Лиганд-зависимое функционирование ангиотензин-превращающего фермента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СКИРГЕЛЛО ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ЛИГАНД-ЗАВИСИМОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

02.00.15 - катализ 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. Автореферат разослан «_» _2006 г.

Научный руководитель: к.х.н., с.н.с. Кост O.A.

Официальные оппоненты: д.х.н., с.н.с. Румш Л.Д.

д.х.н., профессор Банков A.A.

Ведущая организация:

Институт биомеднцинской химии им. В.Н. Ореховича, РАМН

Защита состоится «f »

2006 года в 16 часов на заседании

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

И.К. Сакодылская

Актуальность темы. Ангиотензин превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) — физиологически важная цинк-зависимая пептидаза, участвующая во многих процессах в организме млекопитающих. С нарушением функций этого фермента связаны такие серьезные заболевания, как атеросклероз сосудов, сахарный диабет, бесплодие, сердечная недостаточность и др. В связи с этим новое знание свойств и особенностей функционирования этого фермента может иметь терапевтическое будущее.

Несмотря на то, что изучение АПФ длится более полувека, до сих пор остается невыясненным вопрос о причинах столь сложной организации этого фермента: полноразмерный (соматический) АПФ представляет собой тандем из двух гомологичных С- и К-доменов (гомология составляет около 60%), свёрнутых из единой полипептидной цепи. Каждый из доменов содержит активный центр. Несмотря на то, что домены характеризуются разными физико-химическими свойствами (стабильностью, степенью гликозилирования и т.д.), они взаимодействуют с одним и тем же кругом субстратов и ингибиторов (но с разной специфичностью). До недавнего времени не было единого мнения о характере совместного функционирования активных центров соматического АПФ. Довольно долго считалось, что активные центры функционируют независимо, однако при этом в литературе существовали данные, не соответствующие этой схеме. Предпосылками данной работы явились исследования соматического АПФ быка, в которых было показано, что длина (структура) субстрата определяет кинетический характер совместного функционирования активных центров фермента. В предельных случаях, при гидролизе нона- и декапептидных субстратов активные центры АПФ быка функционируют как два полностью независимых фермента, а при гидролизе трипептидных субстратов наблюдается взаимозависимое функционирование активных центров - в каждый момент времени функционирует какой-либо один из двух.

Аминокислотная последовательность АПФ человека, более значимого с точки зрения здоровья человека, отличается от последовательности АПФ быка, а, следовательно, эти ферменты несколько отличаются и пространственной организацией молекулы, что влечет за собой отличия в субстратной специфичности, способности взаимодействовать с ингибиторами и, возможно, в механизме совместного действия активных центров в составе соматического АПФ. Исследование такого рода особенно важно в связи с тем, что природными субстратами АПФ являются пептиды самой разной структуры, среди которых есть как тетра-, пентапептиды (фактор гемопоэза М-Ас-Зег-Аэр-Ьуз-Рго и энкефалины), так и молекулы с более протяженной структурой. В частности, с гидролизом нонапептида брадикинина и декапептида ангиотензина I связана основная функция АПФ — поддержание уровня кровяного давления млекопитающих. Кроме того, поскольку в

настоящее время лекарства на основе ингибиторов АПФ являются широко распространенным средством при лечении болезней сердца, представляется важным исследование эффективности подавления активности соматического АПФ ингибиторами различной структуры в реакциях гидролиза субстратов различной длины.

Целью работы явилось выявление общего механизма совместного функционирования активных центров АПФ при взаимодействии с лигандами (субстратами и ингибиторами) различной длины/структуры и попытка с помощью исследования однодоменной формы фермента объяснения возможных причин, вызывающих отрицательную кооперативность двух активных центров фермента.

Научная новизна и практическая значимость. Получены новые данные по субстратной и ингибиторной специфичности однодоменных форм и полноразмерной формы АПФ человека в условиях, близких к физиологическим (рН 7,5 и концентрации СГ-ионов 150 мМ). Сравнение полученных данных с имеющимися в литературе данными по субстратной и ингибиторной специфичности активных центров АПФ быка продемонстрировало, что ферменты человека и быка проявляют видовую специфичность.

Показано, что зависимость формально-кинетического механизма функционирования активных центров в составе соматического АПФ от длины лиганда (субстрата или ингибитора) является общим свойством для ферментов быка и человека. Выявлена строгая отрицательная кооперативность активных центров двудоменного АПФ человека при связывании «коротких» лигандов, что означает, что в каждый момент времени функционирует какой-либо один из двух активных центров. При взаимодействии фермента с «длинными» лигандами, по длине соответствующими девяти-, десятичленным пептидам активные центры АПФ функционируют независимо. Более того, ингибирование активности двудоменного АПФ при гидролизе «короткого» и «длинного» субстратов осуществляется по разным механизмам. Так, например, «короткий» ингибитор оказывается более эффективен в случае подавления реакции гидролиза «короткого» субстрата, чем при подавлении реакции гидролиза «длинного» субстрата. Эти данные позволяют заключить, что оценка эффективности новых ингибиторов - потенциальных лекарственных средств - зависит от субстрата, по которому определяется остаточная активность соматического АПФ. Не исключено, что при тестировании в лабораториях новых ингибиторов с использованием трипептидных субстратов получаемая картина не соответствует реальной ситуации ингибирования активности АПФ при гидролизе брадикинина и ангиотензина I.

Обнаружено влияние связывания лиганда с N-доменом АПФ на эффективность связывания с ним специфичных моноклональных антител. Путбм определения

локализации эпитопов связывания этих моноклональных антител и анализа структуры N-домена показано, что однодоменный фермент при связывании лиганда в его активном центре претерпевает конформационные перестройки, т.н. "hinge-bending movement". На основании этих данных, а также на основании кинетического механизма функционирования активных центров в составе двудоменного АПФ впервые сделано предположение о совместном функционировании активных центров в составе соматического АПФ.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на: International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications" (Moscow, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина «Инженерная энзимология» (Москва 2003), International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals & Applications" (St. Petersburg, 2005), IV Meeting of International Society of Proteolysis (Quebec, 2005) и Moscow Inertnational Conference «Biotechnology and Medicine» (Moscow 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы I-III), экспериментальной части (Глава IV), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Главы V-VIII), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена настраницах, содержит таблицы и рисунков. Список литературы включает (?^ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ АНГИОТЕНЗИ11-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Соматическую форму АПФ быка и человека выделяли из легких и почек, соответственно. При выделении фермента использовали экстракцию детергентом Тритоном Х-100, осаждение сульфатом аммония и афинную хроматографию на лизиноприл-агарозе. Тестикуяярную форму АПФ быка, соответствующую С-домену соматического АПФ, выделяли из семенников быка аналогично выделению соматического АПФ.

Соматическая форма

hemgh hemgh

С-домен АПФ

hemgh

N-домен АПФ

Рис. 1. Схематическое изображение различных форм ангиотен-превращающего фермента. Белыми кругами обозначены активные центры.

Рекомбинантный С-домен АПФ человека, экспрессированный в СНО клетках, очищали методом аффинной хроматографии. N-домен фермента быка и человека получали методом ограниченного протеолиза трипсином исходного соматического АПФ. Все препараты были очищены до электрофоретически гомогенного состояния. Концентрация активных центров определена с помощью титрования конкурентными ингибиторами лизиноприлом и каптоприлом.

II. МЕХАНИЗМ СОВМЕСТНОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ СОМАТИЧЕСКОГО АПФ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ГИДРОЛИЗЕ СУБСТРАТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

С целью выявления характера совместного функционирования активных центров в составе соматического АПФ человека при гидролизе пептидов мы определили кинетические параметры гидролиза ряда субстратов под действием всех трёх форм АПФ человека: соматической и С- и N-доменов. Выбор субстратов был продиктован длиной пептида. В нашей работе были использованы следующие синтетические пептидные субстраты: С-концевые аналоги ангиотензина I - Hip-His-Leu, Cbz-Phe-His-Leu и пять фурилакрилоильных производных трипептидов - FA-Phe-Gly-Gly, FA-Phe-Ala-Ala, FA-Phe-Phe-Arg, FA-Phe-Ala-Lys и FA-Phe-Ala-Pro, из которых FA-Phe-Phe-Arg является C-концевым аналогом брадикинина. В качестве субстратов протяженной структуры были взяты декапептид ангиотензин I, пентапептиды [Ме^-энкефалин и [[*еи5]-энкефалин. Сравнение констант гидролиза этих субстратов под действием однодоменных ферментов показало различие в субстратной специфичности отдельных доменов АПФ человека. Анализ данных демонстрирует лучший катализ (iK<T) N-доменом гидролиза практически всех использованных нами субстратов (табл. 1). В то же время, величины Кт гидролиза рассматриваемых субстратов либо одинаковые (FA-Phe-Ala-Pro и FA-Phe-Phe Arg), либо ниже для С-домена (все остальные субстраты), кроме субстрата Hip-His-Leu, для которого величина Кт гидролиза под действием N-домена в два раза лучше (табл. 1). Эти данные могут свидетельствовать о лучшем связывании трипептидных субстратов на С-домене. Каталитическая константа гидролиза природных субстратов пентапептидов [Leu5]- и [Ме15]-энкефалинов выше под действием N-домена АПФ человека при примерно равных Кт. Отщепление С-концевого дипептида от ангиотензина I происходит с несколько более высокой каталитической константой под действием С-домена АПФ человека при равных величинах Кт (табл. 1). Кроме того, полученные данные демонстрируют разницу в субстратной специфичности доменов АПФ человека и доменов АПФ быка (табл. 1).

Таблица 1. Кинетические параметры гидролиза синтетических трипептидных субстратов под действием трех форм АПФ человека и быка.

АПФ человека АПФ быка [Вшеувк! 2003]

С Кт, мМ *„/ЛГп>Л0'3,М-У' *с1, с'1 Кт, мМ М'.М'с"1

КА-РЬе-С1у-С1у

Соматический 444±14 0,31 ±0,04 1430 280±1б 0,70±0,06 400

И-домен 730±58 1,40±0,13 520 279±10 1,40±0,02 200

С-домен 420±12 0,29±0,04 1450 260±14 0,50±0,02 520

РА-РЬе-А1а-1.у«

Соматический 78+4 0,14±0,03 560 54±2 0,15±0,02 360

И-домен 325±41 0,23±0,8 1410 35±3 0,14±0,01 250

С-домен 41±4 0,038+0,00 1080 85±7 0,17±0,02 500

Шр-Шз-Ьеи

Соматический 71±7 0,51 ±0,07 140 12+1 0,90±0,10 13

Ы-домен 49±4 0,60±0,07 80 12±1 0,50±0,05 24

С-домен 97±6 1,7±0,4 60 12±1 0,60±0,03 20

СЬг-РЬе-Шв-Ьеи

Соматический 116+4 0,055±0,0 2110 58±5 0,25±0,02 230

Ы-домен 256±17 0,23±0,02 1110 122±10 0,15±0,02 810

С-домен 81±6 0,033±0,0 2450 19±2 0,13±0,02 150

КА-РЬе-А1а-А1а

Соматический 320±3 0,081 ±0,0 3950 108±11 0,05+0,01 2200

Ы-домен 827+15 0,084±0,0 9850 35±3 0,05±0,02 700

С-домен 44±1 0,045±0,0 980 178±15 0,05±0,01 3600

РА-РЬе-А1а-Рго

Соматический 121 ±8 0,041±0,0 2950 30±3 0,008±0,00 3800

И-домен 273±12 0,048±0,0 5690 4,8±0,4 0,008±0,00 600

С-домен 18±1 0,037±0,0 490 45±1 0,005±0,00 9000

РА-РЬе-РЬе-Лгя

Соматический 120±4 0,019±0,0 6310 60±5 0,05±0,01 1200

К-домен 167±6 0,011 ±0,0 15180 45±4 0,05±0,01 900

С-домен 29±2 0,011±0,0 2640 76±8 0,12±0,02 630

[1.си5]--)нкеф;1лнп

Соматический 44+4 0,67+0,08 66 52±2 0,37+0,03 140

И-домен 72±4 0,99±0,09 73 61+3 0,40+0,02 152

С-домен 7,2+0,4 1,02+0,08 7 7,5x0,5 0,14±0,01 54

[Ме1!]-энкефалин

Соматический 88±10 0,74±0,10 119 33±1 0,49+0,04 67

Ы-домен 201+17 1,29±0,14 155 33+2 0,37+0,02 90

С-домен 29±3 0,73±0,08 40 60±3 1,20+0,10 50

ангиотензин I

Соматический 66±11 0,076±0,0014 870 74±4 0,12+0,01 620

И-домен 33±б 0,054+0,0 610 10+1 0,15+0,01 70

С-домен 43±9 0,067±0,0 640 57+3 0,13+0,01 440

Условия: 50 мМ Нерез-буфер, рН 7,5, содержащий 150мМНаС1, 1 мкМ2пСЬ, 25°.

Сопоставление эффективностей (^ат/Л"т) гидролиза субстратов под действием АПФ человека и быка показало, что гидролиз всех представленных субстратов (кроме субстратов РА-РЬе-А1а-А1а, РА-РЬе-А1а-Рго под действием С-доменов фермента быка и человека) происходит с явным преимуществом под действием ферментов человека, причем как однодоменных форм, так и двудоменного соматического АПФ (табл 1).

Таким образом, полученные данные демонстрируют существенную разницу в функционировании АПФ человека и быка, что могло бы обуславливать также различный характер совместного функционирования активных центров этих ферментов.

Мы проанализировали характер совместного функционирования активных центров

соматического АПФ человека при гидролизе различных субстратов, который в предельных случаях можно представить в двух вариантах: полностью независимое и взаимозависимое функционирование (схемы 1 и 2).

8кЕс8

к = к +]г

Схема 1. Независимое функционирование активных центров (С- и 1^-) в составе одного фермента.

Зная каталитические константы гидролиза субстратов под действием однодоменных форм АПФ человека, мы рассчитали теоретические значения каталитических констант гидролиза субстратов под действием двудоменного фермента. Сравнение теоретических каталитических констант гидролиза субстратов под действием соматического АПФ с экспериментально измеренной константой показало, что все три- и пентапептидные субстраты гидролвдуются по строго взаимозависимому механизму функционирования активных центров фермента. Только декапептидный субстрат ангиотензин I гидролизуется независимо на обоих активных центрах АПФ человека (табл. 2).

Итак, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при гидролизе многих субстратов связывание субстрата на одном из активных центров АПФ отменяет/ухудшает

кат.набл

+ Кт,С

Схема 2. Взаимозависимое функционирование активных центров (С- и Ы-) в составе одного фермента.

Таблица 2. Экспериментальные и теоретические значения каталитических констант гидролиза субстратов различной структуры под действием трех форм АПФ человека.

Субстрат ^каг. С зависимый механизм Акат, С эксперимент к с1 независимый механизм

FA-Phe-Gly-Gly 473 444±14 1150

FA-Phe-Ala-Lys 81 78±4 366

Hip-His-Leu 65 71±7 146

Cbz-Phe-His-Leu 108 11б±4 337

FA-Phe-Ala-Ala 320 320±3 871

FA-Phe-Ala-Pro 129 121±8 291

FA-Phe-Phe-Arg 94 120±4 196

Cbz-Phe-His-Leu 278 200±Ю 580

[Ьеи5]-энкефалин 40 44±4 80

[Met5]- энкефалин 91 88±10 230

ангиотензин I 37 66±11 76

связывание субстрата на втором активном центре. С тем, чтобы оценить количественно ухудшение связывания молекулы субстрата на одном из активных центров в том случае, когда второй активный центр уже связан с молекулой субстрата, мы рассмотрели равновесную схему функционирования активных центров фермента с двумя активными центрами (схема 3), в которой параметр а количественно отражает изменение константы связывания молекулы субстрата с фермент-субстратным комплексом по сравнению со свободным ферментом.

I В предельных случаях эта схема вырождается в рассмотренные выше схемы, а именно: при а = I константа связывания второй молекулы субстрата не изменяется, и наблюдается независимое функционирование активных центров; при а-юо константа связывания второй молекулы субстрата уменьшается настолько, что тройной фермент-субстратный комплекс не образуется.

Схема 3. Общая схема совместного функционирования двух активных центров (С- и Ы-) в составе одного фермента.

Оценка этого параметра показала, что для трипептидных субстратов значение параметра а, большее или равное 10, уже является достаточным, чтобы в условиях эксперимента не наблюдалось образование комплекса SES. При гидролизе ангиотензина I этот параметр равен 1.

Наши данные в предельных случаях совпали с данными, полученными для фермента быка. Таким образом, формально-кинетический механизм совместного функционирования двух активных центров в составе как АПФ быка, так и АПФ человека зависит от длины субстрата

III. МЕХАНИЗМ СОВМЕСТНОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ СОМАТИЧЕСКОГО АПФ ПРИ ПОДАВЛЕНИИ ЕГО АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРАМИ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ В РЕАКЦИЯХ ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТОВ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ

Продемонстрированная нами зависимость формально-кинетического механизма гидролиза субстратов под действием двудоменной формы АПФ от длины субстрата может иметь важное терапевтическое значение, поскольку используемые в клинике ингибиторы являются аналогами «коротких» субстратов. Мы предположили, что степень ингибирования активности АПФ этими ингибиторами должна зависеть от того, по субстрату какой длины меряется остаточная активность. Более того, ингибиторы более протяженной структуры могли бы оказаться эффективнее «коротких» ингибиторов при подавлении активности двудоменного фермента в реакциях гидролиза «длинных» субстратов.

В качестве субстратов были выбраны те же пептиды, что и в предыдущей части, т.е. семь трипептидных синтетических субстратов, декапептид ангиотензин I, а также нонапептид брадикинин. Выбор ингибиторов также был продиктован их длиной. В работе были использованы: «короткие» ингибиторы каптоприл и лизиноприл (по длине соответствующие ди- и трипептидам); «длинный» ингибитор - нонапептид тепротид; ингибиторы промежуточной длины, соответствующие гекса- и гептапептидам (рис. 2).

С тем, чтобы выявить основные закономерности ингибирования активности соматического АПФ, мы использовали менее дефицитный фермент быка, а затем основные эксперименты были повторены с использованием АПФ человека.

«Короткие» ингибиторы

каптоприл лизиноприл

о ^ R-tCHJjNH,

Ингибиторы промежуточной длины рр 55-119 - гексапептидомиметик

рр-50 - гептапептидомиметик

о

О <»Н

«длинный» ингибитор

тепротид нонапептид

Рис. 2. Структуры используемых в работе ингибиторов.

Прежде всего, мы определили константы ингибирования выбранными ингибиторами активности каждого активного центра АПФ быка (табл. 3).

Табл. 3. Ингибирование активности №- и С-доменов АПФ быка конкурентными

ингибиторами._

К\, нМ

N-домен С-домен

лизиноприл 0,5±0,02 9,1±0,2

тепротид 30±1 0,2±0,02

РР-55 210±10 300±10

_РР 55-119_50±1_90±1_

Условия: 50 мМ Hepes-буфгр, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCI, 1 мкМ ZnCh. 25".

Экспериментальные данные по ингибированию активности соматического АПФ обрабатывали по общей схеме ингибирования фермента с двумя активными центрами, в которой, кроме параметра а, вводили также параметры Р и у (схема 4). Параметр а, как уже указывалось выше, отражает влияние связывания молекулы субстрата на одном активном центре на связывание субстрата на втором активном центре. Параметр Р отражает аналогичное влияние в случае ингибиторов, и параметр у отражает влияние связывания молекулы субстрата/ингибитора с одним активным центром на связывание соответственно ингибитора/субстрата со вторым активным центром. При теоретическом описании экспериментальных зависимостей ингибирования активности соматического АПФ с использованием общей схемы 4 изначально для «длинных» субстратов параметр а мы полагали равным 1, в случае «коротких» субстратов — равным 10 и более. Зная все константы связывания субстратов с каждым доменом и константы ингибирования активности каждого домена, теоретическое описание экспериментальных данных ингибирования активности соматического АПФ сводилось к одновременному подбору двух параметров р и у с тем, чтобы получаемая теоретическая кривая наилучшим образом описывала экспериментальные данные.

Схема 4. Общая схема ингибирования фермента с двумя активными центрами (Ы- и С-).

Для подтверждения получаемых закономерностей ингибирования активности двудоменного АПФ для каждого ингибитора мы использовали как различные «короткие» субстраты, так и различные «длинные» субстраты.

Рассмотрим отдельно четыре варианта ингибирования активности соматического АПФ «длинным» и «коротким» ингибитором при гидролизе субстратов различной длины.

1хЕс

В системе, когда ингибирование активности соматического АПФ осуществляется «коротким» ингибитором при гидролизе «короткого» субстрата, например, при ингибировании каптоприлом реакции гидролиза субстрата РА-РЬе-А1а-Рго (рис. 3), Шр-Шз-Ьеи, РА-РЬе-Шэ-Ьеи, оказалось, что связывание «короткого» ингибитора на одном

Рис. 3.

Ингибирование каптоприлом

активности соматического

АПФ быка при гидролизе

субстрата FA-Phe-Ala-Pro.

Условия: 50 мМ Hepes, рН

7,5, содержащий 150 мМ

NaCl, I mkKÍ ZnC¡2, 25

Концентрация фермента — 10 нМ, концентрация FA-Phe-A la-Pro -100 мкМ.

10* й-м

активном центре как минимум на порядок ухудшает связывание молекулы «короткого» лиганда (ингибитора или субстрата) на втором активном центре соматического АПФ, т.е. параметр Р принимает значения в интервале 15+30 и параметр у принимает значения равные или большие 10. Изменение константы связывания на порядок уже оказалось достаточным, чтобы мы в условиях эксперимента не наблюдали образования тройных фермент-субстрат-ингибиторных комплексов.

Однако при полном ингибировании активности соматического АПФ «коротким» ингибитором по «короткому» субстрату, фермент сохраняет активность по отношению к «длинному» субстрату, т.е. второй активный центр сохраняет способность связываться с «длинным» субстратом. Причем связывание «длинного» субстрата на втором активном центре соматического АПФ происходит либо без изменения константы связывания по сравнению со связыванием со свободном ферментом, либо с чуть худшей константой (у=1-Ч,5). Так, например, связывание лизиноприла с одним активным центром соматического АПФ не изменяло константу связывания молекулы ангиотензина I со вторым активным центром, т.е. параметр у равен 1 (рис. 4). Связывание другого «короткого» ингибитора каптоприла с одним активным центром АПФ вызывало

увеличение Кз как брадикинина, так и ангиотензина I со вторым активным центром АПФ в 1,3 и 1,5 раза, соответственно.

10-» 10-'°

Рис. 4.Ингибирование лизиноприлом реакций гидролиза ангиотензина I под действием соматического АПФ быка Условия: 50 мМНерез, рН 7,5, содержащий 150 мМ ЫаС1, 1 мкМгпСЬ, 25°. Концентрация фермента — 10 нМ, концентрация ангиотензина -100 мкМ.

10-' 10* И»м

Аналогичная ситуация наблюдается в случае ингибирования «длинным» ингибитором активности соматического АПФ при гидролизе «короткого» субстрата, т.е. связывание молекулы «длинного» ингибитора позволяет связываться трипептидному субстрату со вторым активным центром, но может увеличивать значение константы в 1-;-4 раза (рис. 5). Величина эффекта, по-видимому, определяется структурой субстрата.

Рис. 5.

Ингибирование тепротидом реакции гидролиза РА-РЬе-А1а-Рго под действием соматического АПФ быка. Условия: 50мМНере$,рН 7,5, содержащий 150 мМ ЫаС1, 1мкМгпС12, 25°. Концентрация фермента — 10 нМ, концентрация ЕА-РИе-А1а-Рго -100 мкМ.

При ингибировании «длинным» ингибитором - нонапептидом тепротидом реакции гидролиза «длинного» субстрата, декапептида ангиотензина I или нонапептида брадикинина, активные центры двудоменного АПФ функционируют как два независимых фермента: параметры р и у равны 1 (рис. 6).

Ингибитор, содержащий на две аминокислоты меньше, чем тепротид (гептапептидомиметик РР-50), по-видимому, также является «длинным» ингибитором по отношению к активности соматического АПФ, поскольку, во-первых, две молекулы ингибитора связываются с соматическим АПФ либо совсем без изменения константы связывания второй молекулы ингибитора, либо с небольшим изменением: параметр 0 принимает значения от 1 до 2. Во-вторых, связывание этого ингибитора с одним из двух активных центров позволяет связывание не только «длинного», но и «короткого» субстрата со вторым активным центром соматического АПФ, но с возможным небольшим изменением Ks: у принимает значения от 1 до 1,7. Этого нельзя сказать про ингибитор РР 55-119, который является гексапептидомиметиком, т.к. связывание его с одним из активных центров АПФ ухудшило связывание субстрата Cbz-Phe-His-Leu на порядок. Таким образом, сравнение ингибирующего действия ингибиторов промежуточной длины на активность соматического АПФ быка в реакциях гидролиза субстратов различной длины, совместно с кинетическими данными гидролиза пентапептидных субстратов под действием соматического АПФ быка [Binevski FEBS Letters 2003] позволяет говорить, что, по-видимому, длина лиганда в пять-шесть-семь аминокислот является граничной для реализации взаимозависимого или независимого механизмов функционирования активных центров соматического АПФ.

Рис. 6.

о

Ингибирование тепротидом реакции гидролиза брадикинина под действием соматического АПФ быка. Условия: 50 мМ Нерез, рН 7,5, содержащий 150 мМ ЫаС1, 1мкМ2пС12, 25°. Концентрация фермента — 10 нМ, концентрация брадикинина — 70 мкМ.

ю-11 10-'° ю-» ю" ю-' ю* 10' Р]„.м

Поскольку рассмотренные данные по ингибированию «короткими» и «длинными» ингибиторами активности соматического фермента были получены как на ферменте быка, так и на ферменте человека, которые продемонстрировали одинаковые закономерности, можно сделать вывод, что вне зависимости от природы лиганда (субстрата или ингибитора), его длина/структура определяет наблюдаемый характер функционирования активных центров соматического АПФ.

Трудно представить, что различная «реакция» фермента на «длинные» и «короткие» лиганды осуществляется без изменения структуры самого фермента. Более того, поскольку функционирование одного активного центра может оказывать влияние на функционирование другого активного центра, то, по всей вероятности, возможные изменения происходят не только в структуре соматического АПФ, но и затрагивают уровень однодоменного АПФ. Поэтому с тем, чтобы выявить и определить природу возможных конформационных изменений, в дальнейшем мы работали с однодоменным АПФ.

VI. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Ы-ДОМЕНА С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Удобным инструментом для детекции изменения поверхности белка, а, следовательно, и изменения самой структуры белковой глобулы, являются моноклональные антитела (тАЬ). Поскольку на момент начала этой работы в основном имелись антитела только к Ы-домену АПФ, мы работали именно с этим ферментом. Из пула моноклональных антител к И-домену АПФ человека мы выбрали антитела, ингибирующие активность И-домена (ЗА5 и ¡2Н5), поскольку за образованием комплекса фермент-антитело легко следить как в растворе, так и на плашке. Мы предположили, что ингибирующий эффект этих антител может быть вызван тем, что их связывание с ферментом мешает приобретению последним каталитически активного конформационного состояния. Однако мы не исключали и возможность того, что антитела просто могут создать механическую преграду для встраивания субстрата в активный центр фермента. С тем, чтобы выявить причины ингибирования, а тем самым и возможные конформационные изменения структуры однодоменного АПФ, необходимо было определить точный механизм ингибирования антителами ЗА5 и ¡2Н5 активности М-домена АПФ человека. Исследование взаимодействия моноклональных антител с Л-доменом

АПФ в растворе показало, что моноклональные антитела ингибируют его активность при гидролизе СЬг-РЬе-Шв-Ьеи по полному смешанному механизму ингибирования (схема 5).

ЕтАЬ

ЕЭтАЬ

Схема 5.

Е + продукт Кинетический механизм

ингибирования моноклональными антителами (ЗА5 и ¡2Н5) активности Ы-домена АПФ в растворе при гидролизе трипептидного субстрата СЬг-РЬе-Шз-Ьеи.

Следует отметить, что в исследуемой системе уже присутствует лиганд -«короткий» субстрат СЬг-РИе-Н^-Ьси. Полный смешанный механизм предполагает, что шАЬ связывается как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом. При этом только комплекс ЕБ приводит к образованию продукта, т.е. связывание антитела с ферментом полностью блокирует гидролиз субстрата. Оказалось, что в обоих случаях шАЬ лучше связываются с фермент-субстратным комплексом, т.е. 1СтАь> /Спаь-

С тем, чтобы подтвердить полученные данные, мы исследовали взаимодействие обоих тАЬ ЗА5 и ¡2Н5 с №-домсном АПФ в присутствии другого «короткого» лиганда -ингибитора лизиноприла. Для слежения за образованием комплекса антиген-антитело мы использовали твердофазный иммуноферментный анализ. В этом методе на дно полистирольного планшета сорбировали К-домен, затем наносили слой моноклональных антител ЗА5 или ¡2Н5 против М-домена. Количество образовавшегося комплекса определяли с помощью конъюгированных с пероксидазой анти-антител, направленных против иммуноглобулинов мыши. Оказалось, что в присутствии лизиноприла наблюдается такой же эффект - увеличение связывания тАЬ с ферментом, т.е. взаимодействие

Таблица 4. Константы диссоциации комплекса антиген-антитело в присутствии и в отсутствие лиганда (субстрата или ингибитора).

лиганд тАЬ £тЛЬ, нМ Л'тАЬ, н\1

Субстрат ЗА5 4,7 0,90

СЬг-РЬе-ШБ-Ьеи ¡2115 2,9 0,7

Ингибитор ЗА5 2,9 0,90

лизиноприл ¡2115 1,73 0,53

антител ЗА5 и i2H5 с N-доменом может быть описано уравнением ^ ^ EmAb в

mAb _

отсутствие ингибитора и уравнением EI ■ ElmAb в присутствии ингибитора (табл.

4).

Итак, данные по связыванию обоих mAb с N-доменом АПФ ясно свидетельствуют об осуществлении конформационных изменений при связывании лиганда с активным центром фермента.

Опубликованные нативная и лиганд-связанная структуры С-домена АПФ человека идентичны и представляют собой вытянутую вдоль одной оси глобулу с активным центром, расположенным в середине тоннеля, проходящего сквозь всю глобулу белка. Однако оказалось, что нативная структура С-домена содержит связанные в активном центре молекулы ацетата и N-карбоксиаланина, т.е. она вряд ли может считаться структурой свободного фермента. Более того, диаметр входного отверстия в тоннель активного центра в структуре С-домена составляет около ЗА, тогда как, например, расстояние между крайними атомами углерода бензильной группы фенилаланина (который часто входит в состав как природных, так и синтетических субстратов АПФ), составляет 4,ЗА. Это несоответствие предполагает, что для того, чтобы связать лиганд, в молекуле фермента должны произойти конформационные изменения.

Исследование трехмерной структуры недавно открытого структурного гомолога АПФ - однодоменного фермента АПФ2 - показало, что при связывании лиганда с активным центром АПФ2 молекула этого фермента претерпевает структурные изменения, называемые «hinge-bending movement», т.е. «раскрывание-закрывание». Исходно структуру свободного фермента можно представить в виде раскрытой книги, с внутренней стороны корешка которой находится активный центр. Связывание лиганда в активном центре вызывает структурные изменения в глобуле фермента, в ходе которых книга закрывается. Аналогичный механизм наблюдается и в случае других структурных гомологов АПФ и АПФ2: нейролизина и тимет-олигопептидазы человека. Не исключено, что подобный механизм характерен и для таких структурных гомологов АПФ, как дипептидил-карбоксипептидаза Dcp из Е. coli и карбоксипептидаза из Pyrococcus fUriosus. Таким образом, можно предположить, что подобное конформационное изменение в структуре молекулы фермента — «.hinge-bending movement» — может оказаться характерным для всех известных на сегодняшний день структурно сходных ферментов семейства Gluzincins.

С тем, чтобы иметь возможность проанализировать высказанное выше предположение о возможности конформационных изменений при связывании лиганда с однодоменным АПФ и, вследствие этого, объяснить различную эффективность

связывания тАЬ со свободной и лиганд-связанной формами фермента, мы построили как «закрытую», так и «открытую» модели структуры Ы-домеиа АПФ человека. В качестве белков-шаблонов были выбраны С-домен АПФ и АПФ2, соответственно. Эпитопное картирование поверхности М-домена показало, что аминокислотные остатки, входящие в эпитоп связывания тАЬ ¡2Н5, находятся на обеих сторонах открывающейся «книги» активного центра (рис. 7А и В). Связывание антитела с ферментом может вызывать «замораживание» молекулы фермента в определенном конформационном состоянии, препятствуя необходимому для катализа движению «открывание-закрывание». Важно, что предпочтительной для связывания антитела оказывается «закрытая» конформация.

Рис. 7. Эпитопы тАЬ ¡2Н5 (А и В) и ЗА5 (С и О) на поверхности «открытой» (А и С) и «закрытой» (В и О) моделях структуры 1Ч-домена,

построенных на основе трехмерных структур АПФ2 (РОВ 11*42) и С-домена (РЭВ Ю8А), соответственно.

при которой обеспечивается полнота связывания тАЬ со всеми необходимыми аминокислотными остатками, что может объяснить найденную на практике разницу в величинах АТтАь и ЛГтль, т.е. переход АПФ из «открытой» в «закрытую» конформации при связывании лиганда.

Для моноклональных антител ЗА5 причины ингибирования активности фермента иные, однако, они также могут быть связаны с конформационными изменениями в молекуле Г*}-домена АПФ, происходящими в ходе связывания лиганда. Использование программы по расчёту движения белковых молекул ОупГЗот позволило обнаружить, что некоторые аминокислоты, входящие в эпитопы ¡2Н5 и ЗА5 претерпевают изменение торсионных углов при движении «открывание - закрывание» глобулы. Таким образом, фиксация этих аминокислотных остатков также может препятствовать конформационному переходу в глобуле АПФ.

1<-домен по С-домену 1Ч-домен по АПФ2

Рис. 8. Подвижные области на поверхности Ы-домена АПФ, моделированной на основе трехмерных структур С-домена (РОВ Ю8А) и АПФ2 (РОВ №42). Анализ проведён с использованием программы ОупОот. Аминокислотные остатки, окрашенные в синий цвет, участвуют в связывании шАЬ ¡2Н5, в зелёный - шАЪ ЗА5, в красный цвет окрашены аминокислотные остатки, которые участвуют в конформационных перестройках структуры ТЯ-домена при движении «открывание-закрывание».

Кроме того, при переходе >1-домена из «открытой» в «закрытую» конформацию меняется также относительная позиция некоторых элементов вторичной структуры

фермента. Так, например, видно, что положение а-спиралей all, a27 и alO, a31, аминокислоты которых входят в эпитоп связывания антитела ЗА5, в «открытой» структуре N-домена и «закрытой» структуре N-домена, соответственно, отличается (рис. 8).

Таким образом, изучение взаимодействия ингибирующих моноклональных антител с N-доменом в сочетании с эпитопным картированием поверхности N-домена позволили предположить возможный механизм функционирования однодоменного АПФ, основанный на конформационных перестройках молекулы (механизм «hinge-bending movement») при связывании лиганда (субстрата или ингибитора).

В случае полноразмерного соматического АПФ влияние связывания лиганда на его конформацию можно представить следующим образом. На рисунке 9 представлено схематичное изображение фермента с двумя активными центрами. По-видимому, встраивание больших молекул, таких как ангиотензин I, брадикинин или тепротид, предполагает реализацию максимально возможного числа потенциальных многоточечных взаимодействий лиганда с поверхностью щели активного центра. Другими словами, взаимодействие этих пептидов с активным центром, расположенном на одном из доменов, не вызывает совсем или вызывает незначительные изменения в структуре фермента. Этим может объясняться возможность одновременного связывания двух «длинных» молекул лиганда с молекулой полноразмерного АПФ (рис. 9А). В тоже время, длина «короткого» лиганда предполагает образование существенно меньшего числа потенциальных связей, фиксирующих его в активном центре фермента. Поэтому эффективное присоединение «короткого» лиганда требует дополнительной «подстройки» молекулы фермента (рис. 9В) при «закрывании» щели активного центра фермента. Однако более сильные конформационные изменения в одном домене при закрывании его активного центра препятствует закрыванию другого, в результате чего и может проявляться отрицательная кооперативность активных центров АПФ.

^ Щр

А В

Рис. 9. Предполагаемая модель совместного функционирования активных центров соматического АПФ при гидролизе «длинных» (А) и «коротких» субстратов (В).

выводы

1. Продемонстрирована разница в субстратной и ингибиторной специфичности активных центров, расположенных на N- и С-доменах ангиотензин-превращающего фермента человека в реакциях гидролиза ряда пептидных субстратов: природных субстратов ангиотензина I, [Met5]- и [Ьеи5]-энкефалина и семи синтетических субстратов (С-концевых аналогов ангиотензина I - Hip-His-Leu, Cbz-Phe-His-Leu и пяти фурилакрилоильных производных трипептидов - FA-Phe-Gly-Gly, FA-Phe-Ala-Ala, FA-Phe-Phe-Arg, FA-Phe-Ala-Lys и FA-Phe-Ala-Pro), а также при связывании ингибиторов различной структуры (тепротида, РР-50 и РР 55-119).

2. Выявлено, что формально-кинетический механизм функционирования двух активных центров в составе ангиотензин-превращающих ферментов человека и быка является общим для этих ферментов и определяется структурой связываемого лиганда (субстрата или ингибитора): при связывании «коротких» лигандов наблюдается сильная отрицательная кооперативность активных центров фермента, связывание «длинных» лигандов осуществляется при независимо функционирующих активных центрах фермента.

3. Определена локализация эпитопов связывания моноклональных антител ЗА5 и ¡2Н5 на поверхности N-домена ангиотензин-превращающего фермента человека и показано, что связывание лиганда (субстрата или ингибитора) с N-доменом приводит к увеличению эффективности связывания с ферментом моноклональных антител.

4. На основании анализа структуры N-домена ангиотензин-превращающего фермента

человека совместно с данными по влиянию связывания лиганда на эффективность связывания N-домена с моноклональными антителами продемонстрирована возможность существования двух конформационных состояний молекулы однодоменного АПФ, переход между которыми, т.н. «hinge-bending movement», осуществляется при встраивании лиганда в активный центр фермента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Skireello O.E.. Binevski P.V., Pozdnev V.F., and Kost O.A. Kinetic probes for inter-domain co-operation in human somatic angiotensin-converting enzyme (2005) Biochem. J., 391, 641647.

2. Skireello O.E.. Balyasnikova I. V., Binevski P. V., Sun Zhu-Li, Baskin I. I., Palyulin V. A., Nesterovitch A. B., Albrecht II R. F., Kost O. A., and Danilov S. M. Inhibitory Antibodies to Human Angiotensin-Converting Enzyme: Fine Epitope Mapping and Mechanism of Action (2006) Biochemistry, 45, 4831-4847.

3. Skireello P.. Binevski P.V., Kost O., Two Active Sites of Angiotensin-Converting Enzyme: Substrate-Dependent Mechanism of Action (2002) Intertnational Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications, Moscow, p. 136.

4. Скиргелло O.E.. Биневский П.В., Кост O.A. Механизм совместного функционирования активных центров ферментов семейства АПФ при гидролизе коротких субстратов (2003) Конференция молодых учёных, аспирантов и степендиатов фонда им. И.В. Березина «Инженерная энзимология», Москва, с.29.

5. Skireello О.. Kost О., Balyasnikova I., Sun Z., Albrecht R. II., Danilov S. Anti-calalytic Antibodies for Angiotensin I-Converting Enzyme: Inhibitory Effect and Fine Epitope Mapping (2005) Intertnational Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals & Applications, St. Petersburg, p. 111.

6. Balyäsnikova I.V., Skireello O.E. Sun Z-L, Binevski P.V., Albrecht R.FII, Kost O.A. and Danilov S.M. Anticatalytic Antibodies for Angiotensin I-Converting Enzyme: Fine Epitope Mapping and Inhibitory Effect (2005) IV Meeting of International Society of Proteolysis, Quebec, p. 224.

7. Напсрова И.А., Скиргелло O.E.. Биневский П.В., Позднее В.Ф., Кост O.A. Определение механизма ингибирования ангиотензин-превращающего фермента ингибиторами РР-55-119 и РР-50 (2006) Международная конференция «Биотехнология и Медицина», Москва, с. 216.

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 374 Тираж 100 экз.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. СТРОЕНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ 9 МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТОВ

II. СВОЙСТВА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ К- И С-ДОМЕНОВ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО 19 ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

II. 1. Субстратная специфичность С- и Ы-доменов ангиотензин- ^ ^ превращающего фермента быка

11.2. Взаимодействие активных центров ангиотензин-превращающего фермента с конкурентными ингибиторами

III. ХАРАКТЕР СОВМЕСТНОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ В СОСТАВЕ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИН- 39 ПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

IV. 1. Материалы

1У.2. Методы исследования

ГУ.2.1. Синтез аффинного сорбента

IV.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензин- ^ превращающего фермента быка и человека

1У.2.3. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензинпревращающего фермента быка и С-домена АПФ человека

1У.2.4. Получение М-домена соматического ангиотензин- ^ превращающего фермента

IV.2.5. Определение концентрации и чистоты выделенных ^ препаратов фермента

IV.2.6. Кинетические измерения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

V. ПОЛУЧЕНИЕ ТРЕХ ФОРМ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЬЬ

VI. РОЛЬ ДЛИНЫ СУБСТРАТА ПРИ СОВМЕСТНОМ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ СОМАТИЧЕСКОГО 70 АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА

VI. 1. Гидролиз субстратов под действием различных форм ^ ангиотензин-превращающего фермента человека и быка

VI. 1.1. Гидролиз трипептидных субстратов

V. 1.2. Гидролиз энкефалинов и ангиотензина I

V.2. Совместное функционирование активных центров соматического ^

АПФ человека при гидролизе субстратов различной длины

У.2.1. Кинетический механизм совместного функционирования активных центров соматического ангиотензинпревращающего фермента человека

У2.2. Количественная оценка ухудшения связывания второй молекулы субстрата с соматическим ангиотензинпревращающим ферментом человека

VI. СОВМЕСТНОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ

СОМАТИЧЕСКОГО АПФ ПРИ ПОДАВЛЕНИИ ЕГО АКТИВНОСТИ 93 ИНГИБИТОРАМИ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

VI. 1. Подавление активности соматического ангиотензинпревращающего фермента лизиноприлом и каптоприлом ^ короткими» ингибиторами) в реакциях гидролиза субстратов различной структуры

VI.2. Подавление активности соматического ангиотензин-превращающего фермента «длинным» ингибитором

VI.2.1. Количественные характеристики связывания тепротида с соматическим ангиотензин-превращающего фермента 107 быка

VII.2.2. Механизм ингибирования тепротидом реакций гидролиза субстратов разной длины под действием соматического ангиотензин-превращающего фермента

У1.3. Влияние ингибиторов промежуточной длины на активность ^ соматического ангиотензин-превращающего фермента

УИ.3.1. Количественные характеристики связьюания РР-50 и РР у^ 56-119 с ангиотензин-превращающим ферментом

УИ.3.2. Ингибирование РР-50 и РР 56-119 активности соматического ангиотензин-превращающего фермента

УИ.4. Влияние длины ингибитора на механизм подавления активности соматического ангиотензин-превращающего фермента человека

VII.4.1. Ингибирование активности сомАПФч лизиноприлом при j^ ^ гидролизе субстратов различной длины

VII.4.2. Ингибирование активности АПФ человека тепротидом при гидролизе субстратов различной длины

VIII. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ N-ДОМЕНА С ПОМОЩЬЮ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

VIII.l. Механизм ингибирования активности ангиотензинпревращающего фермента человека моноклональными антителами ЗА5 и Í2H

VIII.2. Влияние лизиноприла на эффективность связывания антител с N-доменом ангиотензин-превращающего фермента человека

VIII.3. Определение констант диссоциации комплекса моноклональных антител ЗА5 и Í2H5 с N-АПФч в присутствии 146 лизиноприла

VIII.4. Моделирование структуры N-домена по С-домену ^ ангиотензин-превращающего фермента человека

VIII.5. Эпитопное картирование поверхности N-домена ангиотензин- j^ превращающего фермента человека

VIII.6. Моделирование структуры N-домену ангиотензинпревращающего фермента человека по ангиотензинпревращающему ферменту II

ВЫВОДЫ

Ангиотензин превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает чрезвычайно сложной организацией. Его строение особенно тем, что полноразмерный (соматический) АПФ представляет собой два гомологичных домена (С- и >!-), свёрнутых из единой полипептидной цепи. Оба домена каталитически активны, т.к. каждый содержит активный центр. При достаточно высокой (около 68%) гомологии доменов, они характеризуются разными физико-химическими свойствами (стабильностью, степенью гликозилирования и т.д.). Сложности в изучении каталитических свойств отдельно взятого домена в составе полноразмерного фермента связаны с тем, что активные центры АПФ взаимодействуют с одним кругом субстратов и ингибиторов, но с несколько разной специфичностью.

В течение долгого периода в литературе параллельно существовали мнения, свидетельствующие как в пользу полностью независимого характера функционирования активных центров АПФ, так и взаимозависимого. Недавно на примере АПФ быка было показано, что характер функционирования активных центров фермента дуалистичен и определяется длиной субстрата. Фермент может функционировать как два полностью независимых фермента, что наблюдается при гидролизе декапептидов, так и как фермент с одним «усредненным» активным центром, что осуществляется при гидролизе трипептидных субстратов. Однако существующие в литературе противоречивые кинетические данные по гидролизу субстратов под действием АПФ не позволяют без проверки распространить полученную зависимость механизма функционирования активных центров АПФ быка от длины субстрата на АПФ из других источников, в частности, на АПФ человека, являющегося практически более значимым. Аминокислотная последовательность АПФ человека отличается от последовательности АПФ быка, а, следовательно, эти ферменты несколько отличаются и пространственной организацией молекулы, что влечёт за собой отличия в субстратной специфичности, способности взаимодействовать с ингибиторами и, возможно, в механизме совместного действия активных центров в составе соматического АПФ. Исследование такого рода особенно важно в связи с физиологической значимостью фермента человека, природные субстраты которого представляют собой как нонапептид брадикинин, декапептид ангиотензин I, так и тетрапептиды - гемопоэтический фактор стволовых клеток И-Ас-Бег-Аэр-Ьуз-Рго, люлиберин ЬН-ЯН. Кроме того, поскольку ингибиторы АПФ являются первым средством при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, важно также выяснить, зависит ли механизм ингибирования фермента от длины ингибитора.

Целью данной работы явилось выявление общего механизма совместного функционирования активных центров АПФ человека и быка при взаимодействии с лигандами (субстратами и ингибиторами) различной длины. Кроме того, с помощью исследования однодоменной формы фермента сделана попытка объяснить причины, вызывающие отрицательную кооперативность двух активных центров соматического АПФ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Ангиотензин-превращающий фермент, представляющий собой два каталитически активных домена, С- и 14-, в составе одной полипептидной цепи [1], -ведущий фактор целостной ренин-ангиотензиновой системы, ответственной за уровень кровяного давления в организме. Оба домена соматического фермента участвуют в поддержании необходимой концентрации физиологически активных пептидов в крови: вазопрессора ангиотензина II (образующегося путём отщепления дипептида от ангиотензина I) [2] и вазодилятора брадикинина (последовательно расщепляемого до брадикинина1'7 и брадикинина1*5) [3]. Кроме гидролиза основных физиологических субстратов, АПФ способен отщеплять С-концевые дипептиды от различных других олигопептидных субстратов с не заблокированным С-концом. В некоторых случаях АПФ способен функционировать как эндопептидаза отщепляя С-концевые трипептидамиды от люлиберина [4] и вещества Р [5] и даже три- и дипептиды с Ы-конца этих субстратов, соответственно [4, 6].

В организме синтезируются две физиологически активные формы АПФ: уже упомянутый двудоменный соматический фермент, состоящий из 1306 аминокислот [1], и однодоменная тестикулярная форма АПФ, соответствующая аминокислотной последовательности С-домена соматического фермента, за исключением 36 аминокислот с N конца, образующих уникальную последовательность тестикулярного АПФ [7, 8]. Тестикулярный фермент был обнаружен только в репродуктивных органах, и, по-видимому, участвует в процессах сперматогенеза и овуляции [7, 9-15]. Кроме того, в кишечной жидкости была найдена третья форма АПФ - >1-домен [16]. Внутриклеточный синтез этого фермента маловероятен, так как весь фермент, выделенный из кишечных тканей, являлся полноразмерной формой фермента. Возможно, учитывая высокую концентрацию этой формы в подвздошной жидкости (около 2%), она, так же как и соматический АПФ кишечника, принимает участие в процессах пищеварения. Вместе с тем, поскольку форма, соответствующая И-домену АПФ, была обнаружена у больных при операциях на кишечнике, нельзя исключать, что образование этой формы является патологией.

I. СТРОЕНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ АНГИОТЕНЗИН

ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТОВ

АПФ принадлежит классу цинк-зависимых пептидаз семейства глюцинкинов. Выделяют [17] два характеристических участка в последовательности ферментов этого семейства, которые содержат аминокислоты, составляющие ближайшее окружение атома цинка, т.н. Zn связывающий мотив. При этом эти участки могут отстоять друг от друга на некотором расстоянии, которое варьируется от двух-трёх аминокислот до ста и более. Интересно отметить, что расстояние между этими участками консервативных аминокислот характеризует вторичную структуру данной области [17]. Так, расстояние в три аминокислоты наблюдается в а-спирали, а одна аминокислота - в Р-листе. Кроме аминокислот в ближайшее окружение атома Zn входит необходимая для катализа молекула воды. Ион цинка поляризирует или ионизирует связанную с ним молекулу воды, которая, активировавшись, нуклеофильно атакует карбонильную группу субстрата [18]. В координации иона металла участвуют четыре или пять донорных атома, которые и составляют его тетраэдрическое или бипирамидальное окружение [18].

Последовательность цинк-связывающего мотива обоих доменов АПФ, подобно другим представителям класса металлопептидаз - термолизину, карбоксипептидазе А или нейтральной эндопептидазе 24.11 (неприлизин), состоит из His-Glu-X-X-His.Glu-X-X-X-Asp [18]. С использованием метода точечных мутаций были определены номера ключевых аминокислот цинк-связывающего мотива каждого домена. Так, рекомбинантные формы соматического АПФ человека, содержащие замены либо остатков His361 и His365, либо остатков His959 и His963 на аминокислоту Lys приводили к заметной потере каталитической активности двудоменного фермента [19]. Более того, этот результат позволил однозначно сказать, что оба домена в соматическом АПФ активны. Аналогичный результат показала замена Glu362 в N-домене или Glu960 в С-домене на аспарагиновую кислоту: двудоменный фермент, содержащий мутации в одном из доменов обладал меньшей активностью по сравнению с интактным двудоменным АПФ [19]. По аналогии с другим представителем семейства Zn-зависимых пептидаз, термолизином, авторы [19] предположили, что оба остатка His как в С-домене, так и в N-домене являются Zn-координирующими лигандами, что полностью подтвердилось с опубликованием трёхмерных структур доменов [20, 21].

Замена Glu987 в С-домене АПФ на остаток валина приводила к полной потере ферментативной активности, а замена на аспарагиновую кислоту - к уменьшению значения ккат в 300 раз [22]. Вследствие того, что С-домен, содержащий мутацию в 987 положении не связывает ингибитор [3Н]трандолаприлат, взаимодействие которого с активным центром фермента является Zn-зависимым, авторы [22] постулировали, что Glu987 в С-домене наряду с His959 и His963 является третьей аминокислотой, координирующей атом Zn. Аналогичной аминокислотой в N-домене является остаток Glu389 [19]. Было обнаружено [22], что остаток Asp991 также необходим для проявления каталитической активности, возможно, координируя цинк-связывающий His959.

Остатки Туг и Lys были идентифицированы как аминокислоты, входящие в состав активного центра тестикулярной и С-домена соматической форм фермента кролика [23, 24] с помощью химической модификации 1-фтор-2,4-динитробензолом, который инактивировал обе формы АПФ. Потеря активности могла быть частично предотвращена присутствием конкурентных ингибиторов АПФ. Анализ аминокислотной последовательности модифицированных ферментов показал, что это Lys694 и Туг776 (номера указаны для АПФ человека) [24]. Исследование мутантных форм тестикулярного АПФ кролика [25] показало, что формы только с одной мутацией (Lys-»Glu или Tyr->Phe) демонстрировали те же каталитические свойства, что и интактный фермент. В отличие от этого, двойной мутант (Lys-»Glu и Tyr-»Phe) проявлял совершенно другие свойства: для гидролиза синтетического субстрата Hip-His-Leu наблюдалось 20-ти кратное уменьшение ккат и 6-ти кратное увеличение Кт; кроме того, было продемонстрировано уменьшение влияния хлорида на ферментативную активность. Эти наблюдения позволили сделать вывод, что остатки лизина и тирозина не влияют прямо на ферментативные функции тестикулярного АПФ кролика, а изменения каталитических свойств двойного мутанта видимо связаны с изменением третичной структуры фермента [25].

Функциональная роль остатка Туг776 в С-домене АПФ человека была исследована с помощью его мутации на фенилаланин [26]. У мутантной формы наблюдалось 15-ти и 7-ми кратное уменьшение значения kmr гидролиза FA-Phe-Gly-Gly и ангиотензина I, соответственно. Изменение величины Кт было незначительным, а константа активации хлоридом осталась такой же, что и у интактного фермента. С другой стороны, мутантная форма продемонстрировала 100-кратное уменьшение аффинности к специфическому ингибитору АПФ лизиноприлу, который, как полагают, можно рассматривать как аналог переходного состояния субстрата [27]. Таким образом, был сделан вывод о том, что остаток Туг776 не вовлечен ни в субстратное, ни в хлоридное связывание и не является критичным для катализа; возможно, он влияет на скорость гидролиза субстрата путем стабилизации переходного комплекса по аналогии

I Ой с Туг карбоксипептидазы А [28].

Кроме того, недавно обнаружено, что остаток His1089, расположенный на С-домене АПФ человека, также принимает участие в катализе [29]. Его роль заключается в стабилизации переходного комплекса путем образования водородной связи с карбонильной группой Pi остатка связанного субстрата или ингибитора [29]. Замена этого остатка на Ala приводила к ухудшению гидролиза ангиотензина I в 430 раз, а замена на Leu - в 4000 раз. Более того, мутация His-»Ala вызывала ухудшение связывания лизиноприла на пять порядков [29]. Мутации His1089 в активном центре С-домена АПФ приводили к смещению pH-оптимума в кислую область. Поскольку для остальных ферментов семейства глюцинкинов характерно смещение pH-оптимума при подобных мутациях в щелочную область, было высказано предположение, что каталитический механизм АПФ отличен от остальных ферментов этого семейства [29].

Было показано [30], что Arg1098, входящий в состав активного центра С-домена, играет важную роль в активации АПФ хлорид-ионами. В отсутствие этих активаторов тестикулярный АПФ, как в нативной, так и в мутантной форме (Argl098Gln), проявлял низкую активность. Однако при изменении концентрации С1 от 0 до 20 мМ эффективность катализа нативной формой фермента при гидролизе ангиотензина I увеличилась в 55 раз, а мутантной - осталась неизменной. Аналогичные результаты были получены и для кишечной формы АПФ, соответствующей N-домену фермента, где, как было показано, решающую роль в активации галоген-анионами играет остаток Arg500 [30]. Значимость остатка Arg при катализе АПФ авторы связывают с образованием фермент-СГ-субстратного комплекса, при формировании которого происходят конформационные изменения активного центра фермента. При этом решающая роль отводится именно строению Arg, поскольку его замена на похожий по структуре и по заряду остаток Lys привела к гораздо меньшей зависимости эффективности катализа от концентрации С1 как в С-, так и в N-домене АПФ [30].

Особенности ферментативного катализа субстратов под действием активных центров АПФ авторы [31] связывают с хлоридной зависимостью. Так, например, было отмечено, что гидролиз субстрата Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-Ala-EDDnp демонстрирует большую зависимость от концентрации С1, чем гидролиз субстрата Abz-Phe-Arg-Lys(Dnp)Pro-OH [32]. Это может свидетельствовать о том, что отсутствие отрицательного заряда на С-конце в случае первого субстрата компенсируется хлорид-ионами [31]. Основываясь на высокой степени гомологии активных центров АПФ с другими, упомянутыми выше, протеазами, авторы [31] предложили возможный ферментативный механизм гидролиза субстратов под действием АПФ.

Структуру С-домена АПФ в комплексе с лизиноприлом [20] можно рассматривать как модель переходного состояния [31]. На рисунке 1 представлен механизм гидролиза субстрата под действием какого-либо из активных центров АПФ. Атом цинка, выступая как основание Льюиса, оттягивает на себя часть электронной плотности от кислорода молекулы воды, тем самым облегчает образование связи между кислородом (от молекулы воды) и углеродом расщепляемой пептидной связи. С другой стороны активная группа ЕЗ (Glu960 в С-домене/Glu362 в N-домене) из His-Glu-X-X-His мотива также благоприятствует нуклеофильной атаке активированной водой атома углерода расщепляемой амидной группы, образуя тетраэдрический интермедиат (рис. 1). Остаток Glu, кроме того, способствует переносу протона от воды к атому азота атакуемой амидной связи, что делает образующийся амин хорошей уходящей группой. Кроме того, протонирование этого атома азота облегчается благодаря образованию водородной связи между первым атомом водорода рассматриваемой амидной группой и атомом кислорода группы В (А1а332/А1а930), а также благодаря правильной ориентации атома азота этой амидной группы, обеспечиваемой совместно с помощью групп HI (His33'/His929) и В (рис. 1) [31].

Аминокислота Н6 (His1089/His491) также играет важную роль в стабилизации переходного состояния через образование водородной связи с карбонильной группой в Pi' положении, т.к., как упоминалось выше, мутация этой аминокислоты вызывает изменения в каталитических свойствах фермента [29]. Группе Y7 (Туг1098/Туг501) отводится ключевая роль в активации хлоридом активности С- и N-доменов. Предполагается, что эта аминокислота стабилизирует отрицательный заряд кислорода Pi группы субстрата (рис. 1) [30, 31], что наблюдается в кристаллической структуре С-домена в комплексе с лизиноприлом (рис. 1) [20].

Итак, перечислим ключевые аминокислоты, участвующие в каталитическом расщеплении субстратов под действием С- и N-доменов АПФ. Непосредственное окружение атома Zn в активных центрах АПФ, образующих с участием молекулы воды тетраэдр, составляют остатки His959/ His361, His963/ His365 и Glu987/Glu389 (С-домен/N-домен). Нуклеофильную атаку расщепляемой пептидной связи осуществляют аминокислоты G1u960/G1u362, А1а332/А1а930, His1089/His491 и Туг1098/Туг501. При этом, по-видимому, все перечисленные аминокислоты необходимы как непосредственно для каталитического расщепления субстрата, так и для связывания субстрата, поскольку их мутация в большей или меньшей степени негативно воздействует на обе константы, и на А;кат, и на Кт. Очевидно, что различия в кинетических параметрах гидролиза субстратов АПФ под действием С- и N-доменов обусловлены различиями в аминокислотном составе подсайтов Б'г, в'ь 8], 8г и т.д. активных центров АПФ. В работе [21] авторы выделили несовпадающие аминокислотные остатки каждого из подсайтов активных центров в С-домене и К-домене фермента (табл. 1, рис. 2).

Таблица 1. Отличающиеся аминокислоты подсайтов активных центров С- и >1-доменов АПФ (нумерация по соматическомуАПФ) [21]. с С-домен 01и979 РЬе967 Уа11094

И-домен Аг8381 Туг369 ТЬг496 о С-домен Уа11094 8ег1092 01и719

31 М-домен ТЬг496 Азп494 8ег119

8'. С-домен 01и738 А8П853 вег860 01и948 Азп950 01и952 Азр953 Уа1956

М-домен Азр140 А8Р255 01и262 Аге350 ТИТ352 Азр354 01п355 ТЬг358 в'2 С-домен ТЬг858 Эег860 01и952 Уа1955 Уа1956 Азр1029

М-домен Зег260 Азр262 Азр354 вег357 ТЬг358 01и431

Рассмотрим подробнее как различия в строении активных центров АПФ отражаются на их функционировании при гидролизе субстратов и взаимодействии с конкурентными ингибиторами. кимилскс Михаг комплекс Мнхагчиса Н1 р н н л 1/ . о е

НЧ-. *

О;—H2N—Ьу«1Ш»4а9 у7 СГ Г И р," А но ■ * \ 0

ТугЮвМв» активация хлорид-ионом

Н2 ' 114

Е5 ® мн мн2 я.

Н-домещОсвмьватаций мен!р(

А1В1098 £ Мс!?'«

С-Д0мен1С1-0|1МыбЛ0»ш»й 1*"Т|>)

Лф|04| о-ЫН-^Н

NN

II

О-"-Н2М-1у«10М»«9

••но^.

Тут10«/49»

О"" Н^-1.у»1М9М49

НО

Тут10евМ9в

Агв5«0—им-с—МН2 АцКт-ИН-С—МН2 I !

СдоиЦ&са«ыммы*й цантр)

•НО-.

Тут10вбМ9> переходный комплекс

Рис. 1. Механизм ферментативного гидролиза субстрата под действием АПФ

614624 634 с-АСЕ : УТЯШЕЭБКЙ 7еейвятзоу ЖШЕУАЕЯМИ КГ-АСЕ : 8А@С20Щ АОЗЦМБЗАЕО ЩЬГОЗУАЭБЩ

654 664

Зт ЗК1ЬЬ0КШ0 1аштькуЯт

А1Ш0ЕЕААЬЕ БОЕРАБАшЬ

674

691

701

711

С-АСЕ : О0ККРБУ№Ь ШтЯ---1кЯ ЩкиЖоеЛЕЯ 0АЩА<2ЕЬЕЕ ЩкхЗьО^ЕТ ТЩ/01 И-АСЕ : к"кЕЬУЕР™ ^¡кЗордью" ЩСАЩЯтЭсЗ 0МЩЬАККОО Щ|Аь|зКЩЗН 1ЩТЩК

101

III

731 739 749 759 769 779 с-асе : Я—СЗЙЬОЯЕ 0КЙЕЕ>ШЯ ¡ЖЯОКАЯКА 1ЬОРЯРКУУЕ ЯгЯоЙАкияЯ

КТАТЭИБДО ВЯЕВЬЬ'З" "ЗЦАМЩР™ ЯШАА"1Р ЬКРЬЗебрта |ЗЩЕ|УКОВЩ

131 141 151 161 171 181

КГ-АСЕ : ¡¡¡КТАТ^Здо

131 141

769 779

Ш"ИА 1Ь0РЙРКУУЕ ¡¡^О^АШ^ . ЬКРЬЗебрта

С-АСЕ N-ACE

789

РТ|"

191

ЖАЖОвЩ

799 809 819

ЕТЙЗьВога ЩКЬРЯ

1БЦТР1аШ ШНЬШОдЕ!

201

211

829 839

ШЩНЩао

241

С-АСЕ Ы-АСЕ

859 869 879 889 899

2?т ЖбаЕБМЕтЯ ЕАЩкЗИтр кн^КЕЯвоБ ЯСТа?

0§б "вВЯУВЙ ЩокртиЗун гтЭо^^А тн®ку§еещ ЗВЯы"

261 271 281 291 301

909

С-АСЕ : Ы-АСЕ :

ЖжЕазш щтЯ

МЕсШш Я?А1»

919 шес

GREWC СИЕУУС

929

311

939 33

ШШ» Ш 949 959

ЯтаГт ^ЬЕЕ>!|\Л/АЙ1

321

331

341

ШТ ШЬЕМ\Л^А| и щтмлоЗБТУЩ

351

НЕКГС тая

НЕУЮ И

361

С-АСЕ Ы-АСЕ еЕ АМРСРН | КОУЬАЬБУБ ■тр бщ АЫРСРН 1СШ/ЪАЬБУБ 1тр

381

391

401

1009 1019

ЗБЫЛ АззессбЫЗН ЯкюЗ |ок\тготГ

411

С-АСЕ И-АСЕ

1029 ч

431

29 10391049 1059 1069

ОЯЗ1ткегЯ ОЕЩЗЩЬЩ иШЗьВайВ ¡ВВЯшсЯз бщнтррбкЩ рбДущтщ Й1*

И 441 451 461 471

1079

С-АСЕ И-АСЕ

1109 1119

РНЕАЬС 5 нт5

РНЕАЬС КЕ™ § УЕ^

511 521 оЗЯ

1129 1139

КЕЩОЙТ атамкьЕРЕ

Гк|щАК§ ККУЫЭА^з' 531 541

С-АСЕ КГ-АСЕ

1149

551

1159

1169

1179

2ыт йэршбЭбам АбйЭкЕьье>Ж ^ятеЯеьь

§ЬОАЬЕ>|<2РЬ Зкщсщутой дОЕОЩЗК

ЖОМУ

561

571

581

1189

591

Рис. 2. Выравнивание первичных последовательностей М-домена и С-домена АПФ человека.

II СВОЙСТВА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ Л- И С-ДОМЕНОВ СОМАТИЧЕСКОГО АПФ ЧЕЛОВЕКА

Для выяснения особенностей функционирования как отдельных С- и Ы-доменов, так и доменов в составе полноразмерной формы фермента, были созданы укороченные мутанты АПФ человека, содержащие только один домен, а также с помощью мутаций ключевых аминокислот активных центров АПФ, описанных в предыдущей главе [19], был создан двудоменный мутант АПФ человека, у которого один активный центр был лишен ферментативной активности. Согласно работе [33], укороченные мутанты и мутанты полноразмерного фермента с одним заблокированным активным центром не различались по исследованным свойствам. Это говорит о том, что корректно исследовать свойства отдельного активного центра в составе полноразмерного АПФ с помощью однодоменного фермента. Рекомбинантный АПФ, не содержащий мутаций, был кинетически идентичен ферменту, выделенному из почек человека [33]. Соматический фермент с критическими мутациями в обоих доменах, как и ожидалось, был полностью лишён ферментативной активности, а ферменты с только одним интактным доменом (С- или 1Ч-) были каталитически активны, однако сильно различались между собой по субстратной специфичности, сродству к ингибиторам и по способности активироваться хлорид-ионами [34].

Кроме того, функционирование отдельных доменов АПФ человека было также исследовано с использованием природных одно доменных изоформ: кишечной домен) и тестикулярной (С-домен). Сравнение свойств однодоменных форм также позволило показать, что между активными центрами, расположенными на Ы- и С-доменах АПФ, существуют функциональные различия [16, 35].

Знание количественных параметров взаимодействия активных центров С- и М-доменов АПФ с ингибиторами и субстратами различной структуры и знание трёхмерной организации доменов АПФ позволяют судить о причинах наблюдаемых различных субстратной и ингибиторной специфичностей доменов. Следующие два раздела посвящены сравнению структурных и функциональных особенностей активных центров АПФ человека на примере их взаимодействия с субстратами и ингибиторами.

II. 1. Субстратная специфичность С- и N- доменов АПФ человека

К настоящему моменту наработано довольно много информации о строении селективных лигандов, субстратов и ингибиторов отдельно для каждого домена. Более того, опубликование трёхмерной структуры С-домена АПФ человека в 2003 году послужило серьёзным толчком к развитию комбинаторной химии АПФ.

АПФ действует на широкий ряд пептидов - ангиотензин I, брадикинин, люлиберин, гемопоэтический фактор N-Ac-Ser-Asp-Pro, нейротензин, энкефалины и др. (табл. 2).

Таблица 2. Некоторые регуляторные пептиды - субстраты АПФ [10] (стрелками показаны гидролизуемые связи)

Пептиды Структура и место гидролиза 1 ангиотензин I DRVYIHPF-HL брадикинин RPPGF-SP-FR

1ез-Аг£9-брадикинин 1

RPPGF-SPF вещество Р ■!• 4- 41 не амидированное) RPKPQ-QF-FG-LM

4' 4- 1 вещество Р RP-KPQQ-FF-GLM-NH2 ill люлиберин (ЬН-ЯН) <EHW-SY-GL-RPG-NH2 нейротензин <ELYENKPRRPY-IL

Ьеи5-энкефалин I

YGG-FL

Ме^-энкефалин >1

YGG-FM гемопоэтический фактор роста Ac-SD-KP стволовых клеток атриальный натрийуретический фактор SLRRSSCFGGRMDRIGANSGLGCQSF-RY

Несмотря на высокую степень гомологии аминокислотной последовательности (68% (сравнивался наиболее гомологичный участок, состоящий из 367 аминокислот)

1]), С- и N-домены АПФ проявляют различную субстратную специфичность. Например, оба домена АПФ каталитически активны по отношению к Hip-His-Leu и ангиотензину I, причем эти субстраты быстрее гидролизуются на С-домене фермента [19]. Каталитические константы гидролиза субстратов Hip-His-Leu и ангиотензина I на С-домене в 10 и 4 раза, соответственно, выше (табл. 3). Известно, что субстраты, содержащие остаток Рго в Pf положении или остатки Asp или Glu в Р2' положении, устойчивы к действию АПФ [36, 37]. Так, в результате гидролиза исходного декапептида ангиотензина I образуется ангиотензин И, который в Pi' положении содержит остаток Рго. Этот лиганд проявляет слабые ингибирующие свойства (1С50=Ю мкМ [38]) по отношению к гидролизу ангиотензина I под действием доменов.

Таблица 3. Кинетические параметры гидролиза ангиотензина I и Hip-His-Leu рекомбинантной формой АПФ человека и мутантными формами [19]. Условия: для Hip-His-Leu -100 мМ К3РО4, рН 8,3, содержащий 300 мМ NaCl, 10 мкМ ZnSOj, 37°; для ангиотензина I - 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащий 50 мМ NaCl, 1 мкМ ZnS04, 37°.

Hip-His-Leu Ангиотензин I

Km ¿кат [С1~]оПТ к, кт ¿кат [С1~]опт К,

Фермент (мкМ) (с1) (мМ) (мМ) (мкМ) (О (мМ) (мМ)

Интактный 1540 408 800 180 16 40 30 2,9

N-домен 1980 10 1,4 16 10 1,2

АПФ096О 2000 40 10 1,2 18 12 10 1,5

АПФК959/963 2000 40 10 1,1 15 И 10 1,2

С-домен 2000 800 221 16 30 5,4

АПФ0362 1590 359 800 213 18 35 30 6,5

АПФК361/365 1590 364 800 217 18 34 30 6,4

На эффективность каталитического гидролиза субстратов под действием С-домена АПФ в значительной степени влияет строение С-концевого дипептида [6, 39]. Так, замена отщепляемого дипептида субстрата ангиотензина I His-Leu на Phe-Arg вызывала увеличение скорости гидролиза. При этом на константу Михаэлиса структура С-конца субстрата практически не влияла (табл. 4). Ранее уже было показано, что наличие Arg в Р2' положении субстрата положительно сказывается на эффективности его гидролиза [40].

Вычисление свободной энергии Гиббса образования фермент-субстратного комплекса показало, что улучшение катализа происходит за счет стабилизации переходного состояния, в образовании которого существенная роль отводится аминокислотам Lys1087 и Туг1096 [6]. Так, величина AGtÎ, требуемая для образования

Таблица 4. Кинетические параметры гидролиза ангиотензина I и его производных С-доменом АПФ человека и мутантными формами [6].

Условия: 50 мМHepes, pH 7,5, содержащий 50 mMNüCI, 10 mMZhSO4, 37°.

Субстрат Фермент Km, мкМ ккат, с kcJKm, с'мкМ"1

Анг1 52±0,18 52±0,17 1,0±0,004

РЬе91Анг I [Arg ]Анг I [Phe9, Arg10] Анг I С-домен 32±1,4 44±0,88 11±0,35 550±6,2 460±2,3 1400±2,5 17±0,52 11±0,22 120±4

Анг1 — — —

РЬе91Анг I [Arg1] Анг I [Phe9, Arg10] Анг I Tyrl096Phe 56±1,8 46±1,0 14±0,66 110±1,3 57±0,47 220±1 1,9±0,04 1,3±0,02 17±0,69

Анг1 — — —

РЬе9]Анг I [Arg ]Анг I [Phe9, Arg10] Анг I Lysl087Ala 25±0,06 6,5±0,03 0,26±0,001

Анг1 — — —

РЬе91Анг I [Arg ]Анг I [Phe9, Arg10] Анг I Tyrl096Phe/ Lysl087Ala — — — переходного комплекса С-домена АПФ с ангиотензином I на 1,5 ккал/моль больше, чем в случае субстрата [Arg10]AHr I, на 1,7 ккал/моль в случае субстрата [Phe9]AHr I и на 3 ккал/моль в случае субстрата [Phe9,Arg10]AHr I. При этом отдельная мутация Туг1096 в молекуле АПФ не оказывала заметного влияния на катализ (табл. 4). Согласно [6], в стабилизации ?г группы также участвует Arg1098, контактирующий с ионом СГ. Это, однако, противоречит данным рентгеноструктурного анализа комплекса С-домена с лизиноприлом [20], в котором связи Arg1098 с группой остатка Pro (Р2') ингибитора не наблюдается. Авторы [6] полагают, что исследованный в работе [20] комплекс фермента с ингибитором не соответствует переходному состоянию, для достижения которого, возможно, требуются значительные конформационные изменения в активном центре фермента относительно нативной структуры [6]. При этом авторы ссылаются на близкий структурный гомолог АПФ, АПФ2 [41], который в процессе катализа претерпевает значительные структурные изменения.

Природный субстрат брадикинин, содержащий С-концевой дипептид Phe-Arg,

17 15 расщепляется однодоменными формами АПФ до брадикинина ' и брадикинина ' со сходными значениями каталитических констант для С- и N-доменов АПФ (табл. 5), хотя активность только С-домена в значительной степени стимулировалась хлоридом. Так, в отсутствие хлорида С-домен проявлял только 26% максимальной активности, тогда как Ы-домен по этому субстрату проявлял 76% активности [42]. Помимо различия в СГ активации, для доменов различались рН оптимумы гидролиза брадикинина (8,25 для Ы-домена и 7,25 для С-домена) [42].

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза брадикинина и брадикинина1'7 рекомбинантной формой АПФ человека и мутантными формами [42]. Условия: 50 мМ Нереэ, рН 7,5, содержащий 50мМЫаС1, 1 мкМ2пБ04, 37°.

Брадикинин Брадикинин1"'

Фермент кт (мкМ) ^кат (с"1) ксгл/Кт (мкМ*1 с1) кт (мкМ) ^кат ^cat/^m (с1) (мкМ*1 с'1)

Интактный 0,18 И 61 64 2 220 35

АПФкЗб 1/365 0,24 8 33 79 1 080 14

АПФК959/963 0,54 5 9 72 710 10

Исследования гидролиза синтетических субстатов Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-X-Gln-EDDnp, схожих по строению с брадикинином под действием АПФ показали, что для эффективного катализа важны также аминокислоты в Pi положении субстрата. Однако, следует отметить, что группа EDDnp в рассматриваемых субстратах участвует как Рг' группа, т.е. гидролизуемой связью является связь между остатками Phe и Gin. Субстрат Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Phe-Gln-EDDnp (I), у которого в Pi и Р]' позициях находятся Phe и Gin, соответственно, преимущественно гидролизуется на С-домене (табл. 6). Гидролиз аналогичного по строению пептида, но содержащего остаток Gin в обоих положениях Pi и РГ (Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Gln-Gln-EDDnp (II)) с большей специфичностью проходит под действием N-домена (табл. 6) [32]. Эту разницу в специфичности можно отнести к электростатическим взаимодействиям Gin (Pi) пептида (II) с Asn494 подсайта Si N-домена (Ser1092 в С-домене). В то же время, Phe (Pi) субстрата (I) стабилизируется гидрофобным контактом с Val1094 в С-домене, осуществление которого с аминокислотой Thr496 в N-домене менее выгодно [31]. Аналогичная ситуация наблюдается при гидролизе ангиотензина I [19] (субстрат в Pi области содержит Phe и гидролизируется в основном на С-домене (табл. 3)) и, как получено в работе [43], синтетического субстрата Cbz-Phe-His-Leu: С-домен показал большую специфичность, чем N-домен.

При исследовании роли группы Рг в субстратах типа Abz-X-Asp-Lys(Dnp)Pro (III) для катализа под действием доменов АПФ было показано, что, хотя группа Phe в Р2 положении является более предпочтительной для обоих доменов, чем группы Ser, Thr или Туг, N-домен гидролизует этот субстрат в несколько раз быстрее С-домена вне зависимости от строения группы Рг. При этом как для N-, так и для С-домена по скорости гидролиза аминокислоты в Р2 положении можно расположить в ряд Ser » Thr < Туг « Phe. Однако замена аминокислоты Asp в субстрате типа (III) на Arg Таблица 6. Кинетические параметры гидролиза некоторых субстратов под действием трёх форм АПФ человека [32].

Условия: 100 мМфосфатный буфер, pH8.3, содержащий 300 мМNaCl, 37°.

N-домен С-домен субстрат Km, МкМ ¿кат, С*1 Кт, МкМ ¿кат, с'1

Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Phe-Gln-EDDnp 2,4 3,8 3,7 12,6

Abz-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-GIn-Gln-EDDnp 0,6 1,0 0,9 0,3 существенно влияет на скорость гидролиза под действием доменов. Так, для N-домена будет справедливо Thr < Phe < Туг < Ser, а для С-домена: Thr « Ser < Туг < Phe. Таким образом, катализу под действием С-домена АПФ благоприятствует наличие аминокислотного остатка Phe в Р2 положении субстрата [32].

Разница в функционировании активных центров на N- и С-доменах АПФ человека была также отмечена при изучении гидролиза ряда синтетических трипептидных субстратов (табл. 7). Все трипептиды с остатком гиппуровой кислоты в Pi положении предпочтительней гидролизовались на С-домене фермента. Замена гиппуровой кислоты на бензоил-аспарагиновую кислоту приводила к тому, что гидролиз субстрата в 5 раз быстрее происходил уже на N-домене. Тетрапептид и пентапептид с остатком аспарагиновой кислоты в Pi положении также быстрее гидролизовались на N-домене (в 3,5 раза и 1,25 раза, соответственно). Таким образом, для катализа на N-домене АПФ наиболее предпочтительны субстраты, у которых в Pi положении находится остаток аспарагиновой кислоты. Кроме того, для лучшего связывания субстрата на N-домене необходимо наличие в Р2' положении остатка пролина[44, 45].

Последнее также подтверждается данными, полученными при исследовании гидролиза гемопоэтического фактора роста стволовых клеток N-Ac-Ser-Asp-Lys-Pro [46, 47]. АПФ инактивирует этот пептид путем отщепления С-концевого дипептида, причем происходит это, прежде всего, за счет N-домена, который гидролизует этот субстрат в 40 раз быстрее С-домена (табл. 8). Вероятно, катализу этого субстрата под действием N-домена АПФ благоприятствует взаимодействие группы Ser субстрата с аминокислотой Туг369 в S2 кармане N-домена. Очевидно, что взаимодействие аминокислотах остатков Ser и Туг369, содержащих гидроксильные группы, более

967 выгодно, чем взаимодействие Ser и соответствующей аминокислоты Phe в С-домене.

Кроме того, фиксация этого субстрата в активном центре N-домена происходит за счёт связи Asp субстрата с гидрофильной аминокислотой Arg500 в Si положении [31].

Использование мутантных форм АПФ человека также позволило показать, что производное метаболита холецистокинина (ССК) - CCK5-Gly6-Arg7-Arg8 -гидролизуется в 2,6 раза быстрее на N-домене АПФ человека (табл. 9) [48].

Таблица 7. Кинетические параметры гидролиза синтетических субстратов рекомбинантными формами АПФ человека [44, 45].

Условш: два первых субстрата -100 мМ К3РО4, pH 8,0, содержащий 20 мМ NaCl, 10 мкМ ZnSO4, 1мг/мл БСА, 37°, остальные - 100 мМ Hepes, pH 6,5, содержащий 20 мМ NaCl, 10 мкМ ZnSO 4, 1мг/мл БСА, 37°

Фермент Кт, мкМ k c'J Km, МКМ £Кат, С"'

Интактный АПФк959/963 АПФК361/365 Hip-L 112 74 169 ys-Pro 167 36 211 Hip- 50 21 66 Ala-Pro 264 25 305

Интактный АПФК959/963 АПФК361/365 Bz-Asp-120 177 58 Lys-Pro 40 65 14 Bz-Gb 405 602 106 Ser-Asp 6,2 2,6 5,8

Интактный АПФК959/963 АПФК361/365 Bz-Gly-As 206 132 355 >p-Lys-Pro 24 10 2,8 Bz-Gly-Sei 344 400 773 •-Asp-Lys-Pro 277 408 327

Таблица 8. Кинетические параметры гидролиза гемопоэтического фактора роста стволовых клеток рекомбинантными формами АПФ человека [46, 47].

Условия: 100 мМ Tris, рН 7,0, содержащий 50 мМ NaCl, 10 MKMZnSÜ4, 37°.

ФерментКт, мкМkK¡с"

Интактный 41 12 АПФ|С959/963 31 16 АПФкзб1/зб5390,4

Таблица 9. Кинетические параметры гидролиза холецистокинина29"33-Gly6-Arg7-Arg8 (CCK5-GRR) мутантными формами АПФ [48].

Условия: 100 мМ Hepes, pH 7,0, содержащий 100 мМ NaCl, 10 мкМ ZnSO4, 37°.

Фермент k с1 "-кат, ^ Кт, МКМ

АПФК959/963 28,5 9,4

АПФК361/365 10,4 9,0

Было показано, что соматическая форма АПФ, проявляя эндопептидазную активность, расщепляет связь Тгр3-8ег4 с 1^-конца люлиберина (GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgPгoGlyNH2) с более высокой скоростью, чем тестикулярная форма, что позволило сделать предположение о том, что расщепление может происходить с более высокой скоростью на К-домене фермента [49]. В подтверждение этому были проведены эксперименты с мутантными формами АПФ, показавшие, что, действительно, >1-домен расщепляет связь Тгр3-8ег4 в 10 раз быстрее С-домена [42]. Кроме того, оба активных центра АПФ способны отщеплять С-концевой трипептид от этого же субстрата, но также с большей скоростью (в 30 раз) под действием Ы-домена АПФ (табл. 10). Эти результаты позволяют предполагать, что К-домен предпочтительнее вовлечен в эндопротеолитическое расщепление люлиберина.

Таблица 10. Кинетические параметры гидролиза люлиберина (ЬН-Щ) и Ш-КН4'10 рекомбинантной формой АПФ человека и мутантными формами [42].

Условия: 50 мМИерея, рН 7,5, содержащий 50 мМИаО, I мкМ1п804, 37°.

1Ч-концевой трипептид ьн-1ш4-1и

Фермент Кт (мкМ) ¿кат (с1) [СПопт (мМ) кт (мкМ) ¿кат (с1) [СГ]0пт (мМ)

Интактный 265 1,8 50 215 0,50 300

АПФК361/365 520 1,1 500 210 0,01 —

С-домен 160 0,8 400 85 0,08 30

АПФК959/963 760 8,4 10 960 2,50 20

Ы-домен 235 8,5 25 190 2,50 75

Оба активных центра АПФ способны отщеплять ди- и трипептидамиды с С-конца вещества Р (Аг§РгоЬу8Рго01п01пРЬеРЬе01уЬеиМе1-СОЫН2), однако, скорость гидролиза этого субстрата под действием С-домена была выше, чем под действием 1М-домена (табл. 11) [42].

Таблица 11. Скорость образования С-концевого пептида в ходе гидролиза вещества Р под действием АПФ человека [42].

Условия: 50мМИерея, рН 7,5, содержащий 50мМЫаС1, 1 мкМ2п№4, 37°

Фермент С-концевой дипептид С-концевой трипептид Отнош. тшпепт дипепт образов. [СПопт пМ/мин/мкг (мМ) (мМ) ^образов. [СПопт ^а пМ/мин/мкг (мМ) (мМ)

Интактный АПФК361/365 АПФК959/963 970 30 6 430 30 16 210 15 6 4 130 35 79 1 730 40 76 400 10 97 4,3 4,0 1,9

Как обсуждалось выше, для проявления С-доменом пептидил-дипептидазной активности существенным моментом является узнавание С-концевого дипептида субстрата аминокислотами Туг1096 и Lys1087. Подтверждение этому факту также было получено при расщеплении вещества Р как в амидированной, так и не амидированной форме: при мутации указанных аминокислот в С-домене АПФ человека заметно уменьшалась скорость отщепления ди- и трипептидов с С-конца вещества Р (табл. 12) [6]. Напомним, что С-домен АПФ и соматический АПФ способен проявлять также эндопептидазную активность, отщепляя дипептид с N-конца вещества Р с нонапептидом веществом Р3"11 в качестве продукта. Авторы [6] полагают, что роль этих аминокислот сводится к стабилизации переходного состояния за счёт образования связи с СОО" группой субстрата.

Таблица 12. Скорость образования смеси продуктов гидролиза вещества Р: вещество(1'7) + вещество(|"9) под действием С-домена АПФ человека и С-домена, содержащего отдельные мутации [6].

Условия: 50 мМ Hepes, pH 7,5, содержащий 50 мМ NaCl, 10 fiM ZnSOj, 37°. Скорость гидролиза выражена в пМ/нг фермента/20мин

Фермент Субстрат P-NH2 Субстрат Р-СОО"

С-домен 230±2 650±5,4

Tyrl096Phe 210±5,3 350±4.1

Lysl087Ala 66±1,3 19±0,4

Туг 1096Phe/Lys 1087А1а 53±1,1 9±0,9

Замена Met11 в веществе Р на Arg вызывает преимущественное отщепление дипептида с С-конца субстрата под действием С-домена [6]. Тот факт, что даже при разрушении «участка узнавания», т.е. мутации аминокислот Tyrl096Phe/Lysl087Ala, гидролиз модифицированного вещества Р, [Arg1 ^вещество Р, всё равно происходит с отщеплением только С-концевого трипептида (Gly-Leu-Argn-CONH2) свидетельствует о том, что взаимодействие аминокислот подсайта S3' С-домена с группой Arg субстрата является также более предпочтительным, чем взаимодействие с группой Met немодифицированного субстрата [6].

В работе [50] методом комбинаторной химии с использованием флуоресцентных субстратов с общей формулой Abz-6 аминокислот-(Опр)-ОН было проанализировано влияние строения каждого участка Pi', Pi, Р2, Рз на активность С- и N-доменов АПФ. На рисунке 3 высота столбика соответствует эффективности гидролиза субстрата. Видно, что из рассматриваемых областей связывания в активных центрах доменов область S2 в большей степени отвечает за проявление доменной субстратной специфичности. С-домен в отличие от N-домена менее специфичен к строению подсайтов субстратов (рис. 3). Лучше всего в подсайт S2 как С-, так и N-домена встраивается аминокислота His (рис. 3). Аналогичный результат демонстрирует Arg. Структура Lys обуславливает почти в три раза более эффективный катализ под действием С-домена, чем N-домена АПФ. В тоже время пептиды, содержащие остатки Asp и Glu в ?2 области лучше гидролизуются под действием N-домена. Авторы [50] полагают, что наибольшая разница в доменной субстратной селективности для рассматриваемых пептидов наблюдается в случае субстратов с аминокислотами Ile и Ser в этой области: гидролиз под действием С-домена в 8 и 6 раз эффективнее, соответственно.

Pi'

С-домен

100 - 110 - 100 - 100 о ннннванннннн о ™™ о

OAVLI PFYWSTMNQDERKH OAVLI PFYWSTMNQDERKH GAVU PFYWSTMNQDERKH GAVL IPFYW8TMNQDERKH

100 Î*

N-домен

C/N селект-сть о gj 00 - «О - а iiláliüiliuiJil

OAVLIPFYWSTMNQDERKH ui

Ubi»

ОАУЫРУУУЗТММООЕРКН ОАУЫPFYWSTMNQDERKH ОАУ|. I РУИ8ТМНаОЕ|»КН ОАУЬ I FYWSTMNQDERKH

Рис. 3. Библиотека селективности гидролиза субстратов с общей формулой АЬг-6 аминокислот-(Опр)-ОН под действием С- и ^доменов АПФ человека [50].

Полученная диаграмма позволила выбрать ряд субстратов общей формулы Abz-6 аминокислот-(Опр)-ОН, гидролизующихся преимущественно под действием С-домена АПФ. Оказалось, что с уменьшением длины выбранных пептидов увеличивается субстратная селективность С-домена. В результате группой Bensanetti был синтезирован пептид, строго селективный к С-домену субстрат - Abz-Leu-Phe-Lys-(Dnp)-OH (табл. 13).

Селективность этого пептида во-первых, обеспечивается присутствием ароматического кольца остатка Phe в РГ участке, который контактирует с Glu738 и Glu952 в С-домене. В N-домене соответствующее положение занимают две меньшие по размеру аминокислоты Аэр (Аэр140 и Авр354) (рис. 2). Такая замена вызывает увеличение размеров в)' области фермента и благоприятствует встраиванию аминокислотных остатков большего размера. Это также можно продемонстрировать на примере гидролиза субстратов формулы АЬг-Х-А^Ьуз(Опр)-ОН: больший по размеру остаток Туг в Р[' области субстрата лучше встраивается в соответствующий карман >1-домена, а меньшая аминокислота РЬе лучше «подходит» области С-домена [32] (табл. 14, рис. 3).

Таблица 13. Кинетические параметры гидролиза АЬг-ЬеиРЬеЬуз(Опр)-ОН тремя формами АПФ человека [50].

Условия: 50мМНерей, рН 7,5, содержащий 50 мМЫаС1, 10\1MZnSO4, 37°.

Фермент ¿кат (С ) Кт (мкМ)

С-домен 80.8 2.2

N-домен 3.9 7.7 соматический АПФ 82.6 3.9

Таблица 14. Кинетические параметры гидролиза субстратов формулы АЬг-Х

Аг§Ьуз(Впр)-ОН С- и Ы-доменами АПФ человека [32].

Условия: 100 мМ Тт-НС1, рН 7,0, содержащий 50мММаС1, 10 ¡М2п&04, 37°. АЬг-Туг-Аг£-Ьуз(Рпр)-ОН АЬг-РЬе-А^-Ьу8(Рпр)-ОН ~

Фермент ¿кат (с) Л:т(мкМ) кк„ (с") Кт (мкМ)

С-домен 58,8 4,7 69,2 2,7 домен 85,6 5,0 54,9 3,4

Во-вторых, замена Asp953 в С-домене на Gin в N-домене влияет на заряд Si' области фермента [50] так, что в N-домене также более предпочтительным оказывается взаимодействие этой области с Туг, чем с Phe (рис. 3). И наконец, Val956, который образует связь с кольцом Phe субстрата, заменён на более гидрофильный Thr в N-домене (рис. 4В).

Кроме того, менее полярная гидроксильная группа Ser1092 в Si кармане С-домена легче образует контакт с изопропильной группой Leu, а также с Lys и Arg, чем группа Asn494 в N-домене (рис. 3). Замена Val1094 в Si области С-домена на Thr496 в N-домене также не способствует взаимодействию с гидрофобной аминокислотой субстрата (Leu).

Рис. 4. Схематичное изображение встраивания субстрата АЬг-ЬеиРЬеЬуэфпр)-ОН в активный центр С-домена и Ы-домена АПФ (А) и встраивания РЬе (Р]') группы субстрата в 8|' подсайт активного центра С-домена и М-домена АПФ (В). Аминокислоты обозначены С-домен/Ы-домен (нумерация по соматическому АПФ) [50].

выводы

1. Продемонстрирована разница в субстратной и ингибиторной специфичности однодоменных и двудоменной форм ангиотензин-превращающего фермента человека в реакциях гидролиза ряда пептидных субстратов и при связывании ингибиторов различной структуры.

2. Выявлено, что формально-кинетический механизм функционирования двух активных центров в составе ангиотензин-превращающих ферментов человека и быка совпадает и определяется структурой связываемого лиганда (субстрата или ингибитора). При связывании «коротких» лигандов наблюдается сильная отрицательная кооперативность активных центров фермента. Гидролиз «длинных» субстратов осуществляется при независимо функционирующих активных центрах фермента.

3. Определена локализация эпитопов связывания моноклональных антител ЗА5 и i2H5 на поверхности N-домена ангиотензин-превращающего фермента человека и выявлено влияние связывания лиганда с N-доменом на эффективность связывания с ним моноклональных антител.

4. На основании анализа структуры N-домена ангиотензин-превращающего фермента человека совместно с анализом кинетического механизма функционирования активных центров в составе двудоменного фермента и данными по влиянию связывания лиганда на эффективность связывания N-домена с моноклональными антителами продемонстрировано наличие двух конформационных состояний молекулы однодоменного АПФ, переход между которыми, т.н. «hinge-bending movement», осуществляется при встраивании лиганда в активный центр фермента.

1. Soubrier, F., Alhenc-Gelas, F., Hubert, C., Allegrini, J., John, M., Tregear, G., and Corvol, P. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A, 85,9386-9390.

2. Skeggs, L. Т., Jr., Kahn, J. R., and Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme (1956) J.Exp.Med., 103,295-299.

3. Yang, H.Y.T., Erdus, E.G., Levin, Y. A dipeptidyl carboxypeptidase that converts angiotensin I and inactivates bradykinin (1970) Biochim. Biophys. Acta, 214, 374-376.

4. Skidgel, R. A. and Erdos, E. G. Novel activity of human angiotensin I converting enzyme: release of the NH2- and COOH-terminal tripeptides from the luteinizing hormone-releasing hormone (1985) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 82,1025-1029.

5. Skidgel, R. A., Engelbrecht, S., Johnson, A. R., and Erdos, E. G. Hydrolysis of substance p and neurotensin by converting enzyme and neutral endopeptidase (1984) Peptides, 5,769-776.

6. Naqvi, N., Liu, K., Graham, R. M., and Husain, A. Molecular basis of exopeptidase activity in the C-terminal domain of human angiotensin I-converting enzyme: insights into the origins of its exopeptidase activity (2005) J.Biol.Chem., 280, 6669-6675.

7. Lattion, A. L., Soubrier, F., Allegrini, J., Hubert, C., Corvol, P., and Alhenc-Gelas, F. The testicular transcript of the angiotensin I-converting enzyme encodes for the ancestral, non-duplicatedform of the enzyme (1989) FEBS Lett., 252, 99-104.

8. Hooper, N. M. Angiotensin converting enzyme: implications from molecular biology for its physiological functions (1991) Int.J.Biochem., 23,641-647.

9. Елисеева Ю.Е. Структурно-функциональные особенности ангиотензин-превращающего фермента (1998) Биоорг. Химия, 24,262-270.

10. El-Dorry, Н. A. MacGregor J. S. Soffer R. L. Dipeptidyl carboxypeptidase from seminal fluid resembles the pulmonary rather than testicular isoenzyme (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 115,1096-1100.

11. Velletri, P.A. Testicular angiotensin I-converting enzyme (E.C. 3.4.15.1) (1985) Life Sci., 36,1597-1608.14.17.