Кинетические закономерности функционирования рецепторно-ферментных систем при длительном введении морфина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИ!! ОРДЕ!!Л ЛШША. ОГДШ ОКТЯПРЬСКОП РЕВОЛЮЦИИ M ОГДЕНА ТРУДОВОГО КГАСШГО ЗКЛМШП1 ГОСУДАFCTB0(1 Пч'11 УШВКГСНТН' iîMGrnl M.B. ЛОМОНОСОВА

Химпчоскип факультет

fíft пряпах рукописи УАК 6-19.ЯЧО

ИШША лика Дмитриопна

И.ИШИЧШШБ ЗЛКОНОКШЮПТИ ФУПКЩЮНИГОВЛПШ • И5ЦШОГ1Ю4;ЕГМВ1Т11НХ СИСТЕМ 11Г1! Д'ШТЕШЮМ - ШЕДШИ MOF'îiniA

Специальность 02.00.15 - химическая кипотика и катализ

Л В Т О Г Е Ф Е F Л Т диссертации но.соискание ученой степени . кандидата химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в секторе биокинетики Межфекультетской проблемной НИЛ им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. И.В. Ломоносова. ^

Научный руководитель: доктор химических наук С,В. Зайцев

Официальные оппонента : доктор химических наук Е.С. Чухрай кандадат химических наук С.О. Бачурин

Ведущая организация: Институт Химической физики АН СССР

Защита состоится " Jf 1990 года*

в 16 часов на заседании специализированного совета К 053.05.58 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: II9899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, аудитория СХА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан — , „ _- 1990'года

т

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

/

И,А. АСраменкова

/

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема возникновения лекарственной зависимости и такого заболевания как наркомания - одна из фундаментальных проблем биохимии'й медицины. Морфгаювая интоксикация - наиболее .типичная форма наркомании. Исследования последних лет показали, что длительное ввбдение морфина вызывает глобальные изменения, затрагивающие различные системы организма - нервную, иммунную,.эндокринную и механизмы их взаимодействия.

МОрфиновая наркомания развивается во времени и охватывает механизмы функционирования многих рецепторно-ферментных систем.

Это делает актуальным проведение комплексного исследования механизмов действия морфина с применением методов химической кинетики, позволяющих выявить кинетические закономерности формирования физической зависимости.

• ' Цзль работы. Целью настоящей работы явилось исследование .кинетических закономерностей эффектов морфина на нервную и иммунную ' системы организма, включал изучение центральных и периферических. опиоидных рецепторов, системы передачи сигнала внутрь клетки; через рецепторы и в-белки, системы моноаминов, системы анальгетического эффекта морфина. Особое внимание было уделено теоретическому анализу кинетических- принципов функционирования рецепторыо-фермонкпи систем ■ в условиях длительного воздействия морфина и формирования физической зависимости от него. , Научная новизна. Для •описания поведения рецепторно-ферментных систем в; условиях длительного, введения наркотического препарата предложена кинетическая модель .двойного действия вещества.'; Модель двойного действия, предполагающая влияние морфина' на синтез' и деградацию продукта ферментативного процесса, использована в исследовании поведения дофзшшергической и серото-нияергической систем..моиоэмшюв при хронической морфинизацш. Сформулированы основные кинетические принципы функционирования рецепторно-ферментшх систем в процессе-формирования зависимости от лекарственного препарата. Проведено изучение кинетических закономерностей влияния морфина на анальгетический ответ, систем моноаминов,системы иммунокомпетептных органов, системы опиоидных рецепторов коры головного моэгэ мышей и периферических органов,, а также., динамики изменения кг нцентрзции морфина в плазме

крови. На основании анализа полученных кинетических параметров выявлены корреляции ь зМякгах морфша. С помощью физико-химических методов исследования установлен факт различной регуляции иорфшюм опиоидшх рецепторов центральной нервной системы и ремяшносящнх щютоков мышей, а также супервысокоафршных центров связывания и- и г- лиггшдов коры головного мозга животных. Обнаружегаю, что длительное, введение мор&ша не влияет на характеристики комплексообразованил м-рецепторов, однако, вызывает увеличение сродства супсршсокоаффииного центра связывания ¿-лигадцов в процессе длительной мобилизации. Исследование кинетики диссоциации и- и лиганд-рецелторних комплексов по,й действием сгр показало различное влияние морфина на сопряжение в-белков с и- и б- рецепторами. Установлены отличия кинетический параметров динамики эффектов морфина на селезенку, и тимус - им-мунокошетевтше органы. Обнаружена отличия в.физико-химических характеристиках процесса комплексообразовашш лигандов с опиоид-шд-лк рецепторами линий мышей, обладающих различной генетической чувствительностью к алкоголю. . ' ■

Практическая ценность работы. Модель двойного- действия вещества , предложенная для описания поведения рецепторно-ферментных систем в условиях длительного введения наркотика и возникновения зависимости от него, создает основу, для исследования поведения многих рецепторно-ферментных систем в условиях адаптации к действию лекарственного вещества,Сформулированные кинетические принципы формирования физической зависимости создают основу для изучения наркогенных'свойств новых фармакологических препаратов.

Апробация работы. Основные результаты.были представлены' на 8-ом конгрессе Европейского Нейрохимического Общества (Лейпциг, 1990 г.), на Всесоюзном симпозиума "Биохимия рецепторных систем" (Таллин, 1990 г.).

Структура диссертации. -Диссертационная -работа,- состоит из сведения, литературного обзора, экспериментальной части, 3 глав,, в которых излагаются результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка литературы наименований), Работа изложена

на -/ страницах, включает таблиц и 3 Ц рисунков. '

Публикации. По материалом диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Методика эксперимента. Для , морфинизацщ мышей . линии

Р-гибрид (СВЛхС57СЬ) и линии овл использовали метод подкожной имплантации таблеток с морфином (75 мг из таблетку) и плацебо в качестве контроля. Кинетические эксперимент проводили во временном интервале от Б до 96 часов морфннизаиш. Анэльгетический эффект морфина исследовали "ьаП-Шск" тестом. Развитие записи-мости наблюдали по синдрому отмени морфииа ирн сведении налоксо-на. Концентрации морфина в плазме крови определяли двумя методами: раднорецепторным анализом н поляризационным иммунофпкюромзт-рпческим анализом. Концентрашш моноамштоп в стриатуме мозга определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией. Изучение свойств оииоидних рецепторов семявниосящих протоков мышей проводили, исследуя влияние опиоидшх лнгаидов на электрически стимулируемые сокращения органа. Изучение комшгексообрэзовзштя мечен-ЙОГО ТрИТИеМ м-ЛИГЭЯДЭ {1^]-Туг,0-Л1а3,«Г-11е-Р«1е\с1у5о1]- энке-фэяинэ -('н-олсо) я з-лйгзндэ г['и)-туг. о-зог2, ьси]- энкефалгат-• <№г®)- (^н-сзьетг» с оппоядными рецептарами мембранного препарата коры головного мозга шшей проводили с помощью метода вакуумного фильтрования через стекловолокошшс фильтры б^/п, неспецифическое . связывание определяли при добавлении 10"Г'М немеченого яигаядэ, При исследовании эффектов отр использовали стр-регеяерирумцую систему: креатинфосфэт 2 мМ и креатинфэсфат-кяназа 1 ед. Математическую обработку данных проводили с использованием программы "51 лЬцтрЫся"' и программы "ДЕЛЬТА", разработанной в секторе биокинетики Ыежфакультетской проблемной НИЛ ш. А.Н. Белозерского. ...

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ■ Теоретический анализ кинетических моделей Функшюшрова1тя редепторяо^^ в условиях длительного воздействия

лекарственных препаратов и формирования зависимости.

Детальное рассмотрение известных гипотез действия физиологически активных, веществ на рзцепторно-фермептные системы пока. зало, что все они могут быть сведет к простейшим моделям двух • типов: I)моделям с отрицательной обратной связью между ключевым продуктом р и синтезирующей- его рецопторно-ферментной системой пе,. на, активность которой действует.вещество ь; 2)моделям двойного дейс-таия физиологически активного соединения ь, в рамках

*

которых предполагается, что наркотическое вещество обладает двумя противоположно направленными эффектами: с одной стороны - изменяет активность рецепторно-ферментной системы, с другой сторо-ш - влияет на концентрацию и метаболизм ее компонентов.

Задача проведенного нами кинетического рассмотрения фактически сводилась к выявлению.взаимосвязей, которые должны суще-ст-йовать в выбранных нами моделях, чтобы соблюдались следующие свойства системы; •

1) консервативное поведение рецепторно-ферментной системы относительно внешних воздействий, то есть • способность, поддержив.ать на постоянном уровне концентрации жизненно важных продуктов (р) при длительном воздействии наркотика;

2) значительное, отклонение от контрольного давня концентрации ключевого продукта (р) рецеяторно-фермен-тной системы при <?.тмаде Длительного'введения препарата;

На рис.1 представлена теоретическая кривая изменения, концентрации ключевого продукта р рецепторцо-ферментной системы не

Рис.1 Поведение ключевого продукта ■ (р) рецепторно-ферментной системы в условиях: а) ддеельного влияния эффектора и б) его отмены. (рстз -значение концентрации уж-чевого продукта рецепторно-ферментной системы в отсутствии' эффектора

в условиях введения и. отмены эффектора ь. обладающего.ингибирую-. щим влиянием на , которая .отражает обсуждаемые свойства сис-, теш. - ' '.■■■"'■•'■.'

Мы исследовали условия консервативного поведения по отношению к воздействию ь для схемы Ш. предполагая, что концентрации а и ь в системе постоянны, .а взаимодействие ь' с рецепторно-ферментной системой ле происходит в равновесном режима и,может

усл.ед

е-бедение отмена э<н>ектойп эффектора

включать саше различные типы ингиОировапия или активации, скорость оттока р и яе линейно зависит от концентрат!» р и ке,

к

к

ИЕ + Б

К.

ЬЯЕ + Э

ак

ИЕ + Р

«к.

ШЕв

ЩГ

1.1Ш + I'

ре р

(Г)

где кв, ккат, а, 13 - параметры, характеризующие ферментативный синтез и влияние на него лиганда, к(. - равновесная константа диссоциации комплекса I. с рецепторно-фермвнтной системой; кин -константа скорости инактивации комплекса лиганда с рецепторно-фзрменгноП системой; . грЕ, - V £ - скорости синтеза и деградации рецепторно-ферментной системы ;7р и - скорости независимого от йе притока продукта р и его оттока..

Соответствующая схеме (I) система дифферзнциалышх уравнений будет иметь следующий вид:

дгкез "ЗПГ-

а " - Ч/ • к ' (СЬ]) [ЛС]в те «с • мм х к *' 1 ,

V - V ' + к -(11']) [КЕ1

(1) (2)

где

кКВГ [Э] («К^[1,])/(аКь+ [Ь])

к ' (11.3)-

а (К, ,+ [Ь])

■ + Г'й} " + [Ч . :

к [Ь)

ми1 ' ■ ,

ки1'(([Ь])=-^—^ ,[ДЕ)а- общая концентрация всех

форм фермента в данный момент времени.

Полученные дифференциальные уравнения были проанализированы на устойчивость решения л условия консервативного поведения р.

V

v

При этом для моделей с отрицательной обратной связью в качестве

\че и были выбраны следующие функции: I) V =—--;

к" + [Р]п

р I

* ¡г) - v [р]п ^

2) v^пргэ) *" •

Аналогично сшш исследованы четыре модели двойного действия, предполагающие влияние лиганда на ферментативный синтез р, и также: I) на оиосиятез фермента (у|1Е( [Ь])): 2) на инактивацию фермента (у^цьш ; 3) на независимый от ие синтез продукта (\([1))>: 4) на деградаций продукта

Проведенное нами рассмотрение позволяет сделать следующие вывода.

Во-первых, в моделях с отрицательной обратной связью.консервативность в системе по {Рст1 (рис.1); возможна только в том случае, если в система (1)-(2) й[КЕ]а/<31 не зависит от концентрации (КЕ)а. Это предполагает нулевой то [КЕ)а порядок скоростей изменения концентрации фермента, что в реальных системах кажется маловероятным. Поэтому особое внимание мы уделили моделям двойного действия лиганда. ' -.

Бо-вторих, в случае моделей двойного действия консервативное поведение системы определяется типом функций, характеризующих "второе" действие.лиганда.

В-третьих, оба рассмотренных типа моделей даш? устойчивые состояшя равновесия [Рс1] и [ИЕ)с1, Однако', как видно из проведенного анализа, в отличие от проанализированных нами моделей двойного действия, где состояние равновесия всегда соответствует устойчивому узлу, в случае моделей с отрицательной обратной связью состояния равновесия при некоторых соотношениях параметров отвечают устойчивому узлу, при других - устойчивому фокусу. Вместе с тем, в присутствии ь и соответствующих измененных параметрах, например к' ((ь]), может наблюдаться переход от состояния устойчивого узла к состоянию 'устойчивого фокуса либо, наоборот. следствием этого является возможность появления е системе затухающих колебаний концентраций р и ие в процессе восстановления исходной концентрации [рст],

В-четвертых, проведенное нами рассмотрение модели двойного действия даже в простейшем варианте для случая влияния ■ лиганда

на синтез и деградацию фермента позволяет заключить, что она достаточно удовлетворительно лает качественное совпадение повеления [ее)(ь) и (Р)(Ь) с поведением реальных метаболитов при вводе и отмене наркотика.

Развитие привыкания-к наркотику, возможно, связано со свойством консервативности системы.

Механизм двойного действия обеспечивает не только консервативность систем; по ключевому продукту р, но и по ключевому 'ферменту ие при условии, что "второе" действие лиганда направлено на регуляцию независимого синтеза или оттока продукта и выполняется. соотношения для скоростей этих процессов (ур([ь)) или ур'(Гь])> определяющих консервативность системы. Такого рода механизмы отвечают "идеальной" по концентрации (иЕ)а и по продукту [Р] консервативности системы.

.-< Однако в случае влияния лиганда на независимый синтез продукта будет наблюдаться изменение концентрации предшественников продукта, участвующих в независимом от реЦепторно-ферментной системы, не притоке продукта."' Для механизма • двойного действия, . предполагающего влияние наркотика на ферментативную активность йе и деградацию продукта р, существенные изменения происходят в концентрации метаболитов продукта. 7

~ В-пятых, нами. Си;.о исследовано поведетше моделей двойного действия^ предполагающих влияние лиганда на синтез и деградацию фермента, в- режиме . отмены наркотического вещества. В'кинетике изменения концентрации, продукта р отклонение от стационарного состояния вследствие удаления лиганда наблюдается в случае, когда характерное время процесса оттока р значительно меньше аналогичного времени для яе. Из анализ? кинетических уравнений следу-' ет, что другим-необходиАлм'условием'такого поведения р является ; медленная инактивация' рецепторной системы: без этого невозможно изменение йе до'нового*.стационарного уровня, который и .определяет амплитуду'.отклонения .р после отмены воздействия.

.. Тзккм образом, даншй теоретический анализ позволяет сфор-• мулировать основные юшетические принцшш,' которым:должна удов-' • летворять система в условиях длительного'..введения морфина и формирования физической зовисикюсти:. ;' . .. ' .-•■'.,'; •..'...;.■ ■, I) значительное отличие характерных времен процессов оттока про- , .дукта и фермента; .

2) медленная инактивация рецепторной системы в процессе длительного воздействия лекарственного вещества. .

Кроме того, в ходе анализа Сило показано, что модели двойного действия в большей степени соответствуют, поведению ключевого продукта р в условиях длительного введения наркотического вещества , чем модели с отрицательной обратной связью,

Анализ кинетических кривых изменении концентрации . •морфина в плазме крови р -гибрид (свахС57вь| мышей .

Были исследованы: кинетика изменения концентрации опиатцо-активной формы морфина с помощью радиорёцепторвдго метода анализа, кинетика изменения концентрации иммунореактивных форм морфина с помощью поляризационного иммунофлюорометрического анализа.

Обнаружено, что концентрация опиатно-активной формы морфина значительно ниже .( на два порядка ) чем концентрация его иммуно-реактившх форм ( рис.2 А, Б). Как аддно из рис.2, кинетические

с,м*ю

4о

с, М*ю

-5

I

о го

во 1оо

Рис.2 Кинетические кривые изменения концентрации морфина в плазме крови -гибрид' (свахс57вь) мыщей при подкожной имплантации таблетки с препаратом (75 мг на таблетку): А)опиатно~активная форма морфина; Б) иммунореактивная форма морфина.

кривив изменения концентрации морфина проходят через максимум, а затем концентрация изменяется до уровня порядка 2,0 I Е,2Ю"7 М для опиатно-активного морфина и 1,5 * 0,3 10"5 Ы для его) иммуно-

реактивных форм. После 12 часов введения препарата кинетика изменения концентрации оппзтно-э'ктивиой и мшу норе активной форм морфина удовлетворительно описывается функцией, содержащей одну экспоненту. Показатели экспонент равны, соответственно: а) 0,08 ± 0,02 (ч"'); б) 0.13 1 0,04 (ч"').

Таким образом, показано, что в процессе морфинизации уровень концентрации опиатно-активной фзрмн морфина существенно ниже концентрации иммунореэктивных Форм вещество , однако, относительно висок в течение 96 часов.

Взаимосвязь кинетических параметров кривых изменения концентрации морфина с аналъгетическим действием _морфшш_.

Один из основных физиологических эффектов опиатов - увеличение порога болевой чувствительности. Исследование анальгети-чзского- 01ввта проводилось с помощью "taii-fiick" теста. На рис.3'представлена кинетическая кривая изменения анэльгетичес-

% анальгезии

Рнс.З. Кинетическая кривая изменещм в процессе длительной морфинизации анальгети-ческого эффекта морфина, измеренного "taii-fiick" тестом.

кого ответа в процессе"морфинизации. Из сопоставления кинетических кривых рис.2 и рис.3 видно', что в присутствии значительных концентраций морфина процент анэлЬгезии уже на 72 .часах морфини-ззции стремится к нулю,1 то есть в системе, анальгетического ответа развивается Привыкание' (толерантность)' к морфину.

■'.-;".» Одновременно с изучением анальгезии было,показано развитие

О 20

60

физической зависимости от морфина по 'изменению поведенческих реакций при введении антагониста - налоксона,

Таким образом, длительная морфинизация -гибрид(свахсзэвь) мышей сопровождается формированием привыкания к морфину и развитием физической зависимости от него. *

Исследование влияния морфина на метаболизм норадреналина, дофамина и серотоюша в стриатума головного мозга мышей .

Поскольку в фармакологических и поведенческих эффектах морфина большую роль играют биогенные амины, мы.исследовали кинетику йзменещя концентраций нейрогормодов норадреналина, дофамина (рис.4а) и серотошша (рис.5а), а так же метаболитов дофамина 3,4-диоксифеш1луксусной кислоты (ДОФУК), гомовашшшовой кислоты (ГВК) и метаболита серотошша - 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) в стриатума г ^гибрид(свахсбт&ь) при длительной обработке морфином. '''"..•'",' ■ ."•' ./ ''V. • •" ;

Обнаружено, что содержание в стриатуые норадреналина, дофамина , серотошша и ДОФУК не изменяется в процессе морфинизащщ мышей. Концентрации ГВК (рис.46) и 5-ОИУК (рис.56) изменяются в процессе морфинизации. Кинетические кривив рис.46 и 56 имеют

Рис.4 Изменение концентрации дофамина (а) и его метаболита гомоварлиновой кислоты (ГВК) (О) в стриатуме к(-гибрид мышей в процессе'длительной морфинизрцйм: о - измерения в

опыте'; о - контрольные измерения

дофами

V г ткани

нг

1

5

о 20 во 400 о го во Цоо ^а

г

серотонин, ттШТГ

OS

5-ОИУК, гТ^ТГн

100 t,8 о 20

—i— eo

iOO

Рис.5 Изменение койцеетраки« . соротбгаша (а) и Б-гидроксиииДолуксусго» кислоте (5-ОИУК) (0) в стриатуме f-ПЕбрид(СБАхС57В1> шшей в процесса - длительной морфшш-защет: » измерения в опыте; о - контрольные измерения.

максимумы при различных временах морфинйзации. Однако параметр«, характеризующие скорость" уменьшения концентрации ГВК и 5-ОИУК,. в; пределах бшибки эксперимента совпадают и равни, соответственно-,. 0,029 * 0,008 (ч'1> И 0,033 « 0,012 (ч'1). :

Для описания подобного Доведения' дофаминергической и серо-тонинергической систем моноаййнов, когда.концентрации предшественников метаболитов постоянйй», а концентрации метаболитов возрастают (рис.- 4,5), мы предстой ли модель двойного действия наркотика, предполагаодур койнеисируюше друг друга эффекты морфина на синтез и дергадаци»- и серотошдаа: .

Активация морфи- : ном синтеза ней-рогормона

' Активация мор-

ilell (д>

ротбйШУ

¡ЯКГ

Ш-

фйном деградации нейрогормона

увеличение концентрации метаболитов (ГВК,5-ОИУК)

Таким.образом, мы обнаружили, что развитие физической зависимости вследствие длительной морфишзации г1-ги'брид(свАхс57вь) '. мышей сопровождается значительными изменениями в-' поведении до-' ' фаминергической и серотонинергической систем моноаминов. Полу-

ченный результат согласуется с теоретическим анализом кинетических моделей двойного действия физиологически активного вещества в процессе формирования физической зависимости.

Изменение веса иммунокомпетентных органов в процессе морфшшззции.

Поскольку изменения в метаболизме моноаминов могут отражаться на состоянии значительно иннервированных органов, было изучено влияние длительной морфинизации г|-гибрид(свдхс57вь) мышей на вес тимуса и селезенки.

Установлено, что развитие физической зависимости сопровождается уменьшением веса тимуса и селезенки (рис.6).

1

О?-

&ес ь опыте о &сс в контроле

Рис.6 Изменение веса иммуно-

0

20 бо /

компетентных органов относительно контроля в процессе формирования физической за-, висшости от морфина: О - отношение опытных значений к контрольным длй веса тимуса; о - для . веса . селезенки, вес органа нормирован на вес мыши в момент измере-. 1шя. .

Тимус является первичным лкмфоидным органом, поставляющим в кровь Т-лимфоциты. Селезенка - вторичный лимфойдный орган, являющийся депо в основном В-лимфоцитов. Из-рис.6 видно, что,кинетика уменьшения веса тимуса и селезенки различна. '

Показано, что дополнительная морфинизация ( введение еще одной таблетки с морфином,) Не сопровождается-эффектом, морфина на вес иммунокомпетентных, органов,'то есть в .системе развивается привыкание к наркотику. При дополнительной морфинизации, а также при отмене наркотика вес селезенки увеличивается. 'Величина эффекта уменьшения ; веса тимуса - при' повторном ^введении ' таблетки меньше по сравнению с величиной эффекта при первичной обработке мышей наркотиком. При отмене.препарата также Наблюдается.незначительное уменьшение веса, тимуса. . .•„• ■'.'V-*'';: ': „. ;.'.:;

Таким образом, проведенные исследования говорят о различной регуляции морфином первичного лимфоидного органа - тимуса и вторичного лимфоидного органа - селезенки.'

Влияние^ длительного вмдешш^орфш/а опиоидных рецепторов f -гибрид(сплхс57вь) мышей.

¿. Многообразные эффекты морфина опосредуются взаимодействием наркотика с опиоидными рецепторами. .Поэтому Gu.no проведено исследование влияния длительной морфинизации I) на свойства периферических опиоидных .рецепторов, расположенных на семявшюсящих протоках мышей; 2) «а поведение опиоидшх рецепторов кори головного мозга мыте}}; 3) на механизм сопряжения опиоидных рецепторов с G-белками, Кроме того, были изученц систеш опиоидных рецепторов линий мышей с различной генетической чувствительностью к алкоголю - веществу,, как и морфин, вызывающему физическую зависимость.

I, Кинетика изменения иигциЗирущего эффекта опиоидного пеп-гшОа Id-aiа2, D-Leu*} - 'энкефсцша на электрически сщшулируемие сокращения семявыносагцих протонов мышей в процессе морфинизации.

Было показано, что длительная морфинизации мышей вызывает двойную регуляцию s-опиоидаых рецепторов семявшюсящих протоков мышей. Это видно . из рис.7, где кинетика изменения величины

Рис.7 Изменение в процессе

длительной морфинизации f -гибрид(свахс57bl) мышей величины ed_. равной дозе

50

?

[о-А1аг,о-ьеи6]-знкефал1ша, соответствующей ингибирова-нию электрически стимулируемых сокращений семявшюсящих протоков мышей на 50й: О - измерения в опыте;

О -контрольные измерения.

о 20 бО ioo

ЕВ, -ДОЗЫ (П-А1аг,П-Ьеи5]-Э11КефЭЛИНа, СООТВОТСТВУЩвЙ ИНГИСИРО-

взжто электрически стимулируемых сокращений семлвыносящих протоков мшпой на 50%, имеет максимум. Увеличение ео50 отражает уменьшение чувствительности «-опиоидных рецепторов, органов, уменьшение г.г>50 свидетельствует об увеличении .чувствительности ошюидных рецепторов. ' . ' ■ '

г. Кинетика излечения характеристик колтиексообразования ц-и ь-опиоиВных рецепторов' кори головного лозга г1-гибрид(соАхс57В1,) лыж?а 6 процессе длительной лорфинизации. •

11а коре головного мозга г)-гибрид мышей было показано сущвт-ствование двух ц- и двух «-центров связывания ( Табл.1 ).'

Из анализа изотерм связывания Зн-олсо на препаратах, мембран морфшизировэнннх и контрольных мыией обнаружено, что длительная обработка морфином не влияет .на ,свойства центров связывания |!-лиганда. • ■■ '-./■"....'■;..'',:. -V'-'■'' ' .'•

В отличие от комплексообразования эн-оасо связывание а-лиганда Зп-05ьст с рецепторами препарата мембранморфинизиро-вашшх мышей отлично от контрольных.. .. . .; ,г

Таблица I. Характеристики процессов комплексообразования .. селективного н-лиганда 3н-сасо и селективного в-лиганда ■ ;'н-05ЬЕт с рецепторами кори головного мозга

Г( -гибрид(СВЛХС57ВЬ) ШШей. . V •'•''. ■

лиганд _ пкмояь 1'иг болке К^. иМ О/К, _ пкмояь "а'мг волка кг„м

3И-ОАСО 0,03 0,20- 0,15 ; 0,32 : 2 ,60 0,12 /

ЭН-ОБЬЕТ 0,05 0,76 0,07 •0,35. II .3 0,03

Анализ результатов по' связыванию, г-лиганда пока-"

зал, что характеристики высокоаффинного центра связывания. (о^ И к2), а также концентрация супервысокоаЩюшого центра связывания'' (с,) не изменяются в процессе шр^шизздйи, однако, наблюдается уменьшение константы 'диссоциации, -(..к^ .■ комплекса ллганда. с су-порвысокоаффинным центром.связывания .(рис.8). : ''';:. /';'<., "Ч•' Различная регуляция в процессе морфинизации супервксокоаф-фишшх центров .связывания и-и лигэндов." подтверждает нашу ги--; потозу о независимости, этих центров. • • • / . '. ' '

К! опыт ® контроль

Рис.8 Кинетическая кривая изменения константы, диссоциации сунершсокоаффшшого ¿-центра связывания лиганда озил' относительно контроля в процессе длительной морфшшзации

45

о

Г(-ГИйрИД(СВЛхС57ВЬ) МЫШбИ.

о

о го ео 100 ^з

Таким образом, получешше результаты свидетельствуют ос} от-

сутствии изменений в характеристиках м-рецепторов, через которые, как известно, реализуются наркотические эффекты морфина. Это полностью подтверждает наш теоретический вывод о ¡том, что кинетической особенностью формирования физической зависимости является медленная инактивация рецепторшх систем.

■ 3. Исследование длительного введения лорфина на яежтизл сопряжения рецепторов с а-белками?г

Взаимодействие ошюидных рецепторов с с-белками является ключевым моментом передачи сигнала опиатов через клеточную мембрану. ■ Изучено влияние 96-часовой '' морфиннзации к -гибрид (свдхс57вь) мышей на сопряжение рецептора и б-белка.

Исследование начальной скорости ассоциации селективных и- и в-агоиистов 3н-ва(зо и 3и-рзьет показало, что прединкубация с сгр существенно не влияет на начальную скорость ассоциации лигандов на препаратах контрольных и морфшшзированннх мышей.

Обнаружено значительное уменьшение скорости диссоциации ли-ганд-рецепторного комплекса под действием 0,1 мМ сгр на препаратах мембран корц головного мозга морфинизированшх мышей (Табл,2) и, кроме того, уменьшение величины максимального инги-бирующего эффекта стр, Как видно из Та0л,2, 8-рецепторы в большей степени подвержены изменениям, чем и-рецепторы чоры головного- мозга.

\

)

Таблица 2. Скорость диссоциации комплексов . лигандов озьег (2,5 НИ) и 3н-расо (2нМ) с рецепторами под действием 0,1 мМ стр на препаратах мембран ■ коры головного мозга морфинизированных и. контрольных мышей. ,

лиганд ■Скорость диссоциации, расп./мин

контроль опыт

3Н-05ЬЕТ 3Ц-ОАСО ., ггооо 667' .300 • 400

Таким образом, в процессе формирования у.' мышей, г-гибрид(свдхс57вь') физической зависимости от морфина наблюдаются изменения в системе передачи сигнала внутрь клетки (сопряжения и- и б-рецепторов с с-белками), причем, для а-рецепторов , наблюдаемые изменения выражены в значительно" большей .степени, чем для д-рецепторов,- с которыми в первую очередь связывают наркотические эффекты морфина. Длительная морфшшзаЦия не приводит к существенному ухудшению в системе. сопряжения ц-реиепюров с с-бедками. ,.'..''■•.■•.'"'••■"•'.'

4. Исследование различий систем.опиоидных реиепторов линий лышей с различной генетической чувствительностью к алкоголю.

Длительное употребление алкоголя, как и морфина, приводит к . формированию физической 1 зависимости. Поэтому, мы исследовали ' системы огшоидних рецепторов жяаотанх с различной генетической чувствительностью к алкогояв. В Тайя/ 3 приведены характеристики комнлексообразовзния'к- я а-'-яигзидов с рецепторами коры головного мозга мышей лишш с57ои,.;-о1яичэгаци$ся повышенной восприимчивостью к алкоголю, и мышей, линии рва, не•восприимчивых к алко-'.

Из результатов Табл.З видно,' что характеристики комплексо-образования ц-лигаднз 3н-одсо на препаратах мембран, .исследуемых . . лши1й мышей, одинаковы и удовлетворительно описываются моделью с двумя независимыми центрами связывания. '' л '"■_'•. '■'■":•..

В системе,г- опиоидных рецепторов линий мышей,' отличающихся • пристрастием к алкоголю, наблюдаются существенные отличия - от-• сутствиэ супервысокоаффлнного центра связывания лиганда ^и-рэьет у овл мышей. ( Табл.З )., Кроме того, на мембранных препаратах

Таблица 3. Характеристики связывания лигандов 3н-расо и 'н-оэьет на препаратах мембран коры головного мозга мышей линий С57вь и рва. В таблице представлены медианы значений. I - супервдсокоаффинный центр; 2 - высокоаффгашый центр.

ЛИНИЯ мышей лиганд 0 О к М О л а ' иг бе-^к а К .-ки <2 /К 1 1 ■ л П К К 0 /1 ь 2' м г Л а л к а к.,, ам 0 '-К 2 2

С57вь 3Н-ОАвО ^Н-ВЭЬЕТ 0,002 0,005 0.30 0.35 0.007 0,014 0,054 0,062 12,0 6,0 0,005 0,010

ОБА 3Ц-ОАСО 311- БЗЬЕТ 0,002 0.30 0,007 0.049 0,076 10,5 2.8 0,005 0,048

с57вь мышей константа диссоциации комплекса 3н-озьет и высокоаффинного центра связывания хуже, чем константа диссоциации на препаратах мембран ива мышей.

Различия .систем 5-ошоидных рецепторов, возможно, лежат в основе различной генетической чувствительности к алкоголю.

Кроме того, мы показали, что длительная морфгашзация не влияет на свой.ства ^-рецепторов коры головного мозга сва нишей. Полученный рззультат подтверждает вывод теоретического анализа о медленной инактивации рецепторов, отвечающих за эффекты наркотика и участвующих в формировании физической зависимости.

С/

внвоян

I. Для описания .поселения рецепторно-ферментной системы в услошях длительного введения наркотика предложена, теоретически оопсэнз и экспериментально подтверждена модель двойного действия физиологически активного вещества.

' 2. Впервые сформулированы кинетические принципы формирования физической зависимости: I) значительные отличия в характерных временах процессов деградации ключевого продукта и фермента; 2) необходимость медленной инактивации -рецепторов.

3. Показано, что при длительном введении морфина поведешш дофэминергической И с'еротонние.ргической систем моноаминов стриа-туиа описывается моделью двойного действия физиологически активного вещества.

4. Установлена различная регуляция гюрфином .ц- и s- супер-высокоаффшшых центров связывания* w «задетельствует о независимости этих" центров. -

5. Обнаружено, что линии мышей, «эйлэдащие различной генетической чувствительность к'йлкоголв, гаеют существенные отличия в системе опноилных «-рецепторов.

6. Установлено,что длительная морфинизацля не вызывает, существенных изменений опиоидшх v рецепторов , .с которыми связывают наркотические эффекты морфина, а также системы сопряжения м- рецепторов с g - белками. Это подтверждает'вывод теоретического анализа о медленной инактивации рецепторов как кинетической особенности рецепторно-ферментной системы при формировании физической зависимости.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ .

1. A.D. Ilyina, Р.н. Klodt, R.ïu. Yukhananov, Л.A. Grig.orycv, Л.I. M.iisky, S.V. zaitsev, The effect of chronic morphine administration on the superhigh affinity binding sites oi 5 opiate receptor liyands.// Abstracts of 5th ESlf ,-■ General fleeting. - ' Leipzig, 1990. - p. 68. " . ■

2. S.V. Zaitsev, A.D. Ilyina, S.D. Varfolomeev. Interaction of и and S ligands with the System of opioid receptors. Kinetic model of drug dependence.// Abstracts of 8th ESN - General' Meeting... -Leipzig, 1990.- p.68.

3. R.Yu. Yukhananov, P.M. Klpdt, A.D. Ilyina, S.V. Zaitsev, T.

Tennila, V. S. Kudrin, К. R. Gaina tili no v, A.I. Haiaky. Intluence of chronic morphinizatian on dynamics of monoamines in die atria-tum.// Abstracts of в4'1 ES» - General Meetinq. - Leipzig, ltiuO.-p. 116.

4. O.A. Склянкина, H.H. Курочкин, А.Д. Варфоломеева, Б.В. Крах-нов, C.B. Зайцев, С.Д. Варфоломеев. Кинетические закономерности влияния GTP на свойства оииоидннх рецепторов.// Биохимия. -ХЭ90. - т.55, вып.6. - с,1032 - 1042.

5. А.Д. Ильина, n.M. Клодт, Р.Ю. Юханацов, A.A. Григорьев, А.И. Майский. Влияние хронического те деты морфина на свойства су-первысокоэМмнного центра связывания 5-лиганда.// Тез, доки. Всесоюзного симпозиума "Биохимия рецепторих систем". - Таллин, 1990. - c.Ä3

6. П.М. Клодт, А.Д. Ильина, Р.Ю. Юханано?. Влияние хронической морфинизации на функциональную активность опиатшх, рецепторов. // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Биохимия рецепторих систем". - Таллин, 1990. - с.Л б

7. М.Г. Сергеева, А.Д. Ильина, С.Б. Зайцев, С,Д. Варфоломеев. Десенситизацля рецепторов низкомолекулярних лигандов.// Успехи биологической химии. - 1991. - т. 32 - с, 172-192.