Конструирование конъюгатов синтетических и природных макромолекул при использовании обращенных мицелл в качестве микрореакторов-матриц тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

осшвскш ордена ленина, ордена октябрьской революции и ордена ТРУДОВОГО красного знамени государственный университет имени К.В.ломоносова

ХшкческиЯ фз куль тот

На правах рукописи удк 577.п2.4+541.182.6

ХРУПКАЯ Мария НихзЙлоБНа

конструирование конш'атов синтетических и природных иакрсг'олиот при использовании обращенных мяшл в качестве шшюрелкторов-млтр1щ

02.00.05 - хеши высокошлзкулярныг сседаошШ

Авторефзрат диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

• Москва - 1990

Работа выполнена на кафедрах выссисоиолекуляршя соедкш и химической энэшюлогш1 Химического факультета йосковс» государственного университета км. ¿1.В.Ломоносова.

Научные руководители: академик Б.А.Кабанов,

кандидат химических наук А.В.Кабанов

Официальный оппоненты: доктор хюнчесюа наук,

профессор В.Н.Нзшйлова

доктор химических наук профессор А.д.Берлин

Ведущая организация: Институт нефтехимического сентоэо

на заседают специализированного иовзта д.ихэ.ш.м хиыичй ским наукам при Московском государственном угашерепто ям. М.В.Ломоносова по адресу; 119899, ГСП, Москва, Ленинск горы, МГУ, Лабораторной корпус "А", кефэдрэ внсокоцолекулярЕ соединений, «удЛЗО!»

С дасовртадаей кояно ознакомиться в бпблиотс Химического факультета МГУ.

Завита состоится

■<м ча

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совете кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Задача конструирования конъюгзтов из природных и синтетических макромолекул приобрела в последнее время исключительно большое значение для медицины и биотехнологии. Широкое внедрение методов иммуноферменткого анализа и создание систем направленного транспорта лекарств в организме нуждается в эффективных способах синтеза белок-белковых конъюгатов. В свою очередь, получение конъюгатов белков с линейными полкэлектролитами необходимо для создали синтетических вакцин и лекарственных препаратов на полимерной основе.

Однако используемые в настоящее время способ» получения подобных конъюгзтов в гомогенных растворах сопряжены с принципиальными трудностями контроля глубины и направления протекания реакции. При малых концентрациях сживаемых макромолекул реакция идет с низким выходе?,и а в концентрированных растворах наряду с образованием конъюгвта нужного состава за счет побочных■мегмолекулярных сшивок часто получаются крупные нерастворимые агрегаты.

Для преодоления этик трудностей представляется перспективным в качестве реакционной среды для синтеза конъюгатов использовать микроэмульсию воды в органическом растворителе -систему обращенных мицелл поверхностно-активного вещества (ПАВ). В таких системах могут быть солюбилизоваш саше различные по природе макромолекулы. При солибилизащт макромолекулы включаются во внутреннюю водную полость мицелл, приобретая "о-Золочку" из моаослоя гидратировашюго ПАВ. Размер внутренней полости обращенных мицелл можно Овзрьировать в щпроком диапазоне (от десятка до сотен и более л). Если радиус внутренней полости достаточно велик в одной мицелле может помещаться комплекс пз нескольких макромолекул. Размер такого комплекса (а, следовательно, и размер получаемого при его сшивке конъюгата ) можно задавать изменяя размер мицзлляркей матрицы.

ОСНОВНАЯ ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в исследовании возможности использования систем обращенных мицелл ПАВ в сргзнлчес-

'ких растворителя?: в качестве реакционной среды для синтеза конъюгатов синтетических и природных макромолекул.

. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Изучены системы обращенных мицелл, содержащих различные линейные полиэлектролиты. Показано, что при солюбшшэации макромолекул во. внутренней полости обращенных мицелл происходит компактизэция полимерных молекул. На примере реакций синтеза между белками (бычьим сывороточным альбумином (БСА), а-химотрипсином (ХТ)) и антител с линейными полиэлектролитами (поликатионами . на основе поли-4-винилпирвдина и полиматакриловой кислоты) в системе АОТ (Аэрозоль ОТ, натриевая соль ди-(2-этил)-гексилового. эфира сульфэянтарной кислоты) - вода - октан показана принципиальная возможность использования системы обращенных мицелл ПАВ в качестве реакционной среда для получения конъюгатов макромолекул. Показано, что выход реакции синтеза конъюгата критическим образом зависит от степени гидратации ПАВ, параметра, определяющего размер внутренней водной полости обращенных мицелл. А именно: существует некоторое пороговое значение степени гидратации, ниже которого синтез конъюгатов практически не идет, а выше этого значения выход реакции резко возрастает и достигает 100%. Это явление объяснено на основе полученных в работе данных о структуре мицелл, содержащих линейные полиэлектролиты .

Установлено, что, варьируя размер внутренней полости мицелл, моано также контролировать состав синтезируемого конъюгата.

Предложен новый принцип гомогенного иммуноферментного анализа, основанный на использовании обращенных мицелл в качестве матриц для модуляции каталитической.- активности ферментной метки.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ, Предложенный В работе метод синтеза конъюгатов. позволяет получить с высоким . .выходом конъюгата различных по природе макромолекул заданного состава. Предложенный метод гомогенного иммуноферментного анализа позволяет регулировать чувствительность анализа в- системах обращенных мицелл, а также анализировать - водонерэстворвдне соединения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были лологтэны п обсуждены на VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной знзимологии ( Вильнюс, 1988 ), конференцию! молодых ученых Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова ( 1989 ), и Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы"( Рига, 1989 ), VI международной кнференции молодых ученых по органической химии ( Бехин, ЧССР, 1989 ), на I меадународаой иколе-сименаре молодых ученых "Нетрадиционные методы синтеза полимеров" ( Алма-Ата,1990 ).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (/¿^названия). Работа изложена на страницах,

содержит 3О рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РАЗДЕЛ Г. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В этом разделе рассмотрены фкзико-химические . свойства систем обращенных мицелл п обсуждается возможность их применения для синтеза конызгатов макромолекул. В частности анализируются данные о структуре обращенных мицелл, содержащих глобулярные белки. Рассмотрены имевшиеся в литературе данные о возможностях и перспективах применения систем обращенных мицелл в качества реакционной среды для целей органического синтеза н анализа с участием ферментов, а также для проведения процессов полимеризации. Сделан вывод о той, что в литературе практически не исследован вопрос о возмозшости протекания шзЕмакромолекулярных реакций в таких системах.

РАЗДЕЛ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В этом разделе описаны методики получения использованных

в работе поликатионов на осгове поли-4-винилпиридина (ПВП) : ПВП, алкилированного на .90%. бромистым этилом (ПВП • Rj), ПВП, алкилированного на 20% бромуксусной кислотой и на 70% бромистым этилом (mni-R1Ra), ПВП, алкилированного на 30% бромуксусной кислотой и на 60% бромистым этилом (ПВП2 • . ПВП-r1r2), полиме такриловой кислота (ПМАК), меченной дансилгидра-зином, а также, методики синтеза конъюгатов полиэлектролитоз с белками: конъюгата ХТ с ПМАК (ХТ-Ш1АК), конъюгатов ХТ с ПВП-j i<1r2, и с ilbn^rjr-j (ХТ-ПВП^ rjrj, ХТ-ПВП2- r1r2 ); конъюгатов БСА с ПВ^ rxr2 состава одна глобула белка и две глобулы белка на молекулу полимера (БСА-ПВП^ r.,r2); конъюгата ПВП^ rxr2 с антителами фракции igG (1дс-ПВП1 • R^); даны характеристики других использованных веществ. Рассмотрены также использованные в'работе физико-химические метода исследования: седашенга-ционные измерения, флуориметрия, УФ- и ИК-спектроскопия, светорассеяние и др.

РАЗДЕЛ 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 3.1. Структура обращенных мицелл, содержащих

~ ' ~ линейные полйэлектролиты.

Методом скоростной .седиментации в сканирующем режиме изучены системы ' обращенных мицелл, содержащих различные полиэлектролита. Седиментационныё кривые, наблюдаемые ' для системы обращенных мицелл, не содержащей "солюбилизованннх макромолекул, характеризуются наличием только одной границы, соответствующей пустым (т.е. не" заполненным макромолекулами) мицеллам. (Рис% 1,а). Введете в систему линейных полиэлектролитов приводит' ' к - изменению наблюдаемых седиментационвнх кривых: на седашентограммах ' проявляются '"тяжелые" (характеризующиеся более высокими коэффициентами седиментации) фракции заполненных молекулами . тлиэлектролита мицелл, рис Л, б. Доля таких мицелл'.в условиях проведения экспериментов ,йе превышала Ъ% от общего числа мицелл в системе. Для слежения за этими' фракциями, сканирование проводам на длине волны

погяощапш» солпбплпзованного шлиэлмстролита или ковалэнтно присоединенного к нему хренофорэ.

Аопт.

ед.

Рис.1. Тпшгшые седиантацнонные кривые систем обращенных шщелл : (I) не содержащих солкзбклизовзнные макромолекулы п содерзащя2(2,3) ПБП • г^п, и (4) конъюгата БСЛ-ГОШ • п.п,. Сканирование проводят при 4С0нм.(1,2) и 28С:ч. (3,4). На хрзвей 4 показана высота степеней, соотазтстЕущюс, фракциям ! (я) - легких капелл ( содвраздге кеяюгаг состава 1:1 ) п (у) - тяейлнк иацвлл ( содврпгщпх иопъзтаг состава 2:1 ).

На расуаса 2 правздзш заткгдастп коз®гарзнтов сэдимен-тацпн обргцепннх мицелл, содеряаот: пол!злектро ттн. от степени пщратацш (и0) - шлярного- ссотпоазнш? ;ПоО]/(ПЛВ} в система, параметра, опрадолящзго размер внутренней водной полости гшалл.

20

а. \

/ / ? /

3^ ' I /

X

I

I I

_)-Л_I_

р*

* /

г /

и ,л с'

20

40

О

40-

20-

/

4 У у /

М /

/■

у

< I

20

_1_

40

20г

40

Н.

X

✓ /

"I

I

_1_

о

»'А

20

40

Рис.2. Зависимости коэффициентов седиментации (е) обращенных мицелл, содержащих различные линейные полиэлектролиты от

степени гидратации: I - ПЫЫц

г - ПВП* ;

3 - сополимер

виншширролидона. и . четвертичной соли даметиламиноэтилметакри-лата (ПВПд• ПДМАЭМ • к3); 4 - полиывтакрялоиллупшин (1ШАКЛ). На рисунках приведены экспериментальные точки («), а такие теоретические кривые, соответствуйте (а)~ моделя неизменного внешнего размера н (ь> — модели индуцированного соответствия. Для сравнения показана экспериментальная зависимость б от н0 для пустых мицелл (—) и приведена шкала радиусов внутренней полости пустых мицелл (г ). Вертикальными пунктирными линиями отмечены значения критических степеней гидратации п соответствующих им критических радиусов. [АОТ] » о,х и, концентрация полиэлектролита : 0,1 - 0,4 от/мл, рн - 5,5.

Для каждого полимера на кривой зависимости коэффициента седиментации от степени гидратации шжно выделить две области, разделенные неким критическим значением нкр.

При высоких степенях гидратации ( больших критического значения и0>н ) 'экспериментальные .точки с хорошей точностью описываются теоретическая! кривыми (рис.2, ь), построенными исходя из предположения, что солвбилизация полимера происходит в соответствии с "моделью неизменного внешнего размера", рисунок 3,а.

е

б:

а:

Рис.Э. Модели солюбилизании линейных полиэлектролитов (критический радиус гс) - в обращенных мицеллах (гидродинамический радиус ле, радиус внутренней полости г ), приводящих к образованию заполненных этики макромолекулами мицелл (гидродинамический радиус кр„, радиус внутренней полости гр„). а- "модель неизменного внешнего размера": крс=яо, когда ге*гс; б- "модель индуцированного соответствия": г, >п , г «г-,

рс сз рс с

когда ге<гс.

Согласно "модели неизменного внешнего раэчора", солюбили-ззция полимеркой молекулы происходит без изкзйенчя размера и формы мицеллы, рис.3,а. При этом числе агрегации я степень гидратации ПАВ в мпцз'ллэ сохраняются, з молекулярная масса заполненной мицеллы становится равной сумме масс исходной пустой мицеллы и солюбилизованного полимера. В этом случае козффяцввят седиментации заполнения полимером мицолл («__)

р<~

шяет быть связан с коэффициентом ездиментацид пустых шщелл (О следу юз®? образом:

где м0и ve - соответственно »юлекуЛярная масса и парциальный удельный объем пустых мицелл, ар- плотность растворителя.

Такой механизм солюбилизацяи «модель неизменного внеяного размера" был обнаружен ранее для глобулярных белков [Левашов A.B. и др. Биохимия, (1982), г,4?, с.85).(рис. 3,э).

При низких степенях гидратации (меньших критического значения VJ0<KKp) экспериментальное значения коэффициентов

седиментации мицелл, содержащих линейные полиэлектролиты лехсат между теоретическими точками, рассчитанными для "модели неизменного внешнего размера" (рис.2,а) и "модели индуцированного соответствия" (рис.2,0).

Согласно "Модели индуцированного соответствия", молекула солюбилизованного полимера формирует свою собственную мицеллу, радиус и число агрегации которой равны радиусу и числу агрегации пустых мицелл при критической степени гидратации ПАВ в системе (ио= Количество молекул воды, входящих в

состав такой мицеллы, равно и опс. Коэффициент седимиатации таких мицелл выражается следующим образом :

где и II - коэффициент седиментации, молекулярная

масса, парциальный удельный объем и число агрегации пустых мицелл при критической степени гидратации (нс), а в - молекулярная масса вода.

Таким образом, при низком содержании воды в системе образуются мицеллы, содержащие полиэлектолиты, состав, размеры и форма которых отличаются от рассматриваемых в теоретических моделях "неизменного внешнего размера" и "индуцированного соответствия".

Что же происходит в критической точке, когда степень гидратации (н ) равна критическому значению (к,„)? Данные

о ку

проведенного седаыентавдонного анализа указывают на то, что при критической степени гидратации молекула солюбилизованного подизлектролита заполняет мицеллу, радиус' внутренней полости которой ( критический радиус,4 гс) ) - .в два раза меньше радиуса этого полиэлектролитз в водном раствора, содержащем 0,1 М неС1, рис 4. Это свидетельствует о коыпактизацип полимерной цепи, включенной во внутреннюю полость мицеллы.

Каждый из изученных. полиэлектролитов (ПВП • к3, ПВП • , ПМАК, ПВПд• • ПДМАЭМ* , ПМАКЛ) характеризуется с.Ю1?м значением критического радиуса. Как видно. из' рисунка 4, значения критического радиуса определяются молекулярной массой' солюбилизованного полкздектролита п^. '

Радиус(л)

100

30

60 40

20 •

И/10 о

и

2 4 5 8 10 20 40б1)

?ис.4. Зависимость критического радиуса обращенной мицелли (г-е) от срздневесовой молекулярной массы солкбилнзоваккого полпэлоктролпта :

пмак? 4-7- ИБП • я

сравнения

1 - ПМАКЛг 2 - ПВЦд.^-ПДЙАЭМ к3;

з -

1'

приведешь

ПВП.

1 '*Л' —2

(а) значения радиусов

Ш1,

ПВП,. • й1и2. Для эквивалентной

гидродинамической сфзри (пг) зтшс полиэлектролигов в водном рзсгворз (0,1!! нас1, рн 5,5), а такгэ (о) зэеиспкость молекулярной массы (нр) аффективных радиусов ряда сферических глобулярных белков (гр).

Нэблвдаемзя зависимость линэйна в логарпфмичэсгак координатах а описывается эмпирической формулой: гс(л)«о,9 " 1/3.

Такой теп зависимости (пропорциональность радиуса кубическое корня из молекулярной массы) характерен для глобулярных макромолекул.

Таким образом, обращенная иицелла мояат выступать з роли матрица, "сворачиваггцей" шпочку линейного полиэлектролита.

■Глава 3.2. Синтез коныогэтов макромолекул в обращенных

мицеллах ПШ" Зависимость

в органическом растворителе.

выхода реакции

степени

гидратации {1АВ.

В сзствкэ обращенных мицелл Аэрозоля ОТ % октане 'валя

синтезированы копъггаты следующего состава

«Л-

ХТ-ПВП,

БСА-ПВП,

я

1дн-ПВП

хт-пмак, хт-пвп

Ео

а

всех

случаях для получения конъюгатов аминогруппы белков ковалептно пришивали к карбоксильным группам линейных полизлектролигов. используя карбодишидшй котод. Гола!, входящие в состгз полученных конъюгатов, сохраняли свою функциональную активность. По данным титрования активных центров, содерзашю активного фермента , в коныогатах ХТ-ПЫАК и ХТ-ПВГМа1к2 составляло 40-50% от величины, измаранной для исходного ХТ. Полученные конъюгаты фракционировали гедь-ф£1льтрацией на тоуореаг1 т/55 (ХТ-ПМАК; БСА-ШЬ?.^) и ионообменной хроматографией на КМ-сефарозе (ХТ-ПВП-к,^; хдн-ПБП-к1Р-2). В условиях проведеняя экспериментов по гель-фшьтращш Сзлки удерживались в геле, а лияейнце полизлектролиты а их конъагаты с белками выходили из колонки в пустом объеме, рлс.5(а,б). При проведении ионообменной хро;.*,а?ограф1Ш балки, не связанною ковалентно с полиэлок-тролитом, элзафовались из колонки при низком значении ионной силы, рис.5(г). В этих условиях как нолиэлектрожт, так и конъюгат взаимодействовали с носителем - они злюировалксь из колонки при повышении конной силы, рис.5(в.г).

Поглощение на 280 км. (усл.ед.).

6-

4-

Поглощение на 280 нм. (усл.ед.).

со б А к

5 в ч А 1-У к М:

Концентрация белка (мг/ыл)

-120

--60

[1!аС1] (ШЛЬ/Л ) 0.6

0.4

0,2 Уо,объс5: ЭЛВДИИ, I*-*!.

Рис.5. Фракционирование конъюгатов и смесей белков с линейными полиэлектролитаьш гель-фильтрацией на тоуореаг1 ли 55 (а,0); ионообменной хроматографией на ки-сефэрозе (в,г).(а):

(б): сыась ША-ПВП'К^; (в): гапьюгат (г): смесь ХТ-ПВП • . I- поглощение на 2801Ы; 2- концентрация БСА; 3-активность ХТ; 4- концентрация яасг.

конъюгат ЕСА-ПВЛ-к^,•

ХТ-ГЕП-и^;

Из основании результатов зро^атографических экспериментов Сидя определены выхода реакций синтеза конъюгатов в система обращенных ;.тадедл. Как видно из данных, приведенных на рис.6, глходо рэпкдаи зависят, от степени гидратации и . Эти зависюло-стп нмзпт критический характер - реакции синтеза конъюгатов в с-тих системах практически не идут при низком содержании воды в система, однако при степенях гидратации, больиих некоторого порогового значения, шход реакция резко увеличивается и достигает 100%.

Пороговые значения степеней гидратации отличаются для разных конъюгатов, (рис.6). Так, например, при "0=25 синтез хонъзогата ХТ-ГШ-п.^ практически не идет, в то время как реакция синтеза хонъвгата ХТ-1ШК протекает в этих условиях нацело.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что замена гомогенного водного раствора на систему обращенных мицолл позволяет существенно повысить выход этой реакции. Бри синтезе конъюгатов белков с линейными полиэлектролитами с использованием карбодаимидаого метода в водной сродо выход реакции не превышает 5-10%. Изученные в настоящей работе конъюгаты были синтезированы с выходом близким к 100%. Необходима', условием для достижения высокого выхода является проведение реакции 1фн степенях гидратации, превосходящих пороговое значение.

выход,

10

выход,

100

—I—1"Н?—1~г!—I—Нге'А

г , а

20 ЛО О 20 40

Глс.6. Зазпсэюсть ипсода реакций синтеза конъюгатов. а:

о

2Т-1Ш{, (о) - ХТ-ПВП*я1л2 я б: (*) обращенных шцелл Аэрозоля ОТ з октане от степени гидратации

БСА-ПВП-в системе

(*?0). Для сравнения приведена шкала радиусов внутренней полости мицелл (ге). На шкале ио вертикальными стрелкам отмечены пороговые значения степеней гкдраташш, юше которкх реакции синтеза соответствующих конысгагов не идут. К а шкало гв вертикальными стрелками отмечены радиусы тлекул: (I) - П н (3) - БСА, а также критические радиусе: (2) - 1ЖАК и (4)

- ПБП*К1Е2 (Пу=137000).

Глава 3.3. Обращенные мицеллы как матричные ьажрорзактора.

Проведенное вша рассмотрение механизмов сол^Силпзацпи макромолекул в обращенных мицеллах (рис.З.) позволяет объяснить критический характер зависимостей выхода реакций синтеза конъюгатов макромолекул от степени гкдраташш.

Как видно из рис.6, конъвгатн ие образуются прн- степенях гидраташш меньших соответствующих пороговых значений: 20 (ХТ-ПМАК) ЕЛН 30 (ХТ-ПБП •к1к2; БСА-ПБП • д1йа). В этих условиях макромолекулы ПМАК (ис-ао) и ПВП • (мс»зо)

компактно свернуты и плотно зажаты мицзллярной матрицей (см.также рис.З). В содержащих эти полиэлектролитн мицеллах не могут поместиться объемные молекулы белков < ХТ - гр® 25 & и БСА - грю 34 & ). Поэтому сшиваемые иакроюлекули не реагируют с образованием конъюгатов.

При степенях гидратации, больших пороговых, «0>25 (ХТ-ПМАК) или яо>30 (ХТ-ПВП • ; БСА-ПВП • к^) мицеллы, по-видимому, становятся достаточно большими, чтоба шзстшь. тявкуш белков и, как видно из рис.6, происходит образовать соответствунзда конъюгатов.

Такое предположение подтверзэдается результатам эксперимента по изучению взаишдействия меченых флуоресцеиназотноцио-- катом (ФйТЦ) молекул БСА с ПВП^ кгк2 в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Известно, что кватернизованннй полл-4-вшпшшридин является тушителем флуоресценции. При смешении раствора ФИТЦ-меченого БСА с раствором ПВП1» (рк 9,5) происходит быстрое (десятки секунд) образование комплекса БСА-ПВП1 • сопровождающееся снижением интенсивности

флуоресценции. Значение интенсивности флуоресценции, измерен-

поз после завершения реакции, зависит от концентрации ПВП^ к1й2: при насыщающих концентрациях ПВП1- к1и2 она составляет 50% от интенсивности флуоресценции свободного БСА-ФИТЦ.

Аналогичная картина наблюдается и при смешении мицел-лярных растворов БСА-ФИТЦ и ПВП1 • рис.7, кривая I.

Рис.7. Тушение флуоресценции БСА, меченного ФИТЦ в присутствии ПВП^н^ (0,1 М АОТ; 10~2М борат-ный буфер, рН 9.5). Значение интенсивности флуоресценции измерено через 1.5 часа,(ио-зо(х), и -20(11}) после смешения растворов БСА-ФИТЦ

и ПВП,' й,^, а =498нм, л -517нм; 1 12. вх ев '

[БСА]=6 «10 М.

Принципиальным является то обстоятельство, что равновесное значение флуоресценции ' БСА-ФИТЦ зависит от степени гидратации, рис.7. При wq<oo (т.е. в условиях, когда радиус внутренней полости мицелл меньше критического радиуса ПШ£ соответствующий конъюгат не образуется) флуоресценция БСА-ФИТЦ при введении в систему ПВП^ r1r2 не изменяется, рис.7, кривая Z. При 1<о>зо наблюдается резкое "снижение интенсивности флуоресценции, свидетельствующее об образовании комплекса БСА с ПВП^ r1r2, рис7, кривая I.

Следует, очевидно, допустить, что размер мицеллярной матрицы может влиять не только на выход, но и на состав синтезируемых в системе обращенных мицелл конъюгатоп. Возможность регуляции состава была изучена на примерз синтеза конъвгата, ВСЛ-ПВПг • u r .

Для анализа состава коныогатн. включенные в системы обращенных мицелл, исследовали методом скоростной седиментащш.

Па рис.1, (кривая- 4) приведена типичная седиментограмиа систем обращенных мяшлл, содержащей конъкгат БСА-ПШ!^ IIa седиментограмме сзнеруяптолпсь дво ^.туиг-на. соответг-трушкв

80

40

ii

\

J_I_I-1_

10 7 10 (ПВП:К,R_]

двум фракциям мицелл, заполненных конъюгаташ различного состава. Молекулярные массы солюОилизовашшх конысгатов, рассчитанные из коэффициентов седиментации мицелл "легкой" и "тяжелой" фракции, составили -гозооо ("легкие"* мицеллы) и -269000 ("тяжелые" мицеллы), что соответствует составам БСАгПВГ^ • 1г1Р? - 1:1 и 2:1. Относительное содержание этих конъюгатов в исследуемом образце БСА-ПБГК*г^к, определяли по высотам соответствующее 'ступеней на седиментограмме, рис.1., (кривая 4).

Как видно из'данных, приведенных на рисунке 6,6, состав синтезируемого в системе обращенных мицелл конъюгата задается степенью гидратации ПАВ в реакционной системе. Иными словами, обращенные мицеллы могут выступать в роли матричных микрореакторов для синтеза конъюгатов заданного.состава.

Глаза 3.4. Гомогенный вммунофементный анализ в системе обращенных мицелл^

На примере системы пероксидаза (ИХ) - тироксин (Т4) - антитела к тироксину (АТТ4) была показана возможность проведения иммуноферментного определения Т4 в системе обращенных мицелл.

Известно, что каталитическая активность солвбилизовашшх ферментов существенным образом зависит от степени гидратации -эти зависимости имеют колоколообразный вид, т.е. существует степень гидратации, при которой каталитическая активность ССермента максимальна. На рисунке 8, кривая а, приведена зависимость каталитической активности конъюгата ПХ с Т4.

Рис.8. Зависимость каталитической активности конъюгата ПХ с Т4 от степени гидратации • в системе обращенных мицелл АОТ в октане, не содержащей (а) и содержащей (б) антитела к Т4. ( 0.1 М АОТ; [ПХ"Т4)=0.55 НМ; £АТ]=35 нМ; t « 26 с). Пунктиром показан уровень каталитической активности конъюгата ПХ с Т4 в водной растворе (50 мИ имидазольный буфер рН=7).

о. 5-<

Р

¡пгГ..

II ' ч I 35 45 55

[к20]/(аот]

¿¡ля scez £ор:лентов этот максимум обнаруживается при условии геометрического соответствия радиуса внутренней полости мицеллы радиусу белковой глобулы. При добавлении АТ к солвОшшзоваштому з .системе обращенных мицелл конъюгату фермента-метки .с антигеном происходит образование иммунного комплекса, размер которого существенным образом отличается от размера свободного (но связанного с антителами) конъвгзта. Поэтому происходит изменение наблюдаемой зависимости - сдает профиля каталитической активности в сторону больших степеней гидратации, соответствующих более крупным шцеллзм (рис.8, кривая б). Следует от»двтять) что в присутств!Ш неспецифичных к тироксину антител или нормальной сыворотки зависимость каталитической активности кокыогата пероксидазы с тироксином от степени гидратации в системе обращенных мицелл не изменяется.

На рисунке 9,а приведена калибровочная кривая зависимости каталитической активности конъвгэта от концентрации антител к тироксину при фиксированной степени гидратации. Из этих данных видно, что при нашщавдей концентрации антител активность хоньвгата снияается более чем-на 85% по сравнению с исходным уровнем. Добавление к системе избытка свободного тироксзша приводит к вытеснению конъвгата из комплекса с антителами и, как следствие, восстановлении его активности до первоначального уровня (рис.9,0). Таким образом, предложенный подход может Сыть, использован для определения концентрации свободного тироксина (рис.9,б).

{lga], нУ. [тироксин], нМ.

Рис. 9. Зависимость катактической активности коныогзга ПХ с

Т4 в системе обращенных мицелл АОТ в октанз от концентрация: антител к Т4 -в; от концентрации свободного Т4 -б.(0,1М АОТ, ко=37.5; [ПХ-Т4)=0,55нМ -а; [ПХ-Т4]=1 ЛнИ -б; [АТ]=35 кМ, fc=2£? С ).

Следует подчеркнуть, что в гомогенном водном растворе каталитическая активность коньюгата не изменяется в присутствии антител. Иными словами, в patacas предложенного повода принципиальным является наличие мицзллярной матрицы. наполняющей роль модулятора каталитической активности ©зрлвнта. Чувствительность анализа в системе обращенных мицелл иокно варьировать, изменяя степень гидратации (размер ыкцеллярпоп матрицы), см. рис.8.

Одно из ключебы:: достоинств cueiei: обращенных мзцеля' заключается в том, что в них в стг-^дзртЕш: условиях шгут быть солюбилизовзш саше различные по природа вещества. Это позволяет рассматривать их как пзрсдактпЕзуэ раакдаоннув сроду для конструирования систем гшыунофзршнтного анализа водонера-створкмых соединений. ■•

■ вывалы

1. Изучены систеьаг обращенных шцэлл,. содаркзашэ различные полиэлектролиты. При использовании метода скоростной седиментации показано, что кслячешю, во внутреншео полость обращенных мицелл молекул лннейных полизлектролЕТов мо&уг приводить к их компактизацш.

2. В качества реакционной сроды для получения каиъагатов макромолекул впервые предлолзно использовать система обращенных мицзлл ПАВ в органическом растворителе. В система обращенных мицелл Аэрозоля ОТ (ди-2-этилгокс11лсульфэсукц."шах натрия) в октане с выходом близким к Г00% были синтезированы конызгатн динейних полиэлектролитов (ПМАК; ПВП-й^) с белками (ХТ, БСА, антитела igG). •

'3. Обнаружено, что выход реакции синтеза конъюгатов критическим образом зависит от степени гидратации ПАВ (wQ),

параметра, определяющего радиус внутренней полости обращенных мицелл. Эта зависимость объяснена в терминах геометрического соответствия размеров мицеллярной матрицы и сшиваемых макромолекул: при низких значениях wQ, размер мицеллы слишком мал для того, чтобы в.ней могли одновременно поместиться сшиваемые макромолекулы, и синтез конъюгата не идет. Выход реакции резко увеличивается и достигает - хоо% при увеличении wQ, в условиях, когда мицеллы становятся достаточно 'большими, чтобы вместить сшиваемые макромолекулы.

4. Показана возможность регуляции состава конъюгэтов макромолекул (линейных полизлектролитов с белками) изменением размера мицеллярной матрицы.

5. Предложен новый принцип гомогенного иммуноферментного анализа в системах обращенных мицелл ПАВ в органическом растворителе, основанный на использовании мицеллярной матрицы для модуляции каталитической активности ферментной метки. Возможности принципа продемонстрированы на примере системы для определения тироксина.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях :

1. Кабанов A.B., Алахов В.Ю., Клинский Е.Ю., Хруцкая М.М., Рахнянская-A.A., Полянский A.C., Ярославов A.A., Северин B.C., Кабанов В.А., Левашов A.B. Конструирование конъюгатов природных и синтетических макромолекул при - использовали обращенных мицелл как микрореакторов // ДАН СССР, сер. Биохимия. -1988. -Т.302. —N.3. -С.375-379.

2. Кабанов A.B., Наметкин С.Н., Хруцкая М.М., Клинский E.S0., Алахов" В.Ю., Левашов A.B. Биохимический дизайн макромолекул. Транспорт белков и" их регуляция // Материалы vi Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". Вильнюс. -1988. -4.1. -С.24.

3. Хруцкая М.М., Кабанов A.B., Левашов A.B. Контролируемый синтез конъюгатов .белков и лилейных полиэлектролитов в системах обращенных мицелл // Материалы хх Всесоюзной

конференции "Интерполимерные комплексы". Рига. -1989. -С.303.

4. Кабанов А.В., Хруцкая Ы.М., Будавари М.И., Б^емин С.А., Клячко Н.Л., Левашов А.В. Гомогенный иммуноферментный анализ в системах обращенных мицелл поверносгно-активных веществ в органических растворителях // ДАН СССР, сер. Биохимия. -1989. -Т.305. -N.5. -С.1253-1255.

5. Хруцкая М.М. Использование обращенных мицелл для синтеза конъюгатов макромолекул и имыуноферментного анализа // Материалы конференции молодых ученых хим. фак. МГУ. Москва. Деп. в ВИНИТИ -1989. -н.5358. -4.2. -С.85-88.

6. Khrutskaya М.М. Reversed micelles as microreacfcors-raatrices for synthesis of conjugates of nacronolecules and for enzyme immunoassay // Vl-th International conference of young scientists on organic and bioorganic chenistry. Bechyne. CSSR. -1989. -P.99-100:

7. Хруцкая М.М. Синтез конъюгатов белков с полиэлектролитамя в обращенных мицеллах ПАВ в органическом растворителе // Материалы х конференции молодых ученых "Синтез й исследование биологически активных соединений". Рига. -1989. -С.127.

8. Kabanov А.V., Khrutskaya U.K., Klyachko N.L., Levashov A.V. h new way in homogeneous immunoassay : reversed micellar systems as a medium for analysis // Analytical Biochem. -1989. —V.181. -P.145-140.

9. Khrutskaya K.H. Synthesis of macromolecules conjugates ir the system' of reversed. micelles of surfactant in organic solvents // I-th International school-seminar "Non-traditional methods of polymer synthesis", Alma-Ata. -1990. -P.124-125.

10. Kabanov К.Ч., Levashov A.V., Khrutskaya H.M., Kabano\ V.A. Tailoring of macromolecule conjugates using reverset taicellea as matrix nicroreactors // Macromol.Chem. -1990 -V.33 -P.279-291.

11. Khrutskaya И.И. Intermacromolecalar reactions in th< reversed micelles // VH-th International conference of youn scientists on organic and biological chenistry. Sofia. -1990 -P.2S-27. ',« '

'¡Lit'