Комплексы поликатионов с липидными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

СЫБАЧИН

Андрей Владимирович

КОМПЛЕКСЫ ПОЛИКАТИОНОВ С ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ: СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

_ 3 ИЮН 2910

МОСКВА-2010

004603039

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович доктор химических наук Мисин Вячеслав Михайлович

Ведущая организация:

Институт химической физики

им. Н.Н. Семенова Российской академии

наук

Защита состоится 9 июня 2010 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр.3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Лабораторный корпус "А", ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 6 мая 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.х.н.

Долгова А. А.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Постоянно расширяющееся использование синтетических водорастворимых полимеров, в том числе полиэлектролитов, в биологии и медицине заставляет обратиться к исследованию их поведения в биологическом окружении и, в первую очередь, к изучению механизмов их взаимодействия с клетками. При рассмотрении физико-химических аспектов такого взаимодействия наряду с клетками часто используются модельные системы, среди которых широкое распространение получили сферические бислойные везикулы (липосомы), сформированные из липидов и синтетических липидоподобных соединений.

Систематическое исследование адсорбции полимеров на биологических мембранах ведётся с конца 60-х годов прошлого столетия. В литературе описаны индуцированные полимерами структурные перестройки в липидных мембранах, конформационные переходы в адсорбированных макромолекулах, встраивание полимеров в липидные мембраны, влияние полимеров на мембраны и ряд других эффектов. Однако несмотря на большое количество публикаций, посвященных влиянию адсобированных полимеров на свойства липидных мембран, ряд принципиальных вопросов остается открытым. Это касается, в частности, взаимосвязи между строением межфазных комплексов полимер-липидная мембрана и морфологией частиц с участием макромолекул и липосом. Между тем, свойства межфазного слоя (его толщина, поверхностный заряд, наличие дефектов упаковки липидов и т.д.) в значительной степени определяют направление, по которому будут развиваться морфологические изменения в липосомах после адсорбции полимеров, будет это путь агрегации, слияния или разрушения. Подобные рассуждения справедливы и при рассмотрении клеток в контакте с синтетическими полимерами.

Цель работы заключалась в изучении влияния строения и свойств синтетических катаонных полимеров и анионных липосом на стабильность и морфологию полимер-липидных частиц. Для этого в работе было исследовано формирование комплексов синтетических поликатионов с анионными липосомами; определены толщина межфазных полимер-липидных слоев, стабильность комплексов поликатион-липосома в водно-солевых средах, целостность липосом в адсорбированными поликатионами, а также морфология комплексных частиц с участием макромолекул и липосом.

Научная новизна. Установлено, что стабильность комплексов анионных липосом с поликатионом в водно-солевых средах определяется набором факторов: степенью заряженности липосом, геометрической формой анионных липидных молекул, фазовым состоянием липидного бислоя и размером липосом. Впервые продемонстрировано, что способность катионных полимеров инициировать слияние анионных липосом зависит от

толщины адсорбированного полимерного слоя: если при 30 нм он слиянию препятствует, то при толщине 5 нм приводит к активации этого процесса. Показано, что адсорбция поликатиона на анионном липидном бислое, иммобилизованном на поверхности твердого носителя, развивается в две стадии, электростатическое связывание макромолекул и их последующее встраивание в липидный бислой.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании модельной системы поликатион-липосома, имеют принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия клеточной мембраны с синтетическими поликатионами и биологически активными веществами на их основе. Эти результаты позволяют прогнозировать поведение синтетических полимеров на поверхности клетки и реакцию клетки на адсорбированный полимер и могут быть использованы при разработке новых эффективных липосомальных контейнеров для транспорта биологически активных веществ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 45-ом и 49-ом Международных микросимпозиумах "Структура и динамика макромолекулярных систем" (Чехия, Прага, 2006, 2009), 4-ой Международной Каргинской конференции "Наука о полимерах 21-му веку" (Россия, Москва, 2007), Европейском полимерном конгрессе (Словения, Портороз, 2007), 6-ом Совместном конгрессе Британского биофизического общества и Европейского биофизического общества (Англия, Лондон, 2007), Балтийском полимерном симпозиуме (Литва, Друскининкай, 2007), Международной конференции по коллоидной химии и химико-физической механике (Россия, Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в рецензируемом сборнике статей и 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 143 ссылок.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В обзоре литературы проанализированы данные по взаимодействию катионных полимеров с липосомами и липидными бислоями и структурным перестройкам в липидных мембранах под действием адсорбированных поликатионов, рассмотрено

влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплексов поликатион-липосома, описаны морфологические изменения липосом в присутствии поликатионов.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

В работе использовали катионные полимеры, поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЗВП) со степенью полимеризации 600 и поли-Ь-лизин гидробромид (ПЛ) со степенью полимеризации 340, и анионный полимер, полиакриловую кислоту (ПАК), со степенью полимеризации 300. Для получения липосом использовали этанольные растворы анионных дифосфатидилглицерина (кардиолипина, КЛ2"), фосфатидилсерина (ФС1") и додецилфосфата натрия (ДФН2"), цвиттер-ионного (электронейтральных) природного (яичного) фосфатидилхолина (ФХ), а также дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ). В работе все эти соединения с полярной «головкой» и двумя алкилышми радикалами объединены термином «липид». Липосомы готовили ультразвуковой обработкой водной суспензии липидов. Использовали смешанные липосомы, состоявшие из анионных и электронейтральных липидов, при этом мольную долю отрицательно заряженных полярных головок рассчитывали как у(КЛ2") = 2[КЛ2"]/(2[КЛ2"]+[(ДП)ФХ]); у(ФС'") = [ФС'-МФС'-НСЦЩФХ]); у(ДФН2") = 2[ДФН2"]/(2[ДФН2-]+[(ДП)ФХ]). Для малых моноламеллярных липосом размер (гидродинамический диаметр) колебался от эксперимента к эксперименту, но не выходил за пределы 40-60 нм; для больших моноламеллярных липосом размер составлял 400-600 нм. Воду для приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Формирование комплексов катионных полимеров с малыми анионными липосомами

Для регистрации взаимодействия ПЭВП с малыми анионными КЛ2"/ФХ липосомами использовали метод лазерного микроэлектрофореза. Адсорбция поликатиона сопровождается нейтрализацией поверхностного заряда липосом, что отражается на величине их электрофоретической подвижности (ЭФП). На рисЛа приведены зависимости ЭФП для КЛ2'/ФХ липосом с различным содержанием анионного липида v от концентрации добавленного ПЭВП. Во всех случаях добавление ПЭВП вначале приводило к уменьшению ЭФП до нуля, затем происходила перезарядка поверхности липосом и, наконец, ЭФП достигала своего предельного положительного значения. Концентрация поликатиона, вызывавшая полную нейтрализацию

поверхностного заряда липосом [ПЭВПэфп-о], линейно возрастала по мере увеличения доли анионного липида в мембране (рис. 16, кривая 1).

2 .4 6

[ПЭВП] х 10 , осново-моль/л

а)

С

б)

0,10

0,15

0,20

Рисунок 1. (а) Зависимость ЭФП настиг/ комплекса ПЭВП-липосомы KJI '/ФХ от концентрации ПЭВП. Содержание анионного липида в липосомах v = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.15 (3) и 0.2 (4). (б) Зависимость концентрации ПЭВП, необходимой для полной нейтрачизации заряда липосом, [ПЭВПэфп-о] (1) и концентрации ПЭВП, соответствующей его максимальной адсорбции, [ПЭВП]макс (2), от v. Общая концентрация липидов 1 мг/мл; К?2Мборатпый буфер; рН 9.2.

Параллельное измерение размера частиц в суспензиях зафиксировало агрегацию липосом при добавлении поликатиона (рис. 2). Максимальный размер агрегатов достигался при полной нейтрализации поверхностного заряда липосом, т.е. при ЭФП=0. Дальнейшее введение ПЭВП приводило к уменьшению размера частиц до размера исходных липосом. Очевидно, что стабилизация липосом была обусловлена появлением на их поверхности избыточного положительного заряда, привнесенного адсорбированным поликатионом.

Рисунок 2. Зависимость гидродинамического диаметра части!{ комплекса ПЭВП-липосомы КП2'/ФХ от концентрации ПЭВП. Содержание анионного компонента в липосомах v = 0.05 (1), 0.1 (2), 0.15 (3) и 0.2 (4). Обгцая концентрация липидов 1 мг/мл; Ш2Мборатный буфер; рН 9.2.

Для оценки эффективности связывания ПЭВП с КЛ2'/ФХ липосомами мы анализировали состав супернатанта после отделения липосом с адсорбированным поликатионом. В качестве примера на рис. 3 изображена зависимость концентрации поликатиона в надосадочной жидкости от его общей концентрации в суспензии для липосом с содержанием анионного компонента V = 0.2. Видно, что ПЭВП количественно связывается с липосомами вплоть до [ПЭВП]ма1К, при ббльпшх концентрациях поликатион начинает накапливаться в растворе.

Аналогичные эксперименты были проведены с липосомами, содержащими 5, 10 и 15 мол.% анионных «головок». Оказалось, что по мере возрастания доли анионного липида в липосомальной мембране [ПЭВП] макс также увеличивается, при этом зависимость [ПЭВП]макс от V имеет линейный характер (рис. 1, кривая 2). Полученная прямая оказывалась сдвинутой параллельно вверх по отношению к прямой 1 на том же рисунке, описывающей зависимость [ЛЭВПэ<мм] от v. Таким образом, для всех типов липосом (с разным содержанием анионного липида) предельная адсорбция ПЭВП превышала нейтрализующее количество поликатиона на одну и ту же величину. Иными словами, [ПЭВП]макс - [ПЭВПэфп-о] = Д[ПЭВП] = 6.5><10"5 М. Этот избыток поликатиона сообщал липссомам ЭФП близкую к +3 (мкм/с)/(В/см) (рпс. 1а). При этом на липосомальной мембране формировался электростатический барьер, препятствовавший дальнейшей адсорбции поликатиона.

Рисунок 3.(1) Зависимость концентрации несвязанного с КЛ2'/ФХ липосомами ПЭВП от его общей концентрации в системе. Содержание анионного липида в липосоме V = 0.2; общая концентрация липидов 1 мг/мл; (2) зависимость концентрации ПЭВП в супернатанте от его общей концентрации в системе без липосом; скорость центрифугирования 16500 об./мин.; боратпьш буфер! О"2М, рН 9.2.

Таким образом, комплексообразование осуществляется за счет формирования множественных ионных пар между кватернизованными пиридиновыми кольцами ПЭВП и фосфатными группами КЛ2". Когда заряд комплекса достигает предельного

положительного значения, препятствовующего образованию новых ионных пар, адсорбция поликатиона прекращается.

Толщина слоя ПЭВП на поверхности липосом разного состава (с разной долей анионного липида) была определена с помощью метода динамического светорассеяния. Для того чтобы предотвратить агрегацию связавших ПЭВП липосом, комплексы готовили при соотношении компонентов [ПЭВП]/[КЛ2_] = 5. Для всех исследованных нами систем были измерены гидродинамические радиусы свободных липосом до добавления к ним поликатиона (Ялип) и их комплексов с адсорбированным поликатионом (Кк„Ш1). Таким образом по разнице измеренных величин ДК. = Якомп - К-лип был определён «прирост» размера липосом каждого типа, связанный с адсорбцией поликатиона (рис. 4).

0,05

0,10

0,15

0,20

Рисунок 4. Зависимость толщины адсорбированного слоя ПЭВП от содержания анионного компонента в липосомах v. Липосомы КЛ27ФХ, [ПЭВПИКЛ2-] = 5, боратный буфер Iff2 М, рН 9.2.

Видно, что с ростом V увеличивается и толщина адсорбированного полимерного слоя: с 20 нм для V = 0.05 до 35 нм для V = 0.2. Исходя из данных по адсорбции поликатиона (рис. 16, кривая 2), радиусу липосом (50 нм) и площади, занимаемой в липосомальной мембране одной липидной молекулой (около 0.7 нм2), можно рассчитать максимальное количество макромолекул ПЭВП, которое может адсорбироваться на липосомальной мембране (Т^ахс): 1-2 (для липосом с у=0.05), 3 (у=0.1), 4-5 (у=0.15) и 6 (у=0.2). Профиль зависимости ДЯ от Ммакс повторяет ранее описанную зависимость ДЛ от v (см. дополнительную ось на рис. 4).

в-образная зависимость ДЯ от 1Ччакс, скорее всего, отражает распределение макромолекул по поверхности липосомы. Дело в том, что модель, использованная для гидродинамических расчетов, аппроксимирует комплексы ПЭВП-липосома сферическими частицами. Увеличение доли анионного липида в липосомальной мембране (и,

следовательно, 1Ммакс) делает распределение адсорбированных макромолекул все более равномерньм, тем самым повышая значение Лишл (рис. 5). Иными словами, наиболее адекватно модель работает при большом заполнении поверхности липосом поликатионом. Максимальное значение ДЯмакс = 35 нм можно определить как толщину адсорбированного слоя ПЭВП (поликатионной «короны») на поверхности КЛ2"/ФХ липосом.

Рисунок 5. Изменение гидродинамического радиуса комплекса ПЭВП - КЛ2-/ФХ липосома с ростом V.

Сделанная нами оценка толщины слоя ПЭВП находится в согласии с данными микроэлектрофореза. Слой 35 нм формировался за счет экспонированных в водную фазу петель и хвостов адсорбированных макромолекул, в которых накапливался избыточный положительный заряд, регистрируемый в ходе электрофоретических экспериментов (рис.

На первый взгляд, взаимодействие другого катионного полимера, ПЛ, с КЛ2"/ФХ липосомами подчинялось тем же закономерностям. ПЛ полностью адсорбировался на липосомальной мембране, нейтрализуя заряд липосом и вызывая их агрегацию. Однако при этом даже в 2-кратном избытке поликатиона не наблюдалось перезарядки поверхности липосом (рис. 6, кривая 1). В свою очередь, отсутствие перезарядки не создавало условий для стабилизации комплекса ПЛ-липосома в области [ПЛ] > [КЛ2"] (кривая 2).

1а).

Рисунок 6. Зависимость ЭФП (1) и гидродинамического диаметра (2) частиц комплекса ПЛ-КЛ2'/ФХлипосомы от концентрации ПЛ. Содержание анионного липида V = 0.2, общая концентрация липидов 1 мг/мл; 10'2Мборатный буфер; рН9.2.

[ПЛ]х10 , осново-моль/л

Для оценки толщины слоя ПЛ на поверхности КЛ2*/ФХ липосом был использован метод динамического светорассеяния аналогично тому, как это было описано выше для адсорбированного на липосомальной мембране ПЭВП. Оказалось, что толщина слоя ПЛ составляет около 5 нм и не зависит от доли анионного липида в мембране. Это хорошо коррелировало с результатами электрофоретических и гидродинамических экспериментов, демонстрировавших а) отсутствие перезарядки мембраны и б) формирование крупных агрегатов для системы ПЛ-липосомы (рис. 6).

Целостность липосомальной мембраны в контакте с поликатионами контролировали методом кондуктометрии. Для этого были приготовлены КЛ2'/ФХ липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен 1 М раствором NaCl. Нарушение целостности мембраны должно было сопровождаться увеличением электропроводности липосомальной суспензии. Полученный результат сравнивали с электропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента - разрушения липосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за 100%.

При добавлении ПЭВП к суспензии липосом электропроводность не менялась в течение 2 часов (рис. 7, кривая 1). Что касается системы ПЛ-липосомы, ее электропроводность медленно увеличивалась в течение первого часа и затем резко возрастала (рис. 7, кривая 2). Увеличение электропроводности было результатом появления дефектов в липосомальной мембране, через которые происходило вытекание соли в окружающий раствор. Дефекты могли возникнуть, например, в результате образования трансмембранных пор, слияния липосом или их разрушения.

Рисунок 7. Зависимость относительной электропроводности суспензии комплекса ПЭВП-Ш7ФХ липосомы (1), иПЛ-КЛ2'/ФХ липосомы (2) и суспепзий комплексов после добавления детергента (3) от времени, v = 0.1, общая концентрация липидов 1 мг/мл; П1ЭВП]=3,5*1СГ4 М; [ПЛ]=1,8*1(Г4М; Iff Мборатный буфер; рН 9.2.

Для прояснения ситуации были получены изображения комплексов обоих поликатионов с ФХ-КЛ2" липосомами методом криогенной трансмиссионной электронной

микроскопии (КТЭМ, рис. 8). Этот метод специально разработан для анализа морфологии «мягких» объектов, например, липосом, мицелл, полимеров, которые меняют размер и форму при удалении растворителя, что неизбежно при традиционных вариантах электронной микроскопии. Видно, что липосомы сохраняют сферическую форму после инкубации в присутствии ПЭВП в течение 5 минут (рис. 8а) и двух часов (рис. 86). Добавление ПЛ не сказалось на форме липосом после 5-минутной инкубации смеси (рис. 8г), но вызвало резкие морфологические изменения в липосомах спустя 2 часа после смешения компонентов (рис. 8г). На последнем рисунке отчетливо видны крупные образования, являвшиеся результатом слияния более мелких липосом.

Шш Ш Ш -'

Рисунок S. КТЭМ-изображения комплексов ПЭВП-КЛ2'/ФХ липосомы (а,б) и ПЛ-КЛ2'/ФХ липосомы (в,г). Время инкубации 5 мин (а,в) и 20 мин (б,г), v = 0,1; общая концентрация липидов 1мг/мл; [ПЭВП]=1.2х1СГ4М; [ПЛ]=0.75*1^ М; Iff2Мборатный буфер, рН9.2.

Наблюдаемую картину можно объяснить, принимая во внимание описанные выше результаты по оценке толщины слоя, создаваемого на поверхности КЛ2'/ФХ липосом адсорбированным полимером. Нейтрализация отрицательного поверхностного заряда обоими поликатионами, ПЭВП и Г1Л, сопровождается агрегацией липосом. ПЭВП формирует на поверхности липосом слой толщиной 25-30 нм, что препятствует возникновению межлипосомальных контактов в агрегатах и способствует сохранению целостности липосом (рис. 86). В отличие от этого, создаваемый ПЛ слой 5 нм не способен предотвратить такие контакты, что в конечном итоге приводит к слиянию агрегированных липосом (рис. 8г).

2. Влияние липидного состава мембраны на устойчивость комплексов поликатиона с малыми анионными липосомами в водно-солевых средах

За образованием и последующей диссоциацией комплексов катионного полимера с малыми анионными липосомами следили по изменению относительной интенсивности флуоресценции меченого липида (ДПФЭ-ФИТЦ), встроенного в липосомальную мембрану. Использованный в работе ПЭВП является эффективным тушителями флуоресценции, поэтому указанные процессы сопровождались соответственно уменьшением и возгоранием флуоресценции.

Липосомы готовили из смеси электронейтрального ФХ и анионных липидов различной геометрии (рис. 9). Молекула ФС1' имеет форму цилиндра. Упоминавшийся выше КЛ2' похож по форме на усеченный конус, в котором площадь поверхности, занимаемой полярной головкой (Эг) меньше площади поперечного сечения углеводородного участка молекулы (ву): 8Г<8У. Форма молекулы ДФН2' соответствует

усеченный конус

1

8 <в

Кардиолипин

Рисунок 9. Форма анионных липидов (схематическое представление).

Интерес к таким системам связан с тем, что липидные молекулы с разной геометрической формой присутствуют и в клеточных мембранах. Адсорбция катионных полимеров на поверхности липосом (и клеток), содержащих анионные липиды разной геометрии, может привести к формированию комплексов с разной морфологией и устойчивостью к действию низкомолекулярных электролитов.

На рис. 10а показано, что добавление раствора ПЭВП к суспензии меченых ФС1' /ФХ липосом с разной долей анионного липида v приводило к уменьшению

«перевернутому» конусу, в котором 8Г > 8У,

цилиндр

I

перевернутый конус

ФосфатидиЛ'

серин фосфаты дилхо

8, »в,

ПАВ, лизоформ алипида

интенсивности флуоресценции метки, а последующее добавление соли (№С1) к суспензиям полученных комплексов вызывало её возгорание (рис. 106). Характерно, что в каждом случае интенсивность флуоресценции возвращалась к своему исходному уровню, свидетельствуя о полной диссоциации комплекса на липосомы и молекулы ПЭВП. Особого внимания заслуживает тот факт, что в системах, образованных липосомами с разными v, полное восстановление флуоресценции происходило при разных концентрациях добавленной соли.

5 я

о. о >. к

О

[ПЭВП]х104, моль/л

0.2

CncCI, моль/л

а)

б)

Рисунок 10. (а)Зависимость относительной интенсивности флуоресценции в системе ПЭВП-меченые ФС'/ФХ липосомы от концентрации ПЭВП. (б)Зависимость относительной интенсивности флуоресценции комплекса ПЭВП-меченые ФС'ЧФХ липосомы от концентрации NaCl. [ПЭВП] = 8*Ю4 М.

V = 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3) и 0.4 (4); общая концентрация липидов 1 мг/мл; боратный буфер, 1СГ2М; pH 9.2.

Замена ФС1' в липосомальной мембране на КЛ2' или ДФН/_ приводила к существенным изменениям в поведении комплексов анионных липосом с ПЭВП. В случае КЛ2" комплексы утрачивали способность к диссоциации при v ~ 0.4, а комплексы, содержащие ДФН2', уже при v = 0.2. Использование липосом, заполненных 1 М раствором NaCl, показало, что при этих значениях v в мембранах со встроенными КЛ2" и ДФН2' молекулами формировались дефекты, через которые происходило вытекание соли во внешний раствор. Результаты флуоресцентных и кондуктометрических экспериментов для штосом с содержанием анионного липида v < 0.4 собраны в таблице 1.

Как следует из литературных данных (например, [A.A.Yaroslavov et al., Асс. Chem. Res. 39 (2006) 702-710]), адсорбция катионных полимеров на смешанных ФХ-содержащих липосомах сопровождается формированием кластеров, состоящих преимущественно из молекул анионного липида благодаря электростатическому взаимодействию их полярных «головок» с катионными звеньями адсорбированного полимера. Латеральная сегрегация липидов под действием поликатиона может приводить

к значительному изменению локальной кривизны поверхности. Такое изменение сильнее проявляется для несимметричных липидов, КЛ2" и ДФН2", чем для цилиндрического ФС1", приводя к необратимости взаимодействия поликатиона и анионных липосом, содержащих КЛ2" и ДФН2".

Таблица 1. Восстановление флуоресценции и вытекание соли для комплексов ПЗВП с анионными липосомами.

Характеристика Состав липосом и содержание анионного компонента v

ФС'/ФХ КЛ2/ФХ ДФН2/ФХ

0.1 0.2 0.3 0.4 0.1 0.2 0.3 0.4 0.1 0.2 0.3 0.4

Диссоциация комплекса (флуоресценция восстанавливается) -* + - -

Сохранение целостности липосом (соль не вытекает) + + - -;

Выше отмечалось, что рост отрицательного заряда лшюсом сопровождался последовательным увеличением устойчивости комплекса к разрушающему действию соли (см. рис. 106 для комплекса ПЭВП-ФС'УФХ липосомы). Этот результат вызывает удивление. Полиэлектролитные комплексы, образованные противоположно заряженными линейными макроионами, ведут себя иначе. Их устойчивость в водно-солевых средах практически не зависит от их количества (концентрации). Казалось бы, это должно быть справеливо и для электростатических комплексов поликатион-липосома. Однако данные, приведенные на рис. 106, свидетельствуют об обратном.

По-видимому, обнаруженное различие в поведении двух систем обусловлено разной топологией комплексов. В полиэлектролитных комплексах отсутствует пространственное разделение положительных и отрицательных зарядов. В простейшем случае такую систему можно рассматривать как совокупность множества одинаковых независимых фрагментов, состоящих из взаимно нейтрализованных участков обоих макроионов, которые диссоциируют при некоторой критической концентрации соли в растворе.

В липосомах заряженные группы анионных липидов располагаются в мембране на границе с водой. При адсорбции поликатиона возникает пространственное разделение

анионных и катионных групп: анионные в липидном бислое, а пиридиниевые катионы на границе раздела фаз. Именно этот фактор определяет принципиальное отличие комплексов поликатион-липосома от полиэлектролитных комплексов и позволяет рассматривать липосомальную мембрану с адсорбированным на ней поликатионом как конденсатор, обкладки которого разделены слоем толщиной в несколько нанометров. Энергия такого сферического «молекулярного конденсатора» пропорциональна квадрату заряда на обкладках: W ~ q2. Как. следствие, увеличение количества межфазных комплексов анионный липид/поликатион при возрастании v приводит к прогрессивному увеличению «диссоциирующей» концентрации соли.

3. Влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплекса поликатиоиа с малыми анионными липосомами

Методами лазерного микроэлектрофореза, динамического светорассеяния, тушения флуоресценции и кондуктометрии исследовано влияние фазового состояния мембраны анионных ДПФХ/КЛ2" (v=0.2) липосом на обратимость комплексообразования с ПЭВГ1 и состав/строение образующихся комплексов. Ранее с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что мембрана смешанных ДПФХ/КЛ2" (v=0.2) липосом характеризуется широким фазовым переходом с максимумом при Ti=33.2°C и плечом при Т2=37.1°С [A.A. Yaroslavov et al., Langmuir 23 (2007) 75397544]. Ниже температуры Т; липидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидных молекул («твердые» липосомы). При температуре выше Тг мембрана переходит в жидкокристаллическое состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает («жидкие» липосомы). В нашей работе переход липидного бислоя из состояния геля в состояние жидкого кристалла и в обратном направлении вызывали путем изменения температуры липосомальной суспензии. Твердые ДПФХ/КЛ2' (v=0.2) липосомы получали охлаждением суспензии до 20°С, жидкие - ее нагреванием до 55°С.

Существенное отличие от опубликованных ранее работ состояло в том, что переход от твердого состояния к жидкому (и в обратном направлении) инициировался не в исходных липосомах, а в уже сформированном комплексе. Однако прежде чем обратиться к анализу поведения такой системы, мы исследовали по отдельности связывание поликатиона с твердыми и жидкими анионными липосомами.

В случае твердых липосом комплексообразование развивается как адсорбция поликатиона на поверхности с фиксированным положением отрицательных зарядов. При этом только молекулы анионного липида, расположенные на внешней стороне мембраны,

участвуют в образовании электростатического комплекса с поликатионом. Такое взаимодействие сопровождается формированием дефектов в липосомальной мембране, что в конечном итоге приводит к необратимости связывания поликатиона с твердыми липосомами. Адсорбция поликатиона на поверхности жидких липосом индуцирует переход анионных липидсв с внутренней стороны мембраны на внешнюю (флип-флоп). Целостность липосом при этом сохраняется, обеспечивая обратимость связывания поликатиона. Строение межфазных комплексов, образованных адсорбированным поликатионом на поверхности твердых и жидких липосом, схематически представлено на рис. 11а и рис. 116 соответственно.

Изменение фазового состояния липосомальной мембраны в уже сформированном комплексе оказывает существенное влияние на его структуру и свойства. Так, нагревание суспензии, содержащей комплекс поликатион-твердая липосома, выше температуры фазового перехода лшщдного бислоя активирует флип-флоп анионных липидов. Однако такое «разжижение» липосомальной мембраны не устраняет дефектов, возникших в ней при формировании исходного комплекса (рис. 11в). Благодаря этим дефектам необратимость связывания поликатиона сохраняется и после разжижения мембраны. Еще значительнее эффекты, наблюдаемые при охлаждении суспензии комплекса поликатион-жидкая липосома ниже температуры фазового перехода липидного бислоя. «Отверждение» липосомальной мембраны, вызываемое понижением температуры, сопровождается переходом части анионных липидов в обратном направлении - с внешней стороны мембраны на внутреннюю. В этот процесс оказывается вовлеченным и адсорбированный на мембране поликатион (рис. 11г). Встраивание поликатиона в липидную мембрану делает необратимым его контакт с отвержденными анионными липосомами.

Таким образом, фазовое состояние липосомальной мембраны оказывает решающее влияние на состав и свойства комплексов, формируемых анионными липосомами и молекулами катионного полимера.

(а)

разжижение

I

отверждение|

33

пзвп

хэ длфх

Рисунок 11. Строение межфазных комплексов, образованных адсорбированным поликатионом на поверхности твердых (а) и жиОких липосом (б). Схематическое изображение возможных перестроек в мембране при нагревании комплекса (ПЭВП-твердые липосомы) до 55 'С (разз/сижение мембраны) (в) и при охлаждении комплекса (ПЭВП-жидкие липосомы) до 20 "С (отверждение мембраны) (г).

(в)

(г)

4. Комплексы катиониого полимера с большими анионными лииосомами

Все сказанное выше касается поведения поликатионов на поверхности малых липосом, диаметр которых составляет около 50 нм. В то же время размеры клеток лежат в микронной области. Для приближения липосомальной модели к свойствам

липосомы и исследовано их комплексообразование с Г1ЭВП.

Как и ожидалось, такое взаимодействие приводило к нейтрализации поверхностного заряда липосом и значительному укрупнению частиц в системе. Основное отличие этой системы от рассмотренной выше с участием ПЭВП и малых анионных липосом состояло в следующем. По данным флуоресцентных измерений адсорбция поликатиона на поверхности больших анионных липосом была необратима: поликатион не покидал поверхности липосом в концентрированных растворах солей. По-видимому, необратимость связывания поликатиона была результатом встраивания фрагментов полимерной цепи в гидрофобную часть липидного бислоя, чему способствовала повышенная эластичность мембраны больших липосом. Вместе с тем, такое встраивание практически не сказывалось на толщине слоя адсорбированного ПЭВП: по данным светорассеяния, для больших анионных липосом, предельно заполненных поликатионом, она составляла около 30 нм, то есть была равна толщине слоя ПЭВП на поверхности малых липосом того же липидного состава. Это означало, что необратимость адсорбции для больших липосом обеспечивалась встраиванием в мембрану относительно малой доли звеньев адсорбированного ПЭВП.

моделируемого объекта были приготовлены большие моноламеллярные КЛ2"/ФХ (у=0.2)

5. Адсорбция катионного полимера на липидиых бислоях, иммобилизованных на твердой поверхности

Для получения дополнительной информации о строении межфазного слоя, образованного адсорбированными молекулами поликатиона на бислойпой липидной мембране мы использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), в том числе in-situ с использованием жидкостной ячейки. Липидные бислои с минимальным количеством дефектов были получены слиянием моноламеллярных нейтральных ФХ или смешанных анионных КЛ2"/ФХ (v=0.2) липосом на поверхности слюды с последующим удалением избытка растворителя путем быстрого вращения пластинки в горизонтальной плоскости (метод spin-ccating). Полученные такт образом бислои характеризовались практически молскулярно-гладким рельефом с редкими подъемами и впадинами, высота и глубина которых не превышала 1 нм. Доля этих участков составляла менее 2% от общей площади поверхности. Сканирование в режиме усиленного воздействия кантилевера на поверхность позволяло прорезать полученные слои на глубину до 4 нм, что подтверждало бислойную структуру липидных покрытий.

К нанесенным на слюду липидным бислоям добавляли in situ раствор ПЭВП. В случае КЛ2~/ФХ бислоя это приводило к появлению на поверхности структур, выступавших над уровнем липидного бислоя (рис. 12а). Этот результат, очевидно, отражал адсорбцию катионного полимера на нанесенной КЛ2"/ФХ бислойной мембране. В случае ФХ бислоя добавление раствора ПЭВП не вносило заметных изменений в топографию АСМ реплик по сравнению с исходными ФХ бислоем, что свидетельствовало об отсутствии адсорбции катионных макромолекул на поверхности нейтрального липидного бислоя.

Отдельно распложенные на рис. 12а объекты занимали площади примерно 30 нм х 30 нм, что позволяло отнести их к единичным макромолекулам ПЭВП, и выступали над уровнем липидного бислоя на 3.2±0.7 нм. Для сравнения на рис. 126 приведено АСМ изображение поверхности слюды с адсорбированным ПЭВП. Замена «мягкого» КЛ27ФХ бислоя на твердую поверхность слюды приводит к увеличению высоты адсорбированных макромолекул до 6±0.5 нм, при этом площадь видимых на АСМ изображении объектов практически не изменяется (ср. рис. 12а и рис. 12а). Вдвое меньшая высота ПЭВП макромолекул, адсорбированных на анионном ФХ/КЛ2" бислое, может быть связана с их заглублением в гидрофобную часть бислоя аналогично тому, как это происходит при связывании ПЭВП с большими КЛ2"/ФХ липосомами.

Рисунок 12. ACM изображения ПЭВП на поверхности KJI''/ФХ (а) и ФХ бислоя (б). Продольные срезы вдоль осей 1-1' на обоих изображениях.

Мы сравнили АСМ изображения поверхности нанесенного ФХ/КЛ2" бислоя с адсорбированными молекулами ПЭВП до и после добавления in situ 2 М раствора NaCl на предмет их возможной десорбции в присутствии соли. Оказалось, что добавление раствора соли не приводит к существенному изменению рельефа образца и доли занятой полимером поверхности: 8.5±0.7 и 8.0±0.5% до и после добавления соли соответственно. Это означает, что взаимодействие ПЭВП с КЛ2"/ФХ бислоем, иммобилизованным на поверхности слюды, практически нечувствительно к концентрации соли в окружающем растворе.

Полученые результаты позволяют следующим образом описать адсорбцию поликатиона на анионном липидном бислое, иммобилизованном на поверхности твердого носителя. Такое взаимодействие развивается в две стадии. На первой происходит физическая адсорбция молекул полимера за счет образования электростатических связей между катионными звеньями полимера и анионными группами липидов. На второй стадии адсорбированные макромолекулы встраиваются в липидный бислой. В целом контакт макромолекул с бислоем оказывается необратимым: полимер не десорбируется в раствор даже в концентрированных водно-солевых растворах.

выводы

1. Впервые показано, что морфология липоеом в комплексе с катионным полимером зависит от толщины адсорбированного полимерного слоя. Нейтрализация отрицательного заряда липоеом поликатионом сопровождается их агрегацией. Поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП) формирует на поверхности липоеом слой толщиной 25-30 нм, что препятствует возникновению межлипосомальных контактов в агрегатах и способствует сохранению целостности липоеом. В отличие от этого, создаваемый полилизином (ПЛ) слой 5 нм не способен предотвратить такие контакты, что в конечном итоге приводит к слиянию агрегированных липоеом.

2. Впервые продемонстрировано влияние степени заряженности малых липоеом (диаметром около 50 нм) на стабильность их комплексов с поликатионом в водно-солевых средах. Добавление раствора низкомолекулярной соли к суспензии комплекса приводит к его диссоциации на составляющие компоненты, причем с увеличением доли анионного липида в липосомальной мембране стабильность комплексов к действию соли повышается.

3. Обнаружено определяющее влияние геометрии липидных молекул на устойчивость в водно-солевых средах комплексов, полученных при взаимодействии катионного полимера с малыми смешанными липосомами, отрицательный заряд в которых создавался путем встраивания в мембрану различных по форме молекул анионных амфифильных веществ: фосфатидилсерина (цилиндр), дяфосфатидилглицерина (усеченный конус) и додецилфосфата натрия (перевернутый конус).

4. Установлено, что изменение фазового состояния липосомальной мембраны в уже сформированном комплексе поликатиона с малыми липосомами (от твердого (гелеобразного) состояния к жидкокристаллическому и в обратном направлении) делает адсорбцию поликатиона необратимой, что связано с консервацией дефектов упаковки липидных молекул при «разжижении» твердых липоеом или появлением подобных дефектов при «отверждении» жидких липоеом.

5. С помощью метода атомно- силовой микроскопии продемонстрировано, что поликатион не взаимодействует с нанесенным на поверхность слюды липидньм бислоем, сформированным из нейтрального липида, в то же время поликатион необратимо связывается со смешанным бислоем, в который встроен анионный липид.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Sybachin А.V., Eiimova A.A., Litmanovich Е.А., Menger F.M., Yaroslavov A.A. Complexation of polycations to anionic liposomes: Composition and structure of the interfacial complexes. // Langmuir. 2007. V.23. №. 20. P. 10034-10039.

2. Ярославов A.A., Ефимова A.A., Сыбачин A.B.. Влияние фазового состояния липидного бислоя на строение и свойства комплекса поликатион- анионная липосома // Высокомолек. Соед. Сер. А. 2009. Т. 51. №6. С. 962-971.

3. Efimova A.A., Sybachin A.V. Reversibility of polycation-to-negative liposome interaction. // Proceedings of Baltic Polymer Symposium. 2007. P.l 17-122.

4. Sybachin A.V., Efimova A.A., Litmanovich E.A., Yaroslavov A.A. Physico-chemical characteristics of interfacial polycation-anionic lipid membrane complexes // Abstracts of 45th Prague Meeting on Macromolecules (Прага, Чехия). 2006. P.72.

5. Сыбачин A.B., Ефимова A.A., Литманович E.A., Ярославов A.A. Формирование и свойства комплексов поликатион-отрицательно заряженная липосома // Тезисы докладов IV Всероссийской Каргинской конференции (Москва, Россия). 2007. Т. 2. С. 429.

6. Ефимова A.A., Сыбачин A.B., Ярославов A.A. Обратимость взаимодействия поликатиона с отрицательно заряженными липосомами // Тезисы докладов IV Всероссийской Каргинской конференции (Москва, Россия). 2007. Т. 2. С.344.

7. Sybachin A.V., Efimova A.A., Yaroslavov A.A., Tsarkova L.A. Adsorption of polycaiions on planar and curved lipid membranes II Abstracts of European Polymer Congress (Портороз, Словения). 2007. P.2.4.58.

8. Efimova A.A., Sybachin A.V., Yaroslavov A.A. Reversibility of polycation interaction with anionic liposomes // European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 2007. V. 36 S. 184.

9. Sybachin A.V., Efimova A.A., Yaroslavov A.A. Polycation-anionic liposome interfacial complexes: physico-chemical characteristics // European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 2007. V. 36. S.191.

10. Sybachin A.V., Efimova A.A., Litmanovich E.A., Tsarkova L.A., Yaroslavov A.A. Complexation of polycation to anionic liposomes and lipid bilayers: composition and structure of the interfacial complexes // Abstracts of Baltic Polymer Symposium (Друскиненкай, Литва). 2007.P. 24.

11. Yaroslavova E.G., Sybachin A.V., Litmanovich E.A., Yaroslavov A.A. Exchange reactions in lipid vesicle-polyelectrolyte system // Abstracts of 233rd ACS National Meeting (Чикаго, США). 2007. С. 315.

12. Sybachin A.V., Efimova A.A., Litmanovich E.A., Yaroslavov A.A. The differences in structure and behaviour in complexes of negatively charged liposomes with polycations poly-L-lysine and poly-N-ethyl-4-vynilpiridinium bromide // Abstracts of III International Conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Москва, Россия). 2008. P.30.

13. Sybachin A.V., Efimova A.A., Yaroslavov A.A. Reversibility of polycation interaction with anionic vesicles II Abstracts of 9th International Symposium on Polymers for Advanced Technologies (Шанхай, Китай).2007. P. 14.

14. Sybachin A.V., Kesselman E., Schmidt J., Talmon Y., Yaroslavov A.A. Complexes of cationic polymers with anionic liposomes: Stability, structure and properties. // Abstracts of 73rd Prague Meeting on Macromolecules (Прага, Чехия). 2009. P 47.

Подписано в печать: 05.05.2010

Заказ № 3689 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское щ., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 .Модельные липидные мембраны.

2.1.1. Липиды и их самоорганизация в водной среде.

2.1.2. Липидные везикулы и плоские бислои.

2.1.3. Диффузия липидов и фазовые переходы в модельных липидных бислоях.

2.2. Поликатионы и их взаимодействие с модельными липидными бислоями.

2.2.1. Адсорбция.

2.2.2. Структурные перестройки в липидном бислое, вызываемые адсорбцией поликатиона.

2.2.3. Обратимость взаимодействия поликатионов с отрицательно заряженными липосомами.

2.2.4. Слияние липосом, индуцируемое адсорбцией полиэлектролитов.

2.2.5.0бласти применения комплексов поликатионов с модельными липидными мембранами.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Используемые реагенты.

3.1.1 Фосфолипиды и ПАВ.

3.1.2. Полимеры.

3.1.3. Низкомолекулярные реактивы.

3.1.4. Вода.

3.2. Объекты исследования.

3.2.1. Меченые липосомы из фосфатидилхолина и кардиолипина.

3.2.2. Нанесенные липидные мембраны.

3.3. Методы исследования.

3.3.1. Квазиупругое рассеяние лазерного света (КУРЛС).

3.3.2. Флуориметрия.

3.3.3. Препаративное центрифугирование.

3.3.4. Спектрофотометрия.

3.3.5. Атомно-силовая спектроскопия.

3.3.6 Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия.

3.3.7. Кондуктометрия.

4.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Формирование комплексов катионных полимеров с малыми анионными липосомами.

4.2 Влияние липидного состава мембраны на устойчивость комплексов поликатиона с малыми анионными липосомами в водно-солевых средах.

4.3. Влияние фазового состояния мембраны на строение и свойства комплекса поликатиона с малыми анионными липосомами.

4.4. Комплексы катионного полимера с большими анионными липосомами.

4.5. Адсорбция катионного полимера на липидных бислоях, иммобилизованных на твердой поверхности.

5 .ВЫВОДЫ.

Комплексы поликатионов с отрицательно заряженными сферическими бислойными липидными везикулами (липосомами) представляют большой интерес для исследований. Подобные конструкции позволяют моделировать взаимодействие лекарственных препаратов на основе полиэлектролитов с клеточной мембраной. Другой важной областью применения комплексов липосом с полиэлектролитами является создание эффективных наноконтейнеров для доставки биологически активных соединений в клетки. На сегодняшний день накоплен значительный объём информации по физико-химическим аспектам взаимодействия полимеров с биомиметическими мембранами. В литературе описаны состав и строение межфазных комплексов, индуцированные полимерами структурные перестройки в клеточных и липидных мембранах; влияние полимеров на проницаемость мембран; агрегация, слияние и разрушение мембран под действием полимеров и ряд других эффектов. В большинстве работ основное внимание уделено влиянию природы определённого полиэлектролита на свойства комплекса поликатион-липосома. В то же время практически отсутствует сравнительный анализ свойств комплексов, образованных поликатионами различной природы. Также, несмотря на то, что липосомы могут быть сформированы из различных видов как природных, так и синтетических липидов, мало внимания уделяется роли липидного состава мембран, а именно природе липида, формирующего заряд мембраны и его количеству в липосомах. Между тем известно, что в клеточных мембранах доля отрицательно заряженных липидов может изменяться в достаточно широких пределах. Следует ожидать, что такое различие в составах липидных мембран должно сказаться на характере их взаимодействия с поликатионами.

Важным вопросом остаётся и поведение комплексов в течение длительного времени после адсорбции поликатиона. В большинстве работ рассматривают либо процессы адсорбции полимера на липидной мембране, либо- структуру сформированного комплекса. В то же время известно, что структурные перестройки в липидных мембранах могут происходить за длительные промежутки времени. Адсорбция поликатиона может в свою очередь вызывать процессы, также развивающиеся за большие временные интервалы.

Знание влияния химической природы поликатионов, а также липидного состава биомиметических мембран позволит как создавать лекарственные препараты с большей эффективностью и кругом применения, так и прояснить механизм действия уже существующих систем на основе поликатионов и их комплексов с липосомами. Поэтому в настоящей работе мы сделали первую попытку обнаружения систематических закономерностей между этими факторами и физико-химическими свойствами комплексов поликатионов с липидными мембранами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что морфология липосом в комплексе с катионным полимером зависит от толщины адсорбированного полимерного слоя. Нейтрализация отрицательного заряда липосом поликатионом сопровождается их агрегацией. Поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП) формирует на поверхности липосом слой толщиной 25-30 нм, что препятствует возникновению межлипосомальных контактов в агрегатах и способствует сохранению целостности липосом. В отличие от этого, создаваемый полилизином (ПЛ) слой 5 нм не способен предотвратить такие контакты, что в конечном итоге приводит к слиянию агрегированных липосом.

2. Впервые продемонстрировано влияние степени заряженности малых липосом (диаметром около 50 нм) на стабильность их комплексов с поликатионом в водно-солевых средах. Добавление раствора низкомолекулярной соли к суспензии комплекса приводит к его диссоциации на составляющие компоненты, причем с увеличением доли анионного липида в липосомальной мембране стабильность комплексов к действию соли повышается.

3. Обнаружено определяющее влияние геометрии липидных молекул на устойчивость в водно-солевых средах комплексов, полученных при взаимодействии катионного полимера с малыми смешанными липосомами, отрицательный заряд в которых создавался путем встраивания в мембрану различных по форме молекул анионных амфифильных веществ: фосфатидилсерина (цилиндр), дифосфатидилглицерина (усеченный конус) и додецилфосфата натрия (перевернутый конус).

4.Установлено, что изменение фазового состояния липосомальной мембраны в уже сформированном комплексе поликатиона с малыми липосомами (от твердого (гелеобразного) состояния к жидкокристаллическому и в обратном направлении) делает адсорбцию поликатиона необратимой, что связано с консервацией дефектов упаковки липидных молекул при «разжижении» твердых липосом или появлением подобных дефектов при «отверждении» жидких липосом.

5. С помощью метода атомно-силовой микроскопии продемонстрировано, что поликатион не взаимодействует с нанесенным на поверхность слюды липидных бислоем, сформированными из нейтрального липида, в то же время поликатион необратимо связывается со смешанным бислоем, в который встроен анионный липид.

1. Gunstone, F. D. Fatty acids and lipid chemistry. London: Blackie Academic and Professional. 1996. P. 252.

2. Fahy E., Subramaniam S., Brown H.A. A comprehensive classification system for lipids". // Journal of Lipid Research. 2005. V.46. № 5. P. 839861.

3. Марголис JI.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М. Наука. 1981. С. 8-40.

4. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М. Просвещение. 1987. С. 577.

5. Torchilin V.P., Weissig V.(ed.). Liposomes: A practical approach. Oxford University Press. 2003. P.3-27.

6. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. //Nature. 1962. V.194. P. 979-80.

7. Swart R.M. Langmuir-Blodgett Films; Roberts G. Ed.; Plenum Press: New York, 1990.

8. Boudard S., Seantier В., Breffa C., Decher G., Felix O. Controlling pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration // Thin Solid Films. 2006. V. 495. № 1-2. P. 246-251.

9. Cremer P.S., Boxer S.G. Formation and spreading of lipid bilayers on planar glass supports. II J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. №13. P. 2554-2559.

10. Reviakine I., Brisson A. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.// Langmuir. 2000. V. 16. № 4. P. 1806-1815.

11. Kasbauer M. Junglas M., Bayerl T.M. Effect of cationic lipids in the formation of asymmetries in supported bilayers. // Biophys. J. 1999. V. 76. № 5. P. 2600-2605.

12. Rossetti F.F., Textor V., Reviakine I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. И Langmuir. 2006. V. 22. № 8. P. 3467-3473.

13. Kim Y.-H., Rahman Md.M., Zhang Z.-L., Misawa N., Tero R., Urisu T. Supported lipid bilayer formation by the giant vesicle fusion induced by vesicle—surface electrostatic attractive interaction. // Chem. Phys. Lett. 2006. V. 420. №4-6. P. 569-573.

14. Raedler J., Strey H., Sackmann E. Phenomenology and kinetics of lipid bilayer spreading on hydrophilic surfaces //Langmuir. 1995. V. 11. № 11. P. 4539-4548.

15. Feng Z.V., Granick S., Gewirth A.A. Modification of a supported lipid bilayer by polyelectrolyte adsorption. // Langmuir. 2004. V.20. № 20. P. 8796-8804.

16. Shaw J.E., Slade A., Yip C.V. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. №39. P. 11838-11839.

17. Richter R., Brisson A. Following the formation of supported lipid bilayers on mica: a study combining AFM, QCM-D, and ellipsometry. // Biophys J. 2005. V. 88. P. 3422-3433.

18. Charrier A., Thibaudau F. Main phase transitions in supported lipid single-bilayer. II Biophys. J. 2005. V. 89. № 2. P. 1094-1101.

19. Seelig J. 31P nuclear magnetic resonance and the head group structure of phospholipids in membranes.// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 515. № 2. P.105-140.л

20. Hubner W., Blume A. H NMR spectroscopy of oriented phospholipid bilayers in the gel phase///. Phys. Chem. 1990. V. 94. № 19. P.7726-7730.

21. Marsh D. Studies of membrane dynamics using nitroxide spin labels. // Pure Appl. Chem. 1990. V.62. № 2. P.265-270.

22. Шалыгин A.H., Переведенцева E.B., Барышев M.B. Магнитные свойства и особенности структурной организации фосфолипидных бислоев// Физическая химия. 1990. Т.64. № 6. С.1623-1629.

23. Traube Н., Eibe Н. Electrostatic effects on lipid phase transitions: membrane structure and ionic environment. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1974. V.71. № 1. P.214-219.

24. Геннис P. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Мир. 1997. с. 624.

25. Blandamer M., Cullis P., Engberts J.B.F.N. Differential scanning and titration calorimetric studies of macromolecules in aqueous solution. // Journal of Thermal Analysis. 1995. V. 45. № 4. P. 599-613.

26. Kacperska A. The effect of alkyltrimethylammomum bromides on the thermal stability of dioctadecyl dymethylammonium bromide (DOAB) vesicles in aqueous solutions. // Journal of Thermal Analysis. 1995. V.45. № 4. P. 703-714.

27. Blandamer M., Briggs В., Cullis P., Engberts J.B.F.N. Gel to liquid-crystal transitions in synthetic amphiphile vesicles. // Chem. Soc. Rev. 1995. V 24. №4. P. 251-257.

28. Ferrarini A., Nordio P.L., Moro G.J. Crepeau R.H., freed J.H. A theoretical model of phospholipid dynamics in membranes. К J.Chem.Phys. 1989. V.91. № 9. P.5707-5721.

29. Spink C., Clouser D., O'Neil J. Thermodynamics of transfer of indocarbocyanines from gel to fluid phases of phospholipid bilayers. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1191. № 1. P. 164-172.

30. Santaella C., Vierling P., Riess J., Gulik-Krzywicki Т., Gulik A., Monasse B. Polymorphic phase behavior of perfluoroalkylated phosphatidylcholines. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. Vol. 1190. № 1. P.25-39.

31. Mouritsen P. Theoretical models of phospholipid phase transitions. // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. №.2-3. P. 179-194.

32. Волькенштейн M.B. Биофизика. M. Наука. 1981. C.325-327.

33. Weis R. Fluorescence microscopy of phospholipid monolayer phase transitions. // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. № 2-3. P.227-239.

34. Mantsch H.H. and McElhaney R.N. Phospholipid phase transitions in model and biological membranes as studied by infrared spectroscopy. // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. № 2-3. P. 213-226.

35. Yamazaki M., Miyazu M. and Asano Т. Studies of alcohol-induced interdigitated gel phase in phosphatidylcholine multilamellar vesicles by the excimer method. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1106. № 1. P. 94-98.

36. Watts A. and Spooner P. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. № 2-3. P. 195-211.

37. Dluhy R., Chowdhry В., Cannron. D. Infrared characterization of conformational differences in the lamellar phases of 1,3-dipalmitoyl-sn-glycero-2-phosphocholine. // Biochim. Biophys.Acta. 1985. V. 821. № 3. P. 437444.

38. Marsh D. General features of phospholipid phase transition. // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. № 2-3. P. 109-120.

39. Brown D.A., London E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 3. P. 17221-17224.

40. Tauc P., Reyes Mateo C., Brochon J.-C. Pressure effects on the lateral distribution of cholesterol in lipid bilayers: a time-resolved spectroscopy stud.y // Biophys. J. 1998. V. 74. № 4. P. 1864-1870.

41. Pencer J., White G.F., Hallett F.R. Osmotically induced shape changes of large unilamellar vesicles measured by dynamic light scattering. // Biophys. J. 2001. V. 81. № 5. P. 2716-2728.

42. Berctaz Т., McConnel H.M. Phase equilibria in binary mixtures od dimyristoylphsphatidylcholine and cardiolipin. // Biochemistry. 1981. V. 20. №23. P. 6635-6640.

43. Marassi F., Djukic S. and Macdonald P. Influence of lipid lateral distribution on the surface charge response of the phosphatidylcholine headgroup asлdetected using H nuclear magnetic resonance. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1146. № 2. P.219-228.

44. Bernik D.L., Disalvo E.A. Gel state surface properties of phosphatidylcholine liposomes as measured with merocyanine 540. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V.l 146. № 2. P. 169-177.

45. Shinitzyk M., Barenholz Y. Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence polarization. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 515. № 4. P. 367-394.

46. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. М. Наука, 1981, с. 236-238.

47. Eigenberg К.Е., Chan S.J. The effect of surface curvature on the head-group structure and phase transition properties of phospholipid bilayer vesicles. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 599. № 1. P. 330-335.

48. Gordon L. Jendrasiak, Anthony A. Ribeiro, Mark A.Nagumo, Paul E. Schoen. A temperature study of diacetylenic phosphatidylcholine vesicles. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1194. № 2. P. 233-238.

49. Zhang L., Granick S. Lipid diffusion compared in outer and inner leaflets of planar supported bilayers. // J. Chem. Phys. 2005. V. 123. № 21. P. 211104211108.

50. Kornberg R.D., McConnel H.M. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes. // Biochemistry. 1971. V.10. № 7. P. 1111-1120.

51. Cullis P.R., de Kruijff B. The polymorphic phase behaviour ofо 1phosphatidylethanolamines of natural and synthetic origin. A P NMR study. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 513 № 1. P. 31-42.

52. Anzai K., Yoshioka Y., Kirino Y. Novel radioactive phospholipid probes as a tool for measurement of phospholipid translocation across biomembranes. II Biochim. Biophys. Acta. 1993. V.l 151. № 1. P. 69-75.

53. Bretscher M.S. Assymetrical lipid bilayer structure for biological membranes II Nature. 1972. V. 236. № 61. P. 11-12.

54. Щукин Е.Д., Перцов A.B., Амелина E.A. Коллоидная химия. М. Химия. 1982. С.98

55. Tournois Н., de Kruijff В. Polymorphic phospholipid phase transitions as tools to understand peptide-lipid interaction // Chemistry and Physics of Lipids. 1991. V. 57. №.2-3. P. 327-340.

56. Smits E., Blandamer M.J., Briggs В., Cullis P.M., Engberts J.B.F.N. The effects of chain flexibility on the properties of vesicles formed from di-n-alkyl phosphates // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas. 1996. V. 115. P. 37-43.

57. Saez R., Alonso A., Villena A., Goni F.M. Detergent-like properties of polyethyleneglycols in relation to model membranes. // FEBS Lett. 1982. V. 137. №2. P. 323-326.

58. Posse M., De Arcuri B.F., Morero R.D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. II Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1193. № 1. P. 101-106.

59. Komatsu H., Okada S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membraneformation in their processes. 11 Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1235. № 2. P.270-280.

60. Stegmann Т., Doms R.W., Helenius A. Protein-mediated membrane fusion. // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1989. V. 18. P. 187-211.

61. Hauser H., Barratt H.D. Effect of chain length on the stability of lecithin bilayers. //Biochim. Biophys. Res. Communs. 1973. V. 53. № 2. P. 399-405.

62. Berden J.A., Barker R.W., Raolda G.K. NMR studies on phospholipid bilayers. Some factors affecting lipid distribution. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V.3 75. № 2. P. 186-208.

63. Attwood D., Saunders L.A. A light-scattering study of ultrasonically irradiated leicithin sols. // Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 98. № 2. P.344-350.

64. Barenholz I., Gibbes D., Litman B.J. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. // Biochemistry. 1977. V. 16. № 12. P. 2806-2810.

65. Bordi F., Sennato S., Truzzolio D. Polyelectrolyte-induced aggregation of liposomes: a new cluster phase with interesting applications. II J. Phys. Condens. Matter. 2009. V. 21. P. 203102-2031028.

66. Naghizadeh J. Counterion condensation in polyelectrolyte theory. // Cell Biophysics. 1987. V. 11. № 1. P. 103-108.

67. Bordi F., Cametti C., Sennato S., Diociauti M. Direct evidence of multicompartment aggregates in polyelectrolyte-charged liposome complexes II Biophys. J. V. 91. № 4. P. 1513-1520.

68. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Kabanov V.A. Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of polycation // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1560. № 1. p. 14-22.

69. Yaroslavov A.A., Melik-Nubarov N.S., Menger F.M. Polymer-induced flip-flop in biomembranes. // Acc. Chem. Res. 2006. V. 39. № 10. P.702-710.

70. Yaroslavov A.A., Sitnikova T.A., Rakhnyanskaya A.A., Yaroslavova E.G., Davydov D.A., Burova T.V., Grinberg V. Ya, Shi L., Menger F.M. Biomembrane sensivity to structural changes in bound polymers // J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. № 5. P. 1666-1667.

71. Kabanov Y.A., Yaroslavov A.A. What happens to negatively charged lipid vesicles upon interacting with polycation species? // J Control Release. 2002. V. 78. № 1-3. P. 267-271.

72. Yaroslavov A.A., KuFkov V.E., Efimova A.A., Ignatiev M.O. synthetic polycations on the surface of negatively charged liposomes. // Thin Solid Films. 1995. V. 265. № 1-2. P. 66-70.

73. Yaroslavov A.A., Rakhnyanskaya A.A., Yaroslavova E.G., Efimova A.A., Menger F.M. Polyelectrolyte-coated liposomes: stabilization of the interfacial complexes. // Advances in colloid and interface science. V. 142. № 1-2. P. 43-52.

74. Menger F.M., Seredyuk V.A., Kitaeva M.V., Yaroslavov A.A., Melik-Nubarov N.S. Migration of poly-L-lysine through a lipid bilayer. // J. Am. Chem. Soc. 2003.V. 125. № 10. P. 2846-2847.

75. Yaroslavov A.A., Kufkov V.E., Polinsky A.S., Baibakov B.A., Kabanov V.A. A polycation causes migration of negatively charged phospholipids from inner to outer leaflet of the liposomal membrane. // FEBS Lett. 1994. V. 340. P. 121-123.

76. Yaroslavov A.A., Kiseliova E.A., Udalykh O.Yu., Kabanov V.A. Integrity of mixed liposomes contacting a polycation depends on the negatively charged lipid content. // Langmuir. 1998. V. 14. № 18. P. 5160-5163.

77. Gad A.E., Silver B.L., Eytan G.D. Polycation-induced fusion of negatively-charged vesicles. // Biochim, Biophys. Acta. V. 690. № 2. P. 124-132.

78. Epand R.F., Martin I., Ruysschaert J.-M., Epand R.M. Membrane orientation of the SIV fusion peptide determines its effect on bilayer stability and ability to promote membrane fusion.// Biochem. Biophys. Res. Com. 1994, 205, 3, 1938-1943

79. Martin I., Puysschaert J.-M. Lysophosphatidylcholine inhibits vesicles fusion induced by the NH2-terminal extremity of SIV/H1V fusogenic proteins II Biophys. Biochim. Acta. 1995. V.1240. № 1. P. 95-100.

80. Schroedler U.K.O., Tirell D.A. Structural reorganization of phosphatidylcholine vesicle membranes by poly(2-ethylacrylic acid): influence of the molecular weight of the polymer. // Macromolecules.1989. V. 22. № 2. P. 765-769.

81. Сухишвили C.A., Обольский O.B., Астафьева И.В., Кабанов В.А., Ярославов А.А. Интерполиэлектролитные комплексы, содержащие ДНК: взаимодействие с липосомами. // Высокомолек. Coed. А.1993, Т.43:№ 11. С. 1895-1899.

82. Ringsdorf Н., Sackmann Е., Simon J., Winnik F. Interactions of liposomes and hydrophobically-modified poly-(N-isopropylacrylamides): an attempt to model the cytoskeleton. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1153. № 2. P. 335-344.

83. Gad A.E., Silver B.L., Eytan G.D. Interaction of divalent or basic proteins with phosphatidylethanolamine vesicles. // Biochim. Biophys.Acta. 1977. V. 471. P. 372-390.

84. Uster P.S., Deamer D.W. pH-dependent fusion of liposomes using titratable polycations. //Biochemistry. 1985. V. 24. № l.P. 1-8.

85. Oku N., Shibabnoto S., Fumiaki I., Nango M. Low pH induced membrane fusion of lipid vesicles containing proton-sensitive polymer. // Biochemistry. 1987. V. 26. № 25. P. 8145-8150.

86. Zhang F., Rowe E. Calorimetric studies of the interactions of cytochrome с with dioleoylphosphatidylglycerol extruded vesicles: ionic strength effects. //Biochim.Biophys.Acta. 1994. V. 1193. № 2. P. 219-225.

87. Galla H.J., Sackmann E. Chemically induced lipid phase separation in model membranes containing charged lipids: a spin label study. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 401. № 3. P. 509-529.

88. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J. -F., Pezolet M. A fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphospha-tidylglycerol bilayers. II Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. № 1. P. 131139.

89. Shuber F. Influence of polyamines on membrane functions. // Biochem. J. 1989. V. 260. № 1. P. 1-10.

90. Onki S., Duax J. Effects of cations and polyamines on the aggregation and fusion of phosphatidylserine membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 861. №. l.P. 177-186.

91. Shuber F., Hong K., Duzgunes N., Papahadjopoulos D. Polyamines as modulators of membrane fusion: aggregation and fusion of liposomes. // Biochemistry. 1983. V. 22. № 26. P. 6134-6140.

92. Walter A., Steer G.I., Blumenthal R. Polylysine induces pH-dependent fusion of acidic phospholipid vesicles: a model for polycation-induced fusion. II Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 861. № 2. P. 319-330.

93. Oku N., Yamaguchi N., Yamagushi N.E., Shibamoto S., Ito F., Nango M. The fusogenic effect of synthetic polycations on negatively charged lipid bilayers. II J. Biochem. 1986. V. 100. № 4. P. 935-944.

94. Takahashi H., Matuoka S., Kato S., Ohki K., Hatta J. Electrostatic interaction of poly(L-lysine) with dipalmitoylphosphatidic acid studied by X-ray diffraction. II Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1069. № 2. P.229-234.

95. Kruijff В., Rietveld A., Teldress N., Vaandrager B. Molecular aspects of the bilayer stabilization induced by poly(L-lysines) of varying size in cardiolipin liposomes. II Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. № 2. P. 295304.

96. Gad E.A. Cationic polypeptide-induced fusion of acidic liposomes. // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 728. № 3. P. 377-382.

97. Gordon G. Hammes and Stephen E. Schullery. Structure of macromolecular aggregates. II. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides. // Biochemistry. 1970. V. 9. № 13. P. 25552563.

98. Carrier D., Pezolet M. Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol interactions in model membranes // Biochemistiy. 1986. V. 25. № 14. P. 4167-4174.

99. Franzin C.M., Macdonald P.M. // Biophys J. 2001. V. 81. №6. P. 3346-3362.

100. Kabanov V.A., Zezin A.B. Soluble complexes as a new class of synthetic polyelectrolytes. II Pure andAppl. Chem. 1984. V. 56. № 3. P. 343-354.

101. Vanderwerf P., Ullman E.F. Monitoringof phospholipid vesicle fusion by fluorescence energy transfer between membrane-bound dye labels. // Biochim.Biophy,s.Acta. 1980. V. 596. № 2. P. 302-314.

102. Ellens H., Bentz J., Szoka F.C. H*- and Ca2+-induced fusion and destabilization of liposomes. II Biochemistry. 1985. V. 24. P. 3099-3106.

103. Struck D.K., Hoekstra D., Pagano R.E. Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion. // Biochemistry. 1981. V. 20. № 14. P. 4093-4099.

104. Ellens H, Bentz J, Szoka FC. pH-induced destabilization ofphosphatidylethanolamine-containing liposomes: role of bilayer contact. // Biochemistry. 1984. V. 23. № 7. P. 1532-1538.

105. Murata M., Kagiwada S., Hishida R., Ishiguro R., Ohnishi S., Takahashi S. Modification of the N-terminus of membrane fusion-active peptides blocks the fusion activity. // Biochem. Biophys.Res. Commun. 1991. V. 179. P. 1050-1055.

106. Dawson C.R., Drake A.F., Helliwell J., Hider R.C. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 510. № l.P. 75-86.

107. Carrier D., Dufourcq J., Faucon J.-F., Pezolet M. A fluorescence investigation of the effects of polylysine on dipalmitoylphosphatidylglycerol bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 820. № 1. P. 131-139.

108. Walter A., Margolis D., Blumenthal R. Apocytochrome с induces pH-dependent vesicle fusion. //Membr. Biochem. 1986. V. 6. № 3. P. 217-231.

109. Wang C.Y., Huang L. Polyhistidine mediates an acid-dependent fusion of negatively charged liposomes. // Biochemistry. 1984. V. 23. № 19. P. 4409-4416.

110. Howell B.A., Chauhan A. Interaction of cationic drugs with liposomes. II Langmuir. 2009. V. 25. № 20. P. 12056-12065.

111. Mandy M.M. Oligonucleotide delivery with serum into HeLa cells using polycation liposomes. // J. App. Res. 2007. V. 7. № 1. p. 69-76.

112. Lee R.J., Huang L. Folate-targeted, anionic liposome-entrapped polylysine-condensed DNA for tumor cell-specific gene transfer. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. No 14. P. 8481-8487.

113. Lee R.J., Huang L. Lipidic vector systems for gene transfer. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1997. V. 14. № 2. P. 173-206.

114. Lasic D.D., Barenholz Y. Handbook of nonmedical application of liposomes: theory and basic science. CRC Press. Inc. 1996.

115. Posokhov Y.O., Rodnin M.V., Das S.K., Pucci В., ladokhin A.S. FCS study of thermodynamics of membrane protein insertion into the lipid bilayer chaperoned by fluorinated surfactants. // Biophys. J. 2008. V. 95. № 8. P. 54-56.

116. Muller D.J. Out and in: simplifying membrane protein studies by AFM. II Biophys J. 2006. V. 91. № 9. P. 3133-3134.

117. Fuoss R.M., Strauss U.P. Electrostatic interaction of polyelectrolytes and simple electrolytes. II J. Polymer Sci. 1948.V.3. P. 602-603.

118. Kozlova N.O. Bruskovskaya 1.В., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A., Menger F.M. Interaction of cationic polymer with negatively charged proteoliposomes. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1514. № 1. P. 139-151.

119. Szoka F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 74. P. 4194-4198.

120. Rossetti F.F., Textor V., Reviakine I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. IILangmuir. 2006. V. 22. №. 8. P. 3467-3473.

121. Кирш Ю.Э., Плужнов C.K., Шомина T.C., Кабанов В.А., Каргин В.А. Синтетические полимерные аналоги ферментов, обладающие эстеразной активностью. // Высокомолек. Соед. А. 1970. Т. 12. № 1. С. 186-205.

122. Bellare, J. R., Davis, H. Т., Scriven, L. E., and Talmon, Y. J. Controlled environment vitrification system: an improved sample preparation technique. // J. Electron Microsc. Tech. 1988 V.10. № 1. P. 87111.

123. Porter N.A., Wolf R.A., Weenen H. The free radical oxidation of polyunsaturated lecithins. // Lipids. 1980. V. 15. № 3. P. 163-167.

124. Budtov V.P., Budtova T.V., FrenkeF S.Ya. Swelling of polyelectrolyte chains on change of solution concentration. // Polymer Sci. 1990. V. 32. № 5. P. 1033-1039.

125. Perrin F. Mouvement brownien d'un ellipsoide — I. Dispersion dielectrique pour des molecules ellipsoidales. // J. Phys. Radium. 1934. V. 5. № 10. P. 497-511.

126. Shima S., Sakai H. Poly-L-lysine produced by streptomyces. Part III. Chemical studies // Agric. Biol Chem. 1981. V. 45. № 11. P. 2503-2508.

127. Binks B.P., Dekker M. Modern characterization methods of surfactant systems. 1999. NY Press. P. 147-178.

128. Kabanov V.A. Polyelectrolyte complexes in solution and bulk // Russ. Chem. Rev. 2005. V. 74. P. 3-20.

129. Lee S.Y., Jackson M.L. Surface charge density determination of micaceous minerals by U fission particle track method // Clays and Clay Minerals. 1977. V. 25. № 4. P. 295-301.