Лазерно-флуоресцентные малоинвазивные методы дозиметрии распределения света и концентрации глюкозы в биологических тканях тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

На правах рукописи

Лощенов Максим Викторович

Лазерно-флуоресцентные малоинвазивные методы дозиметрии распределения света и концентрации глюкозы в биологических тканях

Специальность 01.04.21 - лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Центре естественно-научных исследований Института общей физики им. A.M. Прохорова РАН

Научный руководитель:

Кандидат физико-математических наук, Стратонников А. А.

старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, Кашкаров П. К.

профессор

Кандидат физико-математических наук Зубов Б.В.

Ведущая организация Московский государственный институт

радиотехники, электроники и автоматики (технический университет)

Защита диссертации состоится 24 апреля 2006 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.063.02 в Институте общей физики им. A.M. Прохорова Российской академии наук по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.38, корп. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОФ АН.

Автореферат разослан

11

марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Макаров В.П. т. 132-83-94

Общая характеристика работы

Актуальность темы'

В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение малоинвазивные1 лазерно-спектроскопические методы исследования и диагностики патологий в различных тканях

Одной из наиболее важных проблем является проведение точной пространственной дозиметрии и мониторинга распределения лазерного излучения внутри биологической ткани в процессе фотодинамической терапии (ФДТ) Связано это с тем, что в последнее время в фотодинамической терапии все больше используются фотосенсибилизаторы (ФС), имеющие низкий контраст накопления в опухоли относительно нормальной ткани2 В этом случае лазерное излучение должно доставляться так и в том объеме, чтобы не повредить здоровые ткани, особенно жизненно важных органов Особую актуальность задача приобрела при все более широком внедрении ФДТ в лечение внутритканевых глубокозалегающих опухолей, соседствующих с жизненно важными органами При лечении рака предстательной железы, который в настоящее время выходит на первое место среди онкологических заболеваний у мужчин, с помощью ФДТ, очень важно, чтобы лазерное излучение не повредило расположенную рядом уретру, являющуюся легко повреждаемым жизненно важным органом С другой стороны, если доза лазерного излучения окажется ниже пороговой величины для ФДТ в какой-либо части опухоли, то раковые клетки останутся жизнеспособными и, с высокой вероятностью, вызовут рецидив, что недопустимо.

Другой актуальной проблемой, которой посвящена вторая часть работы, является малоинвазивная диагностика и мониторинг сахара в крови человека, особенно, у людей, страдающих сахарным диабетом. По данным ВОЗ, в России диабетом в той или иной форме страдают приблизительно 4,6 млн. чел. (по состоянию на 2000 год), и это число продолжает расти. Больные диабетом должны регулярно (минимум 2 раза в сутки) измерять уровень сахара в крови. В настоящее время для этого используется метод прокола пальца ланцетом и анализ полученной капли крови. Эта процедура болезненна, неудобна, может вызвать проникновение инфекции, а вид крови у многих (особенно у детей) вызывает стрессовое состояние. Актуальность предлагаемого в работе малоинвазивного и бескровного метода получения и анализа малых капель межклеточной жидкости не вызывает сомнений.

' от англ. minimal invasive, группа методов в медицине, отличающаяся минимально возможным повреждением ткани при проведении процедуры.

2 фотосенсибилизаторы сосудистого механизма действия, в частности,

Тукад, Вгоудин и прочие.

библиотека I

I С. Петербург^ У П> I

Цель исследования

Основной целью диссертационной работы является развитие малоинвазивных методов дозиметрии пространственного распределения плотности мощности света при лазерном облучении биологических тканей в процессе фотодинамической терапии и малоинвазивных методов дозиметрии содержания глюкозы в крови путем лазерной перфорации кожного покрова и анализа межтканевой жидкости с помощью лазерно-флуореценттной спектроскопии.

Задачи исследования

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи

1. Разработка, расчет, моделирование и экспериментальные исследования оптоволоконных флуоресцентных многосенсорных зондов с пространственно разнесенными флуоресцентными метками (локационными флуорофорами, ЛФ) для контроля пространственной плотности мощности лазерного излучения с длиной волны 670 нм (широко применяемого при ФДТ), возбуждаемых этим излучением и обеспечивающих, за счет спектральных различий флуоресценции используемых ЛФ, возможность определения парциальных вкладов каждого из них.

2 Разработка физической модели и математического алгоритма для расчета пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани из спектрально-флуоресцентных данных, полученных с оптоволоконных зондов.

3. Разработка многоканальной волоконно-оптической регистрирующей системы для исследования спектров излучения, выходящего из оптоволоконных зондов, и специального математического обеспечения для сбора и обработки получаемых спектральных данных.

4 Проведение модельных и экспериментальных исследований по определению плотности мощности лазерного излучения в тканях предстательной железы экспериментальных животных в процессе ФДТ

5. Экспериментальное исследование взаимодействия с поверхностью кожи лазерного излучения с длиной волны 2 9 мкм, имеющего различную длительность и энергию импульсов.

6. Исследование методами лазерно-флуоресцентной спектроскопии процессов, происходящих при взаимодействии глюкозы в хроматографической бумаге, пропитанной специальными химическими реагентами.

7. Спектрально-флуоресцентное определение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости человека, полученной при лазерной перфорации кожи.

Научная новизна исследования

• Впервые проведены исследования, показывающие принципиальную

возможность определения пространственного распределения света в биологической ткани с помощью моноволоконного датчика с 4-мя разными флуорофорами путем одновременной передачи флуоресцентного сигнала от них по одному оптическому волокну с возможностью последующей дешифровки вклада каждого из флуорофоров в общий спектр при возбуждения флуоресценции флуорофоров внутри биологической ткани, облучаемой светом низкой интенсивности.

• Впервые метод спектральных координат применен для расшифровки

спектральных данных, получаемых с флуоресцентных зондов, и формализации спектральных данных лазерно-флуоресцентных исследований различных опухолей пациентов при ФДТ.

• Обнаружен и изучен эффект образования капли внутритканевой жидкости

на поверхности из кратера, образованного при перфорации верхних слоев кожи лазерным импульсом, без повреждения капиллярного русла.

• Методами лазерно-флуоресцентного анализа была изучена кинетика

протекания реакции глюкозы, содержащейся в межклеточной жидкости, с химическими реагентами (Amplex Red, кислород, глюкозоксидаза, пероксидаза), результатом которой является сильнофлуоресцирующее вещество резоруфин.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, существенно улучшают качество дозиметрии ФДТ и позволяют оптимизировать процесс ФДТ с тем, чтобы, с одной стороны, уменьшить количество возникновений рецидивов, а, с другой стороны, не повреждать жизненно важные органы, находящиеся в непосредственной близости от опухоли. Созданная в рамках работы установка является прототипом системы для клинического применения.

Разработанная методика определения концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости может послужить основой для создания клинической диагностической малоинвазивной системы измерения сахара в крови человека.

Разработанное в процессе выполнения данной работы программное обеспечение по получению и разностороннему анализу и формализации спектральной информации нашло широкое применение в различных областях спектроскопии, вошло в стандартную комплектацию серийного спектрометра ЛЭСА-01-Биоспек и успешно функционирует в более чем 20-и лабораториях России, а также в Канаде, Словакии, США, Южной Корее, Польше.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (Санкт-Петербург, 2001), Международном симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан-Хосе, США, 2001), десятом Конгрессе Европейского Фотобиологического Общества (10 Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 6-11, 2003), Международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике (Saratov fall meeting 2005, Саратов, 2005), Международной конференции Photonics in Medicine, (Торонто, Канада, 13-14 сентября, 2005).

Публикации По результатам диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, включая патент РФ (№2258452 от 20.08 05 с приоритетом от 03 09.03), две статьи в рецензируемых изданиях, 3 статьи в иностранных журналах, 5 публикаций в материалах российских конференций и 3 публикации в материалах зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации' Диссертация состоит из введения и 5-и глав Содержание диссертации изложено на 125 страницах, иллюстрировано 48-ю рисунками Список цитируемой литературы включат 107 источников. Приводятся 2 приложения общим объемом 28 страниц, иллюстрированные 12-ю рисунками.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, ее новизна и практическая значимость, определена цель работы, представлены основные результаты, полученные в ходе выполнения работы, и рассматривается краткое содержание диссертации.

В Главе 1 приведен обзор литературы по тематике дозиметрии ФДТ и малоинвазивным методикам исследования различных биологических тканей. Приведен обзор последних достижений в области дозиметрии сахара в крови. Показана значимость и своевременность проведенного в работе исследования

Установка для дозиметрии распределения плотности мощности лазерного излучения в биологической ткани.

Глава 2 полностью посвящена созданию аппаратуры и метода точного определения пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани путем флуоресцентного кодирования данных о плотности мощности в толще биологической ткани, для чего была создана установка, приведенная на Рис 1 Лазерное излучение с использованием диффузного рассеивателя доставляется в биологическую ткань. Для генерации излучения используется полупроводниковый 6-канальный лазер 670нм с максимальной мощностью 600мВт на канал, т. к в случае ФДТ простаты используется 6 диффузоров.

Компьютер

Полупроводниковый ' 670 нм

р»

Линейная комбинация флуоресценции сенсоров света лазера, флуоресценции фотосенсибилиэатора и автофлюоресценции ткани

1024 пике

Рис. 1. Схематическое изображение установки для контроля плотности мощности света в биологической ткани.

Пройдя ткань, излучение попадает на флуорофоры, нанесенные на оптическое волокно. Все флуорофоры, нанесенные на одно волокно имеют высокий квантовый выход, разные спектры флуоресценции, пик поглощения в области излучения лазера (670 нм) и длинную стоксову компоненту, что позволяет им поглотить излучение диффузора и испустить люминесценцию внутрь волокна зонда. Суммарное излучение, спектр которого представляет собой линейную комбинацию спектров флуорофоров с коэффициентами, пропорциональными поступившему от диффузора излучению, поступает через фильтр, подавляющий лазерную линию, на спектрометр.

Флуорофоры.

Локационные флуорофоры, наносимые на волокна-зонды, состоят на 99% из клея, затвердевающего при УФ - облучении, и на 1% из сильно флуоресцирующего вещества.

На Рис 2 схематически приведена схема одного зонда на примере 2-х флуорофоров. Флуорофоры подобраны таким образом, чтобы давать высокий квантовый выход флуоресценции при возбуждении в области длин волн используемого лазера Кроме того, их спектры должны достаточно различаться, чтобы позволить осуществить декомпозицию суммарного спектра на парциальные вклады составляющих его спектров Из матрицы ковариаций коэффициентов корреляции были выбраны вещества с

максимально отличающимися спектрами флуоресценции, а именно, красители с кодами Р (ADS745HT), F (LDS 821), D (ADS68OHO), N (Nile Blue 690 Perchlorat), L (LD 800), спектры флуоресценции которых приведены на Рис. 3.

Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли.

Поскольку спектры ЛФ не очень сильно отличаются друг от друга, в том числе по причине ограничений,

связанных с применением в медицинской промыш-

ленности, то необходимо разрабатывать специальные методы декомпозиции спектров. Анализируемый спектр в необходимо разложить на четыре спектра ЛФ или представить этот спектр в виде линейной суперпозиции спектров 4 ЛФ.

Диффузор

Рис. 2 Принцип действия флуоресцентного зонда на примере двух флуорофоров.

О)

S = aiSj+ a2S2+ a3S3+ mS4, ИЛИ 5 = j] ■а,5,.

i-i

Для этого была разработана модификация метода спектральных координат (МСК).

Если умножить обе части уравнения (1) на частоту перехода f и проинтегрировать по всему спектру, уравнение принимает вид:

J/"5(/>f = ¿aJ/"5I(/)r. (2)

В левой части этого равенства стоит момент и-го порядка анализируемого спектра, а справа стоит линейная комбинация этих же моментов с парциальными коэффициентами а„ величины которых надо определить Пусть отношение интегралов определяет относительные спектральные координаты каждого ЛФ.

' ~ \rs{f W ■ (3)

Откуда основное уравнение декомпозиции:

Или в матричной форме = 7,

(5)

Уравнение представляет систему уравнений с неизвестными коэффициентами аь где А - вектор - столбец парциальных коэффициентов ЛФ, М- матрица относительных величин спектральных моментов или спектральных координат, Г- вектор - столбец с единичными элементами.

Калибровка прибора

Для калибровки прибора был разработан специальный блок, состоящий из интегрирующего цилиндра и двух трубок внутри (Рис. 4).

В отверстие для подачи света подается свет с длиной волны 670 нм. В непрозрачную трубку с прорезью помещается зонд с ЛФ и, посредством шагового двигателя, с равномерной скоростью извлекается из цилиндра так, что все ЛФ последовательно проходят под прорезью Регистрирующая система сохраняет все полученные р процессе движения спектры. Амплитуда спектров, полученных в то время, когда какой-либо из ЛФ был максимально освещен, выше, благодаря чему, из общей массы спектров, с использованием специально разработанного программного обеспечения, вычисляются спектры ЛФ, путем интегрирования группы спектров, относящихся к заданному ЛФ.

еда 700 710 720 730 74а 750 760 77а 780 790 800 810 820 830 840 Ш№е1елд№ пт

Рис. 3. Красители, выбранные как сенсоры для построения системы.

Лазерное излучение 670 нм

Ингтегрирующий циллиндр"

Непрозрачная У^У^ трубка

Шаговый двигатель

г

Прорезь Прозрачная трубка

Управляющие сигналы из компьютера

Рис. 4. Схема установки для калибровки флуоресцентных зондов.

После того, как получены формы спектров флуоресценции ЛФ, зонд помещается в прозрачную трубку и, при известной плотности мощности излучения внутри цилиндра, снимается суммарный спектр со всех ЛФ. Такой спектр будет представлять линейную комбинацию всех измеренных шагом ранее ЛФ только с неизвестными коэффициентами.

(Я) (6)

1-1

Где Злили -суммарный спектр, снятый с зонда в прозрачной трубке и бдли' ] - спектры, полученные интегрированием группы спектров для заданного ЛФ. После определения /с, и зная величину плотности мощности света внутри интегрирующего цилиндра, спектры каждого из флуорофоров преобразуются следующим образом:

зм^ЗмгМУ^ <7>

Где Цг - известная плотность мощности внутри интегрирующего цилиндра. Очевидно, что такой спектр (Я) будет соответствовать плотности мощности равномерного освещения ЛФ в 1 Вт/см2 и изменяться линейно вместе с поданной на ЛФ плотностью мощности.

Верификация применимости сконструированных зондов

В Главе 3 приводятся результаты исследований свойств самой системы и пример эксперимента на животном. Для проведения измерений было разработано специальное измерительно-аналитическое программное обеспечение, позволяющее полуавтоматически снимать спектры, как в рабочем, так и в калибровочном режимах, с возможностью построения временных карт интенсивности. Такая карта представляет собой плоскость где по оси X отложено время (в случае калибровки - шаги двигателя, в рабочем режиме - единицы времени), по оси Г длины волн а под цветом каждой точки - интенсивность, всего 512 градаций от синего к оранжевому.

Из Рис. 5 а) видно, что, несмотря на фильтр, небольшое количество лазерного излучения проходит в насечки, причем, это количество не велико.

Рис. 5. Калибровочные карты а) волокна с четырьмя пустыми насечками и срез на длине волны 670 нм., 6) во вторую насечку нанесен флуорофор, 1-я, 3-я - клей и 4-я насечка не заполнена и интегральный срез на длине волны от 640 нм до 900 нм.

По оси X отложены шаги двигателя, по оси У длины волн, интенсивность закодирована цветом соответствующей точки.

Для количественной оценки возможного эффекта возбуждения флуоресценции соседних сенсоров светом, проникшим в насечку на волокне, или «растекания», был проведен следующий эксперимент, на волокно с четырьмя насечками в одну из насечек был нанесен флуорофор (во 2-ю с дальнего от спектрометра конца). Результаты эксперимента приведены на Рис. 5 б). Свет, попавший через щель непосредственно на флуорофор (2-я насечка) вызвал отчетливый сильный флуоресцентный сигнал, тем не менее, ограниченный геометрией сенсора. Эффекта «растекания» почти не наблюдается. Из Рис. 6. видно, что в «худшем» случае интенсивность флуоресценции, возбужденной через соседние насечки, составляет не более 3% от интенсивности флуоресценции в самом флуорофоре.

■ 12 -

л

6

I ' • hoe-

¡¡06-(I

J » 04 ■

02- _

on 0029 001

о -

1-я насечка 2-я насечка 3-я насечка 4 я насечка

Рис. 6 Диаграмма интегральных значений спектров по длине волны в точках максимума флуоресценции.

Модельные эксперименты.

Следующим этапом исследования было измерение реальных спектров флуоресценции, излученной нанесенными на зонды флуорофорами Были взяты сенсоры N. Б, Ь, Р. Далее была проведена калибровка стандартным способом с использованием непрозрачной трубки с прорезью. На Рис 7 а) приведена калибровочная карта, обработанные спектры индивидуальных флуорофоров приведены на Рис. 7 б) Как видно из рисунка, все сенсоры отчетливо просматриваются на карте, также видна и подавленная фильтром лазерная линия (670 нм), которая возрастает от сенсора к сенсору с приближением к спектрометру.

Зонд N сенсор О- сенсор I. сенсор Р сенсор В пи ней ной шкапе

Рис. 7. Данные модельного исследования, а) Калибровочная карта зонда с четырьмя сенсорами 1\'-0-Ь-Р. По оси X отложены шаги шагового двигателя, по оси У длины волн, интенсивность закодирована цветом соответствующей точки. На графике ниже приведены срезы карты на длинах волн 760нм и 700нм (черная и красная линии) и интегральная линия, точки которой соответствуют суммам интенсивностей от 700 до 760 нм; все линии нормированы, б) Индивидуальные спектры флуорофоров, полученные путем сложения всех спектров каждого ЛФ,

зарегистрированных в процессе калибровки зонда в непрозрачной трубке с прорезью, в) Коэффициенты, полученные в результате расчета 100 модельных спектров с 5% белым шумом.

График на рисунке демонстрирует, что интенсивность, взятая на 2-х характерных длинах волн, равномерно возрастает с приближением сенсора к прорези внутри непрозрачной трубки, а затем достаточно равномерно убывает. Некоторым исключением является сенсор Ь, интенсивность

которого убывает неодинаково на разных длинах волн с изменением угла падения света на сенсор внутри непрозрачной трубки. Таким образом, в этом случае был зарегистрирован эффект перепоглощения. Чтобы максимально нивелировать этот эффект, было решено в качестве исходных спектров сенсоров брать суммарные спектры, те для данного случая: от 130-го до 140-го шага для И, от 160 до 175-го шага для Б, от 200 до 220-го шага для Ь и от 230 до 245-го шага для Р.

С целью проверки устойчивости метода к шумам был проведен модельный эксперимент Спектры были сложены с коэффициентами 0,2, 0,3, 0,4 и 0,1 для сенсоров И, Ь, О и Р соответственно. К получившемуся таким образом спектру был прибавлен белый шум с амплитудой 5% от максимума суммарного спектра. Такая процедура была проведена 100 раз, и каждый раз случайный шум генерировался заново. Далее каждый из спектров был разложен с помощью измененного МСК (Рис. 7 в). Как видно из рисунка, результат достаточно стабилен.

Опыты на экспериментальных животных.

На экспериментальном животном (собаке, т.к. размер простаты собаки близок к размеру простаты человека) метод был апробирован в Медицинском Университете Толедо, США

Зонд был погружен в сенсибилизированную простату собаки в процессе ФДТ с использованием лазера 670нм. Было снято 32 спектра с интервалом 30 сек , некоторые из них приведены на Рис 8 а). Как видно из карты эксперимента, приведенной на Рис 8 б), в процессе ФДТ спектры имеют тенденцию к затуханию. На Рис. 9 приведены значения плотностей мощности во времени.

Розу/штаты измерений спектрое простаты экспериментального животного

Рис. 8. а) Некоторые спектры, снятые с простаты экспериментального животного в процессе фотодеструкции, б) Временная спектральная диаграмма эксперимента на простате экспериментального животного. По оси X отложено время, по оси У - длина волны, цветом закодирована интенсивность.

Из диаграммы можно сделать вывод, что, со временем, освещенность во всех сенсорах, кроме первого, падала Это, вероятно, связано с тем, что при ФДТ степень оксигенации ткани понижается, а деоксигенированный гемоглобин имеет большее поглощение на длине волны 660нм

Плотности мощности излучения в простате

Время, мин.

Рис. 9. Значения плотностей мощности, полученных в результате декомпозиции спектров, зарегистрированных в процессе ФДТ простаты.

Получение межклеточной жидкости путем микроперфорации кожи лазером YAG:Er

Главы 4 и 5 настоящей работы посвящены разработке методики измерения концентрации глюкозы в межклеточной жидкости человека В Главе 4 разрабатывается методика микроперфорации верхнего слоя кожи с целью бескровного получения капли межклеточной жидкости На Рис. 10 представлена диаграмма, которая условно разделяет различный характер взаимодействия лазерного излучения с тканью, в зависимости от длительности импульса и энергии в импульсе. Область параметров используемого лазера показана на рисунке синим цветом и лежит в пограничной области между режимом выпаривания и фотоабляцией.

Для перфорации кожи (Рис. 11, а) в данной работе использовался YAG.Er лазер с длиной волны 2 94 мкм, длительностью импульса 125 мкс, и энергией в импульсе в диапазоне от 100-600 мДж. Минимальный диаметр лазерного луча составлял 200 мкм (Рис. 11,6) Одной из целей, поставленных в данной работе, было подобрать такие параметры энергии в лазерном импульсе, а также геометрию облучения, чтобы полностью избежать появления крови в образованном лазером канале, и, в то же время, собрать достаточное количество (порядка 1 мкл) межклеточной жидкости. Для того, чтобы избежать повреждения капилляров, кратер, образованный под воздействием лазерного излучения, не должен глубоко заходить в дермальную область (см. Рис. 10). Кроме того, чтобы полностью избежать

перфорации крупных вен, которые могут находиться в приповерхностной области, на поверхности кожи формировали складку и производили перфорацию в области верхнего гребня складки. Выбором такой конфигурации удалось избежать повреждения крупных венозных сосудов

Глубина образованного кратера определяется энергией в импульсе Выбор энергии импульса, при которой с большой вероятностью удается избежать перфорации капилляров, определялся эмпирическим путем при постепенном увеличении энергии в импульсе, пока не наблюдалась кровь в образовавшемся кратере.

плотность мощности

Параметры лазерного импульс 1= 125 икс., \ЛА=630 Дж/см2

10е

Длительность импульса (с)

Рис. 10. Диаграмма взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями в зависимости от плотности энергии и длительности импульса лазерного

излучения.

Диапазон настроек ЕгУАЭ лазера 2,9 нм 1= 125 мкс., /№300 - 2000 Дж/Ы

Граница появления крови

— 125 мкс №1000Дж/см2

Порог перфорации капилляров определяли для 3 добровольцев в зоне внешней поверхности руки, в области предплечья. Фотография эксперимента приведена на Рис 11 б) При этом, стартуя от энергии в импульсе 100 мДж, который заведомо не вызывал перфорацию капилляров, увеличивали энергию в импульсе с шагами 25 мДж, пока в образовавшемся кратере не наблюдали кровь Величина порога повреждения капилляров составила 300 ± 50 мДж. Для дальнейших исследований была выбрана мощность в импульсе 200 мДж. Таким образом, диаметр пучка составлял 200 мкм, плотность энергии в импульсе составляла 600 Дж/см2, а плотность мощности 5*106 Вт/см3. При данных параметрах лазера болевой эффект полностью отсутствовал.

Определение концентрации глюкозы в межклеточной жидкости.

Для определения содержания глюкозы в малых объемах жидкости, чему посвящена Глава 5 настоящей работы, был использован метод лазерно-флуоресцентной спектроскопии с использованием специальных маркеров, нанесенных на хроматографическую бумагу толщиной 450 мкм (тест-полоски). Приготовление тест-полосок производилось следующим образом. На образцы хроматографической бумаги (примерно 10 см в длину и 3 см в ширину) наносились основные компоненты химических маркеров: раствор Amplex Red, раствор пероксидазы, раствор глюкозоксидазы. Далее полоски просушивались при комнатной температуре в темном помещении в течение одного часа. Приготовленные таким образом тестовые полоски сохраняли свои свойства, как минимум, в течение недели, при условии хранения в сухом темном месте.

Рис. 11. а) фотография эксперимента по получению межклеточной жидкости из кожи руки, б) экспериментальная установка для перфорации верхних слоев кожи.

После нанесения капли раствора глюкозы на тест-полоску, раствор «впитывается» в бумагу, и начинается реакция глюкозоксидазы с глюкозой (см. Рис. 12) с образованием глюконолактоны и перикиси водорода. Перекись водорода немедленно обнаруживается красителем Amplex Red. В присутствии пероксидазы, Amplex Red реагирует с перекисью водорода (стехиометрия процесса 1:1), в результате чего образуется сильно флуоресцирующее (с пиком возбуждения в районе 563 нм и пиком излучения в 587 нм, см. Рис. 13) вещество резоруфин. Интенсивность излучения полученного таким образом резоруфина измерялась с использованием оптоволоконного спектрометра. На Рис. 12 приведена схема экспериментальной установки, созданной для измерения содержания глюкозы в межклеточной жидкости В качестве регистрирующей системы

Перфорация L = 2 mm, Н = 0.2 mm

«ус

был использован волоконно-оптический спектрометр и специально разработанное программное обеспечение

Свет от твердотельного лазера с диной волны 532 нм и мощностью 10 мВт доставляется к тест-полоскам посредством передающего кварцевого волокна с толщиной сечения 200 мкм. Флуоресцентное излучение поступает в спектрометр по приемному кварцевому волокну с таким же сечением в 200 мкм. Расстояние между приемным и передающим волокнами 250 мкм (от центра до центра). На входе спектрометра установлен оптический фильтр, подавляющий длину волны лазерного излучения. Измеренная интенсивность флуоресценции резоруфина коррелирует с концентрацией глюкозы в исследуемом растворе.

На Рис. 13 представлены спектры флуоресценции капель резоруфина разной концентрации на тест-полоске. Пик на длине волны 532 нм обусловлен усеченной фильтром лазерной линией, широкий пик в диапазоне 594 нм - 615 нм флуоресцентное излучение, искаженное фильтром и перепоглощением флуоресценции Спектры нормированы на амплитуду усеченной лазерной линии в 532 нм Это позволяет учитывать нестабильность лазерного излучения и частично нивелировать эффект от неидеальности геометрического расположения волокон и образца.

Рис. 12. Схема экспериментальной установки для определения содержания глюкозы в маленьких каплях жидкостей. 1 - компьютер с разработанным программным обеспечением, 2 - волоконно-оптический спектроанализатор, 3 - лазер YAG:Nd, вторая гармоника, 4 - тестовая полоска, 5 - схема химической реакции, 6 -точка соединения волокон, 7 - приемное шестиканальное волокно.

Интенсивность флуоресценции рассчитывалась как площадь под кривой от 550 нм до 750 нм, деленная на площадь под рассеянной и

подавленной фильтром лазерной линией 524 нм - 540 нм. При больших концентрациях резоруфина пик флуоресценции смещается в красную область, что связано с эффектом перепоглощения. Тем не менее, очевидно, что такой эффект малозначителен для первых трех спектров, которые сняты с образцов до 0.04 [мМ], что говорит о том, что зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации резоруфина при концентрации резоруфина ниже 0.04 [мМ] близка к линейной Для более высоких концентраций резоруфина такая зависимость нелинейна

В основе метода, при котором интенсивность флуоресценции нормируется на площадь подавленной линии рассеянного лазерного излучения, с целью учесть вклад перепоглощения, лежат два предположения' средняя длина пробега фотона лазерного излучения приблизительно равна средней длине пробега фотона флуоресцентного излучения, а коэффициенты поглощения на длине волны возбуждения и длине волны излучения равны

Рис. 13. Спектры флуоресценции резоруфина, нормированные на усеченную лазерную линию (532нм) при разных концентрациях

Для количественного определения глюкозы в малых объемах внутритканевой жидкости была построена калибровочная зависимость, приведенная на Рис 14

Сбор внутритканевой жидкости, полученной после лазерной микроперфорации кожи, производился следующим образом Подготовленная по описанной выше методике тест-полоска с маркерами располагалась непосредственно в контакте с поверхностью кожи Лазерный импульс инициировал одновременно перфорацию тест-полоски и верхнего слоя кожи (Рис 11, а) При этом образовавшаяся внутритканевая жидкость сразу впитывалась тест-полоской, причем, диаметр пятна на тест-полоске

составлял 2-3 мм. Через 10 минут после этого проводились измерения интенсивности флуоресценции в центре пятна, так, как это было описано выше Концентрация определялась из интенсивности флуоресценции с помощью калибровочной кривой, приведенной на рис. 14

Измерения проводились на двух здоровых добровольцах натощак Лазерная перфорация проводилась на коже руки в области предплечья Измерения во внутритканевой жидкости проводились в 6 различных точках и из этих данных вычислялось среднее значение и средне-квадратичное отклонение Результаты измерений дали значения 4.5 ± 1 8 [мМ] и 5.3 ± 2.3 [мМ]. Как видно из результатов измерений, точность измерения глюкозы во внутритканевой жидкости с помощью предложенной методики составляет 45% и пока недостаточна для использования этой методики в клинике. Тем не менее, предложенный принцип, в частности, метод получения и сбора внутритканевой жидкости с помощью лазерной микроперфорации, может служить основой для дальнейшего развития с целью клинического применения

Рис. 14. Интенсивности флуоресценции резоруфина через 10 мин после нанесения капель (2 мкл) раствора глюкозы разной концентрации на тестовые полоски бумаги, подготовленные с Amplex Red, глюкозоксидазой и пероксидазой.

Приложения.

В Приложении 1 приведены основные положения Метода Спектральных Координат для формализации спектрально-флуоресцентной информации, регистрируемой с биологических тканей. В Приложении 2 приводится краткое описание основных возможностей математического обеспечения, разработанного в ходе выполнения работы. Рассматриваются примеры применения математического обеспечения для дозиметрии концентрации и контраста накопления фотосенсибилизаторов в биологических тканях.

н

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Концентрация глюкозы, [мМ]

I

Выводы:

1. Предложена модель, проведены исследования и расчеты, на основе которых разработана методика и аппаратура для определения плотности мощности излучения внутри биологической ткани методом флуоресцентной спектроскопии пространственно разнесенных флуорофоров, нанесенных на оптические волокна:

- разработаны оптимальная конструкция волоконно-оптического зонда на основе полимерного волокна с 4-мя флуорофорными фрагментами и процедура выбора флуорофоров с наиболее подходящими спектрами флуоресценции из промышленно выпускаемых веществ;

- разработана многоканальная высокочувствительная система на основе ПЗС матрицы для одновременной регистрации спектров флуоресценции с восьми волоконно-оптических зондов, включающая систему и алгоритм калибровки зондов на основе специально модифицированной интегрирующей сферы;

разработан математический алгоритм определения пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани, включающий методику калибровки и декомпозиции спектров с использованием метода спектральных координат.

2. Проведены модельные исследования и исследования ца экспериментальных животных, подтвердившие эффективность системы для мониторинга параметров лазерного излучения в биологических тканях при фотодинамической терапии:

проведены спектральные исследования, подтвердившие применимость выбранных флуоресцирующих веществ, и осуществлено численное моделирование эксперимента с целью оценки влияния шумов на сходимость используемого алгоритма;

- проведены исследования по мониторингу пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри ткани в условиях реальной процедуры ФДТ предстательной железы на экспериментальных животных; исследования показали адекватность используемой модели для интерпретации экспериментальных данных.

3. Определены оптимальные значения энергии импульса лазерного излучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости из верхних слоев кожи человека, не приводящие к повреждению капиллярного русла, и исследован процесс взаимодействия такого излучения с кожей и другими биологическими тканями.

4. Методом лазерно-флуоресцентной спектроскопии исследованы кинетика реакции взаимодействия глюкозы с группой специальных реагентов на хроматографической бумаге. На основе проведенных исследований разработан алгоритм для количественного определения глюкозы с концентрациями физиологического диапазона 3-20 [мМ] в малых объемах жидкости.

5. Проведены калибровка метода для количественного определения содержания глюкозы в межклеточной жидкости кожи человека и исследования на пациентах, подтвердившие применимость метода для мониторинга монотонных изменений уровня сахара в крови человека.

Публикации

1. Будзинская М.В., Ворожцов Г.Н, Ермакова Н.А., Кузьмин С.Г., Лощенов В.Б., Лощенов MB., Лукьянец Е.А., Лужков Ю.М., Меерович Г.А., Шевчик С А., «Устройство и способ диагностики и фото динамической терапии заболеваний глаз» Патент РФ №2258452 от 20.08 05 с приоритетом от 03.09.03

2. ГА Меерович, С.А. Шевчик, MB Лощенов, М.В. Будзинская, Н.А. Ермакова, С С Харнас «Лазерно-спектроскопический комплекс для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии заболеваний сетчатой и сосудистой оболочек глаза» // Квантовая Электроника, Том 32, №11, с 941 -1034(2002)

3 Кустов ЕФ, Лощенов MB, Муравьев Э.Н., «Метод спектральных координат», Инженерная Физика, Москва, №2, с.6- 9 (2001)

4 Maxim V. Loschenov, Alexander S. Parfenov, Gennadii L Kisselev, Alexander A Stratonnikov, Katerina Ershova and Rudolf W Steiner, "Fluorescence method for monitoring of glucose in interstitial fluids" SPIE 4263, p.34-39 (2001).

5. Kustov E.F, Loshchenov M.V., «Formalization of PDT photosensitizer spectral data with spectral coordinates method», Progress in biomedical optics and imaging, SPIE, 5973-21, p. LI- L10 (2005).

6. Kustov E.F., Loshchenov M V., Lilge L.D , «Spectral coordinates in spectra fitting for explicit photodynamic therapy dosimetry», Progress in biomedical optics and imaging, SPIE 5937-07, p 1-11 (2005).

7. MB Лощенов, В Б Лощенов, Г. Л Киселев, А. Н Березин, «Анализ спектров лазерно-индуцированной флуоресценции фотосенсибил-изированных биологических тканей», Материалы международной конференции «Лазерные и Информационные технологии в медицине XXI века», С.-П., том 2, с.425, (2001)

8. Е Ф. Кустов, М В Лощенов, «Метод спектральных координат в спектроскопической диагностике», Материалы международной конференции «Лазерные и Информационные технологии в медицине XXI века», С.-П., том 2, с 485, (2001).

9 MB Лощенов, Г Л Киселев, А.Н Березин, «Обработка визуальной информации в медицине по цветовым признакам», Материалы международной конференции «Лазерные и Информационные технологии в медицине XXI века», С.-П., том 2, с.489 (2001).

10. М.В.Лощенов, А.С.Парфенов, Г.Л Киселев, А.А.Стратонников, Е Ю. Ершова, Р В. Штайнер, «Флуоресцентный метод для мониторинга содержания глюкозы во внутритканевых жидкостях», Материалы международной конференции «Лазерные и Информационные технологии в медицине XXI века», С -П., том 2, с.491 (2001).

11 Victor В. Loschenov, Nadejda A. Ermakova, Sergey S. Kharnas, Gennady A Meerovich, Maria V Budzinskaya, Sergey A Shevchik, Max V Loschenov, Sergey G Kuzmin. Experimental model of photodynamic therapy using Photosence" by choroidal neovascularisation // ESP 2003 10 congress of the European society for fotobiology Sept. 6-11 p 94 (2003)

12. Loshchenov M.V , Douplik A, Russnov R , Jiminez-Davila M , Netchev G, Sciszar S , Lilge L , Fluorescence based sensors probe data acquisition system for minimal invasive therapies, IX International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov,, p 6 (2005)

13 L. D. Lilge, M V. Loshchenov, M Jimenez, M. Gurari, Opto-electronic readout system for multitasking absorbance, fluorescence, and phosphorescence sensor probes // SPIE [5969-78] (2005)

14 Alexander A. Stratonnikov, Natalia V Ermishova, Maxim V. Loschenov, Igor G Meerovich, Sergey G Kuzmin, Eugeny A. Luk'janez «Photodynamic efficiency of PPIX and hematoporphyrin derivatives activated by light at 670 nm» Proc of 10 Congress of the European Society for Photobiology, p 90, Vienna, Austria, September 6-11, (2003)

Подписано в печать 14.03.2006. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать электрографическая. Гарнитура тайме. Объем 1,5 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 10 Издательство "Фотон-А" Москва, Ясногорская ул., д.5, корп. 2 425-7311,426-5069 Отпечатано в типографии ООО "Первая типография"

А №6A i

e^Jt

6 97 2

Введение.

Вступление.

Актуальность темы.

Цель исследования:.

Задачи исследования.

Научная новизна исследования.

Практическая значимость.

Апробация работы.

Публикации.

Объем и структура диссертации.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Малоинвазивные методы.

1.2 Лазерно-флуоресцентная спектроскопия в медицине.

U Обзор ФДТ.

1.3.1 Положение дел в ФДТ.

1.3.2 Фотосспсибилизатор.

1.3.3 Физика фотодинамического эффекта.

1.3.4 Дозиметрия при ФДТ.

1.4 Распространение света в биологических тканях.

1.5 Малоинвазивные методики определения содержания сахара в крови человека.

1.5.1 Методики множественной пффорации и постоянного автономного мониторинга.

1.5.2 Электро-перфузия с химическим детектированием.

1.5.3 ИК-спектроскопия основанная на био-имплантантах.

1.5.4 ИК спектроскопия па поверхности кожи.

1.5.5 Определение концентрации глюкозы на основе импсдансной радио волновой спектроскопии

1.5.6 Химическое детектирование глюкозы па контактных линзах.

1.5.7 Флуоресцентные сенсоры-имплантанты.

Глава 2. Система для определения плотности мощности излучения в биологических тканях при минимальной инвазии.

2.1 Цели создания системы.

2.2 Вступление.

2 J Описание системы.

2.4 Флуорофоры.

2.5 Геометрия волокон.

2.6 Методика расчета вклада флуорофоров в конечный спектр.

2.7 Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли.

2.8 Пример решения уравнения для четырех ЛФ.

2.8.1 Относительные спектральные координаты нулевого порядка.

2.8.2 Спектральные координаты первого порадка.

2.8.3 Спектральные координаты второго порадка.

2.8.4 Спектральные координаты третьего порядка.

Спектральные координаты четвертого порядка.

2.9 Методика декомпозиции спектров по спектральным координатам.

2.10 Оптимизация методики декомпозиции спектра по спектральным координатам.

2.11 Модификация метода введением весовых коэффициентов.

2.12 Калибровка прибора.

2.13 Оценка изотропности распределения света в калибровочной установке.

Глава 3. Измерения и валидация системы определения плотности мощности излучения в биологических тканях.

3.1 Измерение волокна с насечками без нанесения флуорофоров.

3.2 Измерение одного ЛФ.

3.3 Модельные эксперименты.

3.4 Опыты на экспериментальных животных.

Глава 4. Микроперфорация кожи с использованием лазера YAG:Er.

4.1 Введение.

4.2 Исследование взаимодействия лазерного облучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости.

Глава 5. Измерение концентрации глюкозы в межклеточной жидкости.

5.1 Методика определения содержания глюкозы в малых объемах жидкости.

5.2 Калибровка тест полосок с помощью стандартных растворов глюкозы.

5.3 Измерение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости, полученной после лазерной микроперфорации кожи.

5.4 Выводы.

Вступление.

Лазеры и лазерные технологии за последние три десятка лет вошли во все сферы человеческой деятельности. Одной из наиболее важных для общества областей применения лазеров является медицина [1, 2 ,3]. Благодаря высокой плотности мощности излучения и низкой расходимости пучка, лазер является наилучшим источником света для работы с оптоволоконной техникой. В зависимости от длины волны, плотности мощности и времени импульса излучения, лазер может быть как скальпелем с минимальной шириной «лезвия», так и аппаратом точечного выпаривания сколь угодно малых участков биологической ткани [4]. Высокая спектральная и пространственная плотность мощности позволяет использовать лазеры для измерения, как люминесцентных свойств ткани, так и таких тонких явлений, как доплеровский сдвиг спектра при отражении луча от движущихся молекул гемоглобина в кровеносных сосудах.

Ярким примером медицинского применения лазеров и флуоресцентной спектроскопии является бурно развивающаяся область фотодинамической терапии (ФДТ) [5] злокачественных новообразований. Для корректного проведения ФДТ одним из важнейших критериев является точная информация о пространственном и временном распределении света внутри биологической ткани, которое зависит от типа ткани, геометрии органа, его кровенаполненности, степени оксигенации [6], расположения сосудов [7], выгорания препарата [8, 9] и пр. и т.п. [10, 11].

Существует множество подходов, позволяющих либо в явном виде измерить, либо посредством математической модели [12 13] предсказать распределение плотности мощности внутри органа при ФДТ, однако, явное измерение зачастую неприемлемо по причине высокой степени инвазии в ткань, что недопустимо при лечении онкологических заболеваний, а модельные приближения не всегда дают точный ответ, что чревато неэффективным ходом лечения.

В настоящей работе предлагается явный и, в то же время, малоинвазивный метод дозиметрии пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения в биологической ткани при ФДТ с использованием флуоресцентной спектроскопии [14, 15]. Низкая степень инвазии достигается за счет размещения нескольких флуоресцентных сенсоров на одном оптоволокне достаточно маленького диаметра (200мкм), чтобы не вызвать патологические процессы.

В качестве другого применения лазерно-флуоресцентной спектроскопии для малоинвазивной диагностики, в работе предлагается оригинальная методика измерения сахара в крови человека путем получения межклеточной жидкости при лазерной перфорации поверхности кожи с последующим флуоресцентным анализом капли на содержание глюкозы.

Актуальность темы

В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение малоинвазивные лазерно-спектроскопические методы исследования и диагностики различных патологий на различных тканях [16].

Одной из наиболее важных проблем является проведение точной пространственной дозиметрии и мониторинга во времени лазерного излучения внутри биологической ткани в процессе фотодинамической терапии [17]. Связано это в том числе с тем, что в последнее время в фотодинамической терапии все больше используются фотосенсибилизаторы сосудистого типа, имеющие относительно низкий контраст накопления в опухоли относительно нормальной ткани, в частности, Тукад, Визудин, пр. В этом случае лазерное излучение должно доставляться так и в том объеме, чтобы не повредить здоровые ткани, особенно жизненно важных органов. Особенную актуальность задача приобрела при все более широком внедрении ФДТ в лечение внутритканевых глубокозалегающих опухолей, соседствующих с жизненно-важными органами. К примеру, при лечении рака предстательной железы, который в современном мире выходит на первое место по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний, с помощью ФДТ, очень важно, чтобы лазерное излучение не повредило расположенную рядом уретру, являющуюся легко подверженным повреждению органом. С другой стороны, если доза лазерного излучения окажется ниже пороговой величины для ФДТ в какой-либо части опухоли, то раковые клетки останутся неповрежденными и с высокой вероятностью вызовут рецидив, что недопустимо.

Другой актуальной проблемой, которой посвящена вторая часть работы, является малоинвазивная диагностика и мониторинг сахара в крови человека [18]. Широкая распространенность, ранняя инвалидизация и высокая смертность больных определили сахарный диабет как острую медико-социальную проблему современного мира. По данным ВОЗ, диабетом в той или иной форме страдают до 10% населения (приблизительно 4,6 млн. чел. в России по состоянию на 2000г) [19], и это число продолжает расти. Больные диабетом должны регулярно (мин 2 раза в сутки) измерять уровень сахара в крови. В настоящее время для этого используется метод прокола пальца ланцетом и анализ полученной капли крови. Эта процедура болезненна, неудобна, может вызвать проникновение инфекции, вид крови у многих (особенно у детей) вызывает стрессовое состояние. Актуальность предлагаемого в работе малоинвазивного и бескровного метода получения и анализа малых капель межклеточной жидкости не вызывает сомнений.

Цель исследования:

Основной целью диссертационной работы является развитие малоинвазивных методов дозиметрии пространственного распределения плотности мощности света при лазерном облучении биологических тканей в процессе фотодинамической терапии и малоинвазивных методов дозиметрии содержания глюкозы в крови путем лазерной перфорации кожного покрова и анализа межтканевой жидкости с помощью лазерно-флуоресцентной спектроскопии.

Задачи исследования

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Разработка, расчет, моделирование и экспериментальные исследования оптоволоконных флуоресцентных многосенсорных зондов с пространственно разнесенными флуорофорами для контроля пространственной плотности мощности лазерного терапевтического излучения с длиной волны 670 нм, возбуждаемых терапевтическим излучением и обеспечивающих за счет спектральных различий флуоресценции используемых флуорофоров возможность определения парциальных вкладов каждого из них.

2. Разработка физической модели (подхода) и математического алгоритма для расчета пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани из спектрально-флуоресцентных данных, полученных с оптоволоконных зондов.

3. Разработка многоканальной волоконно-оптической регистрирующей системы для изучения спектров излучения, выходящего из оптоволоконных зондов, и специального математического обеспечения для сбора и обработки получаемых спектральных данных. и

4. Проведение модельных и экспериментальных исследований по определению плотности мощности лазерного излучения в тканях предстательной железы экспериментальных животных в процессе ФДТ.

5. Экспериментальное исследование взаимодействия с поверхностью кожи лазерного излучения с длиной волны 2.9 мкм, имеющего различную длительность и энергию импульсов.

6. Исследование методами лазерно-флуоресцентной спектроскопии процессов, происходящих при взаимодействии глюкозы в хроматографической бумаге, пропитанной специальными химическими реагентами.

7. Спектрально-флуоресцентное определение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости человека, полученной при лазерной перфорации кожи.

Научная новизна исследования

• Впервые проведены исследования, показывающие принципиальную возможность определения пространственного распределения света в биологической ткани с помощью моноволоконного датчика с 4-мя разными флуорофорами путем одновременной передачи флуоресцентного сигнала от них по одному оптическому волокну с возможностью последующей дешифровки вклада каждого из флуорофоров в общий спектр при возбуждении флуоресценции флуорофоров внутри биологической ткани изучаемым при ФДТ лазерным излучением низкой интенсивности.

• Впервые метод спектральных координат применен для расшифровки спектральных данных, получаемых с флуоресцентных зондов.

• Впервые обнаружен и изучен эффект образования капли внутритканевой жидкости на поверхности кожи человека из кратера, образованного при перфорации верхних слоев кожи лазерным импульсом.

• Методами лазерно-флуоресцентного анализа была изучена кинетика протекания реакции глюкозы, содержащейся в межклеточной жидкости, с химическими реагентами (Amplex Red, кислород, глюкозоксидаза, пероксидаза), результатом которой является сильно-флуоресцирующее вещество Резоруфин.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, позволяют существенно улучшить качество дозиметрии ФДТ, тем самым, с одной стороны, уменьшить количество возникновений рецидивов, с другой стороны, не повреждать жизненно важные органы, находящиеся в непосредственной близости от опухоли. Созданная в рамках работы установка может служить прототипом системы для клинического применения.

Разработанная методика определения концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости может послужить основой для создания клинической диагностической малоинвазивной системы измерения сахара в крови человека.

Разработанное в процессе выполнения данной работы программное обеспечение по получению и разностороннему анализу и формализации спектральной информации нашло широкое применение в различных областях спектроскопии и вошло в стандартную комплектацию серийного спектрометра ЛЭСА-01-Биоспек [20], успешно функционирует в более чем 20-и лабораториях России, а также Канаде, Словакии, США, Южной Корее, Польше.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (С.-Петербург, 2001), Международном симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан-Хосе, США, 2001), десятом Конгрессе Европейского Фотобиологического Общества (10 Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 611, 2003), Международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике (Saratov fall meeting 2005, Саратов, 2005), Международной конференции Photonics in Medicine, (Торонто, Канада, 13 - 14 сентября, 2005).

Публикации.

По результатам диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, включая патент РФ (№2258452 от 20.08.05 с приоритетом от 03.09.03), две статьи в рецензируемых изданиях, 3 статьи в иностранных журналах, 5 публикаций в материалах российских конференций и 3 публикации в материалах зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения и 5-и глав. Содержание диссертации изложено на 125 страницах, иллюстрировано 48-ю рисунками. Список цитируемой литературы включат 107 источников. Приводятся 2 приложения общим объемом 28 страниц, иллюстрированные 12-ю рисунками.

5.4 Выводы.

Полученные в результате исследования результаты дают основания полагать, что флуоресцентный метод определения концентрации глюкозы в маленьких каплях раствора с применением Amplex Red может быть применен в биологических и медицинских диагностических системах, тем не менее, 'остаются неразрешенные до конца вопросы. Использование возбуждающего излучения с длиной волны 580-590 нм должно снизить влияние перепоглощения флуоресценции. Для уменьшения минимально допустимого размера капли целесообразно воспользоваться диагностической бумагой меньшей толщины. Кроме того, метод может быть легко модифицирован для измерения концентрации холестерола в растворах путем замены глюкозоксидазы на холестеролоксидазу при приготовлении тестовых полосок.

Заключение

1. Предложена модель, проведены исследования и расчеты, на основе которых разработана методика и аппаратура для определения плотности мощности излучения внутри биологической ткани методом флуоресцентной спектроскопии пространственно разнесенных флуорофоров, нанесенных на оптические волокна:

• разработаны оптимальная конструкция волоконно-оптического зонда на основе полимерного волокна с 4-мя флуорофорными фрагментами и процедура выбора флуорофоров с наиболее подходящими спектрами флуоресценции из промышленно выпускаемых веществ;

• разработана многоканальная высокочувствительная система на основе ПЗС матрицы для одновременной регистрации спектров флуоресценции с восьми волоконно-оптических зондов, включающая систему и алгоритм калибровки зондов на основе специально модифицированной интегрирующей сферы;

• разработан математический алгоритм определения пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани, включающий методику калибровки и декомпозиции спектров с использованием метода спектральных координат.

2. Проведены модельные исследования и исследования на экспериментальных животных, подтвердившие эффективность системы для мониторинга параметров лазерного излучения в биологических тканях при фотодинамической терапии:

• проведены спектральные исследования, подтвердившие применимость выбранных флуоресцирующих веществ, и осуществлено численное моделирование эксперимента с целью оценки влияния шумов на сходимость используемого алгоритма;

• проведены исследования по мониторингу пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри ткани в условиях реальной процедуры ФДТ предстательной железы на экспериментальных животных; исследования показали адекватность используемой модели для интерпретации экспериментальных данных.

3. Определены оптимальные значения энергии импульса лазерного излучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости из верхних слоев кожи человека, не приводящие к повреждению капиллярного русла, и исследован процесс взаимодействия такого излучения с кожей и другими биологическими тканями.

4. Методом лазерно-флуоресцентной спектроскопии исследованы кинетика реакции взаимодействия глюкозы с группой специальных реагентов на хроматографической бумаге. На основе проведенных исследований разработан алгоритм для количественного определения глюкозы с концентрациями физиологического диапазона 3-20 [мМ] в малых объемах жидкости.

5. Проведены калибровка метода для количественного определения содержания глюкозы в межклеточной жидкости кожи человека и исследования на пациентах, подтвердившие применимость метода для мониторинга монотонных изменений уровня сахара в крови человека.

1. Щербаков И.А., Конов В.И., Осико В.В. Возможности применения фундаментальных достижений физики в разработке новых лечебно-диагностических методов // Труды IV Международной конференции по реабилитологии. Москва, 4-6 октября(2002)

2. Тучин В.В. «Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях». Саратов: Изд-во Сарат. Ун-та, 1998. - 384с.: ил.

3. Руководство для врачей. Лазеры в клинической медицине Под ред. Проф. С.Д. Плетнева. М: изд."Медицина", с.53-54 (1996)

4. Прикладная лазерная медицина. Учебное и справочное пособие. / Под */ред. Х.-П. Берлинеа и Г.И. Мюллера: Сокр. Пер. с нем. Под ред. Н.И. Коротеева и О.С.Медведева, М: изд-во Интерэкспорт, 1997. 356с. - ил.

5. Dougehrty T.J. PDT of malignant tumors // in press in: "CRC Critical Reviews in oncology/Hemathology" CRC Press, Boca Raton, Florida, p. 184(1984)

6. Киселев Г.Л., Лощенов В.Б. Распределение лазерного излучения в биологической ткани при фотодинамической терапии и диагностике // Российский химический журнал, №5,т. XLII. стр. 53. (1998)

7. Stratonnikov А.А., Douplik A.Yu., Loschenov V.B. Oxygen Consumption and Photobleaching in Whole Blood Incubated with Photosensitizer Induced by Laser Irradiation // Laser Physics, V.13, 1, p. 1-21 (2003)

8. Stratonnikov A.A., Meerovich G.A., Loschenov V.B. Photobleaching of Photosensitizers applied for Photodynamic Therapy // Proc. SPIE, 3909, p.81-91 (2000)

9. Ishimara A. Wave propagation and scattering in random media // Academic press , New York (1978)

10. Mitra S., Foster Т.Н. Carbogen breathing significantly enhances the penetration of red light in murine tumors in vivo // Physics in Medicine and Biology, 49, p. 1891-1904 (2004)

11. Тучин B.B. Исследование биотканей методами светорассеяния // Успехи физ. Наук. г. Т. 167, №5. С.517-539 (1997)

12. Welch A., Gardner С., Richards-Kortum R., Chan Е., Criswell G., Pfefer J., Warren S. Propagation of fluorescent light // Lasers in surgery and medicine, Vol. 21, p.166-178 (1997)

13. Lilge L., Molpus K., Hasan Т., Wilson B.C. Light Dosimetry for Intraperitoneal Photodynamic Therapy in a Murine Xenograft Model of Human Epithelial Ovarian Carcinoma // Photochemistry and Photobiology, 68 (3), p.281-288 (1998)

14. Lilge L., Flotte T.J., Kochevar I.E., Jacques S.L., Hillenkamp F. Photoactivable Fluorophores for the Measurement ofFluence in Turbid Media // Photochemistry and Photobiology, 58(1), p.37-44 (1993)

15. Loschenov V.B., Kuzin, M. I., Artjushenko V.G., Konov, Vitaly I. Study of tissue fluorescence spectra in situ // SPIE Proc., vol.1066, 271-274, (1989)

16. Gross weiner L.I. PDT Light Dosimetry Revised //Journal for Photochemistry and Photobiology, B:Biology 38, p.258-268 (1997)

17. Baba J., Cameron В., Gerard S. Effect of temperature,PH, and corneal birefringence on polarimetric glucose monitoring in the eye // Journal of Biomedical Optics. Vol7(3). P.321-328 (2002)

18. WILD S., ROGLIC G., GREEN A., SICREE R, KING H. Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030 // DIABETES CARE, 27(5), (2004)

19. Лощенов В.Б., Стратонников А.А., Волкова А.И., Прохоров A.M. Портативная спектроскопическая система для флуоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией // Росс. Хим. Журнал;т.ХЫ1(5) с.50-53 (1998)

20. Invasive: medical // Интернет энциклопедия Wikipedia, Адрес в Интернет: en.wikipedia.org/wiki/Invasive%28medical%29

21. Minimally invasive // Интернет энциклопедия Wikipedia, Адрес в Интернет: en.wikipedia.org/wiki/Minimallyinvasive

22. Борсуков А. В., Лемешко 3. А., Сергеев И. E., Момджян Б. К. Под общ. ред. Харченко В. П. «Малоинвазивные вмешательства под ультразвуковым контролем в клинике внутренних болезней. Учебно-методическое пособие», Смоленск. 2005. - 121 с - ил.

23. И. В. Кудряшова, А.В. Борсуков., «Оценка возможностей ультразвуковой томографии и малоинвазивных вмешательств в ранней диагностике хронического панкреатита» // тезисы X российской гастроэнтерологической недели, 25-28 октября 2004 года, Москва.

24. МНИОИ им. П.А. Герцена Торако-абдоминальное отделение, Адрес в Интернет: www. mnioi .ru/clinic/134/136

25. В.Б. Лощенов, А.А. Стратонников, А.И. Волкова, A.M. Прохоров Портативная спектроскопическая система для флуоресцентной диагностики опухолей и контроля за фото динамической терапией" // Российский химический журнал, том XLII, N5 стр. 50-53 (1998).

26. Линьков К.Г., Березин A.H., Лощенов В.Б. Аппаратура для ФД и ФДТ // Российский биотерапевтический журнал; (2), стр.54 (2004)

27. Stratonnikov A.A., Loschenov V.B. Evaluation of blood oxygen saturation in vivo from diffuse reflectance spectra // Journal of Biomedical Optics, 6(4), p.457-467 (2001)

28. Dickey D.J., Partridge K., Moore В., Tulip J. Light dosimetry for multiple cylindrical diffusing sources for use in photodynamic theraphy // Physics in Medicine and Biology, 49, 3197 3208 (2004)

29. Kessel D Photodynamics theraphy: from the beginning // Photodiagnosis and photodynamic theraphy, 1, 3-7 (2004)

30. Barr H Photodynamic theraphy for dysplastic Barrett's oesophagus and early cancer // Photodiagnosis and photodynamic theraphy, 1, 195-201 (2004)

31. Allison R et. Al. Photosensitizers in clinical PDT// Photodiagnosis and photodynamic theraphy, 1, 27 42 (2004)

32. Mang T.S. Lasers and light sources for PDT: past, present and future // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 1, p.43-48 (2004)

33. Лощенов В.Б., Стратонников А.А. Физические основы флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии // Сборник трудов МИФИ, том 4, стр. 53-54 (2000)

34. Stewart, F., Baas, P. & Star, W. 1998, 'Review article: What does photodynamic therapy have to offer radiation oncologists (or their cancer patients)?' // Radiotherapy and Oncology, vol. 48, pp. 233-248 (1998)

35. Dougherty, T.J., Gomer, C.J., Henderson, B.W., & Jori, G. 1998, 'Photodynamic Therapy' // Journal of the National Cancer Institute, vol. 90(12), pp.889-905 (1998)

36. Wilson, B.C. 2002, 'Photodynamic Therapy for Cancer: Principles' // Canadian Journal of Gastroenterology, vol. 16(6), pp. 393-396 (2002)

37. Dougherty, T.J. & Marcus, S.L. 1992, 'Photodynamic Therapy' // European• Journal of Cancer, vol. 28A(10), pp. 1734-42 (1992)

38. Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., & Reed, M., 'The History of Photodetection and Photodynamic Therapy' // Photochemistry and Photobiology, vol.• 74(5), pp. 656-669.(2001) Г

39. Ershova E. Yu., Karimova L. N., Kharnas S. S., Kuzmin S. G., Loschenov

40. V. B. Photodynamic therapy of acne vulgaris. // Proc. SPIE; 4949, p. 62-67 (2003)

41. Lilge, L., O'Carroll, C., & Wilson, B.C. 1997, 'A solubilization technique for photosensitiser quantification in ex vivo tissue samples' // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, vol. 39, pp. 229-235 ( 1997)

42. Muller, P.J. & Wilson, B.C. 1993, 'Photodynamic Therapy for Brain Tumours', in A Clinical Manual: Photodynamic Therapy of Malignancy, ed. J.S. McCaughan, Jr., R.G. Landes Co., Austin, pp. 201-211 (1993)

43. Lilge, L., & Wilson, B.C. 1998, 'Photodynamic Therapy of Intracranial Tissues: A Preclinical Comparative Study of Four Different Photosensitisers' // Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery, vol. 16(2), pp. 81-91(1998)

44. Fernandez J.M., Bilgin M.D., Grossweiner L.I. Singlet oxygen generation by photodynamic agents. //J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 37. pp. 131-140 (1997)

45. Niedre, M., Patterson, M.S., & Wilson, B.C. 2002, 'Direct Near-infrared Luminescence Detection of Singlet Oxygen Generated by Photodynamic Therapy in Cells In Vitro and Tissues In Vivo' // Photochemistry and Photobiology, vol. 75(4), pp. 382-391 (2002)

46. DeRosa M.C., Crutchley R.J. Photosensitized singlet oxygen and its applications // Coord. Chem. Rev. Vol.233-234, p.351-371(2002)

47. Красновский A.A. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения // Итоги науки и техники .т.З. с.63-132(1992)

48. Chaplin, D.J., 'The effect of therapy on tumour vascular function' // International Journal of Radiation Biology, vol. 60(1-2), pp.311-325.(1991)

49. Moore, J.V., West, C.M., & Haylett, A.K. 1992, 'Vascular function and tissue injury in murine skin following hyperthermia and photodynamic therapy, alone and in combination' //British Journal of Cancer, vol. 66(6), pp. 1037-1043 (1992)

50. Chen, W., Huang, Z., Chen, H., Shapiro, H., Beckers, J., & Hetzel, F.W. 2002, 'Improvement of Tumour Response by Manipulation of Tumour Oxygenation During Photodynamic Therapy' // Photochemistry and Photobiology, vol. 76(2), pp. 197-203.(2002)

51. McMahon, K.S., Wieman, T.J., Moore, P.H., & Fingar, V.H. 1994, 'Effects of photodynamic therapy using mono-L-aspartyl chlorin e6 on vessel constriction, vessel leakage and tumour response' // Cancer Research, vol. 54(20), pp. 5374-5379. (1994)

52. Mitra S., Finaly J.C., McNeill D., Conover D.L., Foster Т.Н. Photochemical Oxygen Consumption, Oxygen Evolution, and Spectral Changes During UVA Irradiation of EMT6 Spheroids // Photochemistry and Photobiology, 73(6), p.703-708 (2001)

53. Farrell, T.J., Wilson, B.C., Patterson, M.C., & Chow, R. 1991, 'The dependence of photodynamic threshold dose on treatment parameters in normal rat liver in vivo' //Proceedings of the SPIE, vol. 1426, pp. 146-155(1991)

54. Chen, Q., Chopp, M., Dereski, M., Wilson, B.C., Patterson, M., Kessel, D., Heads, L., & Hetzel, F. 1993, 'Treatment parameters affecting the response of normal brain to photodynamic therapy' // Proceedings of the SPIE, vol. 1881, pp. 141-147(1993)

55. Patterson, M.S., Wilson, B.C., & Wyman, D.R. 1990b, 'The Propagation of ® Optical Radiation in Tissue. II: Optical Properties of Tissues and Resulting Fluence

56. Distributions' // Lasers in Medical Science, vol. 6, pp. 379-390. (1990)

57. Wilson, B.C., Patterson, M.S., & Lilge, L. 1997, 'Review Article: Implicit and Explicit Dosimetry in Photodynamic Therapy: A New Paradigm' // Lasers in• Medical Science, vol. 12, pp. 182-199. (1997)

58. Stratonnikov A.A., G.A. Meerovich and V. B. Loschenov "Photobleaching of photosensitizers applied for photodynamic therapy" // Proc. SPIE 3909, p.81-91 (2000).

59. Johanson J., Fluorescence Spectroscopy for Medical and Environmental Diagnostics // Dissertation thesis, Lund Institute of Technology, Lund, Sweeden (1993)

60. Star, W.M. 1997, 'Light dosimetry in vivo' // Physics in Medicine and• Biology, vol. 42, pp.763-787 (1997)

61. Foster, Т.Н., Hartley, D.F., Nichols, M.G., & Hilf, R. 1993, 'Fluence rate effects in photodynamic therapy of multicell tumour spheroids' // Cancer Research, vol. 53(6), pp. 1249-1254(1993)

62. Henderson, B.W., Busch, T.M., Vaughan, L.A., Frawley, N.P., Babich, D., у Sosa, T.A., Zollo, J.D., Dee, A.S., Cooper, M.T., Bellnier, D.A., Greco, W.R., &

63. Oseroff, A.R. 2000, 'Photofrin Photodynamic Therapy Can Significantly Deplete or Preserve Oxygenation in Human Basal Cell Carcinomas During Treatment, Depending on Fluence Rate' // Cancer Research, vol. 60, pp. 525-529 (1992)

64. Lilge, L., Haw, Т., & Wilson, B.C. 1993, 'Miniature isotropic optical fibre probes for quantitative light dosimetry in tissue' // Physics in Medicine and Biology, vol. 38, pp. 215-230.(1993)

65. Arnfield, M.R., Tulip, J., & McPhee, M.S., 'Optical propagation in tissue with anisotropic scattering' IEEE Trans Biomed Eng, vol. 35(5), pp. 372-81 (1998)

66. Компания Спект-ЭрИкс, США, Адрес в Интернет: www.spectrx.com/

67. Harry Delcher et all "Continuous Measurement of Glucose in Interstitial Fluid for Extended Time Periods" // SpectRX corporate publication (2000).

68. Компания Сигнус, Великобритания, Адрес в Интернет: www.glucowatch.com/uk

69. Eastman RC, Chase HP, Buckingham B, Hathout E, Tamada J, Ginsberg B. "How should we interpret "real life" conditions." // Pediatric Diabetes; 4, 59 (2003)

70. Kulcu E, Tamada JA, Reach G, et al. Physiological differences between interstitial glucose and blood glucose measured in human subjects. // Diab Care. 26(8);2405-2409 (2003)

71. Компания Энимас, США, Адрес в Интернет: www.animascorp.com

72. Компания Инлайт солюшнз, США, Адрес в Интернет: www.inlightsolutions.com/

73. Компания Пендрагон Медикал, Швейцария, Адрес в Интернет: www.pendragonmedical.com/

74. Компания Сиба Вижн, Швейцария, США, в Интернет: www.cibavision.com/

75. Компания Биотекс, США, Адрес в Интернет: www.biotexmedical.com

76. McNichols R.J., Cote G.L., "Optical glucouse sensing in biological fluids: an overview"//J. Biomed. Opt. 5, 5-16 (2000).

77. Abdel-Latif M.S., Guilbault G.G., "Fiber-optic sensor for the determination of glucose using micellar enhanced chemiluminescence of the peroxylate reaction" // Anal. Chem. 60, 2671-4 (1988).

78. Moreno-Bondi M.C., Wolfbeis O.S., Leiner M.J., Schaffar B.P., "Oxygen optrode for use in a fiber optics glucose biosensor" // Anal. Chem 62, 2377-80 (1990).

79. Bol'shakov E.N., Dolgikh R.A., Zazulevskaya L.Ya., Zubov B.V., Lobachev V.A., Murina T.M., Prokhorov A.M. Experimental grounds for YAG:Er laser application to dentistry // SPIE, 1353, 160-169 (1989)