Механизмы фотоиндуцированных реакций n-нитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Аврамчук, Татьяна Витальевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2005
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
АВРАМЧУК ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА
МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ РЕАКЦИЙ я-НИТРОЗАМЕЩЁННЫХ АРИЛАЗИДОВ В УСЛОВИЯХ ПРОВЕДЕНИЯ ФОТОАФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ
02.00.10 - биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск, 2005 г.
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный руководитель:
к.х.н. Годовикова Татьяна Сергеевна
Научный консультант:
д.х.н., академик РАН Кнорре Дмитрий Георгиевич
Официальные оппоненты:
д.х.н., профессор Грицан Нина Павловна д.х.н. Сильников Владимир Николаевич
Ведущая организация:
Новосибирский институт органической химии СО РАН
Защита состоится « 2. » 2005 г. в 0 часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Автореферат разослан «
2Г » О К 2005 г.
Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н.
cftyfá
Фёдорова О.С.
тш
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Огромная роль химических методов в изучении белков, нуклеиновых кислот и их комплексов общеизвестна и бесспорна. Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном диапазоне происходят многие биологические события. Кроме того, использование фотореагентов в сочетании с техникой быстрого смешивания компонентов исследуемой системы и последующего импульсного облучения открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.
Несмотря на большое количество времени, прошедшее с начала использования фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, значительная часть вопросов, связанных с особенностями превращения арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации до настоящего времени остается без ответов. Чаще всего интерпретация результатов фотоаффинной модификации биополимеров арилазидными реагентами базируется на сведениях о фотохимических превращениях арилазидов в органических средах. Однако некоторые экспериментальные факты свидетельствуют о том, что в ряде случаев в модификации белков принимают участие не арилнитрены, а частицы, время жизни которых значительно превосходит время жизни первичных продуктов фотолиза. Неполная информация о механизмах фотопревращения арилазидов в водных растворах, а также отсутствие сведений о строении продуктов фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков, затрудняют интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров.
Целью настоящей работы является установление механизма фотоаффинной модификации белков при использовании фотореагентов на основе и-нитрозамещённых арилазидов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить природу реакционно-способных частиц, принимающих участие в модификации белков; 2) установить структуру продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с некоторыми функциональными группами белков.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании и-нитрозамещенных арилазидных реагентов обусловлены образованием в ходе облучения реакционноспособного ароматического нитрозосоединения. Установлено, что в водных растворах предшественником его является Л'-замещенный арилгидроксиламин, а не триплетный
»тали ранее. РдС. НАЦИОНАЛЬНАЯ , БИБЛИОТЕКА |
Выявлено, что при модификации белков реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты наиболее «уязвимыми» мишенями в белковой молекуле являются функциональные группы ароматических аминокислот. Установлено, что при модификации остатка триптофана образуется производное кинуренина. Предложен механизм образования его на стадии «темновых» реакций. Выявлена возможность образования неустойчивых аддуктов сульфиминовой природы при использовании и-нитрозамещённых арилазидов в качестве фотореагентов.
Результаты данной работы, бесспорно, окажутся полезными при планировании экспериментов с использованием реагентов на основе я-нитрозамещённых арилазидов, а также при интерпретации данных по фотоаффинной модификации белков.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на III Съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002 г. и международных конференциях: «Trends in Nucleic Acid Chemistry», Москва, Россия, 2000; Forum of Yong Scientists Protein Structure-Function, Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB, Ойерас, Португалия, 2001; 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Лиссабон, Португалия, 2001; "RNA as Therapeutic And Genomics Target", Новосибирск, Россия, 2001; VI Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes". Новосибирск, Россия, 2002; «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference», Новосибирск, Россия, 2003; «Chemical & Biological Problems of Proteomics», Новосибирск, Россия, 2004.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 16 рисунков, 45 схем и 6 таблиц. Библиография включает 150 литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Долгоживущие интермедиа™ ответственные за «темновые»
процессы, протекающие при фотоаффинной модификации белков реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты
С использованием стрептавидин.биотиновой системы, предложенной ранее, нами были исследованы «темновые» реакции функциональных групп белка с продуктами фотолиза аналогов биотина, несущих 5-азидо-2-нитробензоильную группу, присоединённую к остатку биотина через
1,2-диаминоэтановый или 1,3-диаминопропановый линкер. Выбор в качестве объекта исследования стрептавидин.биотиновой системы обусловлен большим сродством компонентов данного комплекса друг к другу (Ка = 10й М"1), что позволяет ограничить область модификации функциональных групп белков в пределах участка связывания лиганда и накопить достаточное количество продукта модификации аминокислотного остатка для физико-химического анализа.
Синтез №-(5-азидо-2-нитробензоил)-№-(й-биотинил)-1,2-
диаминоэтана (1) и №-(5-азидо-2-нитробензоил)-ТЯ'-(й-биотинил)-1,3-диаминопропана (2) и их аффинные свойства. Фотоаналоги биотина (1) и (2) были получены путём ацилирования первичной аминогруппы /V-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,2-диаминоэтана и ЛЦ5-азидо-2-
нитробензоил)-1,3-диаминопропана с помощью 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина, очищены с помощью ОФХ и охарактеризованы с помощью физико-химических методов.
В силу большого сродства биотина к стрептавидину, оказалось невозможным провести сравнительный анализ по специфическому связыванию биотина и его фотоаналогов обычны^ путём. Выводы о количественном включении аналогов биотина в активный центр стрептавидина были сделаны на основании данных по взаимодействию стрептавидина с фотобиотином (1) и (2) при разных мольных отношениях компонентов (фотоанало1;:стрептавидин = 10:1 и 4:1). Обнаружено, что фотоаналоги биотина полностью связываются со стрептацидином при мольном отношении 4:1. В качестве доказательства того, что фотоаналоги (1) и (2) связываются с тем же центром субъединицы стрептавидина, что и природный лиганд, была продемонстрирована неспособность соединений (1) и (2) связываться с природным комплексом стрептавидин.биотин (мольное отношение фотоаналога к комплексу было 4:1). Способность стрептавидина к специфическому связыванию с продуктами фотолиза соединений (1) и (2) была доказана в аналогичной серии экспериментов с использованием предоблучённых фотоаналогов биотина.
Фотовзаимодействие и вторичные реакции фотоактивируемых аналогов биотина (1) и (2) с активным центром стрептавидина. Для
исследования возможности участия в модификации долгоживущих интермедиатов, генерируемых при облучении реагентов, несущих 5-азидо-2-нитробензойную группу, были поставлены эксперименты по аффинной модификации стрептавидина с использованием фотоактивируемых аналогов биотина (1) и (2) (реакционные смеси I) и
продуктов их фотолитического разложения (реакционные смеси И). Используемое мольное отношение лиганд/белок составляло 4:1.
В таблице 1 приведены данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (1) при различных условиях проведения реакции.
Таблица 1.
Данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (1) при различных условиях проведения реакции (реакционные смеси I—III).
№ реакц. смеси. Облучение фото-биотина, с. Облучение реакц. смеси, с. Хроматографические данные ** (время удерживания, мин)
I — 40 6.97 (/), 11.729 (3)
II 40 — 6.737(7), 9.417 (2), 11.692 (3)
III 40 40 6.73 U), 9.317 (2), 11.618 (3), 14.5 (-0
контрольный эксперимент* 6.833 (1), 9.417 (2)
* — облучённый фотоаналог биотина, ** — детекция при X ~ 360 нм
Видно, что, как в случае реакционной смеси с облучённым комплексом стрептавидин.фотобиотин (1) (реакционная смесь I), так и при модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения (1) (реакционная смесь II), образуются модифицированные пептиды, время удерживания которых на смоле с обращенной фазой одинаково (фракция 5). В случае модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения с повторным облучением реакционной смеси (реакционная смесь III) наблюдается появление модифицированных пептидов, отсутствующих в случае реакционных смесей I и II (фракция 4). Это может указывать либо на образование в ходе облучения фоточувствительных интермедиатов, модифицирующих белок после дополнительного фотолиза, либо на образование фоточувствительного ковалентного аддукта. В ходе аналогичных экспериментов, проведенных с использованием в качестве лиганда фотоаналога биотина (2), получается более сложный набор модифицированных пептидов (данные не приведены), но анализ соответствующих хроматографических данных так же указывает на протекание «темновой» стадии модификации.
Представленные выше результаты указывают на то, что частицей, модифицирующей белок, может быть не арилнитрен, как считали ранее, а продукт его дальнейшего превращения. В силу этого было целесообразно исследовать механизм фотолиза реагентов на основе 5-азидо-2-
нитробензойной кислоты в условиях проведения фотоаффинной модификации белков.
Механизм фотопревращения фотоаналога биотина (1). Изменения электронных спектров поглощения соединений (1) и (2) в ходе их облучения в водном растворе отличаются (данные не приведены). В то же время следует отметить, что характер изменения в спектре поглощения продуктов фотолиза (1) аналогичен изменению в спектре поглощения, наблюдаемому при облучении 7У-(2-нитро-5-азидобензоил)-/У'-(с1-биотинил)-1,4-диаминобутана. Это указывает на то, что судьба арилнитрена, образующегося в ходе облучения фотоактивируемых аналогов биотина, будет определяться размером спейсера, связывающего биотиновый остаток с арилазидной группой. Одним из путей дальнейшего превращения арилнитрена, образующегося при фотолизе соединения (1), может быть его внутримолекулярное взаимодействие с биотиновым остатком (схема 1).
0
1 (N^N11
н
\
ш
-N2
0
1 Н1М 1МН
н
о
(СН2)4-С'
№
NN
¿н2
N0, &
1|3"
нн^лн
е '"а1 15" 7" 8" 9"
"СН2СН2СН2СН2 II 6"а '
N б"? 'О4« 7
С-МН-СНг-СНг
1 а 2' г
<р£=0
о
ы
в" "(СН2)4-С •¡Н: NN
¿н2
С—NN—¿Н2 N0, ^
1
Ь -р
сн2
N02 &
Схема I.
На преимущественное протекание внутримолекулярной реакции арилнитрена с биотиновым фрагментом указывает возрастание процентного содержания основного продукта фотолиза (3) при понижении концентрации исходного арилазида (1) в облучаемом водном растворе. Согласно данным 1Н-ЯМР (таблица 2) соединению (3), соответствует структура циклического иминосульфурана (схема 1).
Соединение (3) оказалось неустойчивым. Время полупревращения 2.5 мМ водного раствора соединения (3) в единственный продукт (4) при комнатной температуре было 8.5 суток. Скорость превращения увеличивалась при нагревании и по мере разбавления раствора водой. Процесс не происходил в таких растворителях, как МеОН и СН3СТ^. Эти факты могут свидетельствовать о протекании протон-зависимой реакции. Кроме того, высокая диэлектрическая проницаемость воды может приводить к увеличению скорости протекания процесса за счёт разделения разноименных зарядов. Данные 'Н-ЯМР для продукта превращения (3) приведены в таблице 2 и соответствуют структуре N-(5-амино-2-нитробензоил)-Лг '-(с!-(5'-оксо)биотинил)-1,2-диаминоэтана (4) (схема 1).
Таблица 2.
Данные 'Н-ЯМР для соединений (3) и (4) (С03С1Ч, 5, м.д. и /, Гц).
(Н) Соед. 3, д, 4, дд, 6,д 1е", дд 1а", дд 2я, ддц 4", дд 5я, ддд
(3) 8.07 79.0 7.19 79.0, 2.5 7.24 72.5 4.10 713.2, 6.0 3.96 713.2, 3.0 4.9 78.0, 6.0, 3.0 4.78 78.0,5.5 4.22 710.5, 5.5,4.0
(4) 7.97 У 9.0 6.70 79.0, 2.5 6.64 72.5 2.83 715.0, 6.5 3.24 715.0, 1.5 4.77 78.5, 6.5, 1.5 4.64 78.5,6.0 2.69 710.0, 5.0,6.0
Строение соединения (4) подтверждено спектральными данными (13С-ЯМР, ИК, МС). В ИК-спектре аминопроизводного (4) наблюдается сильная полоса поглощения при значении волнового числа 1097,9 см'1, что может быть вызвано валентными колебаниями связи Я=0. В масс-спектре этого соединения регистрируется сигнал с т/г 437.2, соответствующий массе иона [М - N0 + Н]+.
При фотолизе соединения (1) не было обнаружено продуктов, характерных для реакций триплетных нитренов. Диалкилсульфиды часто используются в качестве ловушек синглетных нитренов. Таким образом, можно предполагать, что синглетный арилнитрен, образующийся при фотолизе соединения (1), не претерпевает интеркомбинационный переход в триплетное состояние, а при создавшихся благоприятных условиях (близко расположенный нуклеофильный центр на биотиновом остатке) взаимодействует с нуклеофильным атомом серы. Однако возможность образования соединения (4) через взаимодействие триплетного нитрена с атомом серы биотинового остатка также нельзя упускать из рассмотрения. Такое взаимодействие может протекать лёгко за счёт того, что электроноакцепторная нитрогруппа будет способствовать
восстановлению нитрена с образованием соединения сульфиминовой природы.
Образование сульфиминов в условиях фотоаффинной модификации может привести к снижению эффективности образования ковалентных аддуктов между фотореагентом и белком по трем причинам: 1 - за счёт реакции нитрена с компонентами буфера (тиолсодержащими соединениями); 2 - за счёт гидролиза ковалентных аддуктов с сульфиминовой связью, образующихся в случае модификации серусодержащих аминокислотных остатков; 3 - в связи с возможным образованием ковалентно соединённых между собой участков внутри модифицированного белка за счет реакции активного сульфинимина с нуклеофильным боковым радикалом аминокислотного остатка.
Механизм фотопреврашения и-нитрозамещенных арилазидов в
условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров.
Результаты исследований по фотопревращению соединения (1) нельзя обобщать для всех реагентов, несущих остаток 5-азидо-2-нитробензойной кислоты даже в пределах фотоаналогов биотина. Для того чтобы понять, какие долгоживущие интермедиаты могут принимать участие в модификации белков при использовании реагентов на основе п-нитрозамещенных фенилазидов, мы исследовали фотопревращение N-(2-нитро-5-азидобензоил)-1,3-диаминопропана (5) и л-нитрофенилазида (6) - функциональных групп аффинных реагентов - в условиях проведения фотоаффинной модификации белков, т.е. в водных растворах.
Фотопревращения 1У-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропама (5) при облучении в водных растворах. При облучении амида 5-азидо-2-нитробензойной кислоты (5) в водных растворах с различным содержанием кислорода замечено, что в присутствии 02 образуется соединение (7), которое элюируется с обращенной фазы при более высокой концентрации ацетонитрила по сравнению с соединениями, образующимися при облучении соединения (5) в атмосфере аргона. На основании данных 'Н-ЯМР (см. табл. 3) этому соединению, может быть приписана структура Аг-(3-амино-пропил)-5-{3-(3-амино-
пропилкарбамоил)-4-[3-(3-амино-пропилкарбамоил)-4-нитро-фенил-А^О-азокси]фенил-ОЛ^-азокси}-2-нитробензамида (7) (см. рис. 1). Строение соединения (7) подтверждено данными 13С-ЯМР и MC. В MALDI масс-спектре продукта фотолиза (7) наблюдается пик с m/z 959.25, соответствующий массе иона этого соединения с дополнительно присоединенными двумя молекулами трифторацетата и ионом натрия, т. е. [А/(т) + 2 CF3COO" + Na]+. Трифторацетат в составе соединения
выявляется также 19Р-ЯМР-спектроскопией. Появление его в качестве противоиона протонированного аминоспейсера обусловлено использованием раствора трифторуксусной кислоты в качестве элюента в процессе хроматографического разделения продуктов фотолиза арилазида (5).
Таблица 3.
Данные 'Н-ЯМР соединения (7) фМБО-с!6,8, м.д., МГц).
J д, 9.0 ДД 9.0,2.4 Д, 2.4 м м м т, 6.0 т, 6.0 т, 6.0
[Н),8 3 8.34 4 8.56 6 8.47 8,8' 9,9' 10,10' РШ N11' ГШ"
У 8.33 4' 8.29 6' 8.13 и 8" и 9" и 10" 9.02 8.97 8.80
3й 8.26 4й 8.22 6" 8.11 3.37 1.83 2.92
8 9 10 в СН2-СНг-СН2-МН?
I
7С=0
6'
02М
г^УзТ"' *
з 4 о 4.
8' 91 10' СН2-СНг-^Н2
N11 N11? Т<!:=0 Г «:
о 4.
8" 9" 10" СНг-СНг-СНг
N11 N11?
N0;
Наряду с соединением (7) из реакционной смеси с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ было выделено еще два мажорных продукта фотолиза: А^-(5-амино-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропан (8) и N-(2,5-динитробензоил)-1,3-диаминопропан (9). До настоящего времени такие продукты фотолиза арилазидов рассматривались как результат превращения триплетного нитрена (схема 2, путь а).
7
Рис. 1.
Структура продукта фотолиза (7) ЛЦ5-азидо-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана (5).
8 я-ш, 4
Я-N-0-0 —►
* о2
II
6
Впервые на роль предшественника всех
выявленных продуктов
фотолиза нами предлагается и-нитрозамещенный М-арилгидроксиламин (10) -продукт взаимодействия
арилнитрена с молекулами воды (схема 2, путь б), я-м-тч-я Реакционноспособное нитрозо-
соединение (11) может образоваться за счёт окисления № арилгидроксиламина кислородом воздуха или его диспропорционирования. Наличие в молекуле производного гидроксиламина аминоспейсера, рКа которого находится в области значения р/Га для гидроксигруппы и-нитрозамещенного гидроксиламина (рА"а = 10.2), может способствовать смещению равновесия в сторону образования цвиттер-иона гидроксиламина (10) - соединения (10а) (см. схему 3). Взаимодействие последнего с электронодефицитным
Схема 2.
нитрозосоединением (И) приведет к формированию комплекса с
переносом заряда. При внутрикомплексном восстановлении нитрогруппы
в реакционной смеси будет накапливаться 2,5-динитрозопроизводное
(12), которое, вступив в реакцию азоксисочетания с двумя молекулами /V-
арилгидроксиламина (10), образует «тример» (7) (схема 3). -о
' 1ч) -^ М О
СО-М^СНгЫ'Ш,4 С'ОМЩСНгЬКН/
ИэШ СН2)3ИН
^^—N=5 О
12 СО- N ЩС^^Р-Ш/
ЙН ..
о=ы
10
С'0-ЫН(СН2)^Н/
Схема 3
\=/ ЧСГ
СО-ЫН(СН2ЬЫ1Г
-о-
N02
Отсутствие среди мажорных продуктов фотолиза димера - продукта азоксисочетания нитрозосоединения (11) с гидроксиламином (10) -связано, вероятно, с тем, что динитрозопроизводное (12) обладает большей реакционной способностью в реакции азоксисочетания, чем мононитрозосоединение (11).
NN
Н*
НгО н,а
и
14
J
Фотопревращение п-нитрофенилазида (6) при облучении в водных растворах.
Выделение и идентификация А^-арилгидроксиламинов затруднительны из-за их неустойчивости в водных растворах. Зарегистрировать образование ЛЦи-нитро-
фенил)-гидроксиламина удалось только при облучении водного раствора и-нитро-фенилазида (6) в присутствии 30 %-ов метанола (рН 8). В ходе фотолиза наблюдается образование соединения (13) (см. схему 4), электронный спектр поглощения которого (Х^ = 357 нм) аналогичен описанному в литературе для /У-(и-нитрофенил)-гидроксиламина (лит. А™,х = 356 нм).
Образование ТУ-арилгидроксиламина в ходе облучения 4-нитрофенилазида в водных растворах было подтверждено через
Схема4
реакцию азоксисочетания продукта фотолиза с 1-нитрозой-нитробензолом (14) (схема 4). Для того чтобы исключить влияние кислорода, фотолиз и-нитрофенилазида (6) в присутствии «ловушки» -1-нитрозо-4-нитробензола - проводили в атмосфере аргона. Предварительно было показано, что в условиях облучения нитрозосоединение (14) устойчиво. Было обнаружено, что с увеличением дозы облучения, молярный коэффициент экстинции в области максимального поглощения 1-нитрозо-4-нитробензола (Х^ = 282 нм) падает. Это указывает на вовлечение нитрозосоединения в реакцию. Образующееся при этом соединение было выделено и идентифицировано нами как 4,4'-динитроазоксибензол (15).
Дополнительно мы исследовали взаимодействие 1-нитрозо-4-нитробензола (14) с предоблучённым азидом (6). Как видно из таблицы 4, с повышением концентрации нитрозосоединения (14) выход азоксипродукта (15) увеличивается симбатно. Это еще раз свидетельствует о том, что при облучении »-нитрозамещённых арилазидов в водных растворах в качестве промежуточного активного интермедиата образуется М-арилгидроксиламин.
Таблица 4.
Зависимость выхода азоксисоединения от соотношения арилазид/нитрозосоедияение
Соотношение концентрации соединений (6) / (14) В отсутствие (14) 3.6/1 0.7/1
♦Выход соединения (15), % 15 31 73
* - Выход оценен как молярный эквивалент относительно исходного количества нитрозосоединения (14).
Совокупность полученных нами результатов указывает на то, что фотоаффинные реагенты на основе л-нитрозамещенных арилазидов при облучении могут генерировать долгоживущие химически активные соединения - нитрозосоединения. Последние, в силу своей реакционной способности, могут взаимодействовать с функциональными группами белков, что необходимо учитывать при анализе данных по фотоаффинной модификации биополимеров.
Изучение продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитро-бензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров.
Решение проблемы по установлению структуры продуктов фотомодификации аминокислотных остатков мы проводили с
использованием двух модельных систем, предложенных и хорошо зарекомендовавших себя ранее:
1) комплекса стрептавидин.фотоаналог биотина;
2) соединения, в котором аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка.
Анализ модифицированного пептида. В ходе изучения фотоиндуцированного взаимодействия стрептавидина с соединением (1) было обнаружено, что модифицированные пептиды неустойчивы в условиях анализа. Поэтому все работы по установлению структуры модифицированных пептидов проводились с использованием стрептавидина, модифицированного фотобиотином (2).
Для анализа использовали модифицированный пептид, образующийся как при облучении, так и на «темновой» стадии модификации стрептавидина. Электронный спектр поглощения модифицированного пептида характеризуется А™,, = 385 нм, что указывает на присутствие в составе продукта остатка реагента. Первичная структура модифицированного пептида была проанализирована методом Эдмана и определена как в(74) \\'*ТУА\¥*К1Ч(81), где XV* - модифицированный остаток триптофана. В МАЬ01-масс-спектре продукта регистрируется сигнал с т/г = 1455.1, соответствующий массе иона, образованного пептидным фрагментом с дополнительно присоединенным остатком арилнитрена и двух атомов кислорода.
Активный центр стрептавидина хорошо изучен различными методами. Его формируют аминокислотные остатки и пептиды: >}(23)(2Ь08(27); У(43)Е8АУОМ(49); 8(88)АТТ\У(92); \У(108)Щ110); а так же \У(79) \У(120); Б(128); и Т(129). Таким образом, видно, что модифицированный пептид попадает в район активного центра стрептавидина, причём, согласно компьютерному моделированию активного центра стрептавидина АУ(75) и \¥(79) могут взаимодействовать непосредственно с фотоаналогом биотина. В ходе экспериментов по исследованию аффинных свойств фотоактивируемого производного биотина и продуктов его фотолитического разложения нами было показано, что во всех случаях активный центр стрептавидина может включать только одну молекулу фотоаналога биотина или одну молекулу продукта его фотолиза, и проникновение туда второй активной частицы практически невозможно. В то же время, очевидно, что одна нитреновая частица, синглетная или триплетная, не может служить причиной модификации двух остатков триптофана. К тому же модифицированный пептид образовывался как при фотовзаимодействии стрептавидина с
фотобиотином, так и при добавлении к белку предоблученного реагента. Фотомодификация активного центра одной субъединицы реагентом, связанным в активном центре другой субъединицы стрептавидина, также исключается. Для того чтобы арилазидогруппа провзаимодействовала с любым из остатков триптофана соседней субъединицы, нужно сместить её на расстояние, превышающее суммарную длину остатка валериановой кислоты, аминоспейсера и самой арилазидной группы. Таким образом, факт модификации двух остатков триптофана одной молекулой фотореагента может быть объяснён тем, что при облучении образуется соединение, которое, модифицируя один аминокислотный остаток, превращается в другое активное соединение, взаимодействующее со вторым остатком триптофана.
Изучение структуры продуктов фотовзаимодействия функциональных групп белков с арилазидами может дать ключ к пониманию природы образующихся при фотолизе арилазида активных частиц, и механизма их взаимодействия с боковыми радикалами аминокислот. На основе этих данных можно было бы создать предсказательную модель, полезную для интерпретации результатов, полученных при исследовании многих биомакромолекул и биохимических процессов методами фотоаффинной модификации. Поэтому в задачу следующего этапа работы входило определение строения продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с некоторыми функциональными группами белка.
Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с функциональными группами триптофана и гистидина. Решение проблемы установления структуры продуктов фотомодификации аминокислотных остатков целесообразно проводить с использованием модельных соединений, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. Для исследования продуктов фотомодификации функциональных групп триптофана и гистидина реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислот нами были синтезированы два модельных соединения: 5-азидо-ТУ-[2-(3Н-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитробензамид (16) и И- {3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамид (17). Соединение (16) было получено путем бензоилирования аминогруппы гистамина Ы-гидроксисукцинимидным эфиром 5-азидо-2-нитробензойной кислоты. Синтез соединения (17) проводился через ацилирование аминогруппы спейсера пентафторфениловым эфиром Лос-защищенного триптофана. Структуры модельных соединений были подтверждены методами 'Н-
ЯМР, 13С-ЯМР, ИК- и электронной спектроскопии и МАЬЕН-ТОР-масс спектрометрии.
Фотолиз 5-азидо-№[2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитробензамида (16). Было обнаружено, что набор продуктов фотолиза соединения (16) зависит от содержания кислорода в облучаемом растворе. Выделенные после облучения продукты (18), (19) и (20) на основании данных 'Н-ЯМР и электронной спектроскопии были идентифицированы как азокси-амино- и нитросоединения, соответственно (схема 5).
ЬУ
к * ..........."" * шц
16 О 18 19 2» ^С-ЫНЧСНг)г^
Схема 5.
Фотолиз М-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида (17).
4 17
О
02Н
н= —ин
«■¿н2 9
2'Ц Я"»
3'СН2 N4 12" 6=0
н2\4н1Г Й
10" /=\ о 'мню
М Жг&эьбЛ--
110 7'^
Н-
0: ЫНОН
диспропорционирование
о
7" б" И 6
МН-СНгСНзСНзШ С^^^Ш^ £ 10" II" 12" 3' 2' Г 7 Г 24
I
02К2^ *
Схема 6.
Среди продуктов фотолиза соединения (17), наряду с устойчивыми соединениями (21) и (22) (см. схему 6), было выделено соединение, которое с течением времени распадалась с образованием трех основных продуктов: неустойчивого соединения (23) и двух устойчивых соединений (21) и (24). На основании сходства химического поведения и электронных спектров поглощения продукта (23) (Хпшх = 358 нм) и п-нитрофенилгидроксиламина (^тах = 356 нм), соединение (23) было отнесено к производному Л'-замещенного арилгидроксиламина (схема 6).
Данные Н-ЯМР-спектроскопии для соединений (21) и (22) свидетельствуют о том, что модификация по остатку триптофана отсутствует. Согласно данным 'Н-ЯМР и электронной спектроскопии и
МАЬОЬмасс-спектрометрии, соединению (21) может быть приписана структура аминосоединения, а соединению (22) - структура азоксисоединения (схема 6).
При сравнении электронных спектров поглощения триптофана и соединения (24) выявляется отсутствие полосы поглощения, соответствующей индольному кольцу, кроме того, в спектре соединения (24) наблюдается полоса поглощения (Апих = 382 нм), свидетельствующая о наличии 5-амино-2-нитробензоильного остатка (Х^ = 383 нм). Согласно данным 'Н-ЯМР соединению (24) может соответствовать структура ТУ- {3-[2-амино-4-(2-аминофенил)-4-оксобутириламино]-
пропил}-5-амино-2-нитробензамина (см. табл. 5, нумерация атомов в соединении (24) аналогична нумерации, приведеной на схеме 6 для соединения (17)).
Таблица 5.
Данные 'Н-ЯМР для соединения (24) (020,8, м.д. и 7, Гц).
(Н) 3 4 6 2" 5" 6й 7" 8й 10" 11"
о 8.04 6 77 6 65 — 7 84 7.45 6.82 6.91 3.78 4.50
J д, да д, — д, т, т, д, д, т,
90 9.0,2.4 2.5 8.0 8.0 8.0 8.0 6.0 6.0
Данные MALDI-TOF-масс спектрометрии подтверждают образование производного кинуренина. В масс-спектре соединения (24) регистрируются сигналы с m/z 427 [М + Н]+, m/z 397 [М - NO], m/z 381 [М - N0 - О].
NH^H
NH, NH,
|Äc=0 ^ Ч^-СН, г'нс^о ^ Ч.снгс'н-с=о
NH перенос 1 е С- \® NH - NH
^N. о ^ -^N "'V" k^HN V" &
<ZVc NH—СН; 2 <^Zr>-'-NH-CHiH'
ЫГ1. TS k'xi г&
NH, NO= 25 NO
/ ^ nh2 O®
C-CH2-CH-C-NH 'vi, C-Ö V--< - l —< n ,
Ö 6 ¿H . V>CHrC^-C-NH V 0 CH;
■ 1 H'° ö bL ."зО HN L
- - Ii V"2 ' Ч г. ГI
I AWHNH, k^-ZcHr^H-C-NH
-NH-CH,
о ¿и I ° г TT Ы V'b
Схема 7.
Образование предшественника соединения (24) является кислород-зависимым процессом. Среди стадий процесса фотопревращения арилазида (17), кислород-зависимой стадией является окисление /У-арилгидроксиламина (23), приводящее к образованию
нитрозосоединения (25), которое, кроме того, может образоваться за счёт диспропорционирования соединения (23). Взаимодействие арилнитрозогруппы с индольным кольцом триптофана, вероятно, приводит к образованию продукта (24) (схема 7). В реакции диспропорционирования М-арилгидроксиламина (23), наряду с нитрозосоединением будет накапливаться аминосоединение (21). Продуктом конденсации исходного /V-арилгидрокисламина с нитрозосоединением будет азоксисоединение (22) (схема 6).
Работа выполнена при поддержке грантов SCOPES 2000-2003, CRDF Ree 008, РФФИ и №НШ-1419-2003-4.
ВЫВОДЫ
I. В условиях проведения фотоаффинной модификации белков исследован механизм фотохимического превращения и-нитрозамещенных арилазидных реагентов. Впервые показано:
1) облучение и-нитрофенилазида, Л'-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана - функциональных фрагментов фотоаффинных реагентов - в водных растворах приводит к образованию и-нитрозамещенных Л'-арилгидроксиламинов;
2) предшественником ароматических нитрозо-, амино-, азоксисоединений в водных растворах является /V-замещенный арилгидроксиламин, а не триплетный нитрен, как считали ранее; нитрозо- и аминосоединения образуются при диспропорционировании yV-арилгидроксиламина; азоксисоединение является продуктом конденсации исходного /V-арилгидроксиламина с образующимся в процессе его окисления нитрозосоединением;
3) «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании я-нитрозамещенных арилазидных реагентов обусловлены образованием в ходе облучения арилазидогруппы реакционноспособного ароматичекого нитрозосоединения.
II. Для изучения фотоиндуцированного взаимодействия п-нитрозамещенных арилазидных реагентов с функциональными группами аминокислот синтезированы две модельные системы, обеспечивающие сближение реакционных центров:
а) комплекс стрептавидин*фотоаналог биотина;
б) соединения, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка.
С помощью их обнаружено:
1) образование нестабильного ковалентного адцукта сульфиминовой природы, в случае модификации соединений, имитирующих остаток метионина; в водных растворах этот продукт модификации гидролизуется с образованием производного сульфоксида;
2) превращение арилазидного реагента в амино-, нитро-, и азоксисоединения в присутствии функциональных групп лизина и гистидина;
3) образование производного кинуренина, в случае модификации остатка триптофана; предложен механизм его образования на стадии «темновых» реакций.
Основные результаты диссертации изложены в работах:
1. Т.В. Попова. А.Ю. Денисов, Н.И. Комарова, Т.С. Годовикова. Изучение модификации белков продуктами фотолиза амидов 2-нитро- -5-азидобензойной кислоты на примере стрептавидин-фотобиотинового комплекса. // Труды XXXVII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". Из-во НГУ. 1 1999. С. 73-82.
2. Т.У. Popova. A.Yu. Denisov, М.М. Shakirov, N.I. Komarova, P.V. Alekseyev, M.V. Serebriakova, T.S. Godovikova. Long-lived reactive intermediate photogenerated from 7V-(5-azido-2-nitrobenzoyl)-/V'-(d-biotinyl)-l,2-diaminoethane as an affinity reagent to streptavidin // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2001. V. 61. N. 1-2. P. 68-77.
3. T.V. Popova. V.S. Mal'shakova, P.V. Alekseyev, N.V. Kudryashova, M.M Shakirov, L.L. Savinkova, I.A. Drachkova, T.S. Godovikova. Photoanalogues of the initiation substrates of the RNA polymerase II, 5-azido-2-nitrobenzoyl derivatives of the ATP y-amidophosphate: the possible photoinduced degradation of the functional group to an /V-arylhydroxylamine // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acids. 2004. V. 23. N. 6-7. P. 921 — 925.
4. Д. Г. Кнорре, H. В. Кудряшова, Т. В. Попова. М. М. Шакиров, В. С. Малыпакова, О. Е. Шпенев, JI. К. Савинкова, М. В. Серебрякова, Т. С. Годовикова. Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата
РНК-полимеразы II на основе арилазидных производных у-амидофосфатов NTP: синтез, химические и фотохимические реакции функциональных групп. II Биоорган, хим. 2005. Т. 34. № 4. С. 332-343.
5. Т.В. Попова. Т.С. Годовикова. Фотохимическое взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с боковым радикалом триптофана. // Труды 1-го Международного форума "Актуальные проблемы современной науки". Ч. 45: Биология. Из-во СГТУ. 2005. С. 98-101.
Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001. Подписано к печати и в свет 19.10.05 Формат бумаги 60x84/16. Бумага № 1. Гарнитура "Times New Roman". Печать офсетная. Печ. л. 1.1. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 120 Заказ № 155 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090
$212 56
РНБ Русский фонд
2006-4 22883
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Проблемы в фотоаффинной модификации биополимеров при использовании ароматических азидов в качестве функциональных групп аффинных реагентов (обзор литературы)
1.1. Фотоаффинная модификация, и ее место в ряду других методов исследования надмолекулярных комплексов. Типы фотоактивируемых групп. Задача обзора
1.2 Проблемы, возникающие при интерпретации результатов 10 экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров
1.2.1. Фотоактивируемые реагенты, содержащие азидогруппу в 14 гетероциклическом основании
1.2.2. Фотоактивируемые реагенты на основе ароматических азидов
1.2.2.1. и-Нитрозамещённые арилазиды
1.2.2.2. Прочие арилазиды
Огромная роль химических методов в изучении белков, нуклеиновых кислот и их комплексов, в том числе, систем матричного биосинтеза, общеизвестна и бесспорна. [2-5]. Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном диапазоне происходят многие биологические события [4-6]. Кроме того, использование фотореагентов в сочетании с техникой быстрого смешивания компонентов исследуемой системы и последующего импульсного облучения открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.
Несмотря на большое количество времени, прошедшее с начала использования фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов [7], значительная часть вопросов, связанных с особенностями превращения арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации до настоящего времени остается без ответов. Некоторые экспериментальные факты [8,9] свидетельствуют о том, что в ряде случаев в модификации белков принимают участие частицы, время жизни которых значительно превосходит время жизни первичных продуктов фотолиза (арилнитренов или их продуктов внутримолекулярного превращения, таких, как азиридин и азациклогептатетраен [10]). Таким образом, отсутствие достаточной информации о механизме фотовзаимодействия арилазидов с функциональными группами биополимеров и о природе образующихся аддуктов затрудняет интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров.
Целью настоящей работы являлось установление механизма фотоаффинной модификации белков при использовании фотореагентов на основе «-нитрозамещённых арилазидов. Наличие у этих реагентов в пара- положении к азидогруппе такого хромофора как нитрогруппа делает их перспективными в плане использования для исследования нуклеопротеидных комплексов. Это обусловлено тем, что нитрогруппа вызывает сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область (например, у и-нитрофениазида Хтах = 313 нм, а у фенилазида - Хтах = 254 нм). Это позволяет, с одной стороны, эффективно активировать такие арилазиды светом с X > 300 нм, где не происходит фото деградации молекул биополимеров, и, с другой стороны, облегчает детекцию при выделении модифицированного материала. Но, несмотря на широкое применение л-нитрозамещённых арилазидов, информация о механизме их фотовзаимодействия с биополимерами в условиях фотоаффинной модификации последних до сих пор отсутствует, и все рассуждения базируются на результатах фотолиза арилазидов в органических средах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) изучить природу реакционно-способных частиц, принимающих участие в модификации белков;
2) установить структуру продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с функциональными группами белков.
Как изучение природы реакционно-способных частиц, так и установление структуры продуктов фотовзаимодействия является нетривиальной задачей по двум причинам. Во первых, константы ассоциации многих исследуемых ферментов не велики: 106 - 107 М'1. В силу этого, фотоаффинная метка реагирует с большим числом функциональных групп биополимера, что, в совокупности с уже обсуждённой неустойчивостью образующегося аддукта, делает невозможным накопление такого количества модифицированного материала, которое можно исследовать информативными физико-химическими методами. Во вторых, продукты фотомодификации биополимеров имеют олигомерную структуру, что затрудняет применение многих информативных физико-химических методов, таких как ЯМР и масс-спектроскопия. В этом смысле, для решения поставленных нами задач целесообразно использование двух моделей, предложенных ранее [11,12]:
1) комплекс между белком стрептавидином и биотином, содержащим фотореакционноспособную группу, присоединённую к остатку валериановой кислоты через линкер определённой длины. (Ка = 1014 М'1) [13].
2) модельная структура, в составе которой находятся исследуемый арилазидный остаток и группа, имитирующая аминокислотный боковой радикал; эти две группы соединены через аминоспейсер определённой длины таким образом, что они находятся в условиях сближения аналогичных таковым при проведении фотоаффинной модификации белка.
выводы
I. В условиях проведения фотоаффинной модификации белков исследован механизм фотохимического превращения л-нитрозамещенных арилазидных реагентов. Впервые показано:
1) облучение л-нитрофенилазида, АГ-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана -функциональных фрагментов фотоаффинных реагентов - в водных растворах приводит к образованию л-нитрозамещенных iV-арилгидроксиламинов;
2) предшественником ароматических нитрозо-, амино-, азоксисоединений в водных растворах является iV-замещенный арилгидроксиламин, а не триплетный нитрен, как считали ранее; нитрозо- и аминосоединения образуются при диспропорционировании N-арилгидроксиламина; азоксисоединение является продуктом конденсации исходного N-арилгидроксиламина с образующимся в процессе его окисления нитрозосоединением;
3) «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании п-нитрозамещенных арилазидных реагентов обусловлены образованием в ходе облучения арилазидогруппы реакционноспособного ароматичекого нитрозосоединения.
II. Для изучения фотоиндуцированного взаимодействия л-нитрозамещенных арилазидных реагентов с функциональными группами аминокислот синтезированы две модельные, системы, обеспечивающие сближение реакционных центров: а) комплекс стрептавидин*фотоаналог биотина; б) соединения, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с г арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка.
С помощью их обнаружено:
1) образование нестабильного ковалентного аддукта сульфиминовой природы, в случае модификации соединений, имитирующих остаток метионина; в водных растворах этот продукт модификации гидролизуется с образованием производного сульфоксида;
2) превращение арилазидного реагента в амино-, нитро-, и азоксисоединения в присутствии функциональных групп лизина и гистидина;
3) образование производного кинуренина, в случае модификации остатка триптофана; предложен механизм его образования на стадии «темновых» реакций.
1.4. Заключение
На сегодняшний день достаточно большое число работ демонстрирует, что фотоаффинная модификация биополимеров далеко не всегда обуславливается участием только триплетных или синглетных арилнитренов в качестве модифицирующих частиц. Условия проведения фотоаффинного мечения (присутствие молекул воды и кислорода, компоненты буфера) безусловно влияют на природу активных частиц, образующихся при облучении фотоаффинных реагентов, несущих арилазидные группы. Возникновение в процессе фотоаффинной модификации химически активных соединений (азирины, азациклогептатетраены, аминильные радикалы и радикалы амминия, катионы арилнитрения, гидроксиламины, нитрозооксиды, нитрозосоединения, илиды, бензохинонмоно- и диимины) может привести к «темновым» процессам. Это создает проблему при интерпретации данных по фотоаффинной модификации. Анализ литературных данных по химическим реакциям различных химических соединений, образующихся из арилнитренов, позволяет не только оценить вклад в модификацию биополимера тем или иным долгоживущим интермедиатом, но и способствует более грамотному подходу при выборе оптимальной функциональной группы для конструирования реагентов, а также условий проведения фотоаффинной модификации и условий выделения модифицированных биополимеров с целью последующего анализа их физико-химическими методами исследования.
ГЛАВА 2. Результаты и их обсуждение
2.1. Долгоживущие интермедиаты ответственные за «темновые» процессы, протекающие при фотоаффинной модификации белков реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты
Несмотря на то, что в классической арилазидной химии яя/?я-нитрозамещённые арилазиды считаются источником триплетных арилнитренов, о природе модифицирующей частицы в случае их использования нельзя судить однозначно. Исследование механизма фотовзаимодействия реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты с функциональными группами белков имеет фундаментальное значение для интерпретации результатов исследований биополимеров методом фотоаффинной модификации. Успех в решении данной задачи будет во многом определяться правильным выбором в качестве объекта исследования модельной системы - белок.фотоактивируемый лиганд.
Константы связывания многих ферментов с аналогами субстратов находятся в области 105 - 107 М'1, что может обусловить образование в процессе облучения аддукта между белком и фотореагентом вне активного центра фермента и привести к широкому распределению продуктов фотоаффинной модификации. Авторы работы [48] считают, что высокая степень модификации может получиться только в том случае, если время жизни комплекса фермент*лиганд больше времени жизни активной - частицы, осуществляющей модификацию. Кроме того, как считают авторы [35], если фотоаффинный лиганд встраивается в активный центр ошибочным образом, то он может иметь большее разнообразие мишеней, чем лиганд, связывающийся правильно. Большое количество различных модифицированных мишеней может усложнить накопление такого количества каждой, которое позволит исследовать структуру продукта фотомодификации информативными физико-химическими методами. Для решения проблемы установления структуры продуктов фотомодификации аминокислотных остатков, авторами работы [11] был предложен комплекс стрептавидин*фотобиотин, где фотобиотин представляет собой арилазидную группу, соединённую с остатком валериановой кислоты биотина через диаминобутановый спейсер (88) (рис. 3). Выбор в качестве объекта исследования стрептавидин.биотиновой системы обусловлен большим сродством компонентов данного комплекса друг к другу (Кя = 1014 М'1) [13], что позволяет ограничить область модификации функциональных групп белков в пределах участка связывания лиганда и накопить достаточное количество продукта модификации аминокислотного остатка для физикохимического анализа. Авторами [11] было установлено, что мишенью фотомодификации является остаток Туг-54, входящий в связывающий центр белка. О
HN NH О
02N
4S< ^(СН2)4-С—NH(CH2)4NH—
88
Рис 3. Фотоаналог биотина.
С использованием стрептавидин*биотиновой системы нами были исследованы «темновые» реакции функциональных групп белка с продуктами фотолиза аналогов биотина, несущих 5-азидо-2-нитробензоильную группу, присоединённую к остатку биотина через 1,2-диаминоэтановый или 1,3-диаминопропановый линкер.
2.1.1. Синтез Л^-(5-азидо-2-нитробензоил)-]У,-((1-биотинил)-1,2-диаминоэтана (89) и 7У-(5-азидо-2-нитробензоил)-/У'-({1-биотинил)-1,3-диаминопропана (90)
Фотоаналоги биотина (89) и (90) были сконструированы путём ацилирования первичной аминогруппы Аг-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,2-диаминоэтана и ,/У-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана с помощью 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина (схема 36), очищены с помощью ОФХ и охарактеризованы с помощью физико-химических методов. о х
HN NH ch2-ch2-ch2-ch2-c О
-0 + R"NH О
JV
HN NH
4" О
II ^^
Га
R-NH-C-CK2-CH2-CH2-CHr5' S^ 1-е
10" 9" 8" 7" 6"a 6")3
R=
O2N 2
-CH2-CH2-NH—с
2' Г О
02N42^4
N3 — ch2-ch2-ch2-NH
3. 2' 1'
Схема 36.
Выбор данного активированного эфира биотина основан на хромофорных свойствах 2-нитро-4-сульфофенилового остатка, что может быть использовано для наблюдения за ходом реакции методом ТСХ. Другой особенностью 2-нитро-4-сульфофенола является его хорошая:-растворимость в водных растворах, в то время как растворимость фотоаналогов биотина ограничена. Это позволяет выделить целевой продукт реакции путём его экстрагирования этилацетатом в органическую фракцию. Детали синтеза и физико-химические характеристики приведены в экспериментальной части.
2.1.2. Связывание фотоаналогов биотина и продуктов их фотолиза с лиганд-связывающим центром субьединиц стрептавидина
В; силу большого сродства биотина по отношению к стрептавидину, оказалось невозможным провести сравнение аффинности биотина и его фотоаналогов обычным путём. Выводы о включении аналогов биотина в активный центр стрептавидина были сделаны на основании данных по взаимодействию стрептавидина с фотобиотином (89) и (90) при разных мольных отношениях компонентов (фотоаналоггстрептавидин = 10:1 и 4:1). После инкубирования смесей в течение 15 мин в темноте, их анализировали методом гель-фильтрации. Идентификация соединений во всех фракциях пиков была сделана путём регистрации поглощения на длинах волн 320 нм и 280 нм. Выбор соответствующих длин волн был сделан с учетом спектральных характеристик фотоаналогов биотина (А.тах = 320 нм)
71 и белка (Ятах - 280 нм). Было обнаружено, что фотоаналоги биотина полностью связываются со стрептавидином при мольном отношении 4:1. Чтобы доказать, что фотоаналоги (89) и (90) связываются в том же центре субъединицы стрептавидина, что и природный лиганд, была проверена способность фотоаналогов связываться с природным комплексом стрептавидин.биотин. После добавления фотобиотина (89) или (90) к природному комплексу (мольное отношение фотоаналога к комплексу было 4:1), смесь анализировали методом гель-хроматографии. Было обнаружено, что фотоаналоги биотина не связываются со стрептавидином, в котором связывающий центр каждой субъединицы уже занят биотином (хроматографические профили не приводятся). На основании результатов двух серии экспериментов, можно сделать вывод, что фотоаналоги взаимодействуют с биотин-связывающим центром субъединиц стрептавидина.
Прежде чем исследовать «темновые» реакции функциональных групп белка с продуктами фотолиза аналогов биотина, предварительно была изучена способность долгоживущих интермедиатов, образующихся в процессе облучения (89) и (90), связываться с биотин-связывающим центром субъединиц стрептавидина. Для этого каждый из фотореагентов (89) и (90) был облучён и добавлен к ферменту в разных молярных соотношениях. Детали этого эксперимента описаны в соответствующей части раздела «Экспериментальная часть». На рис. 4 приведены профили ионообменной хроматографии;; инкубированных смесей предоблучённых фотолигандов со стрептавидином.
Рис. 4. Профиль аналитической ионообменной хроматографии комплекса стрептавидин
•предоблучённый фотоаналог биотина (89) при молярном соотношении реагента к стрептавидину 4:1 (а) или 10:1 (б) и реакционной смеси, полученной при добавлении предоблучённого соединения (89) к комплексу стрептавидин-биотин (1:4) при молярном отношении (89):комплекс равном 4:1 (с). Детекция проводилась при 360 нм (—) и 280 нм (--).
Время удерживания, мин.
При соотношении предоблучённый лиганд (89):субъединица стрептавидина равном 1:1 наблюдается единственный пик, соответствующий стрептавидину, содержащему продукт облучения фотореагента (пик 2), о чём свидетельствует поглощение при X - 360 нм (Рис. 4 (а)). При избытке фотореагента (89) (соотношение предоблучённый лиганд (89):субъединица стрептавидина равном 2:1 (Рис. 4 (б)) несвязанный префотолизованный лиганд элюируется отдельным пиком при 0.046 М NaCl (пик 1), а стрептавидин, содержащий предоблучённый фотореагент, элюируется в 0.11 M NaCl (пик 2). Результат, полученный с использованием , фотобиотина (90) аналогичен результату приведённому выше для (89), (данные ИОХ не приведены).
Для того .чтобы доказать, что предоблучённые фотоаналоги (89) и (90) связываются с тем же самым сайтом, что и природный биотин, мы исследовали способность продуктов фотолиза взаимодействовать со стрептавидин.биотиновым комплексом. Детали эксперимента приведены в разделе 2, профиль ИОХ приведён на рис. 4 (с). Времена удерживания на аниообменной смоле предоблученного лиганда и стрептавидин.биотинового комплекса сохраняются • (сравнение рис. 4 (б) и 4 (с)). Однако в последнем случае пик, соответствующий белковой фракции, не обладает поглощением при А. = 360 нм. Это может быть объяснено тем, что предоблучённый фотолиганд не может быть включён в связывающий сайт стрептавидина, так как он уже занят биотином.
2.1.3. Фотовзаимодействие и вторичные реакции фотоактивируемых аналогов биотина (89) и (90) с активным центром стрептавидина
Сущность органических фотохимических реакций состоит в активации системы поглощенным квантом света. Химические процессы, которые следуют за поглощением света, представляют огромный интерес для полного понимания механизма фотоаффинной модификации. Принимая во внимание результаты исследований [9], можно было ожидать, что в результате первичных фотохимических процессов образуются долгоживущие интермедиаты, ответственные за протекание вторичных («темновых») реакций с функциональными группами белков.
Для исследования возможности участия в модификации долгоживущих интермедиатов, генерируемых при облучении реагентов, несущих 5-азидо-2-нитробензойную группу, были поставлены эксперименты по аффинной модификации стрептавидина с использованием фотоактивируемых аналогов биотина (89) и (90) (реакционные смеси I) и продуктов их фотолитического разложения (реакционные смеси II). Используемое мольное отношение лиганд/белок составляло 4:1 (согласно пункту 2.1.2.). Модифицированный стрептавидин был подвергнут ферментативному гидролизу протеиназой К и пептиды выделены из гидролизатов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Пептиды, модифицированные остатком фотобиотина, идентифицировали по поглощению на 360 нм. Детали экспериментов описаны в главе «Экспериментальная часть».
В таблице 3 приведены данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (89) при различных условиях проведения реакции. Видно, что, как в случае реакционной смеси с облучённым комплексом стрептавидин.фотобиотин (89) (реакционная смесь I), так и при модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения (89) (реакционная смесь II), образуются модифицированные пептиды, время удерживания которых на смоле с обращенной фазой одинаково (фракция 3). В случае модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения с повторным облучением реакционной смеси (реакционная смесь III) наблюдается появление модифицированных пептидов, отсутствующих в случае реакционных смесей I и II (фракция 4). Это может указывать либо на образование в ходе облучения фоточувствительных интермедиатов, модифицирующих белок после дополнительного облучения, либо на образование фоточувствительного ковалентного аддукта.
1. Правила для авторов. // Изв. АН, Сер. Хим. 2001. Т. 1.С. 156-167.
2. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химический подход к изучению матричного биосинтеза: основные проблемы и изучение транскрипции. // Успехи химии. 1997. Т. 66. С. 346-373.
3. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование'репликации и обратной транскрипции: И Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.
4. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes. // FEBSLetters. 1998. V. 433. P. 9-14.
5. Fleming S.A. Chemical reagents in photoaffinity labeling. // Tetrahedron. V. 51. P. 1247912520.
6. Bayley H., Staros J.V. Photoaffinity labeling and related techniques. // Azides and nitrenes. 1984. P. 433^490.
7. Fleet G.V.J., Porter R.R., Knowles J.R. Affinity labelling of antibodies with aryl nitrene as reactive group. II Nature. 1969. V. 224. P. 511-512.
8. Wower J., Aymie M., Hixson S.S., Zimmermann R.A. Photochemical labeling of bovine pancreatic ribonuclease A with 8-azidoadenosine 3',5'-bisphosphate. // Biochemistry: 1989. .V; 28. P. 1563-1567.
9. Meisenheimer K.M., Koch Т.Н. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins. // Crit. Rev. Biochem. Mol; Biol. 1997. V. 32. P. 101-140.
10. Green N.M. Avidin. II Adv. Protein. Chem. 1975. V. 29. 85-133.
11. Грачев M.A., Кнорре Д.Г., Лаврик О. И. у-Производные нуклеозид-5'-трифосфатов и нуклкознд-5'-триметафосфаты новые реагенты для изучения активных центров ферментов и белковых факторов. // Успехи биол. химии. 1986. Т. 27. С. 30-32.
12. Lavrik O.I., Prasad R., Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoaffinity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate. И J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.
13. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of DNA polymerase a DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog. // FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 31-33.
14. Catalano C.E., Allen D.J., Benkovic S.J. Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3612-3621.
15. Graifer D., Molotkov М., Eremina A., Ven'yaminova A., Repkova М., Karpova G. The central part of the 5.8 S rRNA is differently arranged in programmed and free human ribosomes. // Biochem. J. 2005. V. 387. P. 139-145.
16. Schwartz I., Ofengand J. Photochemical cross-linking of unmodified acetylvalyl-tRNA to 16S RNA at the ribosomal P site. // Biochemistry. 1978. V. 17. P. 2524-2530.
17. Кобец Н.Д., Горожанкин A.B., Годовикова T.C. Аффинная модификация хроматина фотореакционноспособными олиготимидилата. IIДокл. АН. 1996. Т. 349. С. 822- 825.
18. Черноловская Е.Л., Черепанов П. П., Горожанкин А.В., Добриков М.И., Власов В.В., Кобец Н.Д. Взаимодействие фотоактивных производных олиготимидилата с хроматином клеток HeLa. // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 889-893.
19. Tate J .J., Persinger J., Bartholomew B. Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes. // Nucleic. Acids. Res. 1998. V. 26. P. 1421-1426.
20. Stackhouse T.M., Meares C.F. Photoaffinity labeling of Escherichia coli RNA polymerase/polyd(A-T). transcription complexes by nascent RNA. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3038-3045.
21. Chuan H., Lin J., Wang J.H. 8-Azido-2'-0-dansyl-ATP. A fluorescent photoaffinity reagent for ATP-binding proteins and its application to adenylate kinase. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7981-7988.
22. Pal P.K., Coleman P.S. Detecting precatalytic conformational changes in Fl-ATPase with 4-benzoyl(benzoyl)-l-amidofluorescein, a novel fluorescent nucleotide site-specific photoaffinity label. H J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 14996-15002.
23. Persinger J., Bartolomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffinity labeling. И J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33039-33046.
24. Woody Y., Vader C.R., Woody R.W., Haley B.E. Photoaffinity labeling of DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli with 8-azidoadenosine 5'-triphosphate. 11 Biochemistry. 1984. V. 23. P. 2843-2848.
25. Galardy R.E., Craig L.C., Jamieson J.D., Printz M.P. Photoaffinity labeling of peptide hormone binding sites. И J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 3510-3518.
26. Ahmad I., Rao D.N. Photolabeling of the EcoP15 DNA methyltransferase with S-adenosyl-Z-methionine. // Gene. 1994. V. 142. P. 67-71.
27. Landers J.P., Piskorska-Pliszczynska J., Zacharewski Т., Bunce N.J., Safe S. Photoaffinity labeling of the nuclear Ah receptor from mouse Hepa lclc7 cells using 2,3,7,8-3H.tetrachlorodibenzo-/?-dioxin. И J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 18463-18471.
28. Pedersen S.E., Cohen J.B. cZ-Tubocurarine binding sites are located at alpha-gamma and alpha-delta subunit interfaces of the nicotinic acetylcholine receptor. UProc. Natl. Acad Sci: USA. 1990 V. 87. P. 2785-2789.
29. Muhn P., Fahr A., Hucho F. Rapid laser flash photoaffinity labeling of binding sites for a noncompetitive inhibitor of the acetylcholine receptor. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 27252730.
30. Wu Z., Hasan A., Liu Т., Teller D.C., Crabb J.W. Identification of CRALBP ligand interactions by photoaffinity labeling, hydrogen/deuterium exchange, and structural modeling. II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 27357-27364.
31. Warner DR, Hoffman JL. Se-(8-azidoadenosyl)75Se.selenomethionine as a photoaffinity label for S-adenosylmethionine binding proteins. И Anal. Biochem. 1991. V. 195. P. 265-268.
32. Abraham K.I., Modak M.J. Affinity labeling of Escherihia coli DNA polymerase I with thymidine 5'-triphosphate: conditions for optimum labeling, specifity, and identification of the labeling site. II Biochemistry. 1984. V. 23. P. 1176-1182.
33. Годовикова Т.С., Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе. // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 858-867.
34. Bayley H., Knowles J.R. Photoaffinity labeling. I I Methods Enzymol. 1977. V. 46. P. 69-114.
35. Lacapere J.J., Garin J., Trinnaman В., Green N.M. Identification of amino acid residues photolabeled with 8-azidoadenosine 5'-diphosphate in the catalytic site of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 3414-3421.
36. Грицан Н.П.,. Притчина E.A. Механизм фотолиза ароматических азидов. // Успехи химии. 1992. Т. 61. С. 910-939.
37. Schuster G.B., Platz M.S. Photochemistry of phenyl azide. // Ad. Photochem. 1992. V. 17. P. 69-143.
38. Gritsan N.P., Platz M.S. Kinetics and spectroscopy of substituted phenylnitrenes. // Adv. Phys. Org. Chem. 2001. V. 36. P. 255-304.
39. Patai S. The chemistry of the azido group. L.: Intersci. Publ. 1971.
40. Simutani M., Nagakura S., Yoshikara K. The primary process of the photochemical formation of 1-nitrenopurene. // Bull. Chem. Soc. Japan. 1976. V. 49. P. 2995-2998.
41. Schnapp K.A., Рое R., Leyva E., Soundararajan N., Platz M.S. Exploratory photochemistry of fluorinated aryl azides. Implications for the design of photoaffinity labeling reagents. // Bioconjugate. Chem. 1993. V. 4. P. 172-177.
42. Borden W.T., Gritsan N.P., Hadad C.M., Karney W.L., Kemnitz C.R., Platz M.S. The interplay of theory and experiment in the study of phenylnitrene. // Acc. Chem. Res. 2000. V. 33: P. 765-771.
43. Chapmann O.L., Le Roux J.P. l-Aza-l,2,4,6-cycloheptatetraene. // J. Amer. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 282-285.
44. Crow W.D., Wentrup C. Termal interconversation of pyridylcarbene and phenylazide. // Tetrahedron Lett. 1968. P. 6149-6142.
45. Abramovitch R.A., Challand S.R., Scriven E.F.V. On the mechanism of intermolecular aromatic substitution by arylnitrenes. II J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 1374-1376.
46. Soundararajan N., Platz M.S. Descriptive photochemistry of polyfluorinated azide derivatives of methyl benzoate. И J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 2034-2044.
47. Рое R., Schnapp К., Young M.J.T., Grayzar J., Platz M.S. Chemistry and kinetics of singlet (pentafluorophenyl)nitrene. II J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 5054-5067.
48. Liang T.Y., Schuster G.B. Photochemistry of 3- and 4-nitrophenyl azides: detection and characterization of reactive intermediates. И J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 7803-7810.
49. Brinen J.C., Singh B. Electron spin resonance and luminescence studies of the reaction of photochemicaly generated nitrenes with oxygen, phosphorescence of nitrobenzenes. // J. Amer. Chem. Soc: 1971. V. 93. P.6623-6626.
50. Evans R.K., Haley B.E., Roth D.A. Photoaffmity labeling of a viral induced protein from tobacco. Characterization of nucleotide-binding properties. II J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 7800-7804.
51. Woody A.Y., Evans R.K., Woody R.W. Characterization of a photoaffmity analog of UTP, 5-azido-UTP for analysis of the substrate binding site on E. coli RNA polymerase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 150. P. 917-924.
52. Meffert R., Rathgeber G., Schafer H.J., Dose K. UV-induced cross-linking of Tet repressor to DNA containing tet operator sequences and 8-azidoadenines. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 6633-6636.
53. Knight K.L., McEntee K. Covalent modification of the recA protein from Escherichia coli with the photoaffmity label 8-azidoadenosine 5'-triphosphate. I I J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 867-872.
54. Haley B.E., Hoffman J.F. Interactions of a photo-affinity ATP analog with cation-stimulated adenosine triphosphatases of human red cell membranes. // Proc.Natl. Acad. S'ci: USA. 1974. V.71.P. 3367-3371.
55. Borukhov S., Lee J., Goldfarb A. Mapping of a contact for the RNA 3' terminus in the largest subunit of RNA polymerase. II J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 23932-23935.
56. Knight K.L., McEntee K. Tyrosine 264 in the recA protein from Escherichia coli is the site of modification by the photoaffmity label 8-azidoadenosine 5-triphosphate. // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 10185-10191.
57. Свердлов Е.Д., Царев C.A., Модянов Н.Н., Липкин В.М., Грачев М.А., Зайчиков Е.Ф., Плетнев А.Г. // Фотоаффинная модификация РНК-полимеразы Е. coli в транскрипционном комплексе аналогами субстратов. II Биоорган, химия: 1978. Т. 4. С. 1278-1280.
58. Hanna M.M., Zhang Y., Reidling J.C., Thomas M.J., Jou J. Synthesis and characterization of a new photocrosslinking CTP analog and its use in photoaffinity labeling E. coli and T7 RNA polymerases. II Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2073-2079.
59. Kerwin B.A., Yount R.G. Photolabeling evidence for calcium-induced conformational changes at the ATP binding site of scallop myosin. // Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 1993. V. 90. P. 35-39.
60. Grachev M.A., Zaychikov E.F. Photo-modification studies of the contacts of the 5'-terminus of growing RNA with the subunits of RNA-polymerase. // FEBS Lett. 1981. V. 130. P. 2326.
61. Туницкая, В.JI., Мемелова, Л.В., Сколобов, Ю.С., Кочетков, С.Н. Фотоаффинная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 продуктом полимеразной реакции, содержащим азидопроизводное UTP. И Мол. биология. 2004. Т.38. С. 1059-1066.
62. Hixon S.S., Hixon S.H. Photochemical labeling of yeast alcohol dehydrogenase with an azide analog of NAD/I Photochem. Photobiol. 1973. V. 18. P. 135-138.
63. Коваль B.B., Максакова Г.А., Фёдорова O.C. Фотомодификация ДНК перфторарилазидопроизводными олигонуклеотида. // Биоорг. хим. 1997. Т.23. С. 266272.
64. Кудряшова H.B., Шаманина М.Ю., Годовикова T.C., Ананько Е.А., Ахмадиева Ф.Ф., Ромащенко А.Г. Особенности взаимодействия ДНК-полимеразы IЕ. coli и ее большого фрагмента с у-л-азидоанилидом dTTP. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 224-233.
65. Захаренко А.Л. Взаимодействие ДНК-полимераз с dNTP и их фотореакционноспособными аналогами. II Диссертационная работа. 2001. С. 66.
66. Cartwright I.L., Hutchinson D.W. Azidopolynucleotides as photoaffinity reagents. // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 1675-1691.
67. Hollemans M., Runswick M.J., Fearnley I.M., Walker J.E. The sites of labeling of the beta-subunit of bovine mitochondrial Fl-ATPase with 8-azido-ATP. И J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9307-9312.
68. Джонсон А. Химия илидов. Мир, M., 1969. С. 384. Johnson A. Ylid chemistry. Academic Press, New York London, 1966.
69. Hoppe J., Montecucco C., Friedl P. Labeling of subunit b of the ATP synthase from Escherichia coli with a photoreactive phospholipid analogue. // J. Biol. Chem. 1983. V, 258. P. 2882-2885.
70. Gibbs B.S., Benkovic S.J. Affinity labeling of the active site and the reactive sulfhydryl associated with activation of rat liver phenylalanine hydroxylase. // Biochemistry.1991. V. 30. P. 6795-6802.
71. Novak M., Rajagopal S. JV-Aiylnitrenium ions. // Ad. Phys. Org. Chem. 2001. V. 36. P. 167254.
72. Alekseyev P. V., Romanova I.V., Shakirov М.М., Godovikova T.S. p-Azidophenyl phosphate is a photoactivatable phosphorylating reagent and p-benzoquinone monoimine precursor. // J. Photocem. Photobiol. B: Biology. 2001. V. 65. P. 39-46.
73. Галль T.C., Грицан Н.П., Мызина С.Д., Немцева Е.В. // «-Хинондиимин -реакционноспособный промежуточный продукт фотолиза л-азидоанилина в водных растворах. //Докл. АН СССР. 1983. Т. 273. С. 883-887.
74. Badashkeyeva A.G., Gall T.S., Efimova E.V., Knorre D.G., Lebedev A.V., Mysina S.D. Reactive derivative of adenosine-5 '-triphosphate formed by irradiation of ATP y-p-azidoanilid. И FEBSLett. 1983. V. 155. P. 263-266.
75. Кнорре Д.Г., Биченкова E.B., Коваль B.B., Алексеев П.В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т.С. // Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами. // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 663-669.
76. Pougeois R., Lauquin G.J., Vignais P.V. Evidence that 4-azido-2-nitrophenylphosphate binds to the phosphate site on the beta-subunit of Escherichia coli BFl-ATPase. // FEBS Lett. 1983. V. 153. P. 65-70.
77. Doering W.E., Odum R.A. Ring enlargement in the photolysis of phenyl azide. // Tetrahedron Lett. 1966. V. 22. P. 81-93.
78. Carroll S.E., Nay В., Scriven E.F.V., Suschitzky H., Thomas D.R. Decomposition of aromatic azides in ethanethiol. // Tetrahedron Lett. 1977. V. 36. P. 3175-3178.
79. Takeuchi H., Koyama K. J. Photolysis and thermolysis of phenylazide in acetic acid. // Chem. Soc. Chem. Commun. 1981; P. 202-204.
80. Зюсс P., Кинцель В., Скрибнер Дж.Д. Рак: эксперименты и гипотезы. Мир, М., 1977. С. 39-54.
81. Scribner J.D., Miller J.A., Miller Е.С. Nucleophilic substitution on carcinogenic iV-acetoxy-iV-arylacetamides. II Cancer Res. 1970. V. 30. P.1570-1579.
82. Miller J.A., Sandin R.B., Miller E.C., Rusch H.P. The carcinogenecity of compounds related to 2-acetylaminofluorene.// Cancer Res. 1955. V. 15. P. 188-198.
83. Novak M., Pelecanou M., Zemis J.N. Detection of jV-acetyl-p-benzoquinone imine produced during the hydrolysis of the model phenacetin metabolite Ar-(pivaloyloxy)phenacetin. // J. Med. Chem. 1986 V. 29. P. 1424-1429.
84. Doerge D.R., Corbett M.D. Primary arylamine oxidation by a flavinhydroperoxyde. // Biochem. Pharmacol. 1984. V. 33. P: 3615-3619.
85. Leskovac V., Svircevic J., Trivic S., Popovic M., Radulovic M. Reduction of aryl-nitroso compounds by pyridine and flavin coenzymes. // Int. J. Biochem. 1989. V. 21. P. 825-34.
86. Kuwada M., Horie S., Ogura Y. Studies on the enzymatic reduction of C-nitroso compounds. II. Multiple forms of liver C-nitrosoreductase and identity with alcohol dehydrogenaze. H J. Biochem. 1980. V. 88. P. 859-869.
87. Kyrby G.B. Electrophilic C-Nitroso-compounds. // Chem. Soc. Rev. 1977. P. 1-24.
88. Химия нитро- и нитрозогрупп Т. 1. (под ред. Фойера Г.) Мир, М., 1973. С. 189-191: The chemistry of the nitro and nitroso groups. (Ed. Feuer H.) Interscience Publishers, New York London - Sydney - Toronto, 1969.
89. Химия нитро- и нитрозогрупп Т. 2. (под ред. Фойера Г.) Мир, М., 1973. С. 630. The chemistry of the nitro and nitroso groups. (Ed. Feuer H.) Interscience Publishers, New York -London Sydney - Toronto, 1969.
90. Ogata B.Y., Tsuchida M., Takagi Y. Kinetics of the condensation of anilines with nitrosobenzenes to form azobenzenes. // J. Am. Chem. Soc. 1958. V. 80. P. 3591-3595.
91. Wu Y.M., Ho L.Y., Cheng C.H. (Phenylazo)alkanes from reaction of nitrosobenzene with alkylamines. II J. Org. Chem. 1985. V. 50. P. 392-394.
92. Saito K., Kato R. Glutatione conjugation of arylnitroso compound: detection and monitoring labile intermediates in situ inside a fast atom bombardment mass spectrometer. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1984. V. 124. P. 1-5.
93. Albrecht W., Neumann H.G. Biomonitoring of aniline and nitrobenzene/Hemoglobin binding in rats and analysis of adducts. // Arch. Toxicol. 1985. V. 57 P. 1-5.
94. Hiramoto K., Ojima N., Kikugawa K. DNA single strended breaks by aromatic nitroso compounds in the precence of thiols. II Free Rad. Res. 1997. V. 27. P. 409-418.
95. Greci L., Sgarabotto P. Reaction products of 2-methylindole with nitrosobenzenes: a reinvestigation. X-ray analysis of 2-(phenyl-iV-oxidoiminomethyl)-3-phenylaminoindole. II J. Chem.Soc. Perkin. Trans. 1984. II. P. 1281-1284.
96. Страдынь Я:П. Полярография органических нитросоединений. АН Латв. ССР., Рига, 1961.
97. Irving С.С. Reactivuty of conjugates of hydroxylated arylamines and arylamides. In Biologycal oxidation of nitrogen. (Ed. Gorrod J.W.) Elsevier, North Holland Biochemical Press, 1978. P. 325-334.
98. Freese E., Freese E.B., Graham S. The oxygen-dependent reaction of hydroxylamine with nucleotides and DNA.// Biochim.Biophys. Acta. 1966. V. 123. P. 17-25.
99. Heyrowsky M., Vavricka S., Exner O. Charge-transfer interaction in complexes between acids and their anions. //Collection Czechoslov. Chem. Commun. 1972. V. 37. P. 2858-2863.
100. Джонсон А. Химия илидов. Мир, M., 1969. С. 381-382. Johnson A. Ylid chemistry. Academic Press, New York London, 1966.
101. Hayashi Y., Swern D. Generation, reactions and multiplicity of benzoylnitrene. II J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95. P. 5205-5210.
102. Джонсон А. Химия илидов. Мир, M., 1969. С. 383. Johnson A. Ylid chemistry. Academic Press, New York London, 1966.
103. Adams R., Acker D.S. Quinone imides. XXIII. Addition reactions ofp-quinonedibenzimide. H J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 5872-5880.
104. Adams R., Schowalter K.A. Quinone imides. X. Addition of amines to p-quinonedibenzenesulfonimide. И J. Am. Chem. Soc. 1952. P. 2597-2602.
105. Adams R., Elslager E.F. Quinone imides. XXV. Addition of mercaptanes top~ quinonedibenzenesulfonimide. // J. Am. Chem; Soc. 1953. P. 663-666.
106. Райхардт К. Растворители в органической химии. Химия, Л., 1973. С. 11-14, 54-65.
107. Sadtler collection of standard NMR spectra. Philadelphia. PA. 1980.
108. Гордон А., Форд P., Спутник химика. Мир, M., 1976. С. 302. Gordon A., Ford R. The chemist's companion. A Wiley Intersciens Publication, New York London - Sydney -Toronto, 1972.
109. Сильверстейн P., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. Мир, М., 1977. С. 206.
110. Химия нитро-и нитрозогрупп Т. 2. (под ред. Фойера Г.) Мир, М., 1973. С. 194. The chemistry of the nitro and nitroso groups. (Ed. Feuer H.) Interscience Publishers, New York -London Sydney - Toronto, 1969.
111. Подлибнер, Б.Г., Некрасов, Jl.H. Катодное восстановление л-нитроанилина в щелочных средах. // Электрохимия. 1971. Т. 7. С. 1191-1195.
112. Bencheikh-Sayarh S., Cheminat В., Mousset G., Pouillen P. Reduction electrochimique de composes organiques en presence de tensio-actifs-IV. // Electrochimica Acta. 1984. V. 29. P. 1225-1232.
113. Seely G.R., Haggy G.A. Photochemistry in geterogenious system: chlorophyl-sensitized reduction ofp-dinitrobenzene by hydrazobenzene. // J. Phys: Chem. 1987. V. 91. P. 440-447.
114. Calvert J.G., Pitts J.N. Chemical actinometers for determination of ultraviolet light intensities in photochemistry, in Photochemistry. Wiley. New York. 1966. P. 780.
115. Гершкович A.A., Серебряный С.Б. Водорастворимые 2-нитро-5-сульфофенильные соединения в пептидном синтезе. И Биоорг. хим. 1979. Т 5: С. 1125-1132.
116. Гордон А., Форд Р., Спутник химика. Мир, М., 1976. С. 437. Gordon A., Ford R. The chemist's companion. A Wiley Intersciens Publication, New York London - Sydney -Toronto, 1972.
117. Hewick R.M., Hhunkapiller M.W., Hood L.E., Dreyer W.J. A gas liquid solid phase peptide and protein sequenator.// J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 7990-7998.
