Комплексы-ДНК-ПАВ в малополярных органических средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М^ВгЛОМОНОСОВА-------------------------

0Д ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 541(64+183.12)532.77

ПЫШКИНА Ольга Александровна

КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ.

(02.00.06. - Химия высокомолекулярных соединений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА - 1997г.

Работа выполнена в лаборатории полиэлектролитов и биополимеров кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук

профессор, академик В.А. Кабанов

кандидат химических наук В.Г. Сергеев

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

член-корреспондент АН А. Р. Хохлов

профессор доктор химических наук А.М. Копылов

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится ноября 1997 года в ¡5 чаС- на заседании диссертационного совета Д. 053. 05. 43 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по

адресу:

119899, ГСП, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_£_" ОКТЯБРЯ 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.А. Миронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ К настоящему времени достаточно подробно исследовано взаимодействие синтетических гибкоцепных полиэлектролитов с ионогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ). Процессы образования таких полимер-коллоидных комплексов имеют много общего с процессами самосборки, происходящими в биологических системах. Поэтому изучение явлений самоорганизации в системах полиэлектролит-ПАВ с использованием в качестве полиэлектролита нативной ДНК позволяет лучше разобраться в механизмах процессов, протекающих в живых организмах и, в частности, приблизиться к пониманию причин компактизации ДНК в биологических объектах.

Вместе с тем, исследование комплексов предельно жесгкоцепного полиэлектролита, каким является двуспиральная ДНК, с ПАВ в сопоставлении с известными данными для гибкоцепных полиэлектролитов позволит установить влияние жесткости цепи макромолекулы на характер взаимодействия полиэлектролит-ПАВ.

Особый интерес представляет сравнительное изучение характеристик и поведения комплексов ДНК с липидоподобными ПАВ в воде, органических средах различной полярности и на границе водной и органической фаз, что в известной степени позволяет моделировать отдельные стадии трансмембранного переноса ДНК.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в исследовании физико-химических свойств и конформации комплексов ДНК с противоположно заряженными ПАВ в малополярных органических растворителях, а также в изучении закономерностей переноса таких комплексов через границы раздела фаз вода/органический растворитель/водный раствор низкомолекулярного электролита.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые обнаружено, что макромолекулы ДНК могут быть переведены в малополярные органические растворители в форме

их комплексов с ПАБ. Исследованы физико-химические характеристики растворов таких комплексов в хлороформе. Впервые показано, что включенная в комплекс ДНК, растворяясь в хлороформе, сохраняет нативную структуру двойной спирали, но в отличие от гибкоцепных полиэлектролитов приобретает компактную конформацию. Рассмотрены возможные причины компактизации молекул ДНК. Впервые продемонстрирована возможность практически полного переноса ДНК через границы раздела фаз вода/хлороформ/водный раствор низкомолекулярного электролита и изучены закономерности этого переноса.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Перевод ДНК в малополярные органические растворители открывает широкие возможности для модификации ДНК с помощью реагентов, которые невозможно использовать в водной среде. Важно, что при растворении в хлороформе ДНК сохраняет нативную конформацию двойной спиралии может быть обратно переведена в водный раствор низкомолекулярного электролита в форме обычной соли. Изученный в работе перенос ДНК через границу раздела фаз вода/органический растворитель/раствор ЫаС1 может служить моделью трансмембранного переноса ДНК в клетках. - Сами комплексы ДНК-ПАВ могут быть использованы для повышения эффективности направленного транспорта генетичекого и лекарственного материала в клетки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были • доложены на международной конференции по фундаментальным наукам "Ломоносов-96" (Москва, 1996), на 1-ой Международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (Санкт-Петербург, 1996), на Международном симпозиуме по коллоидной химии и химии полимеров "Формирование и динамика самоорганизующихся структур в растворах полимеров и поверхностно-активных веществ - последние достижения" (Нагойя, Япония, 1996), на 4-

ом международном симпозиуме по науке и технологии на нано-уровне "Нано-4" (Бейжинг, Китай, 1996), на 43-ем национальном симпозиуме (Филадельфия, США, 1996), на международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (К 90-летию академика В.А.Каргина) (Москва, 1997), на всероссийском рабочем совещании "Зондовая микроскопия-97" (Нижний Новгород, 1997), на 8-ом международном симпозиуме "Коллоидная и молекулярная электрооптика" (Санкт-Петербург, 1997), на Гордоновской конференции по ионным полимерам (Нью-Лондон, США, 1997), на Европейской Гордоновской конференции по полимерам (Шантейи, Франция, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора лотературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы ( 3Z наименований). Работа изложена на/¿'страницах, содержит -3 7 рисунков, 5 таблиц).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали ДНК: ДНК400 из спермы лосося (ГОСНИИОХТ, Россия) 300 - 500 пар оснований (М = 1.9-3.2х105), ДНК2000 из эритроцитов цыплят ("Союзхимреактив", Россия) 1000 - 3000 пар оснований (М = 0.5-2x10®), ДНК7500 из зобной железы телят ("Sigma") 5000-10000 пар оснований (М = 3.2-6.3х10б).

В качестве катионных ПАВ применяли цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и дистеарилдиметиламмоний хлорид (ДСДАХ), ("Tokyo Kasei Kogyo Со").

В качестве растворителей использовали дистиллированную воду, дополнительно очищенную с помощью системы "Milli-Q" ("Millipore", США), стандартный 0.5 М ТВЕ-буфер и ряд органических растворителей. Хлороформ, гептан и циклогексан (х.ч.) очищали от следовых количеств воды над молекулярными сигами 5 А, ацетон использовали без дополнительной очистки.

УФ-спектры растворов ДНК в воде и комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе получали на спектрофотометре "Specord М-40" (Германия). Оптическую плотность соответствующих растворов - определяли по максимуму при длине волны Х=260 нм.

Седиментационные исследования проводили на аналитической ультрацентрифуге "Beckman-E" (США) при скорости вращения ротора со=48 ООО и 60 ООО об/мин и температуре 20° С. Седиментационные (флотационные) профили регистрировали по изменению оптической плотности растворов при Х=260 нм.

Спектры кругового дихроизма (КД) в области 240-310 нм получали на спектрополяриметре "JASCO J-500 С" (Япония) в 1 см кювете при температуре 20 "С. Величину Де рассчитывали, выражая концентрацию ДНК или комплекса ДНК-ПАВ в молях полинуклеотидов.

СТМ исследования проводили на сканирующем туннельном микроскопе СКАН-8 (Россия), туннельные параметры варьировали в диапазоне: It - от 0.2 до 1 нА, lit - от 50 до 1000 мВ. В качестве подложки использовали свежесколотый пирографит.

АСМ исследования проводили в контактной и "tapping" модах на приборе Nanoscope-3 ("Digital Instruments", США). В качестве подложек использовали свежесколотый пирографит и свежесколотую слюду.

Вязкость растворов комплексов ДНК-ПАВ в органических растворителях определяли в капиллярном вискозиметре Освальда при температуре 294 К (время истечения хлороформа 33.2 с, смеси хлороформа с ацетоном 38.4 с). Вязкость водных растворов ДНК определяли в капиллярном вискозиметре Убеллоде при температуре 294 К (время истечения 0.5 М ТВЕ-буфера 50 с).

Показатели преломления растворителей измеряли на рефрактометре ИРФ-23 при температуре 293 К на длине волны желтой линии ртути.

Измерения ЭДЛ проводили при температуре 294 К компенсационным методом с применением модуляции эллиптической поляризации света. Электрические импульсы прямоугольной формы и синусоидальные импульсы амплитудой до 1.2 кВ подавали на ячейку Керра (Россия) с титановыми электродами длиной 2 и 3 см и с зазором между ними 0.02 см. Частота следования импульсов составляла 1 Гц. Источником света служил Не-Ие лазер (Х=632.8 нм). Компенсацию измеряемого ЭДЛ осуществляли поворотом слюдяной пластинки с разностью хода 0.0IX.

Опыты по изотермической диффузии растворов комплексов ДНК-ДСДАХ проводили в смешанном растворителе хлороформ-ацетон, т.к. показатель преломления раствора ДНК-ДСДАХ в хлороформе практически не отличался от показателя преломления хлороформа. Для регистрации профиля диффузионной границы использовали поляризационный интерферометр (двоение шпатов 0.1 см), в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1 и 5 см.

2. КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В ВОДНОЙ СРЕДЕ.

Комплексы ДНК-ПАВ образуются в результате реакции между ДНК и противоположно заряженными ионами ПАВ в водной среде. Для определения составов комплексов ДНК2ооо и ДНК»оо с. ЦТАБ и ДСДАХ использовали метод дробного осаждения. При титровании водного раствора ДНК водным раствором ПАВ происходит осаждение комплексов ДНК-ПАВ, о составе которых можно судить по величине остаточной концентрации ДНК в надосадочной жидкости после отделения нерастворимого комплекса центрифугированием. Зависимости остаточной концентрации ДНК от соотношения концентраций ПАВ и ДНК представлены на рис. 1.

СДНКх 10', N1

4

2

концентраций СцНк и Спав- 1 - ДСДАХ, 2 -2 ЦТАБ. Концентрация ДНК 20 мкг/мл _(соответствует концентрации нуклеотидных

Рис. 1. Зависимость остаточной концентрации ДНК400 (а) и ДНК2000 (б) в надосадочной жидкости после отделения нерастворимого комплекса ДНК-ПАВ в центрифуге (10000 об/мин в течение 15 мин) от соотношения

0.4 0.8 и

сПАвЛгдНк

,л звеньев 6х10'5 М), Т = 20 °С. .

Как видно из кривой 1, связывание ДНК с более гидрофобными ионами ДСДАХ начинается при очень низких концентрациях ПАВ в растворе, менее 10~6 моль/л. При этом содержание ДНК в супернатанте уменьшается практически линейно с увеличением количества добавленного ДСДАХ. При соотношениях ДНК и ДСДАХ, близких к эквимольному, практически вся ДНК оказывается в нерастворимом комплексе. Таким образом, состав комплексов ДНК-ДСДАХ не зависит от соотношения концентраций исходных реагентов и близок к стехиометрическому. На рис. 1 приведена также кривая 2 осаждения ДНК раствором ЦТАБ. При этом также, как и в случае ДСДАХ, практически полное осаждение ДНК из раствора наблюдается при близком к эквимольному соотношении ДНК и ЦТАБ (кривая 2). Образованию нерастворимых стехиометричных комплексов ДНК-ПАВ в этом случае предшествует образование растворимых комплексов. На рис. I представлены также кривые (16. и 26) осаждения ДНК400 теми же ПАВ - ДСДАХ и ЦТАБ, соответственно. Видно, что эти кривые практически не отличаются от рассмотренных выше зависимостей, полученных для ДНКгооо- Отсюда следует, что длина макромолекул ДНК в исследованном интервале не оказывает существенного влияния на взаимодействие ДНК с ПАВ.

Таким образом, нами изучено образование в водных растворах электростатических комплексов ДНК-ПАВ между различными по длине ДНК и различающимися по гидрофобности ПАВ. Показано, что комплексы ДНК-ПАВ, включающие эквимольные количества звеньев ДНК и катионов

ПЛВ, подобно ранее изученным комплексам гибкоцепных полпионов с противоположно заряженными ПАВ, не способны растворяться в воде, так как ионогенные фуппы взаимодействующих компонентов экранированы от молекул воды гидрофобными фрагментами ПАВ. Такие комплексы в водных средах стабилизированы гидрофобным взаимодействием между углеводородными радикалами ПАВ, фактически образующими внутрикомплексные мицеллы при концентрациях ПАВ значительно ниже ККМ самих ПАВ. Роль нейтрализующих противоионов в данном случае выполняют фосфатные группы ДНК. Их локализация вблизи заряженной поверхности мицелл сопряжена со значительно меньшим энтропийным проигрышем, чем в случае низкомолекулярных противоионов.

Для исследования морфологии комплексов ДНК-ПАВ, синтезированных в водном растворе, использованы методы атомно-силовой и сканирующей туннельной микроскопии (АСМ и СТМ). На рис. 2 (а, б) представлены СТМ-изображения комплексов ДНК2000 с ДСДАХ и ЦТАБ, нанесенных на свежесколотый пирографит.

А Б

Рис. 2 СТМ-изображения комплексов ДНК2000-ДСДАХ (А) и ДНК2000-ЦТАБ (Б) на

графите. Размер кадров: 380 х 380 им и 510 х 510 нм.

В обоих случаях частицы комплексов ДНК-ПАВ, полученные из водного раствора, имеют форму тора.

При оценке количества молекул ДНК (Мдцк). включенных в одну частицу комплекса ДНК-ПАВ, использовали соотношения: Нднк = (Умрв/уцнк)х0.90б,

где Утора = 7гх((Яшгеш - КВцутр)/2)2х2тгх((11В11еш + Квну1р)/2; КШ1утр - радиус кольца внутри тора, нм; Кшкш - радиус внешнего кольца, нм; Утора -объем тора, нм3; УдНК - объем молекулы ДНК вместе с противоионами ПАВ, нейтрализующими ее заряд; 0.906 - коэффициент упаковки комплексных молекул ДНК в торе в предположении гексагональной упаковки взаимонепроникающих цепей комплекса ДНК-ПАВ. Такой расчет показывает, что тороподобная частица комплекса включает, в среднем, 5-15 молекул ДНК. Эту сравнительно высокую степень агрегации можно объяснить гидрофобными взаимодействиями углеводородных радикалов ПАВ, находящихся на периферии молекулы комплекса ДНК-ПАВ.

Таким образом, нами установлено, что комплексы ДНК-ПАВ, полученные из водной среды, независимо от длины макромолекул ДНК образуют тороидальные частицы.

3. КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ.

Выше нами показано, что в результате взаимодействия жесткоцепного полианиона ДНК с катионами ПАВ в водной среде образуются нерастворимые в воде стехиометричные комплексы ДНК-ПАВ. Однако такие комплексы ДНК-ПАВ оказались растворимы в малополярных органических растворителях.

Стехиометричные комплексы ДНК-ПАВ синтезировали смешением разбавленных водных растворов нативных ДНК400, ДНК2000 и ДНК7500 концентрации 10-20 мкг/мл (что соответствует концентрации пар нуклеотидных звеньев 3-6x10"5 М) с водными растворами ДСДАХ и ЦТАБ концентрации 0.001 М, взятыми в эквимольных соотношениях по отношению к фосфатным группам ДНК. Полученные осадки стехиометртеских комплексов ДНК-ПАВ отделяли от супернатанта центрифугированием, декантировали и сушили в вакуумном эксикаторе над хлоридом кальция в течение 7-10 дней до постоянного веса. Высушенные

образцы комплексов ДНК-ПАВ помещали в органический растворитель и выдерживали при комнатной температуре в - течение нескольких часов." Перечень исследованных систем суммирован в таблице 1. Как следует из данных табл.1, способность растворяться в малополярных органических средах можно рассматривать как достаточно общее свойство комплексов ДНК-ПАВ. Следует подчекнуть, что тщательное удаление воды и использование сухих растворителей - необходимые условия достижения растворимости комплексов, образованных высокомолекулярными фракциями ДНК (ДНК2ооо и ДНК750о).

Таблица 1.

Системы комплекс ДНК-ПАВ / органический растворитель *).

Тип комплекса Хлороформ е=4.7 Гептан е=4.0 Циклогексан е=2.0

ДНК400 - ЦТАБ + + +

ДНКжю- ЦТАБ + + +

днк7500- ЦТАБ + + +

днк400 - ДСДАХ + + +

ДНК2ооо - ДСДАХ + + +

ДИК.?«» - ДСДАХ + + +

*) Способность комплекса растворяться обозначена +.

Свойства комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе изучали методами скоростной седиментации, УФ- и КД-спектрофотометрии. Флотационные профили комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе, соответствующие различной продолжительности центрифугирования, приведены на рис. 3.

Рис. 3. Флотационные профили, полученные на сканирующей центрифуге "Вескшап-Е" при <в=48 ООО об/мин, комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе при различной продолжительности центрифугирования. А: ДНКгооо. время центрифугирования 2 (1), 13 (2) и 26 мин (3), ф = 40000 об/мин; Б: ДНК«оо> время центрифугирования 4 (1), 12 (2), 17 (3) и 29 мин (4), и = 60000 об/мин, Т = 20 °С.

Во всех случаях на седиментограммах наблюдается только одна ступенька, соответствующая сгехиометричному комплексу ДНК-ПАВ. Поскольку ДНК в отсутствии ПАВ в хлороформе не растворяется, из приведенных данных следует, что комплексы ДНК-ПАВ не диссоциируют на отдельные компоненты, т.е. представляют собой устойчивые соединения. Подобные данные получены также и для комплексов ДНК-ЦТАБ в хлороформе.

Для установления конформации ДНК в комплексах ДНК-ПАВ, растворенных в малополярных органических растворителях мы использовали метод УФ-спектроскогаш. На рис. 4 представлены спектры поглощения комплексов ДНК400-ДСДАХ и ДНК2000-ДСДАХ в хлороформе (кривые 1 и 2). Для сравнения приведен спектр поглощения тех же ДНК в водном растворе (кривая 3), типичный для двойной спирали ДНК. 3

"*2^^^ Рис. 4. УФ-спектры: стехиометричных

комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе для ДШСюо (I) и ДНК2000 (2), а также исходных ДНК400 и ДНК2ооо в 0.5 М ТВЕ-буфере (3). Концентрация ДНК 20 мкг/мл, Т = 20 °С. Значения оптических плотностей отнесены 260 280 300 А,, им к концентрации ДНК.

Из рис. 4 видно, что при замене водной среды на органическую в спектрах поглощения ДНК не происходит существенных изменений. На всех спектрах наблюдается максимум поглощения в области 260 нм. Существенно, что коэффициент экстинции в обоих случаях составляет 65006700 лхмоль"'хсм"1. Аналогичные спектры получены и для комплексов ДНК-ЦТАБ в хлороформе, а также комплексов ДНК-ДСДАХ и ДНК-ЦТАБ в гептане и циклогексане. Известно, что разрушение двойной спирали сопровождается повышением коэффициента экстинции (гиперхромный эффект). Отсутствие гиперхромного эффекта при замене водной среды на органическую свидетельствует о сохранении ДНК, включенной в комплекс, конформации двойной спирали.

На рис. 5 приведены спектры кругового дихроизма для комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе (кривые 1 и 2) и исходной ДНК в воде, где ее молекулы, как известно, находятся в В-форме (кривая 3).

Де, градх

СМ2ХДМОЛЬ''

Рис. 5. КД-спсктры: комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе для ДНКгооо (1), ДНКюо (2) и для исходных ДНК в 0.5 М ТВЕ-буфсре (3).

В отличие от водного раствора ДНК в спектрах комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе проявляются черты, характерные для С- и А-форм двойной спирали. В частности, для комплекса ДНК2000 характерна длинноволновая положительная полоса с максимумом около 280 нм и молярным дихроизмом меньше 2 градхсм2хдмоль-1, а также интенсивная коротковолновая отрицательная полоса с минимумом при 240 нм. Точка инверсии (Де = 0) лежит в области 270 нм. Аналопгчные спектры КД наблюдали для сильно компактизованных нуклеиновых кислот, находящихся в головках фагов. В спектре комплекса ДНК400 проявляются черты, характерные для спектра ДНК в А-форме. В нем присутствует интенсивная длинноволновая положительная полоса с максимумом около 270 нм и коротковолновая отрицательная полоса с минимумом при 240 нм. Точка инверсии (Де = 0) лежит в области 255 нм. А-форма ДНК отличается от В-формы, характерной для водных растворов, большей закрученностью спирали.

УФ- и КД-спектры отражают лишь локальные характеристики вторичной структуры ДНК, включенной в комплекс ДНК-ПАВ, такие, как сам факт упаковки полинуклеотидных цепей в двойную спираль и локальные особенности двойной спирали. Для установления молекулярных характеристик комплекса ДНК-ПАВ как целого были использованы

гидродинамические и динамооптические измерения для растворов комплексов в хлороформе.

На рис. 6 представлены концентрационные зависимости приведенной вязкости Т15р/с = (г) - т]о)/сг|о (т| - вязкость раствора концентрации с, тю -вязкость растворителя) растворов комплексов ДНК400-ДСДАХ и ДНК7500-ДСДАХ в хлороформе и в смеси хлороформ+ацетон (2:1). В исследованной области концентраций растворов зависимости Г1зр/с - с оказались линейными.

20 ,Чп0/С,дл/г

15

10 2.5 2.0

1.0 0.0

Рис. 6 Концентрационные зависимости приведенной вязкости растворов, Т=20 °С.

1 - ДНК400-ДСДАХ в хлороформе и в смеси хлороформ+ацетон (2:1)

2 - ДНК7500-ДСДАХ в хлороформе и в смеси хлороформ+ацетон (2:1)

3 - ДНКюо в ТВЕ-буфере

4 - ДНК7500 в ТВЕ-буфере

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8С>Г/ДЛ Значения характеристических вязкостей |т!] = Пт(с->0) г^/с, определенные экстраполяцией соответствующих прямых к бесконечному разбавлению, и постоянные Хаггинса к', вычисленные из их наклонов, приведены в табл. 2. Значения [п ] комплексов ДНК400-ДСДАХ и ДНК7500-ДСДАХ в хлороформе и в смеси хлороформ+ацетон практически совпадают и равны 0.55 дл/г.

Из сравнений значений измеренных Моч .и рассчитанных молекулярных масс Мрасч. , а также из прямолинейности концентрационных зависимостей коэффициентов поступательной диффузии следует, что частицы комплексов ДНК-ПАВ неагрегированы в органических растворителях, они включают, в среднем, одну макромолекулу ДНК и что растворы таких комплексов в хлороформе молекулярны.

Таблица 2.

Гидродинамические характеристики комплекса ДНК-ДСДАХ в хлороформе

и смеси хлороформа с ацетоном.

Образец Растворитель М. дл/г к' О0хЮ7, см2/с М расч.. МОпх106

ДНК-ДСДАХ хлороформ 0.55 0.66 3.6 X ю5

ДНК400-ДСДАХ хлороформ+ ацетон (2:1) 0.55 0.66 3.7 ± 0.1 2.8 х 105

ДНК7500-ДСДАХ хлороформ 0.55 0.66 60 X ю5

ДНК7500-ДСДАХ хлороформ+ ацетон (2:1) 0.55 0.66 1.6 ±0.3 40 х 105

среднем одна молекула ДНК.

О компактизации комплексных макромолекул ДНК-ПАВ в

хлороформе свидетельствуют данные таблицы 3 , в которой приведены электрооптические характеристики комплексов ДНК-ПАВ в хлороформе.

Таблица 3.

Электрооптические характеристики комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе, Т=20 "С (К - постоянная Керра, <тг> - среднее время установления равновесной ориентации, <т<1> - среднее время свободной релаксации ЭДЛ, т - время релаксации ЭДЛ, <т1П> - время релаксации ЭДЛ,

Образец КхЮ', <тг>х106, <т<!>х106, тх106,с <Тш>х106, <т<1>/<тш>

СГСЕ с с с

ДНК400- 1.97 - 3 8 - 1.1

ДСДАХ

ДНК2000-

ДСДАХ

с=1.95г/дл 2.8 110 80 13 27 3

с=0.88г/дл 0.52 7.5 4.5 - 2.8 1.6

ДНК7500- 4.52 - 41 25 - 2.4

ДСДАХ

'Мрасч. - получены в предположении, что в частицу комплекса ДНК-ДСДАХ включена в

Величина постоянной Керра К для изученных комплексов ДНК-ПАВ оказалась на два порядка меньше величины К для типичного жесткоцепного полипептида поли-Ь-у-бензил-глютамата, имеющего конформацию ос-спирали в хлороформе. Она также заметно, в 5 раз, меньше значения К комплекса поли-1Ч-этил-4-винилпиридиния с додецилсульфатом, макромолекулы которого в хлороформе имеют конформацию невозмущенного клубка. Эти данные прямо свидетельствует о компактизации макромолекул комплексов ДНК-ПАВ в органической среде.

Характеристическая вязкость [т1]~<К2>3/2/М комплекса ДНК-ПАВ пропорциональна отношению куба радиуса терции Я к молекулярной массе полимера. Таким образом, постоянство величины [г|] в полимергомологическом ряду означает, что изменение объема (У~<112>3/2) макромолекулы пропорционально изменению молекулярной массы полимера. Последнее характерно, в частности, для макромолекул, свернутых в плотные глобулы. Радиус инерции Я полимерной глобулы изменяется пропорционально М1/3, что и обеспечивает постоянство величины [г)] при изменении длины цепи или ММ полимера. Однако, в рассматриваемом нами случае ДНК-ПАВ модель частицы комплекса в виде плотной глобулы для объяснения независимости [т^] от М неприемлема, т.к. экспериментально измеренное низкое значение [г|] (0.55 ал/т) все же на порядок превышает величину, ожидаемую для раствора плотных сферических частиц. Условию У~М могут удовлетворять и другие модели, например, жесткое кольцо, свернутое из соединенного концами молекулярного стержня, или полый цилиндр, образованный эластичным молекулярным стержнем, скрученным в спираль, при условии, что длина цилиндра недостаточна для проявления персистентной гибкости. В последнем случае эффективный объем, исключенный из процесса ламинарного течения, оставаясь пропорциональным М, т.е. длине молекулярного стержня, может оказаться существенно больше его собственного объема. Соответственно возрастет и величина [г|] при сохранении ее независимости от М.

Таким образом, вся совокупность экспериментальных данных, полученных путем изучения растворов стехиометричных комплексов ДНК-ПАВ, показывает, что каждая частица комплекса, растворенная в хлороформе, содержит одну сильно компактизованную молекулу ДНК.

Морфологию частиц комплексов ДНК-ПАВ, фиксируемых на твердых подложках из растворов в хлороформе, изучали методами атомно-силовой и сканирующей туннельной микроскопии. На рис. 7 представлены изображения частиц комплексов ДНК-ПАВ.

А Б

Рис. 7. АСМ-изобр;шение комплекса ДНК_кхгДСДАХ, полученного из хлоро<[юрма, на слюде; размер кадра 6x6 мкн (А); СТМ-изображение комплекса ДНКзооо-ДСДАХ, полученного из хлороформа, на графите; размер кадра 130x130 нм, г = 6 нм (Б).

Из рис. 7 видно, что оба метода дают изображения частицы комплекса ДНК-ПАВ в форме тора. Существенно, что один тор включает в среднем одну молекулу ДНК, в отличие от тороидальных агрегатов, наблюдавшихся методом СТМ при осаждении комплексов ДНК-ПАВ из водных растворов.

Интересно отметить, что внешний диаметр торов компактных комплексов ДНК-ПАВ, включающих молекулы ДНК различной длины и различные ПАВ, варьируется в одних и тех же пределах (100+300 нм).

Компактизацию ДНК под влиянием ПАВ в органических средах невозможно объяснить специфическим взаимодействием алифатических фрагментов ПАВ друг с другом, подобным их гидрофобному взаимодействию в водных средах, тем более, что само растворение комплекса в органической фазе обусловлено опушкой, "смешивающейся" с

молекулами растворителя. Кроме того, известно, что связывание ионов ПАВ с противоположно заряженными гибкоцепными полиионами отнюдь не приводит к компактизации комплексов в малополярных растворителях, где гидрофобное взаимодействие исключено. Наоборот, противоионы ПАВ вызывают лишь дополнительное разворачивание макромолекулярных клубков.

Таким образом, впервые обнаруженное нами явление компактизации макромолекул ДНК в неполярном растворителе обусловлено особенностями двунитевой структуры ДНК как таковой, т.е. является внутренним свойством незаряженной двойной спирали. Полученный результат имеет принципиальное значение и свидетельствует о плодотворности модельного представления ионизованной ДНК как внутренне напряженного эластичного стержня, стремящегося принять компактную форму и реализующего это стремление при нейтрализации отрицательных зарядов на его поверхности.

4. ПЕРЕНОС ДНК ЧЕРЕЗ МЕЖФАЗНУЮ ГРАНИЦУ ВОДА-ХЛОРОФОРМ.

Нами обнаружен и изучен перенос относительно низкомолекулярной ДНК (ДНК400) через межфазную границу вода-хлороформ и хлороформ-водная среда, происходящий с участием противоионов ПАВ.

Для исследования переноса через межфазную границу предложена следующая схема: образующиеся в исходной водной фазе компактные гидрофобные водонерастворимые частицы комплекса ДНК-ПАВ переходят в гидрофобный малополярный органический растворитель (хлороформ), а затем, при контакте с солевым раствором, диссоциируют на исходные компоненты и растворятся в водно-солевом растворе. На основании этой схемы проведены сер™ следующих экспериментов: раствор ДНК объемом У| смешивали с объемом 2У1 органического растворителя. К образовавшейся двухфазной системе добавляли различные количества ПАВ. Полученную смесь тщательно перемешивали, центрифугировали для

наиболее полного разделения фаз и выдерживали в течение нескольких часов. Затем спектрофотометрически определяли содержание ДНК в обеих фазах. На рис. 8 приведены_ кривые зависимости-содержания ДНКздо в водной фазе (кривые 1,2) и в фазе хлороформа (кривые 3,4) от концентрации ПЛВ в системе после осуществления переноса.

ДНК, %

100 80 60 40 20 0

Рис. 8 Крипыс накопления ДНК400 в фазе хлороформа и убыли в водной фазе с применением ДСДАХ (3,1) " ЦТАБ (4Д) при переносе через границу раздела фаз вода/хлороформ.

О

1

2 3 4

СПАВ/СДНК

Из рис. 8 (кривые 1,2) следует, что ЦТАБ и ДСДАХ практически полностью выводят ДНК400 из водной фазы при соотношении концентраций ДНК/ПАВ, близком к эквимольному (с учетом равновесной концентрации ПАВ и коэффициента распределения ПАВ между водной и органической фазами). При этом, как видно из рис. 8 (кривые 3,4), комплекс ДНК-ПАВ практически полностью переходят в хлороформ. Такой перенос, однако, не происходит в случае высокомолекулярных ДНК2000 и ДНК7500. Их комплексы концентрируются в виде макроскопических ■ агрегатов вблизи границы раздела фаз. Выше было отмечено, что для растворения комплексов ДНК2000-ПАВ и ДНК7500-ПАВ в органических растворителях (в частности, в хлороформе) необходимо их тшательное высушивание. Поэтому сам факт отсутствия их переноса в условиях сосуществования водной и органической фаз выглядит вполне естественным. Однако для установления причины требуются дополнительные исследования. Возможно, это лишь кинетический эффект.

Для осуществления переноса стехиометричного комплекса ДНК-ПАВ из хлороформа в раствор низкомолекулярной соли необходимо установить

ее концентрацию, при которой комплекс полностью диссоциирует на исходные компоненты. Устойчивость комплексов ДНК400 с ПАВ (ЦТАБ и ДСДАХ) в водно-солевой среде изучали следующим образом. Стехиометричный комплекс ДНК-ПАВ, полученный смешением водных растворов компонентов и отделенный от супернатанта, заливали определенным количеством водного раствора 1ЧаС1 различной концентрации. Через 48 часов (время, достаточное для достижения равновесия) спектрофотометрически определяли количество перешедшей в водную фазу ДНК. Соответствующая зависимость для ДНК400 представлена на рис. 9.

100 80 60 40 20 0

днк, % 1

Рис. 9 Зависимость процентного содержания ДНК400 в растворе от концентрации ЫаС1 в системе. 1 - ДНК-ЦТАБ, 2 - ДНК-ДСДАХ.

~ 1 5 5 3 ^ С (ЫаС1),М Из рис. 9 видно, что при добавлении ЫаС1 ДНК полностью переходит в водно-солевой раствор в результате диссоциации комплекса. Количество ДНК в растворе увеличивается с повышением содержания №С1 в исследуемой системе, а затем, после достижения концентрации ЫаС1 «1.5 М, становится практически постоянным. На основании полученных результатов была выбрана концентрация солевой фазы для переноса ДНК через межфазную границу хлороформ/водная фаза - 2.5 М.

Для исследования второй стадии переноса удаляли исходную водную фазу и к оставшемуся раствору комплекса ДНК-ПАВ в хлороформе добавляли водный раствор ЫаС1. Образовавшуюся двухфазную систему снова перемешивали, центрифугировали, выдерживали несколько часов и содержание ДНК в солевой фазе фиксировали спектрофотометрически. Кривые зависимости содержания ДНК400 в водно-солевой фазе от концентрации ПАВ после осуществления переноса приведены на рис. 10.

ДНК, %

80

Рис. 10 Кривые накопления ДНКадо в солевом раство!» в зависимости от - _ концентрации ПАВ (1 - ЦТАБ, 2 - ДСДАХ)

60

40

20

после осуществления переноса.

0

0

I

2

1 4

Сднк/спав

Из рис. 10 видно, что наиболее эффективно перенос в солевую фазу осуществляется в присутствии ДСДАХ (рис. 10, кривая 2), однако, как и в случае с ЦТАБ, полный перенос не достигается.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что в результате реакции между макромолекулами ДНК и противоположно заряженными ионами ПАВ в разбавленных водных растворах образуются агрегаты стехи0метр1гчных комплексов ДНК-ПАВ, имеющие форму тора.

2. Установлено, что тщательно высушенные комплексы ДНК-ПАВ независимо от молекулярной массы ДНК способны растворяться в малополярных органических растворителях с сохранением двуспиральной нативнои конформашш макромолекул ДНК.

3. Впервые обнаружено, что комплексы ДНК-ПАВ в хлороформе независимо от молекулярной массы ДНК имеют компактную конформашш. При исследовании морфологии таких комплексов, ' полученных из хлороформа, методами СТМ и АСМ обнаруживаются торообразные частицы, включающие в среднем одну молекулу ДНК. Таким образом, растворение комплексов в хлороформе сопровождается диспергированием их частиц до молекулярных размеров.

4. Впервые обнаруженное явление компактизации макромолекул ДНК в неполярном растворителе объяснено особенностями двунитевой структуры

ДНК как таковой, т.е. внутренним свойством незаряженной двойной спирали.

5. Обнаружен перенос комплексов ДНК-ПАВ через границы раздела фаз вода/органический растворитель/водный раствор NaCl, который может служить моделью трансмембранного переноса ДНК.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А Высокомолекулярную ДНК можно растворить в малополярных органических растворителях путем комплексования. с катионными поверхностно-активными веществами. // Докл. АН, 1996, т. 348, № 4, с. 496-498.

2. Пышкина О.А, Сергеев В.Г., A.B. Лезов, АБ. Мельников, Е.И Рюмцев, Зезин А.Б., Кабанов В.А Компактная конформация комплекса ДНК-катионный ПАВ в хлороформе. // Докл. АН, 1996, т. 349, № 6, с. 772-775.

3. Сергеев В.Г., Пышкина O.A., Зезин АБ., Кабанов В.А Комплексы ДНК-поверхностно-активное вещество, растворимые в малополярных органических жидкостях. // Высокомолек. соед., 1997, тА39, № 1, с. 17-21.

4. Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Gallyamov M.О., Yaminsky I.V., Zezin AB., Kabanov V.A DNA-surfactant complexes in organic media..// Coli. & Polym. Sei., 1997, in press.

5. Галлямов M.O., Зинченко A.A., Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Яминский И. В. Применение методов сканирующей зондовой микроскопии к исследованию конформационных свойств ДНК. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 1997, в печати.

6. Пышкина O.A., Сергеев В.Г. Комплекс ДНК-ПАВ в хлороформе. // Тезисы докладов международной конференции по фундаментальный наукам "Ломоносов-96", Москва, 1996.

7. Галлямов М.О., Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А., Яминский И.В. Конформация комплексов ДНК-ПАВ в водных и органических средах: СТМ-исследование. // Авторефераты докладов 1-ой

Международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии", Санкт-Петербург, 1996, ч. 111, с. 179-181.

9. M.O.Gallyamov, V. A. Kabanov, O.A.Pyslikina, V.G.Sergeev, A.B.Zezin, I.V.Yaminsky, "DNA - Surfactant Complexes in Organic Media" / Abstracts of International Symposium on Colloids and Polymer Science "Formation and Dynamics of Self-Organized Structures in Surfactant and Polymer Solution — Recent Advances", Nagoya, Japan, 1996, p. 72.

10. M.O.Gallyamov, V.A.Kabanov, O.A.Pyslikina, V.G.Sergeev, A.B.Zezin, I.V.Yaminsky. Surfactant-induced DNA condensation: STM study" / Abstracts of Fourth International Conference on Nanometer-scale & Technology "Nano-4", Beijing, P.R.China, 1996.

11. Зинченко A.A., Галлямов M.O., Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Влияние конформации ДНК на процесс взаимодействия с ПАВ. // Тезисы докладов международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (к 90-летию академика В.А.Каргина), Москва, 1997, с. C3-32.

12. Пышкина О.А., Андреева А.С., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Моделирование трансмембранного переноса ДНК./ Тезисы докладов международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (к 90-летию академика В.А.Каргина), Москва, 1997, с. СЗ-69.

13. Kabanov V.A., Zezin А.В., Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Ryumtsev E.I., Lezov A.V. The self-assembly phenomena in DNA-cationic surfactant systems. / Тезисы докладов международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (к 90-летию академика В.А.Каргина), Москва, 1997, с. ПЗ-4.

14. Галлямов М.О., Пышкина О.А., Сергеев В.Г., Яминский И.В.,

Применение методов сканирующей зондовой микроскопии к исследованию конформационных свойств ДНК / Тезисы докладов Всероссийского рабочего совещания "Зондовая микроскопия-97", Нижний Новгород, 1997, с. 128-131.

15. Gallyamov M.O., Pyshkina O.A., Sergeev V.G., Yaminsky I.V., Zezin A.B., Kabanov V.A. Nature of surfactant-induced DNA compactization in media with different polyarity / Abstracts of "Nanomeeting-97", Minsk, Belarus, 1997.

16. Андреева A.C., Галлямов M.O., Зезин А.Б., Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Яминский И.В. Изучение конформационного перехода ДНК методом атомно-силовой микроскопии / Сборник кратких сообщений второго Белорусского семинара по сканирующей зондовой микроскопии, Минск, Беларусь, 1997, стр 15- 17.

17. Gallyamov М.О., Pyshkina O.A., Sergeev V.G., Yaminsky I.V., Zezin A.B. STM-AFM Study of DNA-condensation in the water-alcohol media/ Abstracts of 9th International Conference on Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy"STM'97", 1997, Hamburg, Germany.

18. Lezov A.V., Melnikov A.B., Rjumtsev E.I., Sergeyev V.G., Pyshkina O.A., Bakeev K.N., Zezin A.B. Molecular electrooptics of new polyelectrolyte-surfactant complexes soluble in low-polarity solvents./ Abstracts of VIII International Symposium "Colloid and molecular electrooptics", 1997, St.-Petersburg, p.7.

МОСКОВСКИЙ ОРДЁНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

ПЫШКИНА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ

СРЕДАХ

(02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук профессор академик РАН Кабанов В.А.

кандидат химических наук Сергеев В.Г.

МОСКВА 1997

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

ПЫШКИНА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПАВ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ

РАСТВОРИТЕЛЯХ

(02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук профессор академик РАН Кабанов В.А.

кандидат химических наук Сергеев В.Г.

МОСКВА 1997

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Комплексы шбкоцепных линейных полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ в органических растворителях. 4

1.2 Взаимодействие иономеров с полярными и амфифильными соединениями в органических растворителях. 16

1.3 Особенности ДНК как природного полиэлектролита. 25

1.3.1 Свойства ДНК в растворах. 25

1.3.2 Взаимодействие ДНК с поверхностно-активными веществами в водных растворах. 29 ГЛАВА II ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 36

2.1 Объекты исследования. 36

2.2 Приготовление образцов. 37

2.3 Методы исследования. 38 ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 41

3.1 Комплексы ДНК-ПАВ в водной среде. 41

3.1.1 Взаимодействие ДНК с ПАВ в водной среде. 41

3.1.2 Морфология комплексов ДНК-ПАВ, полученных из водного раствора. 46

3.2 Комплексы ДНК-ПАВ в малополярных органических растворителях. 52

3.2.1 Растворимость комплексов ДНК-ПАВ в малополярных органических растворителях. 52

3.2.2 Свойства комплексов ДНК-ПАВ в малополярных органических растворителях. 55

3.3 Перенос комплексов ДНК-ПАВ через границу раздела фаз вода/органический растворитель/вода. 89

3.3.1 Перенос комплексов ДНК-ПАВ через границу раздела фаз вода/органический растворитель. 89

3.3.2 Устойчивость комплексов ДНК-ПАВ в присутствие низкомолекулрного электролита. 94

3.3.3 Условия и механизм переноса комплексов ДНК-ПАВ через границу раздела фаз органический / водный раствор низкомолекулярного электролита. 100 ВЫВОДЫ 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107

ВВЕДЕНИЕ

Процесс взаимодействия полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ последние десятилетия изучают на примере очень широкого круга синтетических реагентов. Показано, что формирование в результате таких реакций полимер-коллоидных комплексов имеет много общего с процессами самоорганизации в биологических системах [1,2]. Поэтому сравнительно недавно для исследования комплексообразования стали применять природные биополимеры - ДНК и РНК и природные поверхностно активные вещества - липиды [3,4]. В основном такие работы посвящены изучению реакций, протекающих в водной фазе [5], и лишь в последние годы появились работы [6,7], в которых предприняты попытки к переводу продуктов таких реакций в неводные среды.

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование комплексов природного жесткоцепного биополимера ДНК с синтетическими катионными поверхностно-активными веществами в малополярных органических растворителях, изучены их физико-химические свойства и морфология. Эти исследования имеют двойное значение. Во-первых, перевод подобных комплексов в неводные среды позволяет применять к их изучению широкий спектр физико-химических методов исследования растворов полимеров, в то время как в водной среде большинство таких методов неприменимы вследствие нерастворимости комплексов в воде. Во-вторых, растворение комплексов ДНК-поверхностно-активное вещество в органических растворителях в какой-то мере моделирует одну из стадий жизненно важного биологического процесса - прохождение макромолекулами ДНК клеточной мембраны при трансформации, что позволяет наиболее близко подойти к изучению механизма трансформации на модельных системах. И в-третьих, исследования свойств и морфологии комплексов ДНК в средах с различной полярностью, как оказалось, имеют фундаментальное значение при изучении механизма компактизации ДНК.

ГЛАВА I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Комплексы гибкоцепных линейных полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ в органических растворителях.

Известно, что синтетические полиэлектролиты и молекулы мицеллообразующих противоположно заряженных поверхностно-активных веществ (ПАВ) образуют полимер-коллоидные комплексы (ПКК) в разбавленном водном растворе [8-13]. Такие комплексы возникают в результате электростатического взаимодействия звеньев полиэлектролита с ионогенными группами амфифильных ПАВ и стабилизированы гидрофобными взаимодействиями углеводородных фрагментов молекул ПАВ. В зависимости от соотношения [ПАВ]/[полиэлектролит] и значения рН раствора возможно образование как водорастворимых, так и нерастворимых в воде ПКК. Комплексы, включающие звенья полиэлектролитов и ионы ПАВ в эквимольном соотношении, т.е. стехиометричные комплексы, СПКК, не растворяются в воде. Отсутствие растворимости амфифильных СПКК в воде представляется естественным, поскольку ионогенные группы полиэлектролита и ПАВ, образующие друг с другом солевые связи, экранированы от молекул воды неполярными гидрофобными остовами полиионов и алифатическими фрагментами молекул ПАВ. Растворимость и свойства таких комплексов в органических растворителях начали изучать сравнительно недавно, но существует целый ряд работ [14-19], которые посвящены исследованию поведения СПКК в органических растворителях.

В работе [14] представлено систематическое исследование растворимости СПКК линейных синтетических полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ в органических растворителях с низкой диэлектрической проницаемостью. В табл. 1 приведены данные по

растворимости СПКК при комнатной температуре и температуре, близкой к температуре кипения растворителя. Остановимся более подробно на влиянии природы растворителя на растворение различных СПКК.

Табл. 1 Растворимость СПКК в растворителях с низкой диэлектрической проницаемостью.

№ 8 Растворитель А В С Б Е Б в

группы

I 4.81 Хлороформ ++ ++ ++ ++ ' ++ ++ ++

8.93 Метиленхлорид ++ ++ ++ ++ ++ -+ --

10.6 1,2-дихлорэтан ++ ++ -+ -+ — —

II 2.40 Бензол ++ ++ -+ -+ -+ -+ -+

2.38 Толуол ++ ++ -+ -+ -+ -+ -+

2.20 м-Ксилол ++ -+ -+ -+ ' -+ — --

III 7.58 2.21 Тетрагидрофуран 1,4-Диоксан

IV 2.24 4.34 1.88 2.02 Четырех- хлористый углерод Диэтиловый эфир Гексан Циклогексан

(Плюс означает растворение СПКК; минус - отсутствие растворимости; звездочкой обозначен сложный характер поведения СПКК(А) в тетрагидрофуране; первый знак соответствует растворению при комнатной температуре, второй - при температуре, близкой к температуре кипения растворителя; обозначение СПКК соответствует: А - сополимер 1Ч-этил-4-

винилпиридиний бромида и К-цетил-4-винилпиридиний бромида (93:7 мол. %), В - N - этил - 4 - винил пир идиний бромид, С - полистирол сульфонат натрия, D - поливинил сульфат калия, Е - полиакриловая кислота, F -полиметакриловая кислота, G - полиметакриловая кислота, в случае ПАВ А, В - додецилсульфат натрия, С, D, Е, F - цетилтриметиламмоний бромид, G - тетрадецилтриметиламмоний бромид.

Все растворители, приведенные в табл.1, авторы условно относят к четырем различным группам. В среднем, растворимость СПКК в растворителях первой группы выше и уменьшается при переходе к растворителям второй группы. В растворителях третьей и четвертой групп растворения СПКК практически не наблюдается. Такое различие в поведении растворителей, находящихся в разных группах, авторы [14] объясняют с помощью теории параметра растворимости (а) для регулярных растворов полимеров, описанной в работе [20]. Величины (а), приведенные в этой работе (с учетом вклада дисперсионных, полярных взаимодействий и водородной связи), составляют ai=9.4±0.6 для растворителей I-III группы и С2=7.8±0.6 для растворителей IV группы. Если предположить, что параметр растворимости СПКК различного типа близок к ст=9.4±0.6, т.к. многие из приведенных в таблице 2 СПКК растворимы в растворителях I и II групп, то можно заключить, что растворители IV группы хуже в термодинамическом смысле для СПКК, чем растворители I-III групп. Однако наблюдаемое небольшое различие в oi и 02 не позволяет однозначно предсказать отсутствие растворимости СПКК в растворителях IV группы. Более того, теория параметра растворимости не позволяет объяснить отсутствие растворимости СПКК в растворителях III группы. Поэтому авторы приводят некоторые дополнительные соображения о причинах различной растворимости СПКК в органических растворителях. Например, особенностью

растворителей I группы является их склонность к образованию водородной связи, т.к. они являются донорами протона [21]. При этом донорные свойства уменьшаются в ряду хлороформ > метиленхлорид > 1,2-дихлорэтан. Учитывая акцепторные свойства изученных СПКК, можно предположить, что образование водородных связей способствует растворению СПКК в растворителях I группы. Можно также предположить, что склонность к растворению СПКК в растворителях II группы обусловлена образованием я-комплексов [22]. В растворителях III группы атом кислорода проявляет акцепторные свойства, поэтому трудно ожидать образования водородных связей с СПКК. Наконец, отсутствие склонности к специфическим взаимодействиям растворителей IV группы может служить дополнительным аргументом в пользу отсутствия растворимости СПКК в этих растворителях. В работе [14] упоминается необходимость учитывать также влияние химического строения компонентов СПКК на их растворимость в органических растворителях, однако подробный анализ в работе отсутствует.

Однако, как показано в работе [15], в органических растворителях могут быть растворены не только СПКК, но и НПКК -нестехиометричные полимер-коллоидные комплексы - на основе синтетических гибкоцепных полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ. СПКК на основе по л и( 14-этил - 4 - винилпиридин ий бромида) (ПЭВП) и додецилсульфата натрия получали способом, описанным в работе [14]. НПКК синтезировали, используя реакцию обмена между растворенным в хлороформе СПКК и растворенным в метаноле ПЭВП, т.к. в смешанном растворителе (хлороформ-метанол) не растворяются ни ПЭВП, ни додецилсульфат натрия. Полученные таким способом СПКК, содержащие 5, 10 и 16 мол. % избыточных групп ПЭВП, после высушивания оказываются растворимыми в хлороформе. Как следует из седиментограмм Шлирена для растворов СПКК и НПКК в

хлороформе, оба комплекса присутствуют в хлороформе в виде индивидуальных соединений и плотность комплексов меньше плотности растворителя. На Рис. 1 представлены зависимости приведенной вязкости от концентрации СПКК и НПКК в хлороформе. Видно, что во всех случаях зависимости имеют характер, близкий к линейному. Наибольшее значение характеристической вязкости [г|] соответствует СПКК, а соответствующие значения [г|] для НПКК ниже и уменьшаются с уменьшением отношения [ПАВ]/[полиэлектролит]. Авторы работы [15] связывают этот факт с более компактной конформацией НПКК в хлороформе по сравнению с СПКК. Степень свернутости цепей НПКК увеличивается с уменьшением состава (отношения занятых групп полиэлектролита к общему числу ионогенных групп) НПКК. По мнению авторов, вискозиметрические и седиментационные данные свидетельствуют о наличии совпадения свойств растворов НПКК и иономеров в хлороформе. В обоих случаях агрегация солевых групп может возникать в неполярном растворителе, причем в разбавленных растворах агрегация сопровождается сворачиванием полимерных цепей.

Более подробное, систематическое исследование свойств и конформационных состояний СПКК и НПКК в хлороформе предпринято в работах [16, 17 ]. В работе [16] исследованы гидродинамические и динамооптические свойства растворов комплексов на основе ПЭВП и додецилсульфата натрия в хлороформе. В Табл. 2 приведены основные гидродинамические и конформационные характеристики молекул СПКК, НПКК и П4ВП (поли-4-винилпиридиния) в хлороформе.

Рис. 1 Концентрационные зависимости приведенной вязкости -пф/С

растворов ПКК в хлороформе. 1 - СПКК (2=3000), 2 - НПКК1 (2=3000, у=0.95); 3 - НПКК2 (2=3000, ¥=0.85); 4 - НПККЗ (2=3000, \|/=0.70); 5 - СПКК (2=500); 6 - НПК4 (2=3000, \|/=0.55), Температура Т=20°С, [15].

Табл. 2 Гидродинамические и конформационные характеристики молекул ПКК в хлороформе. Т=20°С.

Обра [л] О-Ю7 Мэтг А

-зец г-ю-3 дл/г к' см2/с 10"6 м'ю* нм

СПКК 1.0 3 0.57 0.25 1.88 1.4±0.3 1.2 6.3

1.0 1 0.35 — _ _ 0.40 _

1.0 0.5 0.22 0.32 0.20

НПКК1 0.95 3 0.46 0.31 2.06 1.4±0.3 1.2 5.4

НПКК2 0.85 3 0.35 0.49 2.21 1.4±0.3 1.1 4.3

НПККЗ 0.70 . 3 . 0.28 0.52 1.0 3.6

НПКК4 0.55 3 0.21 0.61 2.78 1.2±0.2 ' 0.93 2.8

П4ВП - 3 0.60 1.0 - - 3.18 2.7

♦Для сравления приведены данные, полученные для поли-4-винилпиридина (П4ВП).

♦«Коэффициенты диффузии, О, в разбавленном растворе ПКК в хлороформе измерены методом изотермической диффузии.

Как видно из таблицы 2, величины константы Хаггинса К4 соответствуют значениям, типичным для растворов гибкоцепных полимеров и как характеристики, зависящие от термодинамического качества растворителя, показывают, что хлороформ является хорошим растворителем для СПКК и НПКК-1. Значение [т|] для ПКК по порядку величины совпадает с характеристической вязкостью гибкоцепных полимеров с соответствующей степенью полимеризации и нелинейно зависит от ионного состава. М]>13 вычисленная с использованием экспериментальных значений Б, [г|] и гидродинамического инварианта Ао=(3.2±0.2) х Ю~10 эрг/Кхмоль1/3 [23] в формуле

МВп = (АоТ/г|оВ)3х100/[т1], (1)

в пределах погрешности эксперимента совпадает с ММ (Мч), рассчитанной из степени полимеризации Ъ и состава ПКК по формуле

(2):

м' = г[фМ01 + (1-Ф)М02], (2)

где М01 и М02 - ММ звеньев сополимера I с противоионами додецилсульфата и Вг соответственно. Соответствие рассчитанных и измеренных значений ММ свидетельствует об отсутствии ассоциации молекул ПКК в хлороформе в широком интервале изменения состава ПКК. По мнению авторов, этот факт позволяет интерпретировать зависимость гидродинамических характеристик от состава ПКК в терминах изменения конформаций макромолекул.

Линейная зависимость приведенной вязкости от концентрации, сохранение симметрии диффузионной границы со временем (рис. 2), а также совпадение величин Мрл и М' свидетельствует об отсутствии полиэлектролитных явлений в растворах исследованных ПКК. Эти факты указывают на то, что противоионы додецилсульфата и Вг в среде хлороформа оказываются практически полностью локализованными вблизи от заряженных звеньев полииона. Авторы статьи [16] предполагают, что молекулы ПКК в хлороформе имеют конформацию статистического клубка.

Макромолекулы ПКК в растворе хлороформа являются незаряженными системами, в которых все противоионы Вг и додецилсульфата связаны с цепью полииона. Влияние состава противоионов, имеющих различные размеры, на степень свернутости молекулярных цепей ПКК подобно влиянию размеров боковых групп на равновесную жесткость обычных гибкоцепных сополимеров со

Рис. 2 Зависимость дисперсии <ст2> диффузионной границы от времени I для образцов в хлороформе, Т=20°С. 1 - СПКК (2=3000), с=0.215 г/дл; 2 - НПКК2, с=0.217 г/дл; 3 - НПКК4, с=0.245 г/дл, [16].

статистическим распределением компонент. Изменение оптической свидетельствует о малом различии анизотропии звеньев, содержащих разные противоионы.

По данным анализа [17] сделан вывод о свойствах ПКК на основе гибкоцепных полиионов и противоположно заряженных ПАВ в малополярных органических растворителях. НПКК можно представить как новый тип иономеров, в которых избыточный заряд полииона скомпенсирован низкомолекулярными противоионами, играющими роль "солевых групп" иономера, способных агрегировать в малополярных органических растворителях. Растворимость таких НПКК в органической среде обеспечивается за счет структурных гидрофобных участков НПКК, состоящих из участков цепи полииона и противоионов - поверхностно активного вещества.

Исследовано равновесное электрическое двойное лучепреломление и кинетика эффекта Керра в растворах полиэлектролитных комплексов различного состава в хлороформе, образованных катионами поли-1Ч-этил-4-винилпиридиния и анионами додецил сульфата и Вг [18]. Установлено, что ориентирующее действие электрического поля на макромолекулы поликомплексов вызвано индуцированным дипольным моментом, время релаксации которого сравнимо с временем релаксации молекулярной ориентации. Обнаружено, что величина постоянной Керра поликомплекса согласуется с величиной оптического коэффициента сдвига и ее изменение с составом и степенью полимеризации поликомплекса вызвано изменением оптичес