Изучение взаимодействия люциферазы светляков Luciola mingrelica с субстратами и их аналогами методом флуоресцентной спектроскопии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

Власова Татьяна Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Lucióla mingrelica С СУБСТРАТАМИ И ИХ АНАЛОГАМИ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

02.00.15 - катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003176909

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова.

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор

Химический факультет МГУ имени М В Ломоносова

Угарова H H

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

Химический факультет МГУ имени М В Ломоносова

Чухрай ЕС

доктор химических наук, профессор Институт биохимической физики РАН

Кузьмин В А

Ведущая организация:

Институт Биохимии им АН Баха РАН

Защита диссертации состоится « 25 » сентября 2007 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан « 20 » августа 2007 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность В настоящее время люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo Для расширения возможностей биолюминесцентного микроанализа возникла потребность в люциферазах, катализирующих эмиссию света в различной области видимого спектра Химическая схема биолюминесцентной реакции и структура излучателя (оксилюциферина - OL) идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых, при этом максимумы спектров биолюминесценции варьируются в интервале 540-620 нм, что зависит от свойств микроокружения излучателя, локализованного в активном центре фермента В связи с этим, изучение физико-химических свойств активного центра имеет важное фундаментальное и практическое значение

Несмотря на то, что известна кристаллическая структура молекулы люциферазы светляков и строение ее активного центра в отсутствие и в присутствии субстратов и продуктов, нет полной и однозначной информации о влиянии микроокружения в активном центре на спектры испускания OL Наиболее удобными и информативными для исследования люциферин-люциферазной системы светляков являются флуоресцентные методы, так как субстрат -люциферин (LH2) и продукт (OL) обладают флуоресцентными свойствами Однако OL нестабилен в водных растворах, поэтому в качестве модели излучателя актуальным является использование его аналогов диметилоксилюциферина (DMOL) и монометилоксилюциферина (MMOL)

Известно, что окончательное формирование активного центра, а, следовательно, и микроокружения излучателя, происходит только после присоединения обоих субстратов (LH2 и АТР) в результате конформационных изменений с образованием «закрытой» структуры, однако роль каждого субстрата в этом процессе не известна Таким образом, актуальным является выяснение роли каждого субстрата в изменении конформации люциферазы при формировании ее активного центра

К конформационным изменениям в белках весьма чувствительна флуоресценция остатков Тгр и Туг Флуоресценция единственного остатка Тгр люциферазы Lucióla mmgrelica успешно использовалась в качестве маркера, при

изучении взаимодействия люциферазы с люциферином и его аналогами Флуоресценция 19 остатков Туг люциферазы до настоящего времени не исследована Однако, преобладающее число остатков Туг, согласно литературным данным, позволяет предположить существенный вклад тирозиновой составляющей в собственную флуоресценцию люциферазы. В связи с этим, перспективным является использование флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы в качестве маркеров фермент-субстратных взаимодействий и сопровождающих их структурных изменений

Цели и задачи исследования* Цель работы - исследовать взаимодействие люциферазы с субстратами и их аналогами, с помощью флуоресцентных маркеров - диметютоксилюциферина и мономегилоксшпоциферина, а также собственных флуорофоров белка - остатков тирозина и триптофана

В соответствии с целью, основными задачами исследования являются

> Изучить спектральные свойства и стабильность DMOL и MMOL, показать возможность их использования в качестве флуоресцентных маркеров

> Сравнить спектральные свойства DMOL и MMOL в буферном растворе, в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазами светляков! mmgrelica

> Определить возможность использования флуоресценции остатков Туг люциферазы светляков L mmgrelica в качестве маркера фермент-субстратных взаимодействий

> Изучить влияние каждого субстрата на сродство люциферазы ко второму субстрату методом флуоресцентного титрования

Научная новизна. Показана возможность использования DMOL и MMOL в качестве флуоресцентных маркеров при изучении физико-химических свойств активного центра люцифераз светляков на основании подробного изучения их стабильности, спектральных свойств в растворителях и в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазами светляков L mmgrelica Объяснено появление желто-зеленой флуоресценции (Хет=500пм) в щелочных растворах LH2, OL и их аналогов за счет образования сходных по строению продуктов разложения Обнаружено, что в комплексе с люциферазой микроокружение DMOL обладает меньшей ориентационной поляризуемостью,

увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL Показано, что для люциферазы светляков Lucióla mingrelica характерна флуоресценция не только единственного Тгр, но и остатков Туг (Хт = 308 нм), которые использованы в качестве флуоресцентных маркеров при исследовании фермент-субстратных взаимодействий Обнаружены два центра тушения молекулой АТР флуоресценции остатков Туг, по-видимому, соответствующих аллостерическому и активному центрам люциферазы Показано, что связывание одного из субстратов затрудняет последующее присоединение другого субстрата

Практическая значимость работы. Показана возможность использования DMOL и MMOL, а также собственных флуорофоров белка (Туг, Тгр) в качестве флуоресцентных маркеров при изучении физико-химических свойств активного центра люциферазы и фермент-субстратных взаимодействий

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных конференциях 12-м и 13-м международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кембридж Великобритания, 2002 и Токио Япония, 2004), международной конференции «Биокатализ-2002» (Москва, 2002)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 101 ссылку Работа изложена на 129 страницах, содержит 34 рисунка и 9 таблиц

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Спектральные свойства и стабильность диметилоксилюцнферина и монометил оксилюцяферина

DMOL и MMOL - аналоги оксилюциферина (OL), содержащие две и одну СНз-группы, соответственно (рис 1) DMOL - может существовать только в кето-формах фенольной (/) и фенолятной (б) Для MMOL кето-формы маловероятны, однако возможно депротонирование по фенольной и гидрокситиазольной группам (формы 2-5)

|| I! И

=ххУ-ОСХЗХС

6 5 4

Рис. 1 Различные формы оксилюциферина и его аналогов оксилюциферин Я) = Л2 = Н, монометилоксилюциферин = СНз, 112 = Н, диметилоксилюциферин = = СН3

Спектры поглощения БМОЬ в буферных растворах, рН 6,0-9,6 (рис 2), указывают на существование кислотно-основного равновесия между фенольной (ЛаЫ = 383 нм) и фенолятной (Хаъ5 = 485 нм) формами с рК = 7,8 ± 0,1 в основном состоянии В возбужденном состоянии рК* фенольной группы значительно уменьшается (-3,9), и, следовательно, ОМОЬ существует только в фенолятной форме Действительно, при рН < 8,0 независимо от длины волны возбуждения (Хех) в спектрах флуоресценции наблюдался только один пик с максимумом (Х^,,) 639 нм, соответствующий флуоресценции фенолятной формы ОМОЬ (рис 3, а)

Рис. 2 Спектры поглощения БМОЬ при различных значениях рН (числа у кривых) Условия 0,05 М трис-ацетатный буферный раствор, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ Мв804, 20 мкМ ОМОЬ

При более щелочных pH появлялся второй пик в желто-зеленой области (рис 3, б) Причем, его интенсивность увеличивалась с ростом pH и во времени, тогда как интенсивность флуоресценции фенолят-иона DMOL уменьшалась Кроме того, при pH > 8,0 для DMOL наблюдалось существенное поглощение при 300-450 нм, тогда как доля фенольной формы вещества составляла при этих pH менее 2% Рассчитанные кэфф при pH 10,5 по уменьшению оптической плотности исходного раствора DMOL и по увеличению интенсивности желто-зеленой флуоресценции были близки, что указывает на образование нового флуоресцирующего продукта в результате разложения DMOL

Спектры поглощения MMOL регистрировали в буферных растворах при pH 69 (рис 4) При уменьшении pH раствора максимум поглощения (>^bs) сдвигался в сторону меньших длин волн от 440 нм до 375 нм, однако изобестичесхой точки не наблюдалось, что свидетельствует о присутствии более двух форм MMOL Спектры поглощения указывают на достаточно узкий интервал pH существования различных форм MMOL Разложением спектров на функции Гаусса показано, что изменения в спектрах поглощения при уменьшении pH обусловлены переходом от дианиона (рис 1, 4), X.ibs = 440 нм к моноаниону (рис 1, 3), Xabs = 400 нм и нейтральной форме (рис 1, 2), = 375 нм, с рК = 6,3±0,1 и 7,7±0,1 для гидрокситиазольной и фенольной групп MMOL соответственно Таким образом, значения рК для фенольной группы MMOL, DMOL и OL близки между собой и равны 7,7±0,1 Фенольная группа MMOL, так же как и DMOL, при возбуждении становится более кислой с рК* = 2,5 и в спектрах флуоресценции MMOL при pH 6,0 - 9,0 наблюдается один пик с ХС!П= 550±5 нм, соответствующий дианиону (рис 1, 4) Изучена стабильность DMOL и MMOL в буферных растворах и показано, что скорость процесса превращения зависит от pH раствора (табл 1) В pH-оптимуме каталитической активности люциферазы светляков (pH 7,8) период полу превращения MMOL составляет 1 ч, а DMOL - более 8 ч, что позволило использовать MMOL и DMOL в качестве флуоресцентных маркеров для изучения люциферазы

X, нм

Рис. 3 Спектры флуоресценции БМОЪ при различных значениях рН (числа у кривых) Условия 1 мкМ ДМОЛ, Х„= 383 нм, рН < 8,0 (а), рН > 8,0 (б) Другие условия те же, что на рис 2

Рис. 4 Спектры поглощения MMOL при различных значениях pH (числа у кривых) Условия 10 мкМ ММОЛ, другие условия те же, что на рис 2

Таблица 1 Константы скорости реакции превращения диметилоксилюциферинз и монометилоксилюциферина при различных рН

pH DMOL MMOL

к э4Ф Ю2, мин"1 t1/2, мин к.з44 10z, мин'1 tj/2, МИН

6,0 - - 1,00 70

7,8 0,13 530 1,10 65

9,0 0,18 385 0,15 475

10,5 1,50 46 - -

Инкубацией DMOL, MMOL и LH> в щелочном растворе (pH >12) были получены продукты их разложения. Спектральные свойства продуктов при pH 3 -12 были одинаковы (табл 2) В спектрах поглощения во всех случаях наблюдались только два пика с четкой изобестической точкой, что указывает на присутствие только двух форм продуктов с рК = 8,8 и рК* = 1

Таблица. 2. Спектральные свойства продуктов превращения LH2, DMOL и MMOL

pH ^•abs> HM Km, HM

<8,8 310 520

>8,8 350 500

Полученные продукты превращения были стабильны, спектр не изменялся в течение 8 ч в изученном диапазоне pH Сходство спектральных свойств продуктов превращения DMOL, MMOL и LH2 указывает на их сходное строение Было показано, что продукты отличаются только числом метальных групп На основании анализа литературных и полученных нами экспериментальных данных предложена структура продуктов разложения DMOL и MMOL в водных растворах

с | ж. где R,=R2=CH3 - продукт превращения DMOL, " HS/ Ri Ri=H, R2=CH3 - продукт превращения MMOL

Показано, что спектры флуоресценции DMOL и MMOL чувствительны к составу растворителя С уменьшением ориентационной поляризуемости (Af) растворителя максимум флуоресценции DMOL сдвигался в коротковолновую область спектра (табл 3) При этом спектры возбуждения не изменялись, следовательно, структура излучателя не изменяется Сдвиг обусловлен неспецифическим (диполь-дипольным) взаимодействием DMOL с растворителем, в результате которого происходит изменение разности энергий между основным и возбужденным состояниями DMOL

Для MMOL в этаноле и диоксане наблюдали смещение по сравнению с буферным раствором, в сторону коротких длин волн до 450 и 437 нм соответственно, при этом в спектрах возбуждения наблюдали один пик с = 375

нм, соответствующий нейтральной форме (рис 1, 2) Следовательно, в этих растворителях в основном и возбужденном состоянии MMOL существует только в нейтральной форме, в отличие от водного раствора, и флуоресцирует в голубой области спектра Уменьшение MMOL в диоксане по сравнению с этанолом, обусловлено меньшей ориентационной поляризуемостью диоксана

Таблица 3 Максимумы флуоресценции (Хеш) DMOL в растворителях с различной ориентационной поляризуемостью, в присутствии 3% триэтиламина

Растворитель е п М Km, "М

Вода 78,30 1,33 0,32 639

Этанол 24,55 1,36 0,29 623

Ацетон 20,56 1,36 0,28 622

Метилэтилкетон 18,51 1,38 0,27 622

Дихлорметан 8,93 1,42 0,22 604

Этилацетат 6,02 1,37 0,19 600

Таким образом, DMOL и MMOL обладают характерными флуоресцентными свойствами, достаточно стабильны в pH-оптимуме каталитической активности люциферазы светляков Флуоресценция DMOL и MMOL чувствительна к эффектам микроокружения Следовательно, они удовлетворяют требованиям, предъявляемым к флуоресцентным маркерам В качестве модели оксилюциферина, существующего в шести формах, актуально использование обоих эффекторов, поскольку DMOL существует только в форме кетона, в MMOL - только в енольной форме

2. Взаимодействие люциферазы светляков с диметилоксилюциферином и монометилоксилюциферином

Показано, что DMOL является сильным ингибитором люциферазы, К, = 10 мкм Тип ингибирования зависит от соотношения концентраций субстратов люциферазы (АТР и LH2) (табл 4) При низкой концентрации АТР диметилоксилюциферин конкурирует с LH2 за связывание с люциферазой, следовательно, DMOL связывается в области, близкой к центру связывания LH2 В присутствии избытка АТР ингибирование по LH2 неконкурентное, то есть центры связывания DMOL и LH2 в этом случае не совпадают, что может быть связано с

изменениями в активном центре люциферазы при образовании комплекса с АТР Характер ингибирования люциферазы совпадает для DMOL и оксилюциферина Следовательно, для DMOL правомерна кинетическая модель ингибирования люциферазы оксилюциферином, предложенная ранее (Бровко Л Ю ВИНИТИ Итоги науки и техники Биотехнология 1988, 14, 155) Таким образом, DMOL связывается со свободным ферментом и с комплексами Е-АТР и E-ATP-LH2, однако не существует комплекса E-LH2-DMOL

Таблица 4. Ингибирование люциферазы DMOL

Условия Тип ингибирования

[LH2] « Km(LH2) [ATP] « КЩАТР [LH2] » Km(LH2) f ATP] » KmATP Неконкурентное по ATP Конкурентное по LH2 Бесконкурентное по АТР Неконкурентное по LH2

Показано, что DMOL и MMOL, так же как LH2, тушат флуоресценцию остатка Тгр при образовании комплекса с люциферазой Методом флуоресцентного титрования рекомбинантной люциферазы светляков и ее мутантной формы (His433Tyr) люциферином, диметил- и монометилоксилюциферинами были получены зависимости интенсивности флуоресценции Тгр от концентрации эффекторов и по уравнению Штерна-Фольмера рассчитаны константы диссоциации (К,) комплексов в диапазоне pH 6,5-9,0 Зависимости величин Kg от pH для каждого случая представлены на рис 5 В этом диапазоне pH эффекторы присутствуют в протонированной и депротонированной форме, рК = 8,5 для LH2 (Гандельман О А и др Биохимия 1990, 55, 6, 1052), рК =7,8 для DMOL и MMOL

60

1 50

3

^•40 30 20

6789 6789 В 7 8 У

1«

Рис. 5 Зависимость констант диссоциации комплексов исходной (светлые точки) и мутантной (His433Tyr) (темные точки) люциферазы с LH2 (а), DMOL (б), MMOL(b) от pH

а

В соответствии с полученными данными, протонированные формы эффекторов лучше связывались как исходной, так и с мутантной люциферазами, по сравнению с депротонированными Сродство исходной люциферазы к LH2 выше, чем к DMOL и MMOL Вероятно, наличие дополнительных метальных групп в молекулах DMOL и MMOL создает стерические затруднения при связывании их с ферментом DMOL имеет большее сродство к мутантной люциферазе, чем к исходной при щелочных pH, a MMOL - во всем изученном интервале значений pH Это объяснено известными из литературы (Угарова Н Н и др Биохимия 2005, 70, 11, 1534) данными о более подвижной структуре активного центра мутантной люциферазы, по сравнению с исходной В связи с чем, в меньшей степени проявляются стерические затруднения при связывании DMOL и MMOL мутантной люциферазой

Спектры флуоресценции DMOL и MMOL регистрировали при pH 7,8 в отсутствие и в присутствии рекомбинантной люциферазы светляков Lucióla mmgrelica и ее мутантной формы (His433Tyr) В соответствии с рассчитанными значениями К, около 50% эффектора было связано в комплекс с ферментом В растворе исходной люциферазы максимум флуоресценции DMOL смещался в коротковолновую область от 639 нм до 619 нм, при этом возрастала интенсивность флуоресценции (рис 6) Еще больший сдвиг наблюдали для DMOL в присутствии мутантной люциферазы (до 614 нм), еще выше была и интенсивность флуоресценции В обоих случаях не наблюдали изменений в спектрах возбуждения DMOL Следовательно, излучающей частицей в комплексе с люциферазами, как и в буферном растворе, является фенолятная форма DMOL (рис 1, б) Коротковолновый сдвиг Ход DMOL, без изменения вызван неспецифическими эффектами микросреды и указывает на уменьшение ориентационной поляризуемости (Af) микросреды активного центра люциферазы По-видимому, микросреда активного центра мутантной люциферазы характеризуется меньшим значением Af по сравнению с исходной люциферазой

400

3

Рис. 6. Спектры флуоресценции БМОЬ в буферном растворе (/), в растворе исходной (2) и мутантной (3) люцифераз Условия 20 мкМ БМОЬ, 50 мкМ исходная люцифераза, 35 мкМ мутантная люцифераза, 0,05 М трис-ацетатный буферный раствор, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ [У^а,, 1 мМ ДТТ, рН 7,8, ^ = 485 нм

^"300

U

200

100

О

550 600

650 700

X, НМ

Для MMOL в присутствии исходной и мутантной люциферазы наблюдали сложный спектр с \т = 450 нм и плечом в длинноволновой области спектра (рис 7) При разложении спектра на функции Гаусса были идентифицированы два компонента >.„„ = 550 нм, соответствующий не связанному с ферментом MMOL, и Хеш = 450 нм, соответствующий MMOL в комплексе с люциферазой Следовательно, при образовании комплекса с люциферазой Xem MMOL сдвигается в коротковолновую область на 100 нм, по-видимому, вследствие изменения структуры излучателя при образовании комплекса MMOL-люцифераза

Это предположение было подтверждено анализом спектров возбуждения при pH 7,8 для MMOL в буферном растворе и в присутствии люциферазы (рис 8) Действительно, в буферном растворе спектр возбуждения MMOL представлял собой суперпозицию спектров с лех = 400 и 440 нм (рис 8, я), соответствующих моно- и дианиону MMOL (рис 1, 3-4), а в растворе люциферазы - суперпозицию спектров с Хсх = 375 и 400 нм (рис 8, б), соответствующих, протонированной форме и моноаниону MMOL (рис 1, 2-3) Сдвиг равновесия от ди- и моноаниона к моноаниону и протонированной форме MMOL при связывании с люциферазой обусловлен специфическим взаимодействием MMOL с полярными аминокислотными остатками активного центра люциферазы, в результате которых увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL Отмечено, что спектры возбуждения MMOL в растворе люциферазы (pH 7,8), аналогичны спектрам возбуждения MMOL в буферном растворе при pH 6,8 Таким образом, флуоресценция MMOL может служить индикатором для характеристики эффективного микро-рН в активном центре люциферазы

Показано, что для DMOL и MMOL в комплексе с люциферазой характерна поляризация флуоресценции (0,26 и 0,32, соответственно) Следовательно, комплексообразование DMOL и MMOL с ферментом затрудняет свободное вращение электронно-возбужденных молекул излучателя

500

600

X, нм

700

Рис. 7 Спектры флуоресценции MMOL в буферном растворе (./), в растворе исходной (2) и мутантной (5) люцифераз Условия 10 мкМ MMOL, = 392 нм, другие условия те же, что на рис 6

Рис. 8 Спектры возбуждения MMOL в растворе люциферазы, = 450 нм (а), и в буферном растворе, Хет=550 нм (б) Экспериментальный спектр (У) разложен на функции Гаусса, соответствующие протонированной форме (2), моноаниону (3) и дианиону MMOL (4)

3. Влияние субстратов и их аналогов на собственную флуоресценцию люциферазы светляков

Спектры собственной флуоресценции люциферазы регистрировали при Хех = 275 и 295 нм (рис 10) Спектр флуоресценции люциферазы при — 295 нм имел один максимум Хт = 340 нм, соответствующий остатку Тгр, и небольшое плечо в более коротковолновой области Разложением спектра на функции Гаусса было показано, что он представляет собой суперпозицию двух компонентов с А.ет = 308±3 и 340±2 нм (рис 10, а) Предположили, что пик с Х^ = 308±3 соответствует флуоресценции остатков Туг люциферазы

Рис. 10. Спектры флуоресценции люциферазы Хсх = 295 нм (а), = 275 нм (б), экспериментальный спектр (1) разложен на функции Гаусса, соответствующие флуоресценции остатков Туг (2) и Тгр (3) Условия 0,05 М трис-ацетатный буферный раствор, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ М§804,1мМ ДТТ, рН=7,8, 20°

Для проверки этого предположения регистрировали спектр флуоресценции в максимуме поглощения тирозина (Ясх = 275 нм), который так же представлял собой суперпозицию двух компонентов с Хт = 308 ± 3 и 340 ± 2 нм, при этом существенно возрастал вклад компонента с Х^ = 308 нм в суммарный спектр (рис 10, 6) Различие спектров возбуждения люциферазы при Хет = 308 и 340 нм так же подтверждало флуоресценцию остатков Туг Таким образом, впервые показано, что для люциферазы светляков £ пн^геНса характерна флуоресценция не только остатка Тгр (Хт = 340 нм), но и остатков Туг (Хст = 308 нм)

Отмечено, что вклад флуоресценции Туг в молекуле люциферазы существенно ниже, чем для модельной смеси триптофана и тирозина в воде, что свидетельствует о тушении флуоресценции большинства остатков Туг Компьютерный анализ ближайшего окружения (5 À) 19 остатков Туг в трехмерной структуре люциферазы показал, что микроокружение большинства остатков Туг может способствовать тушению их флуоресценции вследствие переноса энергии на остаток Tip, образования водородных связей с фенольной группой остатков Туг, ионизации в основном и возбужденном состоянии фенольной группы за счет близко расположенных остатков Asn, Gin, Glu, Asp, Lys, Arg Остатки Tyr98, Туг342, не участвуют в перечисленных взаимодействиях и, вероятно, вносят основной вклад в спектр флуоресценции люциферазы

Изучено влияние субстратов на флуоресценцию остатков Тгр и Туг люциферазы Методом флуоресцентного титрования получены зависимости интенсивности флуоресценции остатков Туг и Тгр от концентрации LH2 (рис 11) Экспериментальные данные обрабатывались методом нелинейной регрессии в соответствии с уравнениями для полного (1) и неполного (2) тушения флуоресценции

I = Io/(l + [Q]/Ks) (1)

I = I0 (1-f [Ql/ttQl + K,)) (2)

где [Q] - концентрация тушителя, Io и I интенсивность флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя, соответственно, / - доля начальной флуоресценции, доступной для тушения, Ks - константа диссоциации комплекса люциферазы с тушителем

Полученные данные хорошо описывались уравнением (2) для неполного тушения, с коэффициентом корреляции не менее 0,99, откуда были рассчитаны значения f, характеризующие долю доступной для тушения флуоресценции, и Ks комплекса люциферазы с LH2 (табл 5) Оказалось, что LH2 более эффективно тушит флуоресценцию Тгр по сравнению с флуоресценцией Туг Значения Ks сопоставимы со значением Кш = 11,5 ± 2,7 мкМ, полученным ранее для нативной люциферазы (Дементьева Е И идр Биохимия, 1986, 51, 130)

Рис. 11. Зависимость интенсивности флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы от концентрации LH2 в отсутствие AMP (темные точки) и в присутствии 130 мкМ AMP (светлые точки)

Таблица. 5. Значения Kg и f для комплекса люциферазы с люциферином, рассчитанные методом флуоресцентного титрования остатков Туг и Тгр в отсутствие и в присутствии 130 мкМ AMP

Флуоресцирующий Е Е AMP

остаток К,, мкМ f,% Ks, мкМ f,%

Туг 10 ± 1 55 ±2 30 ±1 61 ±1

Тгр 7± 1 75 ±4 20 ± 1 83 ±2

Получены зависимости интенсивности флуоресценции Туг и Тгр люциферазы от концентрации АТР и AMP (рис 12) Показано, что ATP (AMP) являются эффективными тушителями флуоресценции остатка Туг Экспериментальные данные хорошо описывались уравнением (1) при высоких концентрациях тушителя (35 - 300 мкМ) и уравнением (2) - при низких (< 35 мкМ) Рассчитанные методом нелинейной регрессии значения f и К* представлены в табл 6

Обнаружено два центра тушения флуоресценции остатков Туг с высоким сродством к ATP (AMP) (К, = 20 мкМ) и неполным тушением флуоресценции (40%) и с более низким сродством (К5(Атр) =110 мкМ) и полным тушением Центр с более низким сродством соответствует активному центру люциферазы, поскольку рассчитанные К* близки к величине Кт(Атр) = 130 ± 30 мкМ, полученной ранее (Дементьева ЕИ и др Биохимия, 1986, 51, 1, 130) кинетическим методом Таким образом, присоединение ATP (AMP) в активном центре люциферазы приводит к полному тушению флуоресценции остатков Туг Центр с более высоким сродством соответствует, по-видимому, аллостерическому центру связывания ATP (AMP)

1 о

0,5

0,0

Туг '

-о Тф

0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 [АТР(АМР)], мМ

Рис. 12 Зависимость интенсивности флуоресценции остатков Туг и Tip люциферазы от концентрации AMP в отсутствие LH2 (темные точки) и в присутствии 25 мкМ LH2 (светлые точки) и от концентрации АТР (темные треугольники)

Таблица 6 Значения IQ и f для комплексов люциферазы с АТР и AMP, рассчитанные методом флуоресцентного титрования остатков Туг и Тф люциферазы в отсутствие и в присутствии 25 мкМ люциферина

Концентрация Е e-lh2

Тушитель тушителя, мкМ К,, мкМ f,% К*, мкМ f,%

Флуоресценция остатка Туг

0-35 20 ±1 39 ±1 34 ±1 37 ±1

AMP 35-300 150 ±8 100 + 5 210 ±5 100 ± 1

0-35 20 + 3 40 ±2

АТР 35-300 110 ± 7 100 ±5

Флуоресценция остатка Тф

AMP 0-300 20+1 18 ± 1 Нет тушения

АТР 0-300 20 ±2 18±2

В присутствии АТР (AMP) наблюдалось незначительное тушение флуоресценции остатка Тгр Рассчитанные по уравнению (2) значения К* = 20±2 мкМ существенно ниже Кт (атр> и согласуются со значениями Ks, рассчитанными по тушению флуоресценции Туг при низких концентрациях АТР (AMP) Следовательно, слабое тушение флуоресценции остатка Тгр может быть связано с присоединением АТР (AMP) на аллостерическом центре люциферазы, а присоединение АТР (AMP) в активном центре люциферазы не влияет на флуоресценцию остатка Тгр

Рис. 13. Микроокружение остатка Туг342 в свободной люциферазе светляков Lucióla mingrelica (стержневая модель) и в комплексе с субстратами (шаростержневая модель).

Таким образом, остатки Тгр и Туг люциферазы являются флуоресцентными маркерами фермент-субстратных взаимодействий. Флуоресценция остатка Тгр чувствительна к образованию комплекса люцифераза-ЬН2 и не чувствительна к присоединению ATP (АМР) в активном центре люциферазы. Тогда как, флуоресценция остатков Туг доступна для тушения обоими субстратами. Сравнением третичных структур люциферазы в отсутствие и в присутствии субстратов (LH2 и АТР) обнаружено, что микроокружение остатков Туг98, 342 в присутствии обоих субстратов изменяется, при этом их фенольные группы участвуют в образовании водородных связей. Остаток Туг342 непосредственно образует водородную связь с гидроксильной группой остатка рибозы АТР, что может являться причиной тушения Туг флуоресценции.

Причиной наблюдаемого тушения флуоресценции Тут и Тгр могут быть так же конформационные изменения в молекуле люциферазы при образовании фермент-субстратных комплексов. В связи с этим интересно было выяснить, насколько повлияет связывание люциферазы с одним из субстратов на величину Ks и

эффективность тушения флуоресценции фермента вторым субстратом Для выяснения этого вопроса проведено последовательное флуоресцентное титрование люциферазы субстратами и получены зависимости интенсивности флуоресценции остатков Туг и Тгр от концентрации LH2 в присутствии 130 мкМ AMP (рис 11) и от концентрации AMP в присутствии 25 мкМ LH2 (рис 12)

Значения f остатков Туг и Тгр для комплекса ЕАМР при тушении люциферином увеличивались приблизительно на 10% по сравнению с таковыми для свободного фермента Значения Ks в присутствии AMP увеличивались по сравнению с таковыми для свободного фермента приблизительно в 3 раза (табл 5) На основании полученных данных сделан вывод, что основное влияние на сродство люциферазы к LH2 оказывает присоединение AMP к аллостерическому центру люциферазы

В комплексе ELH2 эффективность тушения флуоресценции остатков Туг молекулой AMP такая же, как для свободного фермента, тогда как флуоресценция остатка Tip становилась не доступной для тушения Значения К* увеличивались как для аллостерического, так и активного центров присоединения AMP (табл 6) Следовательно, образование комплекса люциферазы с LH2 приводит к уменьшению сродства как ашюстерических, так и активного центров люциферазы к AMP

Таким образом, связывание люциферазой одного из субстратов затрудняет последующее присоединение другого субстрата Это, по-видимому, связано с конформационными изменениями люциферазы при образовании комплекса с каждым субстратом

ВЫВОДЫ

1. Показано, что DMOL и MMOL обладают характерными спектральными свойствами, чувствительными к условиям микроокружения В рН-оптимуме активности люциферазы (7,8) DMOL и MMOL достаточно стабильны, связываются в активном центре люциферазы, в области, близкой к центру связывания субстрата - люциферина и продукта - оксилюциферина, что позволяет использовать DMOL и MMOL в качестве флуоресцентных меток для изучения физико-химических свойств активного центра люциферазы

2. Показано, что желто-зеленая флуоресценция = 500 нм), возникающая в щелочных растворах люциферина, DMOL и MMOL, обусловлена образованием стабильных, сходных по строению продуктов разложения субстрата и его аналогов

3. Методом флуоресцентного титрования определены константы диссоциации комплексов рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазы с DMOL и MMOL в диапазоне pH 6,5-9,0 Показано, что протонированные формы DMOL и MMOL лучше связываются рекомбинантной и мутантной люциферазами, по сравнению с депротонированными DMOL имеет большее сродство к мутантной люциферазе, чем к рекомбинантной при щелочных pH, a MMOL - во всем изученном диапазоне pH

4. Показано, что в комплексе DMOL-люцифераза микроокружение DMOL обладает меньшей ориентационной поляризуемостью по сравнению с буферным раствором, а в комплексе MMOL-люцифераза увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL Следствием этого является смещение максимума флуоресценции DMOL и MMOL в коротковолновую область на 20 и 100 нм, соответственно

5. Показано, что для люциферазы светляков Lucióla mingrelica характерна флуоресценция не только остатка Тгр (лет=340нм), но и остатков Туг (¡Vcm=308 нм) LH2 более эффективно тушит флуоресценцию Tip по сравнению с флуоресценцией Туг, в то время как АТР более эффективно тушит флуоресценцию Туг за счет образования водородной связи между остатком Туг342 и АТР Обнаружены два центра тушения АТР (AMP) флуоресценции Тут, по-видимому, соответствующих аллостерическому и активному центрам люциферазы

6. Методом последовательного флуоресцентного титрования люциферазы субстратами показано, что связывание одного из субстратов с люциферазой затрудняет последующее присоединение другого субстрата, что, по-видимому, связано с конформационными изменениями люциферазы при образовании комплекса с каждым субстратом

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Leontieva О V, Vlasova Т.Н, Ugarova N N, Weiss D Interaction of firefly luciferase Luciola mmgrehca with dimethyloxyluciferin // Proceedings of the 12th International Symposium on "Biolummescence & Chemilummescence Progress & Current applications", Cambridge, UK World Scientific Publishing Co Pte Ltd 2002, p 41-44

2 Leontieva О V, Vlasova T.H, Ugarova N N Interaction of firefly luciferase Luciola mmgrehca with dimethyloxyluciferin // Abstract of International Symposium cm "Biolummescence & Chemilummescence Progress & Current applications", 5-9 April, Cambridge, UK in J of Luminescence, 2002, v 17,№ 2,p98

3 Леонтьева О В , Власова Т.Н , Угарова Н Н Взаимодействие люциферазы светляков с дичетилоксшпоциферином И Вестник МГУ, Сер 2 Химия 2002, т 43, №6, с 363-366

4 Leontieva О V, Vlasova Т.Н, Ugarova N.N Interaction of firefly luciferase Luciola mmgrehca with dimethyloxyluciferin // Abstract of International Conference "Biocatalysis-2002 Fundamentals & Applications", Moscow, Russian Federation, 2002, June 22-27, p 109

5 Vlasova Т.Н., Leontieva О V , Ugarova N N Interaction of oxylucifenn analogs, dimethyl oxylucifenn and monomethyl oxylucifenn, with firefly luciferase // Abstracts of the 13'h International Symposium on "Biolummescence & Chemilummescence Progress & Perspectives", May-June, Yokohama, Japan inJ of Luminescence 2004, v 19, p 182

6 Vlasova T H., Leontieva О V, Ugarova N N Interaction of oxylucifenn analogs, dimethyl oxylucifenn and monomethyl oxylucifenn, with firefly luciferase // Proceedings of the 13th International Symposium on "Biolummescence & Chemilummescence Progress & Perspectives", 2-6August, Yokohama, Japan 2004, p 69-72

7 Леонтьева О В , Власова Т.Н , Угарова Н Н Диметил- и монометилоксилкщиферины как аналоги продукта биолюминесцентной реакции, катализируемой люциферазой светляков // Биохимия 2006, т 71, вып 1, с 65-69

8 Власова Т.Н, Леонтьева О В, Угарова. Н Н Взаимодействие диметил- и монометилоксилюциферина с рекомбинантной и мутантной люциферазой светляков // Биохимия 2006, т 71, вып 5, с 687-692

9 Власова Т.Н, Угарова Н Н Тушение флуоресценции Туг и Тгр люциферазы светляков Luciola mingrelica субстратами Биохимия 2007, т 72, вып 9, с 1182-1188

Подписано в печать 16 07 2007 г Исполнено 20 07 2007 Печать трафаретная

Заказ № 594 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Применение флуоресцентной спектроскопии для изучения физико-химических свойств макромолекул белков

1.1. Собственная флуоресценция белков

1.2. Метод флуоресцентных меток

2. Структура белковой глобулы и активного центра люциферазы светляков

2.1. Структура белковой глобулы

2.2. АТР-связывающие участки

2.3. Люциферин-связывающий участок

2.4. Микроокружение излучателя в активном центре люциферазы

2.5. Изменение конформации люциферазы в процессе биолюминесцентной реакции

3. Использование флуоресцентных методов в изучении биолюминесцентной системы люциферазы светляков

3.1. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов

3.2. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов в комплексе с люциферазой

3.3. Тушение собственной флуоресценции люциферазы в присутствии субстратов и их аналогов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Исходные вещества и рабочие растворы

2. Используемая аппаратура

3. Методики проведения экспериментов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Спектральные свойства диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина

1.1. Спектры поглощения и флуоресценции диметилоксилюциферина (DMOL)

1.2. Спектры поглощения и флуоресценции монометилоксилюциферина (MMOL)

1.3. Стабильность DMOL и MMOL.

1.4. Влияние растворителей на спектры флуоресценции DMOL и MMOL

2. Взаимодействие люциферазы светляков с диметилоксилюциферином и монометилоксилюциферином

2.1. Ингибирование люциферазы диметилоксилюциферином

2.2. Спектры кругового дихроизма (КД) рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазы светляков в отсутствие и в присутствии DMOL.

2.3. Флуоресцентное титрование рекомбинантной и мутантной люцифераз люциферином, диметил- и монометилоксилюциферинами при различных значениях рН

2.4. Спектры флуоресценции и возбуждения DMOL в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами

2.5. Спектры флуоресценции и возбуждения MMOL в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами

2.6. Поляризация флуоресценции DMOL и MMOL в комплексе с люциферазой

2.7. Спектральные свойства DMOL, MMOL, LH2 в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами в присутствии ATP (AMP).

3. Влияние субстратов и их аналогов на собственную флуоресценцию люциферазы светляков

3.1. Флуоресценция остатков Тгр и Туг в люциферазе светляков

3.2. Тушение флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы в присутствии субстратов

ВЫВОДЫ

Люцифераза светляков катализирует биолюминесцентную реакцию окисления люциферина (LH2) кислородом воздуха в присутствии аденозин-5'-трифосфорной кислоты (АТР) и ионов Mg2+. Излучателем в биолюминесцентной системе светляков является продукт реакции - оксилюциферин в синглетном электронновозбужденном состоянии [1-3]. Структура излучателя и химическая схема биолюминесцентной реакции идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых. Основное различие заключается в цвете возникающей биолюминесценции. Согласно литературным данным, существует взаимосвязь между структурой белковой глобулы люциферазы светляков и спектрами биолюминесценции. Цвет биолюминесценции зависит от свойств микроокружения излучателя, локализованного в активном центре фермента [4]. Таким образом, изучение физико-химических свойств микроокружения излучателя в активном центре люциферазы является одним из важных направлений фундаментального изучения люцифераз.

В настоящее время люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo [5]. Для расширения возможностей биолюминесцентного микроанализа возникла потребность в люциферазах, катализирующих эмиссию света в различной области видимого спектра. В связи с этим, изучение взаимосвязи структуры люциферазы и физико-химических свойств микроокружения излучателя имеет большое практическое значение.

Несмотря на то, что известна кристаллическая структура молекулы люциферазы и строение ее активного центра в отсутствие и в присутствии субстратов и продуктов реакции [6-8], нет полной и 6 однозначной информации о физико-химических свойствах микроокружения излучателя в активном центре и роли субстратов в формировании активного центра. Наиболее эффективным методом для изучения свойств микроокружения излучателя является флуоресцентная спектроскопия [9]. Субстрат и продукт биолюминесцентной реакции обладают флуоресцентными свойствами, в связи с этим данный метод успешно применялся ранее для изучения биолюминесцентной системы светляков [10-14]. Поскольку оксилюциферин в водных растворах крайне нестабилен [15], в качестве моделей излучателя использовались аналоги люциферина и оксилюциферина [10, 12, 16-19]. Такое моделирование не могло дать полной информации о свойствах микроокружения излучателя, так как известно [12], что микроокружение участков связывания люциферина и оксилюциферина не идентичны. Кроме того, у большинства используемых аналогов оксилюциферина были заменены функционально значимые для цвета люминесценции группы. В связи с этим, представляется целесообразным в качестве моделей излучателя использовать его аналоги - диметилоксилюциферин (DMOL) и монометилоксилюциферин (MMOL). До настоящего времени подробного изучения спектральных свойств и стабильности этих соединений не проводилось. Поэтому задачей данной работы являлось подробное изучение спектральных свойств и стабильности этих соединений в водных растворах, в различных растворителях и в комплексе с люциферазой. Это позволило получить информацию о физико-химических свойствах микрооокружения излучателя в активном центре люциферазы.

Известно [6], что люцифераза светляков - фермент, состоящий из двух доменов: большого N-домена и малого С-домена, соединенных подвижной неупорядоченной петлей. Окончательное формирование активного центра, а, следовательно, и микроокружения излучателя, происходит только после присоединения субстратов (LH2 и АТР) в результате конформационных изменений с образованием "закрытой" структуры [7]. Однако, какой из субстратов: LH2 или АТР вызывает такое изменение конформации не известно. Флуоресцентные методы широко используются для изучения взаимодействия ферментов с субстратами, продуктами реакции и другими эффекторами, способными тушить собственную флуоресценцию белков, которая в основном обусловлена остатками триптофана и тирозина [9, 20]. Люцифераза светляков Luciola mingrelica содержит один остаток Тгр и 19 остатков Туг [7]. В качестве маркера для исследования взаимодействия люциферазы с люциферином и его аналогами до сих пор успешно использовалась флуоресценция остатка Тгр (^ет= 340 нм) [11, 12, 13, 16, 21, 22]. Было показано, что в присутствии ЬН2 происходит тушение флуоресценции остатка Тгр по статическому типу [21]. Второй субстрат - АТР, тушит флуоресценцию Тгр по динамическому типу только при концентрациях существенно превышающих Кт [14,23].

Флуоресценция остатков Туг люциферазы до настоящего времени не исследована. По литературным данным существенная тирозиновая флуоресценция (Xem = 304-308 нм) наблюдалась для тех белков, у которых содержание остатков Туг больше содержания остатков Тгр [2429]. Поскольку люцифераза светляков Luciola mingrelica содержит 19 остатков Туг и только один остаток Тгр, можно было ожидать существенного вклада тирозиновой составляющей в собственную флуоресценцию люциферазы. Известно, что даже незначительные изменения в трехмерной структуре белка могут привести к тушению флуоресценции остатков Туг [9, 25, 28]. В связи с этим, использование флуоресценции остатков Туг в качестве маркера оказалось перспективным для исследования изменений в структуре люциферазы светляков.

Цель работы - исследовать взаимодействие люциферазы с субстратами и их аналогами, с помощью флуоресцентных маркеров -диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина, а также собственных флуорофоров белка - остатков тирозина и триптофана.

В соответствии с целью, основными задачами исследования являются:

1. Изучить спектральные свойства и стабильность DMOL и MMOL, показать возможность их использования в качестве флуоресцентных маркеров.

2. Сравнить спектральные свойства DMOL и MMOL в буферном растворе, в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазой светляков L. mingrelica.

3. Определить возможность использования флуоресценции Туг остатков люциферазы в качестве маркера фермент-субстратных взаимодействий.

4. Изучить влияние каждого субстрата на сродство люциферазы ко второму субстрату методом флуоресцентного титрования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Показано, что DMOL и MMOL обладают характерными спектральными свойствами, чувствительными к условиям микроокружения. В рН-оптимуме активности люциферазы (7,8) DMOL и MMOL достаточно стабильны, связываются в активном центре люциферазы, в области, близкой к центру связывания субстрата -люциферина и продукта - оксилюциферина, что позволяет использовать DMOL и MMOL в качестве флуоресцентных меток для изучения физико-химических свойств активного центра люциферазы.

2. Показано, что желто-зеленая флуоресценция (А^, = 500 нм), возникающая в щелочных растворах люциферина, DMOL и MMOL, обусловлена образованием стабильных, сходных по строению продуктов разложения субстрата и его аналогов.

3. Методом флуоресцентного титрования определены константы диссоциации комплексов рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазы с DMOL и MMOL в диапазоне рН 6,5-9,0. Показано, что протонированные формы DMOL и MMOL лучше связываются рекомбинантной и мутантной люциферазами, по сравнению с депротонированными. DMOL имеет большее сродство к мутантной люциферазе, чем к рекомбинантной при щелочных рН, а MMOL - во всем изученном диапазоне рН.

4. Показано, что в комплексе DMOL-люцифераза микроокружение DMOL обладает меньшей ориентационной поляризуемостью по сравнению с буферным раствором, а в комплексе MMOL-люцифераза увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL. Следствием этого является смещение максимума флуоресценции DMOL и MMOL в коротковолновую область на 20 и 100 нм, соответственно.

5. Показано, что для люциферазы светляков Luciola mingrelica характерна флуоресценция не только остатка Тгр (Хет=340нм), но и остатков Туг (А,ет=308 нм). LH2 более эффективно тушит флуоресценцию Тгр по сравнению с флуоресценцией Туг, в то время как АТР более эффективно тушит флуоресценцию Туг за счет образования водородной связи между остатком Туг342 и АТР. Обнаружены два центра тушения АТР (AMP) флуоресценции Туг, по-видимому, соответствующих аллостерическому и активному центрам люциферазы.

6. Методом последовательного флуоресцентного титрования люциферазы субстратами показано, что связывание одного из субстратов с люциферазой затрудняет последующее присоединение другого субстрата, что, по-видимому, связано с конформационными изменениями люциферазы при образовании комплекса с каждым субстратом.

1. Suzuki N., Goto T. Studies on firefly bioluminescence. Identification of oxyluciferin as a product in the bioluminescence of firefly lanterns and in the chemiluminescence of firefly luciferin. // Tetrahedron., 1972, V. 28, N. 16, P. 4075-4082

2. McElroy, W.D., De Luca, M. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. // In Chemiluminescence and Bioluminescence (Cormier, M.J., Hercules, D.M., Lee, J. eds.) Plenum Press, N.Y., 1974, P. 285-311.

3. Угарова H. H. Бровко JI. Ю. Взаимосвязь структуры белковой глобулы и спектров биолюминесценции люциферазы светляков. // Известия Академии наук. Сер. Хим. 2001, N. 10, С. 1670-1679

4. Kricka L.J. Application of bioluminescence and chemiluminescence in biomedical sciences. // In Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence. Eds. M.M. Ziegler and Т.О. Baldwin. 2000, P. 333345.

5. Conti E., Francs N. P., Brick P., Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming emzymes. // Structure, 1996, V. 4, P. 287-289.

6. Сандалова T.P., Угарова H.H. Модель активного центра люциферазы светляков. // Биохимия. 1999, Т. 64, N. 8, С. 1143-1150

7. Nakatsu Т., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K. and Kato H. Structural basis for spectral difference in luciferase bioluminescence. // Nature Letters. 2006, V. 440, N. 16, P. 372-375

8. Лакович Дж., Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986

9. Morton R. A., Horkins T. A. Seliger H. H. The Spectroscopic Properties of Firefly Luciferin and Related Compounds. An Approach to Product Emission. //Biochemistry, 1969, V. 8, P. 1598-1607

10. П.Дементьева E. И., Бровко JI. Ю., Дружинина Е. Н., Гандельман О. А., Угарова Н.Н., рН-зависимость спектров биолюминесценции и кинетических констант люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Биохимия, 1986, Т. 51, вып. 1, С. 130-139

11. Чудинова E.A., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П., Угарова Н.Н. Флуоресценция остатков триптофана в люциферазах светляков и их комплексах с субстратами. // Биохимия, 1999, Т. 64, С. 1301-1308

12. Suzuki N., Sato М., Okada К., Goto Т. Studies on firefly bioluminescence. Synthesis and spectral properties of firefly oxyluciferin. A possible emitting species in firefly bioluminescence. // Tetrahedron. 1972, V. 28, N. 15, P. 4065-4074

13. Дементьева Е.И. Кинетические свойства растворимой и иммобилизованной люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Дисс. канд. хим. наук, 1986, Москва МГУ имени М.В. Ломоносова.

14. DeLuca M, Brand L., Cebula T. A., Seliger H.H., Makula A.F. Nanosecond time-resolved proton transfer studies with degydroluciferin and its complex with luciferase. // J. Biol. Chem. 1971, V. 246, N. 21, P. 6702-6704

15. White E.H., Rapaport E., Seliger H.H., Horkins T.A. The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. // Bioorg. Chem. 1971, V. 1, P. 92-98

16. White E.H and Roswell J.D.F. Analogs and derivatives of firefly oxyluciferin, the light emitter in firefly bioluminescence. // Photochemistry and Photobiology. 1991, V. 53, N. 1,P. 131-136

17. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия // М.: Мир, 1980

18. Cherednikova E.Yu., Chikishev A.Yu., Dementieva E.I., Kossobokova O.V., Ugarova N.N. Quenching of tryptophan fluorescenceof firefly luciferase by substrate. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2001, V. 60, P. 7-11

19. Nojima H., Ikai A. and Noda H. Anomalous fluorescence of yeast 3-phosphoglycerate kinase. // Biochimica and Biophysica Acta. 1976, V. 27, P. 20-27.

20. Schlessinger J., Roche. R. S. and Steinberg I. Z. A study of subtilisin tipes Novo and Carlsberg by circular polarization of fluorescence. // Biochem. 1975, V. 14, P. 255-261

21. Sackett D.L., Ruvinov S.B., Thompson J. N5-(L-l-carboxyethyl)-L-ornithine synthase: physical and spectral characterization of the enzyme and its unusial low pK fluorescent tyrosine residues. // Protein Science. 1999, V. 8, N. 10, P. 2121-2129

22. Yang, Y., Shao, Z., Chen, X. and Zhou, P. Optical spectroscopy to investigate the structure of regenerated Bombyx mori silk fibroin in solution. // Biomacromolecules. 2004, V. 5, P. 773-779

23. Finazzi-Agro, A., Rotilio, G., Avigliano, L., Guerrieri P., Boffi, V. and Mondovi, B. Invironment of copper in Pseudomonas fluoresces azurin: fluorometric approach. // Biochem. 1970, V. 9, P. 2009-2014

24. Демченко А.П. Люминесценция и динамика белков. Киев: Наук. Думка, 1988

25. Алфимова Е.Я., Лихтенштейн Г.И. Флуоресцентное исследование переноса энергии, как метод изучения структуры белков. // Итоги науки и техники, серия: Молекулярная биология. 1976, Т. 8, Ч. 2, С. 127-173

26. Экспериментальные методы химической кинетики под ред акад. Эмануэля Н.М. и Кузьмина М. Г. гл. Люминесценция. // М.: Изд-во Московского ун-та. 1985, С. 115-180

27. Владимиров Ю. А. В кн.: Фотохимия и люминесценция белков. // М.: Наука, 1965, С. 232

28. Teale F. W. J. The ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution. // Biochem. J., 1960, V. 76, P. 381-388

29. Lukomska J., Rzeska A., Malicka J., Wiczk W. Influence of a substituent on amide nitrogen atom on fluorescence efficiency quenching of Tyr(Me) by amide group. // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 2001, V. 143, P. 135-139

30. Tula Alev-Behmoaras, Jean-Jacques Toulme and Claude Helene. Quenching of tyrosine fluorescence by posphat ions: a model study for protein-nucleic acid complexes. // Photochemistry and Photobiology. 1979, V. 30, P. 533-539

31. Бровко Л.Ю., Чередникова Е.Ю., Чикишев А.Ю., Чудинова Е. А. Влияние микроокружения на спектрально-кинетические свойства люциферина светляков. // Вестник МГУ 1998, Серия 3, Физика. Астрономия, N. 3, С. 26-29

32. Угарова Н.Н., Малошенок Л. Г., Упоров И. В., Кокшаров М. И. Спектры биолюминесценции нативной и мутантной люциферазы светляков как функция рН. // Биохимия. 2005, Т. 70, вып. 11,С. 1534— 1540

33. Conti Е., Lloyd L. F., Akins J., Brick F., Brick P., Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. // Acta Crtst. 1995, V 52, P. 867-878

34. Sala-Newby G.B., Campbell A.K. Stepwise removal of the C-terminal 12 amino acids of firefly luciferase results in graded loss of activity. // Biochim. Biophys. Acta, 1994, V. 1206, P. 155-160.

35. Sung D., Kang H. The N-terminal amino acids sequences of firefly luciferase are important for stability of the enzyme. // Photochem. Photobiol. 1998, V. 68, P. 749-753

36. Zako Т., Ayabe K., Aburatani Т., Kamiya N., Kitayama A., Ueda H., Nagamune T. Luminescent and substrat binding activities of firefly luciferase N-terminal domain. // Biochimica et Biophysica Asta. 2003, V. 1649, P. 183-189

37. Travis J., McElroy W.D. Isolation and sequence of an essential sulfhydryl peptide of the Active site of firefly luciferase. // Biochemistry. 1966, V. 5, N. 7, P. 2170-2176

38. Denburg J. L., Lee R. Т., McElroy W.D. Substrate binding properties of firefly luciferase. Luciferin-binding site. // Arch. Biochem. Biophys. 1969, V. 134, N. 2, P. 381-394

39. Lee, R.T., Denburg, J.L. and McElroy, W.D. Substrate-binding properties of firefly luciferase. II. ATP-binding site. // Archives of Biochemistry and biophysics. 1970, V. 141, P. 38-52

40. Gates B. J., De Luca M. The production of oxyluciferin during the firefly light reaction. //Arch. Biochem.Biophys. 1975, V. 169, P. 616-621

41. Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова H.H. Субъединичные взаимодействия в люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль в проявлении активности фермента и процессе термоинактивации. // Биохимия. 1982, Т. 47, N. 5 С. 760-766

42. Лундовских И.А., Дементьева Е.И., Угарова Н.Н. Кинетика и механизм термоинактивации люциферазы светляков Luciola mingrelica. // Вестн. Моск. Ун-та, сер. 2 Химия, 2000, Т. 41, N 6, Р. 362-366

43. Conti E, Stachelhaus T, Marahiel N.A., Brick P., Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. // The EMBO journal. 1997, V. 16, N. 14, P. 4174-4183

44. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Histidine 245 in Firefly Luciferase: a Proposed Model of the Active Site. // Biochemistry. 1998, V. 37, P. 15311-15319.

45. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.A., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Firefly Luciferase Active Site Amino Acids: a Proposed Model for Bioluminescence Color. // Biochemistry. 1999, V. 38, P. 13223-13230.

46. Branchini B.R., Murtiashaw M.H.,. Magyar R.A, Anderson S. M. The role of lysine 529, a conserved residue of the acril-adenylat-forming enzyme superfamily, in firefly luciferase. // Biochemistry. 2000, V. 39, P. 54335440

47. Морозов B.M., Угарова H.H. Консервативные мотивы в суперсемействе ферментов, катализирующих образование ациладенилатов из АТР и соединений с карбоксильной группой. // Биохимия. 1996, Т. 61, N. 8, С. 1511-1517

48. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. Mutation of a Protease-Sensitive Region in Firefly Luciferase Alters Light Emission Properties. // J. Biol. Chem. 1997, V. 272, P. 18766-18771.

49. Дементьева Е.И., Железнова E.E., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. // Биохимия. 1996, Т. 61, N. 1, С. 152-158

50. Ayabe К., Zako Т., Ueda H. The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenilation and oxidative steps. // FEBS Letters. 2005, V. 579, P. 4389^39

51. Бровко Л.Ю. Физико-химические и кинетические закономерности функционирования биолюминесцентной системы светляков. // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Биотехнология. 1988, Т. 14, С. 155-195

52. DeLuca М. and McElroy W. D. Two kinetically distinguishable ATP sites in firefly luciferase. Biochemical and biophysical research communications. 1984, V. 123, N 2, P. 764-770

53. Филипова Н.Ю., Духович А.Ф., Букатина В.А., Угарова Н.Н. Аллостерический механизм регуляциии активности люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Биохимия, 1984, Т. 49, вып. 12, С. 1965-1971

54. DeLuca M. Hidrophobic nature of the active site of firefly luciferase. // Biochem. 1969, V. 8, N. 1,160-166

55. Branchini B.R., Hayward M.M. Naphthyl and quinolylluciferin: green and red light emitting firefly luciferin analogues. // Photochemistry and Photobiology. 1989, V. 49, N. 5, P. 689-695

56. Wood К. V., Lam Y. A. and Mc Elroy W. D. Bioluminescent click beetles revisited. //J. Biolum. Cemilum., 1989, V. 4, P. 31-39

57. Kajiyama N.K. and Nakano E. Isolation and characterization of mutants of farefly luciferase which produce different colors of light. // Protein Eng., 1991, V. 4, P. 691-693

58. DeLuca M., Marsh M. Conformational changes of luciferase during catalysis. // Arch. Biochem. Biophys. 1967, V. 121, N. 1, P. 233-240

59. DeLuca M. and McElroy W. D. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. // Biochemistry. 1974, V. 13, N 5, P. 921-925

60. Bowie L. J., Horak V., De Luca M. Synthesis of a new substrate analog of firefly luciferin: an active site probe // Biochemistry, 1973, V.12, N. 10, P. 1845-1851

61. Bitler В., McElroy W.D. The preparation and properties of crystalline firefly luciferine // Arch. Biochem. Biophys. 1957, V. 23, N. 2, P. 358368

62. Suzuki N., Goto T. Synthesis of 4-thiazolon derivatives related to firefly oxyluciferin. //Agr. Biol. Chem, 1972, V. 36, N. 12, P. 2213-2221

63. Miska W., Geiger R. Synthesis and characterization of luciferin derivatives for use in bioluminescence enhanced enzyme immunoassays. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1987, V. 25, N. 1, P. 23-30

64. Goto Т., Rubota I., Suzuki N., Kishi Y. Aspects of the mechanism of bioluminescence. // N.Y. Acad Press. 1974, P. 325-335

65. Gandelman O.A., Brovko L.Yu., Ugarova N.N. and Chikishev A.Yu., Shkurimov A.P. Oxyluciferin fluorescence is a model of native bioluminescence in the firefly luciferin-luciferase system. J. Phothchem. Photobiol., B:Biol. 1993, V. 19, P. 187-191

66. Weiss D., Beckert R., Lamm K., Baader W. J., Bechara E.J. H., Stevani C.

67. V. Playing with luciferin new results on the luminescence of a wellknown molecule. // in: J. F. Case, P. J. Herring, В. H. Robinson, S. H. D.th

68. Haddock, L.J. Kricka, P.E. Stanley (Eds.), Proceedings of the 11 Suymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. Bioluminescence & Chemiluminescence 2000, Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2001, P. 197-200

69. Branchini, B.R., Murtiashaw, M.H., Magyar, R.A., Portier, C.N., Ruggiero, M.C. and Stroh, J.S. Yellow-green and red firefly bioluminescence from 5,5-dimethyloxyluciferin. // J.Am. Chem.Soc. 2002, V. 124, N10, P. 2112-2113

70. Gronowitz S., Matiasson В., Dahibom R., Holmberg В., Jansen K. A. Nuclear Magnetic resonance studies on 2-phenyl-4-thiazolone and somerelated compounds.//Acta chem.Scand. 1965, V. 19, P. 1216-1220

71. White E., Rapaport E., Horkins T.A., Seliger H.H. Chemi- and bioluminescence of Firefly luciferin. //J. Am. Chem. Soc. 1969, V. 91, N. 8, P. 2178-2180

72. Suzuki N., Sato M., Nishikawa K., Goto T. Synthesis and spectral properties of 2-(6'-hydroxybenzothiazol-2'-yl)-4- hydroxythiazole a possible emitting species in firefly bioluminescence. // Tetrahedron letters. 1969, V. 53, P. 4683-4684

73. Denburg J., McElroy W.D. Anion inhibition of firefly luciferase. // Arch. Biochem. Biophys. 1970, V. 141, N. 2, P 668-672

74. Ugarova, N.N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and Regulation mechanism. // J. of Bioluminescence and Chemiluminescence. 1989, V. 4, P. 406-418

75. Arrio В., Rodier P., Boisson C. and Vernotte C. Fluorescence quenching and conformational changes of proteins. // Biochem. Biophys. research communications. 1970, V. 39, N. 4, P. 589-593

76. Dementieva E.I., Fedorchuk E.A, Brovko L.Yu., Savitskii A.P. and Ugarova N. N. Fluorescent properties of firefly luciferases and their complexes with luciferin. // Bioscience Reports. 2000, V. 20, N. 1, P 2130.

77. Талебаровская И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B., Щеголев А.А. Березин И. В. Способ получения D-люциферина. // Авт. св. № 1192324. (Russ.), 1983

78. Chen, Y.H., Yang, J.T., Martinez, H.M. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. // Biochemistry. 1972, V. 11, P. 4120-4131

79. Manning, M.C., Illangasekare, M., Woody, R.W. Circular dichroism studies of distorted «-helices, twisted 13-sheets, and B-turns. Biophys. Chem., 1988, V.31,P. 77-86

80. Хроматография в тонких слоях. Под ред. Шталя. // М.: Мир, 1965

81. Дорсон P., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М.: Мир, 1991, С. 446

82. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. //М.: Высшая школа. 1977

83. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. // М.: Мир, 1978

84. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии // М.: Мир, 1991

85. Бровко Л.Ю., Гандельман О.А., Поленова Т.Е., Угарова Н.Н. Кинетика биолюминесценции в люциферин-люциферазной реакции светляков. // Биохимия. 1994, Т. 59, вып. 2, С. 273-281

86. Филипова Н.Ю., Духович А.Ф., Соколова Н.И, Угарова Н.Н. Ингибирование люциферазы из светляков смешанными ангидридами аденозин-5 '-фосфатов и мезитиленкарбоновой кислоты. // Биохимия, 1984, Т. 49, вып. 4 С. 585-588