Липиды микроскопических грибов Blakeslea trispora, Pythium debaryanum тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1 i ■ 1 л - !' -'í

jf í q иооЩлфй ощена трудового шсного знамени иазтатут

тонкой химической технологий шло.ломоносова

Специализированный Совет Д 063.41.01

На правах рукописи ЭЛЬ-ОАЙЕД МАЩИ МАРВАН

лшвдн микроскопических ггавов

Blakeelea triepora, Pythlua debarjenun

УДК» î. 281.213:579.22/234

02.00.10 - Биоорганичеокая хяияя, химия природных и фяэиолоппбоки активных ведаотв

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на оояоканяе ученой о те пи ни кантата тамичеокнх наук

Мооква - 1990

Работа выполнена на кефедрэ ходы и '»¿аснояогии тонких органически:

соединений Московского ордена Трудового Красного Знаызни шстагут, тонкой хсыическоП технологии им, М.В.Ломоносова

Научные руковод;'.^;;.,: член-гсорроспоцденг ЛИ СССР,

доктор химических ио.тс, профессор Р.Н,0:Си1ГНЕ£ЗЛ

кандидат '/нмнчзскил ¡¡.пт;,

старший иаучшИ сотрут" г: С.Н.АЧЕКСЕЕЗ

9

Сфициальныэ оппо1::;н,и:

доктор химическим наук Н,Г,ХРЛП03А

, .сктор химичосшс: наук

О.Л.СШЛНСЕНЧ

Ведущее предприятие - Институт молекулярной кардиологии ЕЙЩ АМН СССР ■ ,

Защита диссертации состоится "26" г.гаи 1920 г. и 16.С0 мг.еог' «а оасодшгл Л 062,«Л,01 Г.Л'лТ гшпп

¿¡.В.Лсиогюсова, Усс;;ел. 117571, ¡¡р. Йср;:;#сгого', л.

С диссертацией ыс;хно ознакомиться в инилпотоко КТлТ г-лаа М.В.Ло.моносола

огарк;;И научш^ сотрудш:.:

•.'./-йПс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'Дол-

АктуальностьЕ последнее время микроскопические

Р^йУйЩщвлекатт к себе пристальное внимание с одной стороны п качестве перспективных промышленных продуцентов биологически актив-их веществ, в том числе и соединений липидной природы, а с другой ;торош - в качества моделей для изучения закономерностей процесса липогенэза у более сложных организмов, для выяснения разносто-501п:зй функциональной роли лнттидов б процессах обеспечения жизне-хеятельности. Микроскопические грибы обладают высокой липогенной »ктивностьч, при атом возможность регулирования процессов липоге-геза у грибов может быть использована для направленного синтеза и голучения липидов определенной химической структуры. Большой тео-зетический и практический интерес представляет изучение способно-:ти микроскопических грибов к образованию полиненасыщенных жирных гислот. В настоящее время уже многое известно о метаболизме поли-!енасыщенных жирных кислот в животной клетке. Однако услбвня обра-ювания и метаболизм этих кислот у микроорганизмов исследованы [едостаточно. •

Как известно, биологическая роль липидов тесно связана с их тзическими и химическими свойствами. Особенности структуры линия-их молекул определяют их участие в образовании биологических мем--'ран и функциональную роль, связанную с переносом веществ и ионов •ереэ мембраны, энергообеспечением клетки и защитными реакциями рганизма, а также биорегуляторным действием. У микроскопических рибов вопросы взаимосвязи липогенеза (особенно синтеза-полярных ипицов) с различными физическими и химическими факторами практически не изучены.

Остпг.тс.т актурль»*»« метопические проблемы, связанные с вы-елением, идентификацией и установлением структуры липидов микро-

екопических грибов с использованием современных фнзикс-хнмичое.сих методов.

гакляччяась в изучении особе:шостей липогеГгсза у двух видов микрискип^ческих грибов ( Ш^гЛ-орош н Ру-иаеЪагу-апига), в исследовании изменений качественного и количественного состава липидов в зависимости от возраста культуры и физико-химических факторов среды.

Были поставло;ш следующие задачи:

1. Сравнительное изучение осопяниостей* липидного состава двух видов микроскопических грибов.

2. Исследование состава и структуры гликолипидов гриба Bl.tri.b-

рога.

3. Изучение влияния различных модификаций состава питательной среды на процесс образования липидов, а такие полиненасыщенных жирных кислот и их оксигенированных метаболитов. •

Научная_Новизна. В результате изучения процессов липогензза у цвух видов микроскопических грибов: у гриба В1. ггАирога идентифицирован не описанный ранее для микроскопических грибов фенол-содерчшщий гликолипид;

в составе культуральной жидкости и биомассы гриба Р.йеЪагуппия впервые идентифицированы эццогс::ныс простаглаццшгоподобныо 1.:з-таболиты полиненаснй;ошшх кнзлот.

Практическая ценность рпОот^. Показано, ито шкроскбплчс грибы В1,4г1орога и Г.йоЪагуаг.шл характеризуйте;; как высокой пипогегаюй активностью (до 1?/а лшшдои в биомасса), так н иитерсс-ными особзшостгшн липидного состава. Среди иол!ф:ых лкпидоя 1>1, 1г1ирого обнаружен фонолсодср^агглЯ гликолгпнд, что длл шлфоско-пичсскнх -грлооъ от;.:очонэ вперено. В литературе пгг.ютск дата:; о наличии фенелсодершцих гликолипидов у бактерий, пр«'к:.: процпо-

мса^р' ■;. л

: I. п! 'гл:;;;-; оо'гллспг втггогаякля! функпнлмп.

:тпу-гсг~;;1 г.т'рлокислотного состава микроскопического грибп 1уг .ы-лгАпипп пшголепо, что гащомстацнн влияет только на со;;:;р~:::!1;:о с::с:;гсп:трппятттп.тх т.:стаболитог> полшгеняешкшяых мирных хкслэ?. Пояпкспасигссюэтз ~ир!п.>6'кислоты и их оксигошросаигие т-•?ло'ол:;';м прпсутстпутзт ко только з биомассе, но и в кулбтурзльной гндтсостп. Получснгио результаты в опытах с шдомзтацшом гочорят о вос:гожной ферментативной активности гриба

1. Лшидный состав микроскопических грибов В1. 1:г1арога , ■ Vyt. йоЪагуапшз.

2. Гликолипиды микроскопического гриба В1. triвporа : фракционирование, исследование структуры.

3. Полиненасыщенные жирные кислоты и их оксигенированные метаболиты в биомассе и культуральной жидковти микроскопического гриба Ру*. аэЪагуапия,

Агт2обауия_^бота_и_публикации. Результаты работы докладывались на 1У Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (г. Черноголовка, 1989 >.). По материалам работы опубликован!)1 три статьи. . .

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы", обсуждения результатов работы, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ' наименований. Работа изложена- на стр. машинописного текста, содержит таблиц и- - рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОЕСЩЕНИЕ

В качестве объектов исследовании в настоящей работе использовались культуры микроскопических грибов, полученные из коллекции ИШИ АН СССР; 1и-'.:а1еа 1;г1орога , штили 4(-) ; 5( + ) и 9В9( + ) (класс ); .¿^ЧМиш <1еЪагуипии Р.ИШИ (класс Ооиусогоо ).

Образцы биомассы указанных выше штаммов грибов выращивались методом глубинного культивирования в ИШИ АН СССР сотрудниками лаборатории, руководимой к.о'.н. И.В.Конозой.

Экстракцию общих липздоб проводили из влажной или лиофилизо-' ванной гомогенизированной б;'.о:,;ассы по методу Блая-Дайера смесью хлороформ-метанол-вода; 2:1:0,8 (схема I). Для разделения суммарных липидов на классы использовали метод ос&тдения полярных липидов холодик,! ацетоном, или колоночную хроматографию на силикагеле. Фракционирование липидов проводили методом тонкослойной хроматографии в системах растворителей хлороформ-мотанол-вода; 65;25;4 (для полярных липидов) и гексан-диэтпяопиП сфлр-уксуспая кислота; 60:20:1 (для нэйтралыйхс лкякдов). Липшие Фракции ццонтоТсцто-вали с испольного; ¡ьс.л стандартных образцов,, а таккс специфических окрашивающих реагентов. Количественное содержание отдельных фракций липидов определяли гравиметрически, в

Полиненасвдэнные жирны;5 кислоты и их окс!;геш;раг;а;!к:;о продукты екстрагировали из биомассы пли кул1л-у,:.:;>\::з1;- ^•..^оси: :;„.

ацетатом, фракционереьай;Ю 1С,- про^о;....:.: и-.. с т.:V.. чЫ-.-^с. :.....-

тивной шщкостиой. к1)о;.:атогр.лг7.::.-,. таи г. '.о.^./.оьло;. ;.1Г,:.;атогр..,.....

Стеташ кисяэ? (к кх кст:;.эш;: г-фпров) опргдол;.-

ли мзтодом гаоскцдкостноИ хро^а'.'огр..с испольсоосг.г.о:,: ступцл-ртов по времен;! удеркииа;:,;;: кс-ло:;сигов оияси-.яруско». сг^си.

Схема I.

Экстракция общях липидов и их фракционирование

I. Липидный состав микроскопически ¡х грибов

„липотч. 'Лгдеретнке общих липидов расчитывали в % от веса сухой биомасс;; rp.iua. В клетках Dl.txicpora в зависимости от условий культивирования и фазы развития гриба накапливалось от 7 до 17% суммарна:-: липццов. Аналогичные данные (от 7 до 12%) были получены и для Гуt.debaxyaniua „ ■ •

Нейт^альныо_липм,цу содержались в большем количестве в клетках Bl.triapora (83-9ЭД от оо'адк липидов) по сравнению с Pyt. deborïbauu (до 55% от общих липидов). Преобладающим компонентом

нейтрализм липидов обоих ввдов грибов являлись триглицериды

; t »

(около от нейтральных липидов). Кроме того во всех образцах липидов были идентифицированы ноно- {? ддгллцериди, свободше жирные кислоты, углеводорода. Дш гриба Bl.tricporaзафиксировано т/жже значительное еодерпдас» стер;и;ов .ц их афиров, в то время как у l^yt .debaryonum. ото извд-.г» фракции сзлялись минорными компонентами. Типичный фракционшй состав 1Г)£',траяьнж липидов исследованных штаммов микроскопических грибов- кродгтаклэн нл рис. I. *

Полярще_липи,2ы. Среди полярких литров 1зо ьсох обрс^г*^;: грибов преобладающей'фракцией являлся'фосфатздплзт,-ли лад:;;;:сс-г держание которого достигало <IS;i Ccietricpcre ) или ( i^-iv, deboryûnua ) от cy;.i.:u полярных лглпщов. OpsitipïoitiEJil состав поь,.;> них липидов представлен на рис. 2. Характерном для исследован;илс

4

микроскопических грибов является довольно высокое содержание фос-флтидилхолина и фосфатидилсерпна.'Гликолипиды были обнаругкени только у гриба Bl.trioporQ, причем гликолипиц с Rf 0,71 (см.рис.2),

идентифицированный нами в последствии как фенолсодер^йзг.й,. еебтй-

«

г.лял'до Z0% от c.yizzi полярных липидов.

Д&я обоих ввдов микроскопически; rp—cion с'.*ло проведено y.cczo-

<£» 7 е»

(3 6 Я

Ф 5 0

0 4 О О

А Б

Рис. I. Фракционный состав нейтральных •

липидоэ микроскопических .грибов В1.гг1арога (А), -^.йеЬагуааиа Со); 1-моноглицсрида, 2-диглицериды, З-стеринй,. 4-свободные мирные кислоты, 5-триглицериды, 6-эфиры стери-нов, ?-углеводороды. Тонкослойную -хромато-греф»п проводили на пластинках " ЦегоЬ" С«Г) в системе гексан-диэтиловый эфир-уксуснзя кислота; 80:20:1, Проявитель -серная кислота.

о с

I

Л 3

Рис. 2, Зракциошп'й сосг*в подяргах ли-ГПЭДОВ ГрибЗЕ Ш^гЮрога (А), Ру^аеЪагу.^ СБ); I- к 2-гликолипидьг, З-фосфатидилсерин, 4-фосфатидилхолин, 5-фосфатидилэтаноламин, 6-фенолсодеркащий глшштяа, 7-фосфатианая кислота. Тонкослойную хрс:.татогра'"::н) проводи ли на пластинках "Иггс!:" (ФРГ) в системе: хлороформ-метанол-вода; 65:25:4. Проявители серная кислота или пары йода (1-7), нингидр (3,5), молибдековыЯ синий (3,4,5,7), ¿.-на толовый или днфенилеминсвий (1,2,6).

- 8 - - : доврние жнрнокислотного состава общих липидов, с каждом случае отмечалось присутствие жирных кислот с длиной цепи от Cj^ до Cjg, Гриб îyt.dcbBiyun.i:.! характеризуется кроме того наличием и С^д-полиненасыщенньк жирных кислот (см. табл. I), содержание которое в отличие от животных клеток достаточно высоко как во фракции нейтральных, так и полярных липидов. (таба. 2). Это свидетельствует в пользу того, что эти полиненасыщенные жирные кислоты (эйкозаполиеновие) выполняют разнообразные фдокции в составе липидов клеточных мембран. Tait, гзвостно, чтоГу-t.dBbaryanun является

микроскопическим грибом, паразитирующим на корнеплодах (картофель, в

свекла и т.п.), и возможно, что арахидоновая ^0.4) и ойкооапента-

еновая (Сзд-б^ жиРные кислоты и продукты их оксигенации (эйкозапо-• *

иды) играют биорвгуляторную и коммуникационную роль в процессе жизнедеятельности этого rpv:6a, его взщгмодоГ.сткш с сргслг;;с;;о:.!-

Еирно кислотны!? состав общке лтхшдоп исследование микроскопических грибов.

Жирная Соп.ердание •.ирной' кислоти,. %

кислота t, d о bary anus ' El.-trlapcra

С14:0 0,69-9,50 0.3'!.-0,03

°16:0 + GI6:I CI8:D 15,94-17,33 1,09-0,90 22,81-20,4'J 2,11-3,06

CI8;i 33,20-16,10 17,90-29,17

CIS:2 16,04-17,5 33,83-41,09

Л* 0,10-3,40 0,11-6,20

C2Q :il 5,31-6,10 -

IC.^-IV.vO IJ _(.'...Л i :

йиртгокислотшй состав нейтральных и полярных липидов микроскопического гриба ГУ*. йоЪагуапига.

Жирная кислота Процентное содержание жирной кислоты

нейтральные липиды полярные липиды

С14;0 7,87 4,23

С16:0 С16':1 16,22 21,21

С18:0 1,02 1,00

С18:* 27,73 36,01

С18:2 26,68 26,19

С18:3 - " 0,58'

С20;1 8,53 1,55

°20:4 • 4,68 3,49

С20:5 7,27 5,74

2. Гликолипиды микроскопического гриба * В1|. 1;гЛврога, . .

Гликолипиды встречаются в микроскопических грибах довольно редко и практически не- исследованы. Для зигомицета В1.1;г1врога культивируемого в условиях дефицита неорганического фосфата з среде, нами было зафиксировано образование трех различных глико-липидов, которые в сумме составляли до. 25$ от веса фракции полярных липидов. Зракциснирсгани» полярных липидов с-помощью колоночной и препаративной тонкослойной хроматографии на суликагеле в системе хлороформ-метанол-вода; 65:25:4 (с предварительным насы-

щением хроматогрефическоП камеры аммиаком), позволило выделить три фрлкцп;: глшгои-.киол: IL, 0,71 (I), Rf 0,10 (II) и R^ 0,07 (Ш). Преобладающ;... .-ш^лл'.« гликолипид I, mmouy в дальнзйвкзй работе основное внимание ш уделили исследования состава структуры этого гликолипида. Гяшолитщ I является маслообразном беецветты;.: веществом, раствор;::.!*;;.! в хлороформе, метаноле, плсхораетворим^пл в ацетоне, практически по п диотиловок офпрс. Вцдоленный

гликолипид ранее друг:»«! т ошибочно был причислен к цере-

брозидам, поскольку в Bisne>Uv....:iUiOli системе гликолипид I н очпщен-•шй цереброзид из мозга крупного рогатого скота имели одинаковую хроматографическуд подшшюсть (Rf 0,71). Нами било искаск-по, кто в система толуол-ацетон, 1:5 на пластинках Kicacls-3- ("íbrcl; , Q?i) эти соединения имели соответственно П3 0,5 г. 0,1. Крои.., того, сравнение ИК-спектров исследуемого р&ькэлшщка I ь церобо;;-ьзда (см. рис. 3) uonsutrcit рчолпчие í.;; cj-t#«.i.vi»* f. с и.ларз pw-1х.г;::лида I отсутствует, хиракг&р:.атпчсска;1 полоса погло-

цешш КН, которая в случае церсброиида составляет 3220 сгГ^ (см. рис. 3). Следует iarj.ee огздтить, что гз Уй-споктрс rppc.¿i>oc:,~ дз отсутствует поглощение при дуцеих ьолл, nptris-o«.« >•.., Ь^глэшыП ке пел.ш гликолипид I « lw-cneia'-г,и ¡лета:.сие и в:,:.;--cíüiyisj поглощения при 203,260 IY>0 i; hs'j ил '4» с l сгы:ч<..

флюоресценция ыакекцум пр:: S£0 tz¡ i-e^. ?'CJ ц:);

тарные для неконденсированных ароматически; енг'.'слл.

0 наличии ароматической структуры в кзимуки глшеолнпида 1 свидетельствуют также данные ИК-спектроскогши (рис. 3) характеристические полосы поглощения при 850,1050,1350 см"*), а также наличие в ПМР-спектре мультиплетных сигналов с химическим сдвигом 6,06 и 7м.д., с о о т в е т с т вуюцих протонам замещенного фенола.

' Дгм&тькое изучение Ш1Р-спектрсв и а том числе сравнительный

40

и

rj

о

&

о

' р.

а

гооо гсоо

1500

1000 Р, С),Г1

Сиг: кал

HOG G

3. ИК-споктру Си хлороформа) интактного фенолсодертягдего гликолмпнда (—); аглнкона, полученного поело гидролиза

гликолппнда в кислой среде (---); цереброзида из мозга

. крупного рогатого скота С.....).

tree- ! плоть. О

0,6

0f4 '

0,2

325

'кс. 4. УФ-слектрн в г'сглчноле гликолипида I из эигомицет:; Bl.trisporo. (I), гагликона, явлгшяегося продуктом гчпрлгилп глпколкпияа I в кислой среде (2) и продукта гидролиза аглпкоиа в щелочной среде (3).

0

анализ спектров гликолипида до и после ацетилирования позволили. предположить наличие в составе молекулы лкпида дисахаридной структурной единицы жирнокис;ют1Ых .остатков и, как уже упоминалось, замещенного алкилироэанного фенола.

В масс-спеКтре интактного фенолсодержащего гликолипида (рис.

5), полученном с помощью ионизации бомбардировкой быстрыми атомами 252

(осколками деления С/), присутствует группа пиков молекулярных ионов в области 720-770 м/е. Состав и положение этих ионов соответствует гомологической группе родственных соединений, отличающихся .вероятно, структурой и положением жирнокислотных остатков и алкильных-заместителей в ароматическом фрагменте.

!В№ '

75®

5ВС

721,3

749,5

765,8

м а с с а, а.е.м.

Т __631_.

1-Г

_и:з

Рис. - 5. МАсс-'-спектр фенолсодержащего гликолипида, Записанный на времяпролетном иасс-спектрометро 1.1СБХ (СССР), пснп-завд®1 осколками .

В л»»те.рр.туро имеются сообщения о наличии подобных фе.^лсодср-кащих рликолипидов у.бактерий и I,едете;: интенсивное исследованпз й'х СЧВДИЗДы в связи- с тем, что оти гликолппиды могут нести фун;:-йи^а'.йиов. По наши:.! дашп-с.: у «икроскопнчоских гр:;бов фоноле;:-дер£ОД<Г гликолклпды ранее обнаружены из били.

к исследованиэ структуры гли:;олипит;г.- I прэгсх:».:!

с по.-..' . } . ого ;;!:;,,ч^с;:. ::;.о, (<"-.' >'■).

метанолиз гликолигтидэ I в среде безводного метанола, насыщенного хлористым водородом (8 М НС1Д!еСН) позволил получить метилоьые эфиры жирных кислот исследуемого гликолипида, а также выделить углеводную часть в виде метилгликозидов. Жирнокислотный состав (по данным ГЖХ) представлен в таблице 3,

Гидролиз гликолипида I в кислой среде (2 М водная HCl, П0°С^ 4 часа) позволил расщепить исходную молекулу на агликон и углеводный фрагмент. Последующий анализ этого фрагмента с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии позволил установить, что углеводная часть выделенного гликолипида представлена исключительно галактозой'(таблица 4), В свою, очередь агликон был охарактеризован по своим спектральным (рис. 3 и 4) и хроматографическим свойствам. Полученные данные подтвердили наличие в составе агликона яшрнокиспотных остатков и ароматического фрагмента.

- Гидролиз агликона в щелочных условиях КСН в водно-мета-польной среде) позволил выделить фенольнута часть (УФ-спектры на рис. 4) и жирнокислотный фрагмент, состав которого был охарактеризован с помощью газожидкостной хроматографии после метилирования (таблица 3). Последний оказался практически идентичен составу гффоп жирных кислот, полученных в результате метанолиза исходного гликолипида. Это подтверждает предположение о том, что жирные сиелоты структурно связаны с ароматическим фрагментом, а не с /глэводноЛ частью молекулы гликолипида.

Продукт-лен щэлочиого Ридрокиса интактного гликолипида (5^ (ОН в КзШ/НоО, iO°G, Л часа, см. ехстлу 2) являлись жирные кисло-"j и '"ртптнт. Ни гл!пюр:т, и. другие полнолч п

racco ''•'"rnTüf'üv'ronaii'i не были. Поэтому счоридтю, что

' ""О;*!""¡' ■ : ! и'" C7ITC," V РГТ

: ■• г! " ^:"'JTnг/ ry-r-vir/ глипогпчпой ептз'ло.

Таким образом, вся совокупность полученных экспериментальных данных, а также сопоставление их с вероятными расчетными и реаль-ньми значениями молекулярных весов позволяет предположить, что поделенный нами новый фенолсодержащий гликолипид представляет собой гомологичную смесь изомерных соединений общей формулы:

R1

aal - 0 - Gal - О hQT ¡

SR2 _ о-с - n3

где n1 : Н, Ш3, C¡¿\5;

л2 : ai2, С2Н4;

r3 : углеводородные цепи мирных кислот от Cjg до С^г,

Предполагаемая структура содержит две глпкозидные срязи. Можно предположить, что дублет в ПМР-спектре при 8~ 4,35 м.д. ( б гц), положение которого практически не изменяется после ацвтилирования штактного гликолппида, соответствует аномерному протону при ß -гликозидной связи ;;ея!ду молекулами галактозы в димерном углеводном фрагменте. В то ;г.с время дпсахар;1д присоединен к фенольному агликону, по-видимому, ¿i -гликозидной связью, которой соответствует дублет аноморкого протона при 8~ 5,35 н.д. С У^ 1,5 гц), сохраняющий свое положенно поело ацотилирования/

Проведенные нами исследования по динамике накопления гжшео-липида I показали, что'физиологические особенности исследованных культур Bl.tricporo , а так;е и;с созраст сущестпешюго влияния на содержание ъ грибе фенолсодер:'п:';зго гликолипида не оказывают (см.' табл. 5).

Таким образом, основнк:.! фактором, определяющим содержание "казенного гликолппида в биомассе гр;;ба, является, по-вицимому, содержание фосфата в питательной с раде.

Схема 2.

Хпшческая деградация фенолеодержащего гликолппида

о

с! ггл "-4

• ел

г:> . г) (-)

"¡' ' СО

■) Г) 1.)

йирнокислотный состав фракции гликолипида I зигомицэта В1. гг1арога , установленный после метанолиза интактного гликолипида (А) и после щелочного гидролиза агликона (Б)

Мирная Содержание жирной кислоты, %

Кислота А Б

С14:0 15,35 л 16,18

С16:0 27,99 26,97

С16-Д 13,09 13,48

С18:0 1,13 0,90

С18:1 4,52 » 5,06

С18:2 18,06 19,66

С18:3 (п-3) 6,32 • . 6,39

Таблица 4.

Результаты анализа углеводов фенолсодержащего гликолипида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка Зерагоп -ИН^, (15 см х 3 мм), злюент 85^-дай водный ацето-нитрил, скорость 0,5 мл/мин; детектор рефрактометрический).

Моносахарид Время выхода, мин

Манноза 14/7

Глюкбза 16,2

Галактоза 18,3

Углевод из фенолсодержащего

гликолипида 18,3

Результаты исследования содержания фенолсодержащего гликолипида в клеткахВ1,*г1врога в зависимости от возрасте культуры.

Возраст культуры, час. опыта Содержание

Общих липкдов \% от веса су хой биомассы Полярных ли--пидов(% от общих лнпи-дов) Фенолсодержащего гликолипида '% от полярных липи-дов

72 I 7,6 15,6 . 13,0

2 . 6,9 19,8 11,5

3 10,6 22,5 10,8

96 2 7,9 17,2

3 13,0 21,0 14,6

120 I 11,9 18,0 20,7

2 13,5 21,3 18,5;

3 17,2 24,6 15,0

ГЬгг'зчяШ'З5 0 онигах У I использовали штамм (+) •

а й !> 2 а 3 пспояьсоасли'атп»-> (+) 5.

С. Ьсу.'.'г^слайлюша-'Э !:"2ЛР7М мшфосиопипеского

• Ссг'л "¡но л'^рглурш.-! т^И'-^и Йо;;;

!си:Ь":',1!Жв Г';:р-ул к'!С.':о-п. й'-'-^ ^о.'л- у, !?'"')<_;•?ее,!

,азЬахуоаип.на содержание такого рода сосдапзкзй,. иотор::^ экстрагировали этилпщетатом и фракционировали в систс:.;о 'ст'ллдц^-тат-гоксан-уксусная кислота-вода, 14:6:2,5:12 (зерхнля фаза) на пластинках . Биомасса выращивалась в условиях присутствия

и отсутствия индометацина (ингибитора биосинтеза простагландпнзв). Проведенные нами эксперименты по установлению жирнокнслотного состава биомасс, выращенных в вышеуказанных условиях, свидетельствуют о том, что индометацин принципиального влияния но состав полинэ-насыщекных жирных кислот г.е оказывает (см. табл. 6).

Таблица 6.

Сравнение жирнокислотного состава биомасс микроскопического гриба Р^.<1еЪш7апиа , выращенных в отсутствие (А) и в присутствии (Б) индометацина.

Жирная кислота

Содержание жирной кислоты в составе общих липиков биомассы \% вес.)_

Б

°14:0

с16:0 + С16:Г

С18:0 С18:1 С18:2

С18:3 (ц_3)

920:1

°20:4 С20:5

7,94 12,39 3,42 23,31 9,09 О,н 5,02 20,66 18.06

3,80 11,55 3,00 25,09 .15,46 0,20 3,22 21,96 15,72

\

.Однако, присутствие индометацина снижало общее количество зксигенирсванных метаболитов жирных кислот как в биомессэ гри-5а, так ив культуральной жидкости, что следует из результатов тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии соответствующих этилацетатных экстрактов (см. рис. 6 и

Сравнительный анализ этилацетатных экстрактов из биомассы I культуральной жидкости показал, что в культуралыюй жидкости т.е. во внешней среде) содержится достаточно большое количество тродуктов окисления полиненасыщенных жирных кислот и самих поли-генасыщенных жирных кислот. Это свидетельствует о вероятном учас-'ии этга соединений в процессах приспособления к внешним услови-гм в период жизнедеятельности гриба. .

С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на си-шгсарвле удалось выделить из биомассы и культуральной жидкости Ру-ь.ааЪшуапшп фракции: полиненасыщенных жирных кислот (время гтхода 1,28 мин. см. рис. 7); гидроперекисей полинеиаснщенных ирных кислот (время выхода 1,80 мин) и фракцию простаглавдино-юдобшх метаболитов (4,87 мин) , которые характеризовались наченет.ти (См, хроматограммы на рис. б ) 0,92; 0,70 и 0,10 оотаетстпенно. В У^-спэктре (в метаноле) фракции полиненясицен-'"'.^'ч'х кислот отсутствовало поглощение прп длинах волн, прэ-ыяиззг 220 5-1, это свидетельствует о том, что удалось отделить кеягетарозягою продукты. Фракция гидроперекисей шела УФ-спектр

б:тс:'-сст,1, ггра^зкной в присутстаии индометацина, и соот-отстгу.: н,у ..¿Г/р".!,:"" Г.ГДГ'.ОСТ!' Лроттия простнгландинов Прак-ичсскн отсу"стронала,. что соответствует рели индометацина кат: ШТСГТРГЛ прооглгда'дпн-стгргтэгяч

О О о • о С?

0 . 0 6

е

0 о 0 {

0 1

0

о о

о о Q

-*-

la 16 2a 2tí 3

i .

Рис. б. Результаты тонкослойной хроматографии на пластинках silufol в системе этилацетат-гексан-уксусная кислота-вода, . .14:6:2,5:12 (верхний слой) (проявитель: пары йода или серная ■ кислота) этилацетатных экстрактов из биомассы микроскопического

гриба P.debaryanui» , выращенной в отсутствие (1а) и в присутствии

(1б) ивдометацина, й'из соответствующих культуральных'жидкостей

. *

(2а) и '.2б). (3> - овтоекисленная арвхидоновая-кислота.

Pr:c. 7. Результаты гыеояоэффзктипюй яидкостной хрематогреалш •;лл;:псч:5К2:х скетргктов из биомассы микроскопического гриба

. - --, '-*' ' , .•Т".'."Л"{0:1 в отсутствие (1а-) и Э ПТГ'ЛСуТСТВ:"! (id) кз евот^тстзуттек культуралъизг жидкостей (Üa) п ■ г.; Tocr.-.i.ncisn.l opsxiwmoaoR нислстк ГЗ) из сяликлгег.сгсЛ

• t.'.. л tl'-rî '■• 3 ¡"i), с'лстемп гексан-изспрогт-'юл, 100 j4, (сги-

вызови

1. Изучен лкпидный и жирнокислстшй состав биомассы различи: к штаммов грибаВ1 .гг1прога • Показано, что при недостатке фосфата в составе питательной среды в процессе глубинного культивирования в липидах всех исследованных штажов происходит накопление различных гликолипидов.

2. Разработан метод выделения и очистки гликолипидов из суг-мирнш липидов гриба в1^г1врогп . Проведено исследование структуру основного гликолипида, ранее ошибочно отнесенного к цероброаи-даи. Показано, что указанный гликолипид содержит в. споем составе галактозу, фенолсодержащий фрагмент и жирнокислотные•остг тки.

3. Исследована динямика накопления фенолгодер?:ащего гликолипида

в составе липидов различных штаммов гриба ВХ.-ЬгИерогав зависимости от условий культивирования и возраста культуры. Показана «то основным фактором, определяющим содержание указанного гли-

колипида, является содержание неорганического Фосфата в пита-<

тельной среде. • ' -

4. Изучен липидный и жирнокислотный состав биомассы и культураль-ной жидкости различных штаммов гриба р.аеЪагушшп . Показано, что присутствие в питательной среде ивдомцтацина-ингибито-ра биосинтеза простагландиков,не оказывало существенного влияния на динамику роста биомассы, на ее липиднцй и жирнокисяотт состав. ; . . •

5. В составе липидов "биомассы и культуральной яркости гриба Р,<1еЪагуапша идентифицированы различные оксигёгофованныс метаболиты полиненасыщенных жирных'^кислот, в "том числе гидроперекиси полиненасьще.нных жирных кислот и простагландиноподо-бные соединения. Отмечено, что индометацин в :составе питатель-

ко", среди практически полностью ингибировал образование тао-стагланциноподобных метаболитов полиненасыщенннх жирных кислот.

Список^аботА_ощбликовага^_по_тем

'. Коновя И.В., Карпова Н.В,, Ткачевская Е.П., Алексеев С.М., Эль-Сайед Магди Марван, Евстигнеева Р.П. Состав липидных фракций 'гетероталличных штаммов зигомицета Bl.triepora . Фенолсодержащий глнколипид. //Деп. в ОНИИТЭхим. - Черкассы. -18.05.1990. - № 383-ХП 90.

!. Эль-Сайед Магди Марван, Тухачевская Е.П., Алексеев С.М., Коно-ва И.В., Карпова Н.В., Евстигнеева Р.П. Идентификация фенол-содержащего гликолипида зигомицета Bl.triepora. //Деп. в ОНИИТЭхим. - Черкассы. - 18.05.1990. _ » 384-ХП 90.

!. Эль--Сайед Магди Марван, Ткочевская Е.П., Алексеев С.М., Карпова Г.В., Абдрахмапова A.M., Бехтерева H.H., Евстигнеева Р.П. Простагландиноподобные метаболиты ненасыщенных жирных кислот п составе биомассы гриба Pythiuia debaryanua . //Деп. в ШИИТЭхш. - Черкассы. - 18.05.1990. - № 385ЛП 90.