д, Е и "варианта" в молекулярных весах, С-концевых аминокислот и содержании отдельных аминокислот обусловлены неидентичностью аланиновых субъединиц.

Так как рицин Т отличается по своей биологической активности от известных рицинов,то детальное изучение первичной структуры алани-новой субъединицы способствовало выяснению структурно-фушсционадь-ных отношений.активных участков, а также роли отдельных аминокислотных остатков в реализации биологической функции рицинов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АЛАНШОВОЙ '

суеьвдшвдц рицина т

I. Выделение и характеристика трипткческих _пептипов_

Аланиновая субъединица рицина Т содержит по данньш аминокислотного анализа 256 аминокислотных остатков (о учетом триптофана), в том числе 7 остатков лизина и 14 остатков аргинина.Следовательно, при строго специфичном расщеплении трипсином следовало ожидать образования около 22 пептидоЕ с молекулярной массой около 1000 Да.

Для подбора оптимальных условий и времени гидролиза.использовали метод пептидных карт,позволяющий судить о числе образованных пейтвдов.Иосла' двухчасового гидролиза трипсином на пептидной карте проявлялось около 15 пептидов. Яри болылем времени гидролиза число нептвдоз возрастало,а после 38 часов на пептидной карте имелось у яге более 30 пептидов.Поскольку при меннаем времени гидролиза уменьшается вероятность неспецифическсто расщепления пептид-.них цепей,то для получения крупных триптических поптщов мы испода-

эовали двухчасовой гидролиз трипсином.

Для разделения пептидов использовали ионообменную хроматографию на катионите Аминекс- д-150 Э (рис.8).

Рис.8. Хроматография триптвческого гидролизата аланиновой субъединшщ рицина Т на колонке (1,2 х 100 ом) с Аминекоом- д -150 Б в градиенте концентрации я рН пиридин-ацетатных буферов.

Фракции элюата анализировали с помощью никгидриновой реакции после щелочного гидролиза атшквот и определения поглащения при 570 км. В результате было получено 16 объединенных фракций.

Индивидуальные пептиды получали после очистки фракций методом . препаративного электрофореза на бумаге 141-17 в пиридин-ацетатном . буфере с рН 6,5. Чистоту всех пептидов оценивали о.помощью пептидных карт и н -концевого анализа данеильным методом. Результаты аминокислотного аналига а определения вг -концевых аминокислотных остатков выделенных пептидов представлены в таблице 5.

В результате из продуктов триптического гидролиза аталиновой -субъединицн рицина Т выделено в гомогенном состоянии 14 пептидов, содержащих в сумме 256 аминокислотных остатков.

Таблица 5

Аминокислотный состав и к -концевые аминокислоты триптических пептидов апалиновой субъединиш рицина Т

Аминокислоты T-I Т-2 т-з Т-4 Т-5Т-6 Т-7

îyt-'(Om) 2,45(2) 2,00(2) 1,00(1) 1,00(1)

Авх 6,95(7) 4,55(5) 1,59(2) 2,42(2) 3,56(4) 3,04(3) 1,05

Ihr 8,50(9) 3,77(4) 1,34(1) 1,00(1) 1,00(1)

Ser 5,52(6) 3,92(4) 2,00(2) 1,00(1) 1,52(2

ais 6,93(7) 0,92(1) 0,95(1) 1,98(2) 5,11(5)

Fro 2,05(2) 0,57(1) 2,00(2) 0,98(1)

Gly ' 75(5) 1,77(2) 0,90(1) 2,23(2)

A3 а 2,77(3) 1,77(2) 1,00(1) 2,25(2) 0,95(1)

Val 5,54(6) 2,54(3) 1,00(1)

Met 0,93(1) 0,55(1)

Ile 2,77(3) 0,93(1) 1,06(1) 2,42(2) 1,65(2) 1,00(1)

Ij«U 7,06(7) 1,77(2) 0,90(1) 1,00(1) 3?20(3) 1,12(1)

Tyr 1,82(2) 3,02(4) 1,22(1)

Phe 0,65(1)

Hla

Lys 0,77(1) 1,06(1) 1,00(1) 0,93(1)

Arg 0,79(1) 2,06(2) 1,09(1) 0,80(1) 1,00(1)

Trp* + . + +

Всего

остатков 62 35 11 10 11 21 7

в-кони.

аминок-ты ihr Авх Ala aix Авх Ala Ala

Продолжение табл.5

Аминокислоты Т-8 т-э т-ю T-II T-I2 7-13 T-I4

Суй(Ст)1,00(1 1,00(1) 1,C0(l)

Авх 3,06(4 1,61(2) 1,65(2) 2,94(3) 2,34(2) 1,00(1)

ТЬг 1,98(2 1,05(1) 2,00(2)

Ser 2,54(3 0,85(1) 1,54(2)

Glx 0,98(1 1,65(2) 1,00(1) 1,00(1)

Pro 0,98(1 2,54(3) 0,65(1)

Gly 3,04(3 1,65(2) 1,95(2) 1,00(1) 1,05(1) 0,85(1)

Ala 1,00(1 1,05(1) 1,00(1)

Val 2,04(2 0,6(1) 3,04(3) 1,95(2)

SAot 0,65(1

lie 1,65(2 1,95(2) 0,60(1) 0,84(1) 0,88(1)

Leu 4,05(4 3,65(4) 0,65(1) 0,94(1) 0,87(T)

ïyr 1,00(1 0,65(1)

?he 1,05(1 с,98(1) 0,64(1)

H la 0,94(1) 0,75(1)

Lys 0,98(1 0,95(1) 0,85(1)

Arg 1,00(1 1,54(2) 1,00(1) 0,95(1)

ïrp* + + +

Всего

остатков 29 20 " 12 5 11 12 3

и- кони.

аминок-тн Не - Glx Ile Gly Ser Ala Авх

»- Триптофан определяли качественно при помощи реактива Эрдяха.

2. Определение аминокислотной последовательности триптлческих пептидов_'

Аминокислотную последовательность триптических пептидов определяли путем ступенчатой деградации по методу Эдмана в сочетании с н -концевым анализом укороченных пептидов дансилышм методом.

Для установления С-кокцевой аминокислотной последовательности использовали карбоксипептидазу А.

результаты определения аминокислотной последовательности введенных ноптидоз суммированы в таблице 6. ,

- 14 - ■ i,

Таблица 6

Аминокислотная последовательность пептидов - • ' триптического гвдролязата аланиковой субъединицы рицина Т

_ , ______

Пептид остатков

Ï-1* Ïhr-Б er-Lüu-7al-Aap-Thx-Leu-(CrnOys2,Аэрб,ЧЪх7,S or5,Glu7,

Ï-2 Aap-Aan-ü er-Leu-Arg-S er-Asp- С Ca'Jy в 2, Aop2, Thr4, S er2, Glu 1,

Pro 1, Gly 2, A3 a2,Val3 ,Ke t1, Ile 1, beul, Îyr4,lys1,Arg1) 35 '¿-3 Ale-Z-op-Val-CKCyt-üet-Asn-Pro-Ilö Pro-Glu-Arg 11

ÏÏ-4* Crlu-Ilö«Trp-Ass:-.Asx-STy-Thr-Ile-Leu-Glu-Arg 11.

i-5 Aap-Aun-CfflGyg-IjCU-Thr-Sei^Aep-Ser-Asa-Iie-Arg 11

T-6 Al(i-Glu-Gln-T£V»A£_ -Glu-0ln-Gly-( Aap2,Thr1,3or1 ,Glu1,

Gly1 ,Ala1 ,Х1э1 ,I>eu3#^yi"t , Arg1 ) 22 ÏÏ-7 Aln-SeïvAon-Pro-Sor-beu-Ъув 7

!T-8 Xle-I'5u-S3r-CmCys-üly-I>ro-Ala-(Aap4,Thi,2,Sei-2,Glu1,Gly2,

Ile1^et1fXeu3,Val2,Tyr1,Füe1^e1,Arg1) 29

T-S Glu-Ile-X-ea-Iyr-Pro-Vsl-Trp-aXy-(Asp2,Ser1,Glu1,Pro2,

Gly 1,Ile1, Xiôu3 , Phw1,Kls1) 21 T-iO XIo-Vai-Gly-Arg-Asn-Gly-Leu-CßOyu-Val-Aar.-Val-Arg 12 T-11 Gly-Thr-Vel-Val-Lye 5

T-12 Ser-Gln-Thr-Aap-Ala-Aep-»Asn-Ilei.Thr-Leu-Ars • 11

T-13 А1а-Авр-Рго-СЯу-Аап-гЬ8-1,еи-Сг1и-11и--Тгр-Н1а-Сш0уо~Хуа 13 . T-U Aop-Gly.-Aj.-g 3

, - Углзводсодеряащий пептиды,Определение углеводов'прсьедено качественно по реакция с орцином.

Как видно из таблицы, для девяти пептидов: Т-3, Т-4, У-5, Т-7, Т-10, T-II, T-12, T-I3 я T-I4, содержащйх от 3 до 12 аминокислотных остатков, выяснено строение.Для пяти крупных пептидов T-J, Т—3, Т~6, Т-8 и Т-Э, содержащих в своем составе от 21 дс 62 аминокислот-. ¡тх остатков,определена н-концевая последовательность 7-8 остатков.

у становления их полного строения било проведено допольнятслшое расцепление на более мелкие пептиды. Полное строение и локализация ввделешшх из крупных триптических пептидов T-I,T-2,T-6,T-8 и Т--9 сушяроьагш з схемах I, 2, 3, 4, и-5.

Схема I

Строение пептидов,выделенных из пептида Т-1 после исчерпывающего триптяческого гидролиза

Анализируемый пептид

Результаты анализа

Число остатков

ИТ-1-1 ИТ-1-2

ИТ-1-3 ИТ-1-4

ИТ-1-5 ит-1-е

ТЬг-Эег-Хеи С5НО

РЬе-ТЬг-Хвп-Лап-ТЬг-аХл-Рго-ггд-Уа! • ■

-ЦТ-1-4К-1-

АВ1.-ТХ е-Туг-А 1 а-йог-О Ху-Рго-Ьзи .

---~и;-1-4Х-2--*

А1а-а|пг-11а-Уа1-&1у-Ьси-Туг

С1у-1еи-С>,дуп-1зи--1т1ц-А1а-'АвЕ-.'Зег-С1у-р1и-

-ОТ-1-6К-2

(Г-

V

Уй1-Уа1-Х1о-01п-Анр-Зег-Сгг;Сун-Зег-а1п-Ьуа. -и®-1 - 6К-1-» л--->

18 7

20 •

' - Здесь и долее в схемах 1-5 -—г аминокислотные остатки,опре- . деленные методом Эдмяна в ручном варианте.

- расщепление- трипсином, ]ХТ - расщепление химотрипсином;

],К - пептидные связи расщепленные при частичном кислотном гидролиз

Схема 2 :

Аминокислотная последовательность триптяческого пептида Т-2 аланиновой субъедпкицы рицина Т

Авр-Аап-Бег-Ьси-Агп-Зе^ , ■«-и?-2-1-— Л-2-2-»-С-—............ .

ш--ит-2-з-——-—

-К'Г-2-3«Т-2-

¡¿Т-2-ЗХ1'4—

-ит-г-зхт-1-

ТЬг-йег-А1 п-С1п-Ага. - . -».

, . Схема 3

Аминокислотная последовательность трпптического

пептида Т-6 аланиновой субъединицы рицина Т хт

АХа-йХи-С 1п-1Ч^-Л:;р-С;1и-Г.^п-С1у-11о-Ьаи-'Гуг-А1а-2ег-<----ит-6-г-—" ■

<—ит-б-гхк—^--ит-б-зхт1—

т

ОХу-Ааи-Ьси-Ьуя-Авп-ТЬг-Ъеи-СХп-.ьгг.

--ьу-б~2 _*

Схема 4

Аминокислотная последовательность триптического пептада Т-8 аланиновой'субъединицы рицина Т

ЖХв-Хец-Ве^СмСуе-СЛ^-Ргд-АХв-УЬ^Звг-аХ.у-ОХп-АгД ------—-

V

Тгр-Ые^-Рпо^уо^Авп-Рсх^Х^-ТЬг^ --:—и2-8-1-► -Ь-Т-Й-3-

4--ОТ-8- 5-

'^р-Ьеи-УаХ-Ьац-Аар-УаХ-Агя. '.. --».«г--иТ-3-2--*

Схема 5

Аминокислотная последовательность траптического пептида Т-Я.р т нкновой субъединиш рицина,Д

-Т-9-

-192ТЗ—^-Т9ХТ5-

™ ---Т9ХТ-1-

Аер-11с-Ьеи-Рго-1'Ьв*Ьви-Сг1у-Звг.

"^-гёята"^ —»• ^гэиб—«-

Таким ос!раэом,установлено строение всех пептидов,составляющих в сунме 256 аминокислотных остатков аланиновой субъедкниш рицина Т.

Показано,что пештзд Т-3 занимает в молекуле н -концевое положение, ^ пэнтад Т-9 - С-концевое полонение»

Полученные данные цозволлют провести детальное сравнение структур тлакянотэкх субъедрняц рицина Т, Д а Е.

3* Сравнение первичных структур трштичоских пентодов аланиновых субъединиц рицина Т г Д

Исследование аминокислотного состава и н-концевтгс аминокислотных последовательности пептидов,полученных в результате ферментативного гидролиза аланиновсй субъединицц рицина Т, дало нам возможность провести сравнение строения трштическпх пептидов с соответствующими пептидами В-иепи рицина Д и триптическими пептидами В-цепи рицина Е.

Таблица 7

Сравнение аминокислотной последовательности триптических пептидов аланиновых субъединиц рицина Т, рицина Д и рицина Е

Рицин Триптические!

пептиды !

Аминокислотная последовательность

С АХа-Аар -УаХ-СшОу в -¡¿е 1; ■Авр' -Рг<И а!»

Е АХа-Азр-\га1-СгаСуз-Пе1;- гАер -Рго- •?го41Хв-УаХтАга

С т-з АХа-/ 1р-Уа1~СтСуз-11в'Ь- [Агт -Рго- [ш -Рго-Ь-1и- 4агк

т о

ь

Е Т

I) Е Т

Л

Б $

V Е Т

Г)

Е 1'

Т-10

Т-14

Т-1Э

Т-12

Т-2

Г-2

ч-г

13

1Хе-УаХ-С1у-Аге-Азп-ЗХу-Ьеу-СпСуэ-УаХ

25 27 Азр-С-Ху-Лге .

Азр-31у-Аге

Авр-'Лу-Аге •

24

Ио-УсХ-аХу-Агй-Азп-аХу-Ьеи-СсСув-УаХ^Алр-'/аХ-Агз

Аир -Уп1-Аг§ А.чп-УаХ-Аге

?3

Р11э-Айп-Н1а|-а1у-Азп-(А1а-Х1в-а1Гж-1^Г РЬо-Авп-Н1в-ОХу-Авп4А1а-Х1е-СХп-Ьеи-А1а-Аао-Рго1-йХу-Авп-

Тгр

РЬз-Ьеи-5Хи-.Т.Хе|-7гр

Тгр-Рго

■Н1з

40

СпСуз-1уя

Рго -С:лСуз-1ув

СтСув-Ьув 53

Бвг-Аап|-1,пг-А8р-А1а4-Аэп-01а-Х«ви-а,гр)-№г-Ьеи-р5^|А1'е Бег-!Азп -ТЬ.г-Азр-АХа^ -Аеп-в1п-Ьви-Тгр|-Т!1Г-1еи--Ьу -Агд Яег-451п1-ТЬг-Аор-А1а-1-Адо-Азп-11е- -НТЬг-Хаи-)-_^Агд

54 __Ъ5

Авр-Аан-Ч г-1Хе|-Агй-Зег4'йш1-(>Ху-7,у8-СпСуа4^еа|-ТЬг-Аар-Азп- 'Пгг-ХХе^Аге-Еег^Аеп -аХу-Ьуа-0шСуа|Хеи4-ТЬг-Азр-Азп- 3ег-Ьои|-Ага-3ег^Аьр -ОХу-Ьу п-С'.лСув 4У пХ-Х'пг-

66 III- , ~^ 77

Тпг- Туг-,гЦХу]-1уг-Рго-Зег^01у-Уа1-Туг-У зХ-Ые-Ь-ХХе-ТЫ-Туг- ОХу -Tyr-Pro-Зer-аXy-VaX-,Pyr-VaX-I,;et-IXc-ТПг-Туг41^^1-Туг-Рго-5ег-0Ху-7аХ-,1уг-\,в1-1,:е1-ХХе-

т£х4Жр|Сп)Су в -Азп-ТЬг-А1е.}А1аг ТЬг-рГБг}-А1а|"«оТ)*-

пи,« I Л ПЧ*-« - /. 1 лХ 41 .Л т-| - Л 1 г.Хп'Ьтч- *< -г".

Туг|Аар|С1иСув-Аап-ТЬг-А1а7АХа|-'1'ЬГ"Аор Тугуяту-С1п0уэ-А8П-ТЬг--А1а'|- КХЧиЧое,

■АХа-|1'Иг*-Ага

т

D

I] T

D

T

D E œ

3) E ï-

D E

D S T

D

à!* f

D

E T

D

E

D 'E T

D --S0. r* n I-Glu-

Ü Trp- ■om.

T Ï-4 ■GXu

1) доз. OCi1- •Sor-

3 Sur' -Sfct-

ïï Ï-1 [гь^ 113 D ЛЕ.П- -3ar -Cer

В Asn -Ser

que

Продолжение

табл.7 ,.Ю2

T-1-4

-1-4

T-l-3

2-1-5

T-1-б

T-1-6

Т-б

- T-6

т-п

T-8

rie-a'i-p-A3ri-¿¿a-03y-Thr-IXe|jle~.\on-Pro+Ar¿ Ile-îrp~Asp-Asn-01y-3?!ir-Ilô-rXle~Aan-rro+Ars

Ile-ïrp-A[in-Asn-'.!ly-ïhr-J.Xe|Leu-01u- 4Arg ____________jpg--

•3or-Lcju-Vcl4Leu-Ala-Alc.-14ir-Ccr-Gly"f

■Lau-Vax|ljeu-Ala-Al£.-îhr-S e r-GXy j

bea-VfO.+Aap-ïhr Leu-Gln-Arg |

L------------------ir5

Gly~Thr-rihr-I,eu-ï:ii--Yo.l~ain-Thi--Asn-IlB-ïyr-

■l'Xy

Aon-Ser-Gly. '"S

ihr-Thr-Lev-îhr-Yс

ïhx-~ïhr-Lou-ïhi,~V aX-Gln-'i'hr-Asn-I le-Tyr-■Thr-'ihr-beu-Thi^-Val-GXn-Ttir-Asn-lXe-ïyr-132 Leu

úla-f Л?.

133 QîiC •' ' 141

Pae-ïhr-iîun-Asji-Thr-Gln-rro-Trjv-VnX

A3.a-fTtXi- S er-RîШрGly-Pr и ' ~ '-УйХЬЗегЦаХпгС .y-Trp-Lsu

■Uicr-Г ' qiío •

i-Gly-Pro-Leu

rro-'.l'hr-Aon-Asri-î'hr-GXn-Pro-Phs-v'aX ri-O-ïhr-Asn-Aaii-Chr-Gln-Pro-'P.i.T-VaX 15ÍL 148

hrXTlir-I X e-V al-GXy-Leu-Tyг ¡'.?hrf'i'hr-IXe-Ve.X-GXy-iiei;-ïyr

! Ai&fï.'ar-Xle-VnX-GXy -Leu-Туг _

Gly-Loii-CaGy3-Iieu-|IiXnrAXti-Aan--Ser-CiXy-GXn-VüX-Val-Iie-Cly-Î.Ist-CïiCyr-l,eu-iGlnj-Aln-Asn-Ser-Gly-Lye~V&X-Tx,p-Lou-GXy-Leu-CmCya-Leu-Glui-Ala-/nn-Ser-GXy-GIn-Val-Vc.X-Ilc-

162 • 163

Glu-Asp-Ser-CtuCyts-Ser-CXu-Lys

fllu-A3p-CBj0ys-íhr-Ser-Glai-I¿-a . .

Glu-Asp-Ser-CmCyB-Sor-UXu-Lya

169 --------182__

AXa-Glu-GXn4-GXn -Srp|Ala-Leu-Tyi,-Ala-Sor-GXy-Asn-IXe-Aon-AXa-GXu-GXn4-GXnj-ï.tp+AXa-Leu-Tyr-AXe.-ABp-Gly-Ser-IXe-Ai'g-

AXp.-GXu-GXn-fc__j-îrpfAap-Glu-'. ■Ji-GXy-lXQ-Lsu-Tyr-AXa-Ser-

-ЧЭЗ--г-_18'7___

190

Pro-Glr.-Gln-Arg-Arg" Pro-Gln-Gln-Aen-Arg ЦХу-Азр- -Leu-Lyp-AHn-Thr-Leu-GXa-Ar¿;

Acp-Aan-CmCys-Lau-Tiir-Ser-Aap-Ser-Aon-IXa-Arg Aap-Aun-OmCytt-Leu-Thr-Thr-Acp-AXa-Aan-IXe-Ii/c Aßp-Aen-CmCys-Leu-Thr-Ser-Aep-Ser-Aan-Ils-Are 203

(Sluj-ïhr-Vel-VaX-LyB

ÛXyj-Thr-Val-VaX-Lyc GlyKi'hr-VaX-YaX-Lya

Ile-Leu-Scr-CniCya-Gly-Pro-Ala-tüRr+Ser-Gly-Gln-Ärs Ils-ldu-Sor-Cr.OyG-Gly-Pro-AXa-j-StíT -Sa-^-GXy-GXu -A-'g IX e-Leu-3 er-CciCy e-Gly-f ro-Aln- ■ïhrj-S er~Giy «Olli- A.rg

215

UT3-1

ÜTO-З

UT8-2

D

E T

D

T?

T D

jJj

T

216 219 Try -Ii e t-Phe-Xiya Tip-Met-Pho-Lys 'iip-Msfc-Phc-Lya 220___

АзптЛяр-i-Gly-Xhr-Aen-j-Anp-j-G ly-l'hr-AentS 01-f 0 ly-Thr-

im?-Leu-Anp-Val-Val-Leu-Asp-Vol-VaX-Leu-Asp-VaX-

237 __

Ala-Ser-j-AepiPrc-Arg-SeïjAsp-j-Prc-Ala-Serj-Aon-j-Pro-

2-И 1 _

G'lnj-Ilorlle

Ile-

Ile Ile

Продолжение таол.7

231

-liau-i-Aôii--i.éuj'jJy xj-O er-(îly3 LouLou ri Аеп- Uly 4 Le ц-f'X'yr+Ann-Acp-j-Lsu-

-Lau-j-Aon.-

■uSU-jAsn-■Lou+

Ч; Are

■Her-■Serrer-

■Leu-Val' ■ -Lau-

-ïyr-

:yr-.

243 -Leu-Xyo -leu-Lya -Leu-Lys

■Pro-f Leu-•Pro-j-Val-ProlVel'

T—9

G3n -Ilfîf-Ile Glu -Ile

i—2 53-----

Hlo-Asp-Pro-Asm-Gln-Leu-Ile-

Asn-Leu- .sn-Gln-IXe-Trp-Lsu-

Ann-Glu-Pro-His-Lcu-Asp-Ilc-

■¿y¿

Trp-GXy-His-üly-■Trp-aiy-

-2б2-

-Leu-Pro-Phe.

-Pro-Lsu-Phe. I

-Leu-Pro-Phe-Leu-Gly-Ssr.

9

» _ _

В рамки заключены отличающиеся участки пептидных цепей сравниваемых последовательностей.

Совокупность полученных данных позволила представить предполагаемую аминокислотную последовательность аланиновой субъединицн рицина. Т. По налим данным пна отличается от B-цепи рицина Д в положениях 6, 8, 38,42,52,60,64,63,79,84,86,88,90,91,103,127,129,142, 153,172,199,211,221,239,244,243 и последовательностью аминокислотных остатков на участках 10-11,28-30,33-3.6,46-49,56-57,99-101,107-112, -172-187,226-227,229-230,250-251 и 2-53-262. Здесь имеются'14 делений, 65 замен я 2 вставки. '

Таким образом, из 26? аминокислотных остатков аланиновой субьеди-иици рицина Д последовательность 191 остатков идентична,что составляет 75/» таковой для рицина Т. При этом часть замен представлена

структурно близкими аминокислотами типа Asp «—> Aen, Glu 4_у Gin,

Lys f—>- Arg, Leu с—!" IXe, Ser*—* ïhr, Leu«—»-Val ß Xle <—Wol.

С учетом этого факта структурная гомологичнооть молекул аланиновых субъединиц рицина Т и Д Еыше 75$ и составляет примерно 36$.

Различая н сходство в структуре и биологических свойствах изо--тслскнов позволяли продподоаить,что изофорш возникли в процесоо

оьолюцци из общего предшественника ив результате мутации приобрели различающиеся гены.Однако неизвестно, как связана биологическая активность рицина с их структурой, какие функциональные группы ответственны за токсичность,какие структурные особенности обусловливают клеточную специфичность. Следует отметить, что даже незначительные отличия в строений молекул могут существенно изменить биологическую функцию изстсксинов.Кроые того,для проявления биологической активности е&тшя. и кснДюрмац. л молекулы рицина.Поэтому отличия в аминокислотной последовательности существенно изменяющие пространственную структуру молекулы,могут достаточно сильно сказаться на взаимодействия с соответствующим рецептором.

ВЫВОДЫ

1.Впервые из седин среднеазиатской клещевины выделена новая разновидность рицина- рицин Т с молекулярной массой 58 кДа,р1 7-7,1 и

.: коЭ'Т&ицпентом седиментации 4,6СБ ,по токсичности превышающей рицин Д,Е в Р. раза и рицин-варианта - в 3 раза.

2.Показано,что радмн-Т состоит из двух неидектичних субьединиц, соединенных дисульфидной связью,имеющих на Н-концах остатки алашша и язолейцина.и является изоформой известных рицинов,

3.Иг\че"ы физико-химические свойства обеих субъединиц рицина Ш и установлено,что изолейцинсвая цепь идентична аналогичной цепи -рицина Д, Е и рицина-варианта.В аланиновой цепи рицина Т обнару-. жены отличия в аминокислотном составе и последовательности аминокислотных остатков на С-концевом участке полипептидной цепи.

4.Проведен триптичесгаЛ гидролиз восстановленной и карбоксиметили-рованной аланиновой цепи рицина Т.

Выделено 14 пептидов составляющих в суше 256 аминокислотных . остатков.Установлено аминокислотная последовательность всех трип-тическйх пептидов.

5.Сравнение аминокислотной последовательности полученных фрагментов с известной структурой В-цепи рицина Д позволило впервые обна- . ру;:;и?ъ отличие в пептидных цепях сравниваемых молекул,и показано, что гомолегичнооть аланиновых субъединиц с учетом структурно сходных замен аминокислот достигает 86$.

С.Изучение первичной структуры и биологических свойств рицина Т позволило усовершенствовать методику его выделения. Данная усовершенствованная методика используется в производстве для получения концентрата рицина. , '

Основные результаты работы изложены в следующие статьях я докладах:

1. Хашимов Л.А.,Алимов Х.Г. .Ддалилов Б.Д.,Юлдашев П.Х. Г>елкя семян Ricinus communis L.I.Изучение водорастворимых белков семян и

шрота Ricinus сопшшпХаьУ/ Химия природ.соедш.- 1986.-.£5.-С. 630-631.

2. Хашимов Д.А. .Алимов Х.Г. .Юддашез П.Х. II.Выделение и сравнительная характеристика кислого рицина, Ï из семян среднеазиатской клещевины.// химия природ.со^дин.- 1987.- й 6.-С.883-887.

3. Хашимов Д,А.,Алимов Х.Г.,Юлд зев-П.Х. III .Выделение и характеристика двух составных полипептидных цепей кислого рицина Т,// Химия природ.соедян. - 1987. - & 6. -С.887-892.

4. Алимов Х.Г.,Хашимов Д.А. .Юлдаиев П.Х. Изученге первичной структуры аланиновой цепи кислого рицина Т из семян среднеазиатской клещевины. // Тезисы и докладов 711 Всесоюзный симпозиум по химии белков я пептидов. Таллин - 1987 г.

5. Хашимов Д.А.,Алимов Х.Г.,Юлдашев П.Х. 1У.Аминокислотная последовательность ai. липовой субъединицн рицина Т сеглян среднеазиатской клещевины.Пептиды ограниченного триптического гидролиза.

// Химия природ.соедин. - 1988. - й 2. - С.243-248. " ' •"

6. Хашимов Д.А.,Алимов Х.Г.,Юлдаиев П.Х. У.Первичная структура . аланиновой субъединицы рицина Т семян среднеазиатской клещевины. Пептиды бромцианового расщегагенж.// Химия природ.оондин.- 1988. - ß 6. -С.845-848. " . •

7. Хашимов Д.А.,Алимов Д.А.,Юлдашев П.Х, Первичная структура аланиновой субъединицы рицина Т и выделение двух форм агглютинина из семян среднеазиатской клещевины. // Изучение и применение Г лектинов. - 1989. - T.I. -C.I84-I9Ï.

8. Khashimov D.A. «Alisiov Kh.G. .UldaaheVP.ZCh.// Primary ptrueturo of Ala-chain of ricin T.//Eleventh International lcctin conference. - Tartu - 1SÖ3. - Р. 32.

9. Хашимов Д.А.,Алимов Х.Г..Хугабактова S.A..Юлдашев П.Х. Метод обнаружения рицина.// Пищевая промышленность. - 1989, № II. - 0.55.

Соискатель ^^^ Алимов Х.Г.

су/

Подписано в печать —Д .

Формзт бумаги ^0Х847и- Бумагатипографская № 1. Печаи, «РОТАПРИНТ». Объем Тиран; /РР экз. Заказ У О,

Т|.'п01'раф|.н издательства «Фан» АН УзССР 700170. Ташкент, пр. Л1. Горького, 79,