Кинетика процесса окисления глюкозы с помощью микроорганизма Escherichia coli в присутствии экзогенных медиаторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

На правах рукописи

КУЗЬМИЧЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

КИНЕТИКА ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМА ESCHERICHIA COLI В ПРИСУТСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ МЕДИАТОРОВ

Специальность 02.00.05 - электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

00347471Ь

Саратов - 2009

003474715

Работа выполнена на кафедре физической химии ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Казаринов Иван Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Камнев Александр Анатольевич

Ведущая организация: Воронежский государственный

университет, г. Воронеж

Защита состоится 26 июня 2009 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, I корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

доктор технических наук, профессор Шпак Игорь Евгеньевич

Автореферат разослан мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

В.В. Сорокин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении XX века мировой расход энергии существенно возрос, что привело энергетику в неуравновешенное состояние. Интерес к разработке альтернативных источников энергии, в том числе и химических источников тока, не ослабевает в связи с грядущим глобальным истощением на Земле источников полезных ископаемых, используемых для нужд энергетики. В настоящее время новым витком в развитии электрохимической энергетики является создание биологических топливных элементов (БТЭ), представляющих собой устройства, которые используют биологические компоненты как катализаторы для генерации электричества.

В отличие от химических топливных элементов, биологические работают при более мягких условиях, а именно при комнатных температуре и давлении. Они также используют нейтральный электролит и недорогие катализаторы. В БТЭ в качестве катализаторов применяют либо целые микроорганизмы, либо ферментные препараты. В связи с этим БТЭ подразделяют на ферментные топливные элементы (ФТЭ) и микробные топливные элементы (МТЭ). Кроме того, в отличие от химических топливных элементов, использующих водород, этанол и метанол как топливо, БТЭ в качестве топлива могут использовать энергетически ёмкие, но электрохимически пассивные вещества (углеводы, органические кислоты и спирты), а также многие органические отходы. Это открывает возможность одновременного решения энергетической и экологической проблем.

Перспективным направлением является подход, основанный на использовании в качестве биокатализаторов целых микроорганизмов. По мощности и кулоновской эффективности МТЭ, использующие экзогенные редокс-медиаторы для переноса электронов от бактериальной клетки к электроду, пока уступают МТЭ с прямым переносом электронов. Эффективность их работы зависит от многих параметров. К ним в первую очередь следует отнести природу экзогенного медиатора и микроорганизма и их совместимость друг с другом. Каталитическая активность микроорганизмов в присутствии экзогенных редокс-медиаторов, а также кинетика процессов, протекающих на микробных медиаторных электродах, на сегодняшний день мало изучены. Существует только несколько попыток их исследования с применением современных методов экспериментальной электрохимии. Между тем, исследование кинетических закономерностей процессов, протекающих на биоанодах, представляется действительно актуальной задачей, поскольку они могут служить фундаментальной основой при создании МТЭ медиаторного типа.

Цель работы. Установление кинетических закономерностей процесса окисления глюкозы с помошью микроорганизма Escherichia coli в присутствии экзогенных медиаторов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:

- изучить электрохимическое поведение экзогенных редокс-медиаторов, выбранных из различных классов веществ (тиазины, азины и оксази-ны), в рабочем электролите и оценить их коэффициенты диффузии;

- определить эффективность работы исследуемых медиаторов в биоэлектрохимической системе;

- изучить электрохимическими методами кинетику процесса биоэлектро-каталитического окисления глюкозы клетками Escherichia coli и определить кинетические параметры этого процесса;

- создать макет микробного топливного элемента и изучить кинетику процесса окисления глюкозы на микробном медиаторном аноде в условиях его работы.

Научная новизна. Впервые электрохимическими методами проведено изучение каталитической активности микроорганизма Escherichia coli при окислении глюкозы в присутствии экзогенных медиаторов - метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина. Обосновано и доказано, что метиленовый синий и галлоцианин являются эффективными медиаторами при реализации микробного медиаторного анода на основе клеток Escherichia coli. Установлено, что процесс окисления метиленового синего на биоаноде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля, а процесс окисления галлоцианина - в режиме диффузионной кинетики. Определены кинетические характеристики реакции окисления метиленового синего на биоаноде - порядок реакции и гетерогенная константа скорости.

На основе уравнения Михаэлиса-Ментен проведен кинетический анализ процессов диффузии метиленового синего и галлоцианина между клеткой (катализатором) и контактирующим с ней раствором. Показано, что метиленовый синий является более эффективным медиатором по сравнению с галлоцианином в реакции окисления глюкозы с помощью микроорганизма Escherichia coli.

Изучена кинетика процесса окисления глюкозы бактериальными клетками в условиях работы макета микробного топливного элемента. Показано, что лимитирующей стадией в работе микробного медиаторного ?.но да является процесс окисления медиатора - метиленового синего. Практическая значимость. Разработан микробный медиаторный анод на основе клеток Escherichia coli для процесса окисления глюкозы и оптимизированы условия его работы. Проведенные испытания на макете микробного топливного элемента показали, что предложенный микробный ме-

диаторный анод на основе глюкозы и микроорганизма Escherichia coli работает удовлетворительно и может быть в дальнейшем использован для практических целей при создании медиаторного микробного топливного элемента. Данные по электрохимическим характеристикам микробного медиаторного анода могут быть использованы при создании микробных биосенсоров.

На защиту выносятся следующие положения:

- возможность использования метиленового синего и галлоцианина в качестве медиаторов, осуществляющих эффективный перенос электронов от микроорганизма Escherichia coli на электрод;

- результаты исследования кинетических закономерностей процесса окисления глюкозы с помощью бактериальных клеток Escherichia coli, протекающего в присутствии экзогенных редокс-медиаторов, во внешнедиффу-зионной и внутридиффузионной цепи;

- результаты испытания работы микробного медиаторного анода в макете микробного топливного элемента.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на III Всероссийском семинаре с международным участием «Топливные элементы и энергоустановки на их основе» (Екатеринбург, 2006), на JII Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» «ФАГРАН-2006» (Воронеж,

2006), на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2007), на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва.

2007), на III Всероссийской конференции «Актуальные проблемы электрохимической технологии» (Энгельс, 2008), на VII Международной конференции «Фундаментальные проблемы электрохимической энергетики» (Саратов, 2008), а также на IV Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» «ФАГРАН-2008» (Воронеж, 2008).

Личный вклад соискателя заключается в анализе литературных источников и написании литературного обзора, постановке и проведении эксперимента, обсуждении результатов исследования, подготовке статей, материалов конференций, рукописей диссертации и автореферата. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи, 2 из которых в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых журналов, рекомендуемых ВАК, 6 статей в сборниках научных трудов, 3 тезисов докладов.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включая литературный обзор, выводов и списка цитируемой литературу (121 наименование). Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрирована 49 рисунками и содержит 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследования, сформулирована цель работы, отражены научная новизна и практическая значимость, перечислены положения, выносимые на защиту.

Первая глава является литературным обзором, посвященным проблематике биологических топливных элементов. Рассмотрены особенности работы БТЭ ферментного и микробного типов. Показано, что МТЭ (медиа-торные и безмедиаторные) являются перспективными альтернативными источниками электрической энергии. Подробно описаны механизмы электронного переноса в МТЭ, а также представлены сведения о видах микроорганизмов и медиаторов, которые могут быть использованы при их создании. Указаны основные проблемы МТЭ и области их применения. Вторая глава содержит подробное описание методики эксперимента. Для исследований была выбрана следующая модельная система: моногидрат глюкозы СбН)20б'Н20 (х.ч.) в качестве субстрата, клетки Escherichia coli штамма К-12 в качестве биологического катализатора и окислительно-восстановительные индикаторы - метиленовый синий (ч.д.а.) из класса тиазинов, нейтральный красный (ч.д.а.) из класса азинов и галлоцианин (ч.д.а.) из класса оксазинов в качестве медиаторов. Для проведения электрохимических измерений использовали стеклянную трёхэлектродную герметичную ячейку с разделенными анодным и катодным пространствами. Эксперименты проводили в термостатируемых условиях при температуре 37°С в атмосфере аргона. Вращающиеся дисковые электроды были выбраны в качестве рабочих электродов, которые представляли собой диски из стеклоуглерода и платины площадью 0.071 см2 и 0.39 см2, соответственно. Вспомогательный электрод был выполнен из платиновой проволоки, скрученной в спираль. Потенциометрические измерения проводились относительно насыщенного хлоридносеребряного электрода сравнения, потенциал которого составлял +0.201 В относительно нормального водородного электрода. Рабочим электролитом служил фосфатный буферный раствор (рН 7.0) с добавкой хлорида натрия в качестве фонового электролита. Снятие поляризационных кривых проводилось с помощью потенциостата IPC-compact, соединенного с персональным компьютером. Амперометрические измерения были сделаны с помощью потенциостата П-5848. В этом случае электрический отклик рабочего электрода регистрировался самопишущим потенциометром КСП 4.

Третья глава посвящена установлению кинетических закономерностей процесса окисления глюкозы клетками Escherichia coli, протекающего в присутствии экзогенных редокс-медиаторов во внешнедиффузиоиной цепи.

Возможность использования метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина в качестве медиаторов, осуществляющих перенос электронов от микроорганизма на электрод, была изучена с помощью метода циклической вольтамперометрии. Циклические вольтамперные кривые были сняты при различных скоростях вращения на стеклографи-товом дисковом электроде для различных концентраций исследуемых медиаторов (рис. 1-3).

Рис. 1. Циклические вольтамперные кривые стеклографитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 1.25-10"1 моль/л метиленового синего и 210"' моль/л глюкозы при различных скоростях вращения (рад/с): 1-178.0; 2240.6; 3-293.1; 4-345.2; 5-397.6. Скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

м1сА/смг

Рис. 2. Циклические вольтамперные кривые стеклографитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 1.25-10"1 моль/л нейтрального красного и 2-10':' моль/л глюкозы при различных скоростях вращения (рад/с): 1-178.0; 2240.6; 3-293.1; 4-345.2; 5-397.6. Скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

Рис. 3. Циклические вольтамперные кривые стеклографитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 5-10"4 моль/л галлоцианина и 2-10*5 моль/л глюкозы при различных скоростях вращения (рад/с): 1-178.0; 2-240.6; 3-293.1; 4345.2; 5-397.6. Скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

Установлено, что электрохимические реакции восстановления мети-ленового синего, нейтрального красного и галлоцианина на электроде протекают в режиме диффузионной кинетики. По уравнению Левича определены коэффициенты диффузии исследуемых медиаторов, которые близки между собой и составляют (1.3±0.1)10"6 см2/с, (1.1±0.2)10'бсм2/с и (1.5±0.1)-10"6 см2/с для метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина, соответственно. Из циклических вольтамперных кривых определены значения анодных и катодных электрохимических ёмкостей и установлено, что метиленовый синий и галлоцианин на стеклографитовом электроде работают обратимо, а нейтральный красный является необратимо работающим редокс-медиатором.

Для определения эффективности работы метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина в биоэлектрохимической системе глюкоза - клетки Escherichia coli проведены амперометрические измерения процесса окисления глюкозы бактериальными клетками на вращающемся дисковом электроде при различных концентрациях субстрата и исследуемых медиаторов в рабочем электролите (рис. 4-6). Из рис. 4 видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит, содержащий в качестве медиатора метиленовый синий, начинается резкое возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение

концентрации восстановленной формы метиленового синего в объёме раствора, о чем свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. Кривые проходят через максимум, после чего наблюдается постепенное снижение плотности тока во времени с выходом на постоянное значение. Величина плотности тока максимума возрастает при увеличении скорости вращения дискового электрода. Общая скорость процесса зависит от объёмной концентрации медиатора и субстрата в растворе. Показано, что процесс окисления метиленового синего на биоаноде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля. Установлено, что порядок реакции по медиатору и глюкозе приблизительно равен единице, а среднее значение гетерогенной константы скорости процесса анодного окисления метиленового синего при его различной объемной концентрации составляет 1.74-10"3 см/с.

Время, сек

Рис. 4. Потенциостатические кривые анодного окисления метиленового синего на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5-104 моль/л медиатора, 4.610'3 моль/л глюкозы и 2 мг вл.веса/мл клеток при различных скоростях вращения (рад/с): 1- 36.6; 2-54.5; 3- 80.6; 4-104.6; 5-151.8 при потенциале +0.250 В.

Из рис. 5 видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит, содержащий в качестве медиатора галлоцианин, наблюдается

медленное возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение концентрации восстановленной формы галлоцианина в объёме раствора, о чем свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. Плотность тока достигает предельного значения за время 2500-3000 с, что примерно в 10 раз продолжительнее, чем для метиленового синего. Установлено, что электрохимическая реакция окисления галлоцианина на биоаноде протекает в режиме диффузионной кинетики.

Рис. 5. Потенциостатические кривые анодного окисления галлоцианина на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 1 • 10"3 моль/л глюкозы и 2 мг вл.веса/мл клеток при различных концентрациях галлоцианина (моль/л): 1-1.25-10"4; 2-2.5'Ю"4; З-5'IO"4; 4-7.510"4; 5-1-103. Скорость вращения 36.6 рад/с, при потенциале +0.250 В.

Из рис. 6 видно, что при введении бактериальных клеток в рабочий электролит, не происходит возрастания плотности анодного тока. Это связано, по всей видимости, с неудовлетворительной работой нейтрального красного как медиатора, осуществляющего перенос электронов от микроорганизма на электрод.

Таким образом, изучение поведения экзогенных медиаторов в биоэлектрохимической системе показало, что метиленовый синий и галло-цианин являются эффективными окислительно-восстановительными системами в условиях работы микробного медиаторного анода на основе бактериальных клеток Escherichia coli, а нейтральный красный не может быть использован в качестве медиатора, осуществляющего перенос электронов от микроорганизма на электрод.

В связи с этим в четвёртой главе проведено изучение каталитической активности микроорганизма Escherichia coli при окислении глюкозы в присутствии экзогенных медиаторов - метиленового синего и галлоцианина. При этом особую важность представляло построение кинетических моделей и описание механизмов протекания ферментативных реакций. Одним из фундаментальных представлений о механизме ферментативной реакции является представление о фермент-субстратном комплексе, образующемся при превращении субстрата в продукт под действием фермента.

15 -

1200 Время, сек

Рис. 6. Потенциостатичсская кривая анодного окисления нейтрального красного на стекло-графитовом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 5-10"1 моль/л нейтрального красного, МО"5 моль/л глюкозы и 2 мг вл.всса/мл клеток. Скорость вращения дискового электрода 36.6 рад/с, потенциал +0.250 В.

Считается, что механизм ферментативной реакции заключается в следующем: субстрат образует комплекс с активным центром фермента, в комплексе происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата. Медиатор должен быть специфическим субстратом фермента и, кроме того, электрохимически активным на электроде. С учётом вышеизложенного, схема процесса переноса электронов в системе субстрат-микроорганизм-медиатор-электрод была представлена в виде:

г» I 17 ) к, . р . р

клет ок, клет ^ ¡~ клет клет в, клет

м0к,_ + Ев и <==> ЕМмя —МВ1 + Еок _ (2),

Мв —ЭлектР°д > Мок + пе- (3),

где и Рклет - субстрат и продукт внутри бактериальной клетки, соответственно;

M0KiI01eT и Мв клет - окисленная и восстановленная формы медиатора внутри

бактериальной клетки, соответственно; Мок иМ,- окисленная и восстановленная формы медиатора вне бактериальной клетки, соответственно; Е0к,клет и Ев>клет - фермент, локализованный в цитоплазматической мембране бактериальной клетки, в окисленном и восстановленном состояниях, соответственно. В работе проведён анализ процессов диффузии метиленового синего, гал-лоцианина и субстрата между клеткой (катализатором) и контактирующим с ней раствором, то есть в условиях, когда скорость реакции определяется внутридиффузионными эффектами, а именно, массопереносом внутри частицы катализатора (реакции (1) и (2)). Для этого были выполнены ам-перометрические измерения процесса окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli на стеклографитовом электроде при различных концентрациях субстрата и медиаторов. Показано, что с увеличением концентрации субстрата и медиаторов величина силы тока (скорость реакции) возрастает (рис. 7).

Рис. 7. Зависимость величины тока максимума процесса анодного окисления метиленового синего от концентрации медиатора при избыточной концентрации субстрата, равной НО"3 моль/л. В рабочем электролите содержится 2 мг вл.веса/мл клеток.

Установлено, что в заданных экспериментальных условиях при концентрациях метиленового синего и субстрата, равных 2-10"3 моль/л и 1-10"3 моль/л, соответственно, наблюдается эффект насыщения, то есть скорость процесса перестает зависеть от концентрации. Для галлоцианина эффект насыщения наблюдается при концентрациях медиатора и субстрата, равных 1-10'3 моль/л. Для анализа экспериментальных данных была применена математическая модель, основанная на уравнении Михаэлиса-Ментен

(уравнение 4) и учитывающая константы распределения субстрата и медиаторов между внутренней средой клетки и анализируемым раствором:

гу L ок.клет J (г .

Км.р = г,, т (6)'

j __max______

~ 1 + /KSp[S] + км^ет /KUiP[Mm] (4),

V _ ] /«Л

l^oic.om j

Ш

где KSp и KMp - константы распределения субстрата и медиатора между внутренней средой клетки и внешним раствором, соответственно;

^хккт и Км.юет - константы 'Михаэлиса для субстрата и окисленной

формы электронных медиаторов, соответственно; SK]em и S - субстрат внутри и вне бактериальной клетки, соответственно;

Мок, ает и Мок - окисленная форма медиатора внутри и вне бактериальной клетки, соответственно; 1тах - максимальная скорость реакции. Учитывая, что измерения ведутся при избытке субстрата и медиаторов можно использовать следующие упрощенные уравнения:

I ^S мет I =-—-=-= (при-« 1 - избыток субстрата) (7),

I к

I =-—-г—^ (при--.« 1 - избыток медиатора) (8).

l + Ks^eJKsJs] KKir\Mj

Каталитическая активность клеток в присутствии метиленового синего и галлоцианина была охарактеризована тремя параметрами: максимальной скоростью реакции (Imax) и отношениями константы Михаэлиса к константе распределения для субстрата (KS-KTCT/KSip) и для исследуемых медиаторов (Км клет/Км.р), которые были определены из экспериментальных данных (рис. 8). Как правило, из данных по стационарной кинетике эти параметры определяют на основе линеаризации уравнения Михаэлиса:

-L = 1 + ,ккт _ 1 ^

I 1 max ^ Л/ ,р' ^ wax ^ ок

I

I /,

1 ^S,Kjem 1

К •I

max S,p max

M

0,5

1/1, mkA"1

у = 2E-05x +0,0719

-4000\_ _ty 4000

(К M, клет /К M,p)

12000

16000

С"1, (моль/л)"1

Рис. 8. Зависимость величины обратного тока максимума процесса анодного окисления ме-тиленового синего от обратной величины концентрации медиатора. В рабочем электролите содержится 2 мг вл.веса/мл клеток и МО'5 моль/л глюкозы.

Показано, что отношение Iт„J(Кк1 К_~,е„/Кк 1р), которое характеризует эффективность медиаторов, для метиленового синего составляет 4.4-10"2 с'1, а для галлоцианина 2.8-10'2 с"1 (таблица 1). Следовательно, скорость диффузии метиленового синего между клеткой и контактирующим с ней раствором больше, чем у галлоцианина. Таким образом, метиленовый синий является более эффективным медиатором по сравнению с галлоцианином в реакции окисления глюкозы с помощью микроорганизма Escherichia coli.

В пятой главе проведена апробация работы микробного медиатор-ного анода в макете топливного элемента. Анодом служил пористый графитовый электрод, легированный металлической платиной, а катодом -диоксидносвинцовый электрод. В качестве медиатора для создания микробного медиаторного анода был использован метиленовый синий. Рабочее напряжение такого макета микробного топливного элемента составляло от 1.0 В до 1.4 В, что определялось степенью заряженности диоксид-

носвинцового электрода. Получены разрядные кривые исследуемого макета микробного топливного элемента при различных разрядных токах.

Таблица 1. Значения параметров процесса окисления глюкозы бактериальными клегкамп Escherichia coli в присутствии медиаторов - метиленового синего и галлоцианина.

Км,клеп/Км,р 1тах/(Кмлт>/Км,р)

Медиатор 1тах, мкА •ю4, ■Ю2,с1 \

моль/л i

Метиленовый |

синий 13.7 3.1 4.4 j

Галлоцианин 12.0 4.3 2.8 I

В качестве примера на рис. 9 приведена разрядная кривая исследуемого макета микробного топливного элемента при токе разряда 10 мА.

-0-3

•0,2

0 Cb^O- O^O- CF O- О- - -О---О- - -о-

ß 10 20 30 40 50 60 70

Время, мин

Рис. 9. Разрядные кривые исследуемого макета микробного топливного элемента при юке разряда ЮмА: 1 - напряжение макета микробного топливного элемента, 2 - потенциал диск-сидносвинцового катода, 3 - потенциал микробного медиаторного анода.

Показано, что работа макета микробного топливного элемента ограничена диоксидносвинцовым электродом, а предложенный микробный медиаторный анод на основе глюкозы и микроорганизма Escherichia со-'■

работает удовлетварительно и может быть в дальнейшем использован для практических целей при создании медиаторного микробного топливного элемента.

Для изучения кинетики процесса анодного окисления исследуемого микробного медиаторного электрода были сняты в прямом и в обратном направлениях поляризационные кривые пористого графитового электрода в условиях работы макета микробного топливного элемента. Анализ полученных кривых показал, что лимитирующей стадией в работе микробного медиаторного анода является процесс окисления медиатора - метиленово-го синего.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Изучено электрохимическое поведение некоторых окислительно-восстановительных систем: метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина на стеклографитовом электроде в фосфатном буферном растворе (pH 7.0). Показано, что метиленовый синий и галлоцианин являются обратимыми окислительно-восстановительными системами и могут быть использованы в качестве медиаторов при реализации микробного анода на основе клеток Escherichia coli. Установлено, что электрохимические реакции восстановления исследуемых медиаторов на рабочем электроде протекают в режиме диффузионной кинетики. Определены их коэффициенты диффузии, которые близки между собой и составляют (1.3±0.1)-10"6 см2/с, (1.1±0.2)ТО'6 см2/с и (1.5±0.1)-10"6 см2/с для метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина, соответственно.

2. Изучено поведение исследуемых медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза - медиатор - клетки Escherichia coli. Показано, что метиленовый синий и галлоцианин являются эффективными окислительно-восстановительными медиаторами при реализации условий работы микробного медиаторного анода, а нейтральный красный работает не эффективно.

3. Изучена кинетика процесса биоэлектрохимического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli с использованием метиленового синего и галлоцианина в качестве медиаторов. Показано, что общая скорость электрохимической реакции зависит от концентрации медиаторов и субстрата в объеме раствора. Из зависимости общей скорости биоэлектрохимического процесса от скорости вращения дискового электрода установлено, что процесс окисления метиленового синего на биоаноде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля, а процесс окисления галлоцианина - в режиме диффузионной кинетики.

4. Определены кинетические характеристики реакции окисления ме-тиленового синего на биоаноде - порядок реакции и гетерогенная константа скорости. Показано, что порядок реакции по медиатору и глюкозе приблизительно равен единице, а среднее значение гетерогенной константы скорости процесса анодного окисления метиленового синего при его различной объемной концентрации составляет 1.74-10"3 см/с.

5. Изучена каталитическая активность микроорганизма Escherichia colt в условиях работы микробного медиаторного анода. Показано, что с увеличением концентрации медиаторов и субстрата скорость процесса возрастает. В заданных экспериментальных условиях при концентрациях метиленового синего и субстрата, равных 2Т0'3 моль/л и 1-10'3 моль/л, соответственно, наблюдается эффект насыщения, то есть скорость процесса перестает зависеть от концентрации. Для галлоцианина эффект насыщения наблюдается при его концентрации, равной 1-10"3 моль/л.

6. На основании уравнения Михаэлиса-Ментен был проведен анализ кинетики процессов диффузии метиленового синего и галлоцианина между катализатором и контактирующим с ним раствором. Отношение максимального тока процесса к эффективной константе обмена 1тах/(Км,1ает/Км,р) Для метиленового синего составляет 4.4-10"2 с"1, а для галлоцианина составляет 2.8-10'V1. Это указывает на то, что скорость обмена метиленового синего между клеткой (катализатором) и контактирующим с ней раствором быстрее, чем у галлоцианина.

7. Проведено испытание микробного медиаторного анода на основе клеток Escherichia coli для процесса окисления глюкозы в разработанном макете топливного элемента, в котором катодом являлся диоксидносвин-цовый электрод. Показано, что работа макета топливного элемента в данных условиях ограничена диоксидносвиниовьш электродом, а процесс окисления микробного медиаторного анода лимитируется скоростью окисления медиатора - метиленового синего.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Казаринов И.А., Власова Е.Л., Кузьмичева Е.В. Биотопливные элементы: современное состояние и перспективы // Топливные элементы и энергоустановки на их основе: Тезисы докладов III Всероссийского семинара с международным участием.- Екатеринбург: Изд-во Урал, унта, 2006,-С. 17-20

2. Казаринов И.А., Кузьмичева Е.В. Биотопливные элементы - новое направление в развитии электрохимической энергетики // Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах (ФАГРАН-2006): Материалы III Всероссийской конференции.- Воронеж: Научная книга, 2006.- Т. I.- С. 113-116

■3. Казаринов И.А., Кузьмичева E.B, Игнатов O.B. Микробный топливный элемент на основе микроорганизма Escherichia coli И Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах (ФАГРАН-2006): Материалы III Всероссийской конференции." Воронеж: Научная книга, 2006.- Т. 1.- С. 116-117

4. Казаринов И.А., Кузьмичева Е.В., Степанов А.Н. Анализ современного состояния и перспективы развития биотопливных элементов // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии,- М.: Граница, 2007,- Т. 3,- С.139

5. Казаринов И.А., Кузьмичева Е.В., Степанов А.Н., Игнатов О.В. Кинети-

ка электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli в присутствии электронного акцептора // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии.- М.: Граница, 2007,- Т. 3.- С.179

6. Кузьмичева Е.В., Казаринов И.А., Степанов А.Н., Фокина Т.Э., Пройда-

кова A.C. Изучение кинетики электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli в присутствии медиатора // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VI Всерос. конф. молодых ученых с международ, участием.- Саратов: Изд-во «Научная книга», 2007,-С. 311-312

7. Кузьмичева Е.В., Решетов В.А., Казаринов И.А., Игнатов О.В. Разрядные характеристики микробного топливного элемента на основе микроорганизма Escherichia coli И Электрохимическая энергетика,- 2007,Т. 1, №1.- С. 33-37

8. Кузьмичева Е.В., Степанов А.Н., Казаринов И.А., Игнатов О.В. Изучение кинетики окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli с помощью метода вращающегося дискового электрода // Электрохимическая энергетика,- 2007.- Т. 7, №4,- С. 200-204

9. Кузьмичева Е.В., Казаринов И.А. Изучение кинетики процесса окисления микробного медиаторного анода // Материалы III Всероссийской конференции «Актуальные проблемы электрохимической технологии»,- Саратов: Изд-во Саратовского государственного технического университета, 2008.-С. 329-331

10. Кузьмичева Е.В., Казаринов И.А., Игнатов О.В. Кинетика биоэлектро-

химического окисления глюкозы с помощью микроорганизмов Escherichia coli II Фундаментальные проблемы электрохимической энергетики: Материалы VII Междунар. конф./ Под ред. проф. И.А. Казаринова,- Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2008.- С. 138

11. Кузьмичева Е.В., Казаринов И.А., Игнатов О.В. Изучение кинетики

процесса окисления микробного медиаторного анода методом вращающегося дискового электрода // Материалы IV Всероссийской

1В

конференции «Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах (ФАГРАН-2008)».- Воронеж: Научная книга, 2008,- С. 161-164 12. Кузьмичева Е.В., Казаринов И.А. Современное состояние, проблемы и перспективы развития микробных топливных элементов // Все материалы. Энциклопедический справочник.- 2008, №7,- С. 28-36

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение автор выражает благодарность своему научному руководителю профессору, д.х.н. И.А. Казаринову за постановку задач и помощь в их решении, сотрудникам Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов), профессору, д.б.н. О.В. Игнатову за постоянное внимание к работе и методологическую помощь в проведении биохимических экспериментов и м.н.с. JI.H. Маркиной за помощь, оказанную при выращивании клеток Escherichia coli.

КУЗЬМИЧЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

КИНЕТИКА ПРОЦЕССА ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМА ESCHERICHIA COLI В ПРИСУТСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ МЕДИАТОРОВ

Специальность 02.00.05 - электрохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Подписано в печать мая 2009 г. Формат 60x84 1/16. Объем 1,25 пл. Тираж 100 экз. Заказ № Ц.

Отпечатано в типографии Саратовского государственного университета. 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Биологические топливные элементы (литературный обзор)

§

1.1. Устройство и классификация биологических топливных элементов

1.2. Особенности работы ферментных топливных элементов

§

1.3. Общие представления о микробном метаболизме \ \

1.3.1. Катаболизм углеводов \

1.3.2. Дыхательная цепь \

1.3.3. Искусственные акцепторы электронов \

1.3.4. Особенности брожения осуществляемого микроорганизмами семейства ЕЫегоЪас1ег1асеае 1.4. Механизмы электронного переноса в микробных топливных элементах

1.4.1. Медиаторный электронный перенос

1.4.2. Прямой электронный перенос

1.5. Основные проблемы и оптимизация условий работы микробного топливного элемента

1.6. Применение микробных топливных элементов

1.6.1. Очистка сточных вод

1.6.2. Седиментные микробные топливные элементы

1.6.3. Производство водорода

1.6.4. Создание гастророботов

ГЛАВА 2 Методика эксперимента 35 2.1. Материалы и приборы

2.1.1. Микроорганизмы

2.1.2. Экспериментальная ячейка

2.1.3. Реактивы

2.1.4. Рабочий электрод

2.1.5. Электрохимические измерения

2.2. Методика биоэлектрохимического эксперимента

2.3. Методика снятия разрядных кривых в макете микробного топливного элемента

ГЛАВА 3 Изучение кинетики процесса окисления глюкозы с помощью клеток Escherichia coli в присутствии экзогенных ¿ц медиаторов методом вращающегося дискового электрода

3.1. Электрохимическое поведение редокс-медиаторов в рабочем электролите на стеклографитовом электроде

3.2. Оценка эффективности работы редокс-медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза — клетки Escherichia coli

ГЛАВА 4 Изучение каталитической активности микроорганизма Escherichia coli при окислении глюкозы в присутствии экзо- 71 генных медиаторов

ГЛАВА 5 Апробация работы микробного медиаторного анода в макете микробного топливного элемента

5.1. Электрохимические характеристики микробного медиаторного анода в макете микробного топливного элемента

5.2. Кинетика анодного окисления микробного медиаторного анода 39 ВЫВОДЫ 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Актуальность темы. На протяжении XX века мировой расход энергии существенно возрос, что привело энергетику в неуравновешенное состояние. Интерес к разработке альтернативных источников энергии, в том числе и химических источников тока, не ослабевает в связи с грядущим глобальным истощением на Земле источников полезных ископаемых, используемых для нужд энергетики. В настоящее время новым витком в развитии электрохимической энергетики является создание биологических топливных элементов, которые находят применение для очистки сточных вод [1,2], производства водорода [3,4], в медицине (запитывание имплантируемых устройств) [5].

Биологические топливные элементы (БТЭ) представляют собой устройства, которые используют биологические компоненты как катализаторы для генерации электричества [6].

В отличие от химических топливных элементов, биологические работают при более мягких условиях, а именно при комнатных температуре и давлении. Они также используют нейтральный электролит и недорогие катализаторы. В БТЭ в качестве катализаторов применяют либо целые микроорганизмы [7,8], либо ферментные препараты [9]. В связи с этим БТЭ подразделяют на ферментные топливные элементы (ФТЭ) и микробные топливные элементы (МТЭ). Кроме того, в отличие от химических топливных элементов, использующих водород, этанол и метанол как топливо, БТЭ в качестве топлива могут использовать энергетически ёмкие, но электрохимически пассивные вещества (углеводы [10], органические кислоты [11] и спирты [12]), а также многие органические отходы [13]. Это открывает возможность одновременного решения экологической и энергетической проблем.

Перспективным направлением является подход, основанный на использовании в качестве биокатализаторов целых микроорганизмов. По мощности и кулоновской эффективности МТЭ, использующие экзогенные редокс-медиаторы для переноса электронов от бактериальной клетки к электроду, пока уступают МТЭ с прямым переносом электронов [14]. Эффективность их работы зависит от многих параметров. К ним в первую очередь следует отнести природу экзогенного медиатора и микроорганизма, способного катаболи-зировать специфичный субстрат и их совместимость друг с другом. Каталитическая активность микроорганизмов в присутствии экзогенных редокс-медиаторов, а также кинетика процессов, протекающих на микробных ме-диаторных электродах, на сегодняшний день мало изучены. Существует только несколько попыток их исследования с применением современных методов экспериментальной электрохимии [15-17]. Между тем, исследование кинетических закономерностей процессов, протекающих на биоанодах, представляется действительно актуальной задачей, поскольку они могут служить фундаментальной основой при создании МТЭ медиаторного типа.

Целью данной работы является установление кинетических закономерностей процесса окисления глюкозы с помощью микроорганизма Escherichia coli в присутствии экзогенных медиаторов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи: изучить электрохимическое поведение экзогенных редокс-медиаторов, выбранных из различных классов веществ (тиазины, азины и ок-сазины), в рабочем электролите и оценить их коэффициенты диффузии;

- определить эффективность работы исследуемых медиаторов в биоэлектрохимической системе;

- изучить электрохимическими методами кинетику процесса биоэлек-трокаталитического окисления глюкозы клетками Escherichia coli и определить кинетические параметры этого процесса;

- создать макет микробного топливного элемента и изучить кинетику процесса окисления глюкозы на микробном медиаторном аноде в условиях его работы.

Научная новизна. Впервые электрохимическими методами проведено изучение каталитической активности микроорганизма Escherichia coli при окислении глюкозы в присутствии экзогенных медиаторов — метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина. Обосновано и доказано, что ме-тиленовый синий и галлоцианин являются эффективными медиаторами при реализации микробного медиаторного анода на основе клеток Escherichia coli. Установлено, что процесс окисления метиленового синего на биоаноде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля, а процесс окисления галлоцианина — в режиме диффузионной кинетики. Определены кинетические характеристики реакции окисления метиленового синего на биоаноде — порядок реакции и гетерогенная константа скорости.

На основе уравнения Михаэлиса-Ментен проведен кинетический анализ процессов диффузии метиленового синего и галлоцианина между клеткой (катализатором) и контактирующим с ней раствором. Показано, что ме-тиленовый синий является более эффективным медиатором по сравнению с галлоцианином в реакции окисления глюкозы с помощью микроорганизма Escherichia coli.

Изучена кинетика процесса окисления глюкозы бактериальными клетками в условиях работы макета микробного топливного элемента. Показано, что лимитирующей стадией в работе микробного медиаторного анода является процесс окисления медиатора — метиленового синего. Практическая значимость. Разработан микробный медиаторный анод на основе клеток Escherichia coli для процесса окисления глюкозы и оптимизированы условия его работы. Проведенные испытания на макете микробного топливного элемента показали, что предложенный микробный медиаторный анод на основе глюкозы и микроорганизма Escherichia coli работает удовлетворительно и может быть в дальнейшем использован для практических целей при создании медиаторного микробного топливного элемента. Данные по электрохимическим характеристикам микробного медиаторного анода могут быть использованы при создании микробных биосенсоров.

На защиту выносятся следующие положения:

- возможность использования метиленового синего и галлоцианина в качестве медиаторов, осуществляющих перенос электронов от микроорганизма Escherichia coli на электрод;

- результаты исследования кинетических закономерностей процесса окисления глюкозы с помощью бактериальных клеток Escherichia coli, протекающего в присутствии экзогенных редокс-медиаторов, во внешнедиффу-зионной и внутридиффузионной цепи;

- результаты испытания работы микробного медиаторного анода в макете микробного топливного элемента.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на III Всероссийском семинаре с международным участием «Топливные элементы и энергоустановки на их основе» (Екатеринбург, 2006), на III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» «ФАГРАН-2006» (Воронеж, 2006), на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2007), на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), на III Всероссийской конференции «Актуальные проблемы электрохимической технологии» (Энгельс, 2008), на VII Международной конференции «Фундаментальные проблемы электрохимической энергетики» (Саратов, 2008), а также на IV Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» «ФАГРАН-2008» (Воронеж, 2008).

ВЫВОДЫ

1. Изучено электрохимическое поведение некоторых окислительно-восстановительных систем: метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина на стеклографитовом электроде в фосфатном буферном растворе (рН 7.0). Показано, что метиленовый синий и галлоцианин являются обратимыми окислительно-восстановительными системами и могут быть использованы в качестве медиаторов при реализации микробного анода на основе клеток Escherichia coli. Установлено, что электрохимические реакции восстановления исследуемых медиаторов на рабочем электроде протекают в* режиме диффузионной кинетики. Определены их коэффициенты диффузии,

L f. которые близки между собой и составляют (1.3±0.1)-10' см"/с, (1.1±0.2)-10~

О А О см~/с и (1.5±0.1)-10" см~/с для1 метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина, соответственно.

2. Изучено поведение исследуемых медиаторов в биоэлектрохимической , системе глюкоза - медиатор - клетки Escherichia coli. Показано, что метиленовый синий и галлоцианин являются эффективными окислительно-восстановительными медиаторами при реализации условий работы микробного медиаторного анода, а нейтральный красный работает не эффективно.

3. Изучена кинетика процесса биоэлектрохимического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli с использованием метиленового синего и галлоцианина в качестве медиаторов. Показано, что общая скорость электрохимической реакции зависит от концентрации медиаторов и субстрата в объеме раствора. Из зависимости общей скорости биоэлектрохимического процесса от скорости вращения дискового электрода установлено, что процесс окисления метиленового синего на биоаноде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля, а процесс окисления галлоцианина — в режиме диффузионной кинетики.

4. Определены кинетические характеристики реакции окисления метиленового синего на биоаноде — порядок реакции и гетерогенная константа скорости. Показано, что порядок реакции по медиатору и глюкозе приблизительно равен единице, а среднее значение гетерогенной константы скорости процесса анодного окисления метиленового синего при его различной объа емной концентрации составляет 1.74-10" см/с.

5. Изучена-каталитическая, активность микроорганизма Escherichia coli в условиях работы микробного медиаторного анода. Показано, что с увеличением концентрации медиаторов и субстрата скорость процесса возрастает. В заданных экспериментальных условиях при концентрациях метиленового з л синего и субстрата, равных 2-10" моль/л и 1-10" моль/л, соответственно, наблюдается« эффект насыщения, то есть скорость процесса перестает зависеть от концентрации. Для галлоцианина эффект насыщения наблюдается при его а концентрации, равной 1-10" моль/л.

6. На основании уравнения Михаэлиса-Ментен был проведен анализ кинетики4 процессов диффузии * метиленового синего и галлоцианина между катализатором и,контактирующим-с ним раствором. Отношение максимального тока процесса к эффективной константе обмена 1тса/(Км,клаг/К-м,р) для мети-ленового*синего составляет 4.4-10"" с" , а для галлоцианина составляет 2.8-10"*" с"1. Это указывает на то, что скорость обмена метиленового синего между клеткой (катализатором) и контактирующим с ней раствором быстрее, чем у галлоцианина.

7. Проведено испытание микробного медиаторного анода на основе клеток Escherichia coli для процесса окисления глюкозы в разработанном макете топливного элемента, в котором катодом являлся диоксидносвинцовый электрод. Показано, что работа макета топливного элемента в данных условиях ограничена диоксидносвинцовым электродом, а процесс окисления микробного медиаторного анода лимитируется скоростью окисления медиатора — метиленового синего.

1. Microbial fuel cells for wastewater treatment / P. Aelterman, K. Rabaey, P. Clauwaert, W. Verstraete // Water Science and Technology. 2006. - Vol. 54. -P.9-15

2. Logan B.E. Simultaneous wastewater treatment and biological electricity generation // Water Science and Technology.- 2005.- Vol. 52.- P.31-37

3. Principle and perspectives of hydrogen production through biocatalyzed electrolysis / R.A. Rozendal, H.V.M. Hamelers, G.J.W. Euverink etc. // International Journal of Hydrogen Energy.- 2006.- Vol. 31.- P. 1632-1640

4. Hydrogen production with a microbial biocathode / R.A. Rozendal, A.W. Jere-miasse, H.V.M. Hamelers, С.J.N. Buisman // Environmental Science Technology.- 2008.- Vol. 42.- P.649-634

5. Heller A. Miniature biofiiel cells // Phys. Chem. Chem. Phys.- 2004.- Vol. 6.-P.209-216

6. Biological fuel cells and their applications / A.K. Shukla, P. Suresh, S. Berchmans, A. Rajendran // Current Science.- 2004.- Vol. 87.- P.455-468

7. Bennetto H.P. Electricity generation by microorganisms // Biotechnology Education.- 1990.-Vol. 1.-P.163-168

8. Tanisho S., Kamiya N., Wakao N. Microbial fuel cell using Enterobacter aero-genes II Bioelectrochem. and Bioenerg.- 1985.- Vol. 21.- P.25-32

9. Barton S.C., Gallaway J., Atanassov P. Enzymatic biofiiel cells for implantable and microscale devices // Chem. Rev.- 2004.- Vol. 104.- P.4867-4886

10. Градсков Д.А., Казаринов И.А., Игнатов В.В. Биоэлектрохимическое окисление глюкозы с помощью бактерии Escherihia coli // Электрохимия. 2000.- Т. 37, №11.- С. 1397-1400

11. Measurements of oxidoreductase-like activity of intact bacterial cells by an amperometric method using a membrane-coated electrode / T. Ikeda, T. Kurosaki, К. Takayama, К. Капо // Analytical Chemistry.- 1996.- Vol. 68.- P.192-198

12. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells / J.R. Kim, S.H. Jung, J.M. Regan, B.E. Logan // Biore-source Technology.- 2007.- Vol. 98.- P.2568-2577

13. Moon H., Chang I.S., Kim B.H. Continious electricity from artificial wastewater using a mediator-less microbial fuel cell // Bioresource Technology.- 2006.-Vol. 97.- P.621-627

14. Comparative study of three types of microbial fuel cell / I.A. Ieropoulos, J. Greenman, C. Melhuish, J. Hart // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.-Vol. 37.- P.238-245

15. Voltammetric behavior of living cells T. shanghaiensis and its bioanalytical application / J. Feng, Y.-X. Ci, C.-M. Gao, Y.-Z. Li // Bioelectrochemistry and Bioenergetics.- 1997.- Vol. 44.- P.89-93

16. Ciureanu M., Goldstein S. Chronopotentiometric study of electroenzymatic processes with homogeneous mediation // Bioelectrochemistry and Bioenerget-ics.- 1997.- Vol. 44.- P.65-75

17. Федорович B.B., Мажитов Т.О., Калюжный С.В. Биотопливные элементы новые возможности для энергетики // Катализ в промышленности.-2004.-№1.- С.29-34

18. Корпан Я.И., Ельская А.В. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы //Биохимия.- 1995.- Т. 60.- С.1988-1998

19. Варфоломеев С.Д. Биосенсоры // Соросовский образовательный журнал.-1997.-№1.- С.45-49

20. Electricity generation from alkalotrophic organisms / Т. Akiba, H.P. Bennetto, J.L. Stirling, K. Tanaka // Biotechnol. Lett.- 1985.- Vol. 9.- P.611-616

21. The source of fuel cell: efficient biomass conversion using a microbial catalyst / H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason, H.D. Roller etc. // Biotechnol. Lett.- 1985.- Vol. 7.- P.611-616

22. Direct electrode reaction of Fe (III) reducing bacterium, Shewanella putrefa-ciens / B.H. Kim, HJ. Kim, M.S. Hyun, D.H. Park // J. Microbiol. Biotechnol.-1999.- Vol. 9.- P. 127-131

23. Microbial fuel cells / J.L. Stirling, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason etc. // Biochem. Soc. Trans.- 1983.- Vol. 11.- P.451-453

24. Tanisho S., Kamiya N., Wakao N. Microbial fuel cell using Enterobacter aerogens //Bioelectrochem. Bioenerg.- 1983.- Vol. 21.- P.25-32

25. Vega C.A., Fernandez I. Mediating effect of ferric chelate compounds in microbial fuel cells with Lactobacillus planetarium, Streptococcus lactis and Er-winia dissolvens II Bioelectrochem. Bioenerg.- 1987.- Vol. 17.- P.217-222

26. Zhang X., Halme A. Modelling of a microbial fuel cell process // Biotechnol. Lett.- 1995.- Vol. 17.-P.809-812

27. Калюжный C.B. Микробные топливные элементы на основе возобновляемых источников энергии // Катализ в промышленности.- 2004.- №5.-С.38-42

28. A microbial fuel cell with improved cathode reaction as a low biochemical oxygen demand sensor / K.H. Kang, J.K. Jang, Т.Н. Pham, H. Moon etc. // Biotechnology Letters.- 2003.- Vol. 25.- P.1357-1361

29. Novel BOD (biological oxygen demand) sensor using mediator-less microbial fuel cell / B.H. Kim, J.S. Chang, G.C. Gil, H.S. Park etc. // Biotechnology Letters.- 2003.- Vol. 25.- P.541-545

30. Microbial phenazine production enhances electron transfer in biofuel cells / K. Rabaey, N. Boon, M. Hôfte, W. Verstraete // Environmental Science Technology.- 2005.- Vol. 39.- P.3401-3408

31. Chaudhuri S.K., Lovley D.R. Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells // Nature Biotechnology.- 2003.- Vol. 21.- P.1229-1232

32. Стейниер P., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов.- M.: Мир, 1979.-Т.1.- 320 с.

33. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.: Мир, 1987.- 566 с.

34. Ленинджер А. Биохимия-М.: Мир, 1976.- 540 с.

35. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.- М.: Мир, 1982.- 310 с.

36. Allen R.M., Bennetto H.P. Microbial fuel cells: electricity production from carbohydrates // Appl.Biochem.Biotechnol.- 1993.- Vol. 39/40.- P.27-40

37. Electron transfer coupling in microbial fuel cells. 1. Comparison of redox mediator reduction rates and respiratory rates of bacteria / S.D. Roller, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Mason etc. // J. Chem. Technol. Biotechnol.- 1984.-Vol. 34B.- P.3-12

38. Park D.H., Zeikus J.G. Electricity generation in microbial fuel cells using neutral red as an electroionophore // Appl. Environ. Microbiol.- 2000.- Vol. 66,-P. 1292-1297.

39. Tanaka K., Kashiwagi N., Ogawa T. Effects of light on the electrical output of bioelectrochemical fuel-cells containing Anabaena variabilis M-2: mechanisms of the post-illumination burst // J. Chem. Technol. Biotechnol.- 1988.- Vol. 42.- P.235-240

40. Tanaka K., Tamamushi R., Ogawa T. Bioelectrochemical fuel-cells operated by cyanobacterium, Anabaena variabilis II J. Chem. Technol. Biotechnol.-1985.- Vol. 35B.- P.191-197

41. Индикаторы^ / под ред. Э. Бишопа, пер. с англ. И.В. Матвеевой.- М.: Мир, 1976.- Т. 2.-614 с.

42. Biofuel cells select for microbial consortia that self-mediate electron transfer / K. Rabaey, N. Boon, S.D. Siciliano, M. Verhaege, W. Verstraete // Applied and Environmental Microbiology.- 2004.- Vol. 70.- P.5373-5381

43. Hernandez M.E., Kappler A., Newman D.K. Phenazines and other redox-active antibiotics promote microbial mineral reduction // Appl. Environ. Microbiol.-2004.- Vol. 70.- P.921-928

44. Metabolites produced by Pseudomonas sp. enable a Gram-positive bacterium to achieve extracellular electron transfer / Т.Н. Pham, N. Boon, P. Aelterman, P. Clauwaert // Applied Microbiology and Cell Physiology.- 2007.- Vol. 77.-P.l 119-1129

45. Newman D.K., Kolter R. A role for excreted quinones in extracellular electron transfer //Nature.- 2000.- Vol. 405.- P.94-97

46. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants / O.Bretschger, A. Obraztsova, C.A. Sturm, I.S. Chang etc. // Appliedand Environmental Microbiology.- 2007.- Vol. 73, №4.- P.7003-7012

47. Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR-1 and other microorganisms / Y.A. Gorby, S. Yanina, J.S. McLean, K.M. Rosso etc. // PNAS.- 2006.- Vol. 103, №30.- P.l 1358-11363

48. Rabaey K., Verstraete W. Microbial fuel cells: novel biotechnology for energy generation // TRENDS in Biotechnology.- 2005.- Vol. 23.- P.291-298

49. Schroder U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency // Physical Chemistry Chemical Physics.- 2007.- Vol. 9.- P.2619-2629

50. Калюжный C.B., Федорович B.B. Микробные топливные элементы // Химия и жизнь.- 2007.- №5.- С.36-39

51. Habermann W., Pommer Е.-Н. Biological fuel cells with sulphide storage capacity //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1991.- Vol. 35.- P.128-133

52. Electrode-reducing microorganisms that harvest energy from marine sediments / D.R. Bond, D.E. Holmes, L.M. Tender, D.R. Lovley // Science.- 2002.- Vol. 295.- P.483-485

53. Understanding the anode mechanism of a seafloor fuel cell: interactions between geochemistryand microbial activity / Biogeochemistry.- 2005.- Vol. 76.-P.l 13-139

54. Microbial fuel cells for sulfide removal / K. Rabaey, K. Van de Sompel, L. Maignien, N. Boon etc. // Environmental Science Technology.- 2006.- Vol. 40,- P.5218-5224

55. Gregory K.B., Bond D.R., Lovley D.R. Graphite electrodes as electron donors for anaerobic respiration // Environ. Microbiol.- 2004.- Vol. 6.- P.596-604

56. Thauer R.K., Jungermann K., Decker K. Energy conversation in chemotrophic anaerobic bacteria // Bacteriol. Rev.- 1977.- Vol. 41.- P. 100-180

57. Microbial fuel cells for simultaneous carbon and nitrogen removal / B. Virdis, K. Rabaey, Z. Yuan, J. Keller // Water Research.- 2008.- Vol. 42.- P.3013-3024

58. Microbial electrode BOD sensors / I. Karube, T. Matsunaga, S. Tsuru, S. Suzuki //Biotechnol. Bioeng.- 1977.- Vol. 19.-P.1727

59. Schröder U., Nießen J., Scholz F. A generation of microbial fuel cells with current outputs boosted by more than one order of magnitude // Angew. Chem.-2003.- Vol. 115.- P.2986-2989

60. Fluorinated polyanilines as superior materials for electrocatalytic anodes in bacterial fuel cells / J. Niessen, U. Schröder, M. Rosenbaum, F. Scholz // Electrochemistry Communications.- 2004.- Vol. 6.- P.571-575

61. Niessen J., Schröder U., Scholz F. Exploiting complex carbohydrates for microbial electricity generation a bacterial fuel cell optrating on starch // Electrochemistry Communications.- 2004.- Vol. 6.- P.955-958

62. Niessen J., Schröder U., Harnisch F., Scholz F. Gaining electricity from in situ oxidation of hydrogen produced by fermentative cellulose degradation // Letters in Applied Microbiology.- 2005.- Vol. 41.- P.286-290

63. Oh S.E., Logan B.E. Hydrogen and electricity production from a food processing wastewater using fermentation and microbial fuel cell technologies // Water Research.- 2005.- Vol.39.- P.4673-4682

64. Interfacing electrocatalysis and biocatalysis with tungsten carbide: a highperformance, noble-metal-free microbial fuel cell / M. Rosenbaum, F. Zhao, U. Schroder, F. Scholz //Angewandte Chemie.- 2006.- Vol. 118.- P. 1-4

65. Evaluation of catalytic properties of tungsten carbide for the anode of microbial fuel cells / M. Rosenbaum, F. Zhao, M. Quaas, H. Wulf etc. // Applied Catalysis.- 2007.- Vol. 74.- P.262-270

66. Mac A, a diheme c-type cytochrome involved in Fe (III) reduction by Geobacter sulfurreducens / J.I. Bulter, F. Kaufmann, M.V. Koppi, C. Nunez etc. // J. Bacterid.- 2004.- Vol. 186.- P.4042-4045

67. Leang C., Coppi M.V., Lovley D.R. OmcB, a c-type polyheme cytochrome, involved in Fe (III) reduction in Geobacter sulfurreducens II J. Bacterid.-2003.-Vol. 185.- P.2096-2103

68. Genome of Geobacter sulfurreducens: metal reduction in subsurface environments / B.A. Methe, K.E. Nelson, J.A. Eisen, I.T. Paulsen etc. // Science.-2003.- Vol. 302.-P. 1967-1969

69. Improving dynamic response of a mediator-less microbial fuel cell as bio-chemicha oxygen demand (BOD) sensor / H. Moon, I.S. Chang, K.H. Kang, J.K. Jang etc. // Biotechnol. Lett.- 2004.- Vol.26.- P. 1917-1921

70. Microbial ecology meets electrochemistry: electricity driven and driving communities / K. Rabaey, J. Rodriguez, L.L. Blackall, J. Keller, P. Gross, D. Bat-stone, W. Verstraete, K.H. Nealson // The ISME Journal.- 2007.- Vol. 1.- P.9-18

71. Lovley D.R. Microbial energizers: fuel cells that keep on going // Microbe.-2006.- Vol. 1.-P.323-329

72. Electrochemically active bacteria and mediator-less microbial fuel cells / I.S.Chang, H. Moon, O. Bretschger, J.K. Jang., H.I. Park, K.H. Nealson, B.H.

73. Kim // Journal of Microbiology and Biotechnology.- 2006.- Vol. 16.- P. 163177

74. Myers C.R., Myers J.M. Localization of cytochromes to the outer membrane of anaerobically grown Shewanella putrefaciens MR-1 // J. Bacteriol.- 1992.-Vol. 194.- P.3429-3438

75. Myers C.R., Myers J.M. Role of outer membrane cytochromes OmcA and OmcB of Shewanella putrefaciens MR-1 in reduction of manganese dioxide // Appl. Environ. Biotechnol.- 2001.- Vol. 67.- P.260-269

76. Improved performance of a microbial fuel cell using a membrane-electrode assembly / T.H. Pham, J.K. Jang, H. Moon, I.S. Chang // J. Micro-biol.Biotechnol.- 2005.- Vol. 15.- P.438-441

77. Dynamic behaviors of redox mediators within the hydrophobic layers as an important factor for effective microbial fuel cell operation / Y. Choi, N. Kim, S. Kim, S Jung // Bull. Korean Chem. Soc.- Vol. 24, №4.- P.437-440

78. Park, D.H., Zeikus, J.G. Improved fuel cell and electrode designs for producing electricity from microbial degradation // Biotechnol. Bioeng. -2003.- Vol. 81.-P.348-355

79. Harnessing microbially generated power on the seafloor / L.M. Tender, C.E. Reimers, H.A. Stecher, D.E. Holmes etc. // Nat. Biotechnol.- 2002.- Vol. 20.-P.821-825

80. A mediator-less microbial fuel cell using a metal reducing bacterium, Shewanella putrefaciens / H.J. Kim, H.S. Park, M.S. Hyun, I.S. Chang etc. // Enzyme Microb. Technol.- 2002.- Vol. 30.- P. 145-152

81. Bond D.R., Lovley D.R. Electricity production by Geobacter Sulfurreducens attached to electrodes // Appl. Environ. Microbiol.- 2003.- Vol. 69.- P. 15481555

82. Liu H., Logan B.E. Electricity generation using an air-cathode single chamber microbial fuel cell in the presence and absence of a proton exchange membrane // Environmental Science Technology.- 2004.- Vol. 38.- P.4040-4046

83. Kim B.H., Chang I.S., Gadd G.M. Challenges in microbial development and operation // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2007.- Vol. 76.- P.485-494

84. Park D.H., Zeikus J.G. Utilization of electrically reduced neutral red by Acti-nobacillus succinogenes: physiological function of neutral red in membrane-driven fumarate reduction and energy conservation // J. Bacterid.- 1999.- Vol. 181.- P.2403-2410 '

85. Operational parameters affecting the performance of a mediator-less microbial fuel cell / G.C. Gil, Chang I.S., Kim B.H., Kim M. etc. // Biosens. Bioelec-tron.- 2003.- Vol. 18.- P.327-334

86. Graphite fiber brush anodes for increased power production in air-cathode microbial fuel cells / B. Logan, S. Cheng, V. Watson, G. Estadt // Environmental Science Technology.- 2007.- Vol. 41.- P.3341-3346

87. Tubular microbial fuel cells for efficient electricity generation / K. Rabaey, P. Glauwaert, P. Aelterman, W. Verstraete // Environmental Science Technology.- 2005.- Vol. 39.- P.8077-8082

88. Microbial fuel cells: methodology and technology / B.E. Logan, B. Hamelers, R. Rozendal, U. Schröder, J. Keller, S. Freguia, P. Aelterman, W. Verstraete, K. Rabaey // Environmental Science Technology.- 2006.- Vol. 40.- P.5181-5192

89. Cheng S., Liu H., Logan B.E. Increased power generation in a continuous flow MFC with advective flow through the porous anode and reduced electrode spacing // Environmental Science Technology.- 2006.- Vol. 40.- P.2426-2432

90. Oh S., Min B., Logan B.E. Cathode performance as a factor in electricity generation in microbial fuel cells // Environmental Science Technology.- 2004.-Vol. 38.- P.4900-4904

91. A graphite-granule membrane-less tubular air-cathode microbial fuel cell for power generation under continuosly operational conditions / S. You, Q. Zhao, J. Zhang, J. Jiang etc. // Journal of Power Sources.- 2007.- Vol. 173.- P.172-177

92. Non-catalyzed cathodic oxygen reduction at graphite granules in microbial fuel cells / S. Freguia, K. Rabaey, Z. Yuan, J. Keller // Electrochimica Acta.- 2007.-Vol. 53.- P.598-603

93. Non-catalyzed cathodic oxygen reduction at graphite granules in microbial fuel cells / S. Freguia, K. Rabaey, Z. Yuan, J. Keller // Electrochimica Acta.- 2007,-Vol. 53.-P.598-603

94. He Z., Angenent L.T. Application of bacterial biocathodes in microbial fuel cells // Electroanalysis.- 2006. Vol. 18.- P.2009-2015

95. Logan B.E., Regan J.M. Microbial challenges and fuel cells applications // Environmental Science Technology.- 2006.- Vol. 40.- P.5172-5180

96. Power generation using different cation, anion, and ultrafiltration membranes in microbial fuel cells / J.R. Kim, S. Cheng, S. Oh, B.E. Logan // Environmental Science Technology.- 2007.- Vol. 41.- P. 1004-1009

97. Min B., Cheng S., Logan B.E. Electricity generation using membrane and salt bridge microbial fuel cells // Water Research.- 2005.- Vol. 39.- P. 1675-1686

98. Mass transport through a proton exchange membrane (Nafion) in microbial fuel cells / K.J. Chae, M. Choi, F.F. Ajayi, W. Park etc. // Energy and Fuels.-2008.-Vol. 22.- P.l69-176

99. Continuous electricity generation at high voltages and currents using stacked microbial fuel cells / P. Aelterman, K. Rabaey, H.T. Pham, N. Boon, W. Ver-straete // Environmental Science Technology.- 2006.- Vol. 40.- P.3388-3394

100. Construction and operation of a novel mediator and membrane-less microbial fuel cell / J.K. Jang, T.H. Pham, I.S. Chang, K.H. Kang, H. Moon, K.S. Cho, B.H. Kim // Process Biochemistry.- 2004.- Vol. 39.- P.l007-1012

101. Liu H., Ramnarayanan R., Logan B.E. Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell // Environmental Science Technology.- 2004.- Vol. 38.- P.2281-2285

102. Min B., Logan B.E. Continuous electricity generation from domestic wastewater and organic substrates in a flat plate microbial fuel cell // Environmental Science Technology.- 2004.- Vol. 38.- P.5809-5814

103. Electricity generation from swine wastewater using microbial fuel cells / B. Min., J.R. Kim., S.E. Oh., J.M. Regan., B.E. Logan // Water Research.- 2005.-Vol. 39.- P.4961-4968

104. Production of bioenergy and biochemicals from industrial and agriculturalwastewater / L.T. Angenent, K. Karim, M.H. Al-Dahhan, B.A. Wrenn, R. Dotmiguez-Espinosa// TRENDS in Biotechnology.- 2004.- Vol. 22.- P.477-485

105. He Z., Minteer S.D., Angenent L.T. Electricity generation from artificial wastewater using an upflow microbial fuel cell // Environmental Science Technology.- 2005.- Vol. 39.- P.5262-5267

106. Microbial fuel cells in relation to conventional anaerobic digestion technology / T.H. Pham, K. Rabaey, P. Aelterman, P. Clauwaert, L. De Schamphelaire, N.

107. Boon, W. Verstraete // Engineering in Life Sciences.- 2006.- Vol. 6.- P.285-292

108. Substrate-enhanced microbial fuel cells for improved remote power generation from sediment-based systems / F. Rezaei, T.L. Richard, R.A. Brennan, B.E. Logan // Environmental Science Technology.- 2007.- Vol. 41.- P.4059-4058

109. He Z., Shao H., Angenent L.T. Increased power production from a sediment microbial fuel cell with a rotating cathode // Biosensors and Bioelectronics.-2007.- Vol. 22.- P.3252-3255

110. Performance of single chamber biocatalysed electrolysis with different types of ion exchange membranes / R.A. Rozendal, H.V.M. Hamelers, R.J. Molencamp, C.L.N. Buisman // Water Research.-2007.- Vol. 41.- P. 1984-1994

111. Combining biocatalyzed electrolysis with anaerobic digestion / P.Clauwaert, R. Toledo, D. van der Ha, R. Crab etc. // Water Science.- 2008,- Vol. 57.-P.575-579

112. Wilkinson S. «Gastrobots» benefits and challenges of microbial fuel cells in food powered robot applications // Autonomous Robots. -2000.- Vol. 9.- P.99-111

113. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике.- М.: Мир, 1976.440 с.

114. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии.- М.: Химия, 1965.390 с.

115. Дамаскин Б.Б., Петрий О.А. Введение в электрохимическую кинетику.-М.: Высшая школа, 1975.- 416 с.

116. Плесков Ю.В., Филиновский В.Ю. Вращающийся дисковый электрод.-М.: Наука, 1972.- 344 с.

117. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология.- М.: Академия, 2005.-480 с.