Направленный мутагенез гамма-субъединицы фосфодиэстеразы cGMP палочек сетчатки быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

УДОВИЧЕНКО ИГОРЬ ПЕТРОВИЧ

НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ -у-СУБЪЕДИШНДЫ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ сСМР ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ БЫКА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.

Москва - 1990

Работа выполнена в Филиале Ордена Трудового Красного Знамени института биоорганической химии имени М.М.Шемякина АН ССОР

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Лшжин В.М. .

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Думлэр И. Л., доктор химических наук Ефимов В. А.

Институт биологической физики АН СССР, г. Пущгаю.

1990 г.

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится в 10 час."ßb на заседании специализированного совета Д 002.^5.01 по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при

Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина ДН СССР.

Автореферат разослан

м

1990 Г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе зрительного восприятия у эукариотических организмов является одной из важных задач современной физико-химической биологии. ,

Фосфодиэстераза cGMP (КФ 3.1.4.17) (ФДЭ) наружных сегментов палочек сетчатки быка состоит из трех субьединиц: каталитических субъединиц а,р (ФДЭоф) и ингибиторной 7 (ФДЭ7). Субъединичный состав ФДЭ описывается формулой а)Э7г.

Фотоактивация родопсина приводит к связыванию трансдуцином GTP и а-субъединица трансдуцина в комплексе с GTP (Ta-GTP). взаимодействуя с ФДЭ7, активирует ФДЭ. Изменение уровня cGMP приводит в конечном счете к возникновению фоторецепторного ответа.

В настоящее время определены первичные структуры ФДЭ7 из сетчаток быка, мыши и человека< Сравнение этих структур показало высокую степень гомологии между ингибиторными субъединицами ФДЭ7 (две аминокислотные замены). ФДЭ7 является небольшим (87 аминокислотных остатков) сильноосновным белком (р1=10,5), содержащим большое количество остатков аргинина и лизина в центральной части молекулы (24-45). :

Для идентификации функционально -важных аминокислот ФДЭ7 перспективно получение рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7 методом направленного мутагенеза и изучение их функциональной активности. Необходимый этап этого подхода - создание экспрессирущих систем, позволяющих получать достаточные для функционального изучения количества.рекомбинантной ФДЭ7.

Цель работ. Данная работа является частью проводимого в ФИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР комплексного структурно-функционального изучения белков, участвующих в процессе восприятия и преобразования зрительного сигнала. Целью исследования явилось получение рокомбинантной ФДЭ7 в клетках Escherichia coll и в бесклеточной системе трансляции с последующим изучением структур-

но-функциональных свойств рекомбинантных мутантных форм . ФДЭ7, получешшх методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Получена прямая экспрессия гена ФДЭ7 в клетках E.coll ив бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы.

Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 7 рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7: Arg24-^ly, Lys29-»-Thr, Arg33-M31y, Lys39->Thr, Lys41-*-Thr, Iya44-»Thr и Lys45-»-Thr. Показано, что активности мутантов Lyg39-»Thr, Lys41-»-Thrt Lys44-»-Thr и Lys45-»-Thr ; , определяемые по способности ингибировать активность ФДЭ, активированную трипсином (ФДЭсф), и по связыванию с а-субъединицей трансдуцина в комплексе с негидролизуемым аналогом GTP - гуанозин-5'-0-(р,7-тио)трифосфатом (Ta-GTPTS), были практически идентичны активностям природной ФДЭ7, выделенной из сетчатки (К±^0,1 нМ). Мутант Arg24-*Gly слабо инги-бировал активность ФДЭсф (К^О нМ) и слабо связывался с TC1-GTF7S. В ряду Arg24-*Gly, Lys29-»-Thr и Arg33-*Gly эффект мутации на обе функции ФДЭ7 постепенно уменьшался. Показано, что ухудшение инги-бирующей способности Arg24-»Gly связано с уменьшением способности связываться с ФДЭар.

Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи, полученные результаты докладывались на Конференции молодых ученых по биохимии и молекулярной биологии: (Пущино, 1988), Симпозиуме UCLA по• молекулярной и клеточной биологии "Белковая и фармацевтическая инженерия" (Парк-Сити, США, 1989),*б Конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бечине, ЧССР, 1989), Советско-Западногерманском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Западный Берлин, '1989), Симпозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Передача сигнала G-белками" (Тамарой, США, 1990), Всесоюзном симпозиуме по химии белка (Т51Ш1СИ, 1990), 9 Международном симпозиуме по исследованию глаза

(Хельсинки, Фгаиянда, 1990) и на 7 Конференции.молодых учених по органической и биоорганической химии (Варна, ВНР, 1990).

Объем работа. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста. Она состоит из введения, литературного обзора "Роль фосфодиэстэразы cGMP в процессе фототрансдукции", 4 глав, посвященных результатам и их обсувдеяию, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

СОДШШЩ РАБОТЫ.

Введение

Ранее в нашей лаборатории на основе анализа кдонотеки кД1П£ из сетчатки быка Оал идентифицирован клон (плазмида Р72О), содеряаэдй кодирующую последовательность гена ФДЭ7, и впервые установлена первичная структура ФДЭ7 из палочек сетчкатки бшса. Это позволило приступить к работе по экспрессии гена ФДЭ7 и ее направленному мутагенезу.

1. Экспрессия гена ФДЗу в клетках Escherichia coli.

Для прямой экспрессии ФДЭ7 в клетках Е. coli в качестве исходных были использованы экспрессионшэ плазмидные векторы pTISIP (рис. 1) и рЕР2Т (рис. 2). Оба вектора сконструированы нами на основе мультикопийного репликона плазмид серии pUG с делегированной 1ас-областьв и содержат фрагмент ДНК фага К с геном термочувствительного репрессора cl 857 и сильным ранним промотором Рг. Плазмида pTISIP представляет из себя "ATG-вектор" для экспрессии эукариотических генов с сопряженной двухцистронной системой трансляции , где роль первого, эффективно транслируемого мини-цистрона выполняет й-концевой фрагмент гена его фага Я. Отличие секреторного экспрессионного вектора рЕР2Т от pTISIP состоит в замене синтетического фрагмента, содержащего идеализированный участок j'vrnрно и стартовый ATG-тршлет

на фрагмент гена рha А Е. coli, кодирующий лидерный пептид щелочной фосфатазы (рис.2). Кроме того в конец полилинкерной области вектора рЕР2Т введен синтетический терминатор транскрипции trp А.

Схема конструирования вектора pPGS2 для прямой экспрессии

Рис.1. Схема конструирования плазмидных векторов рРйЗг и рРйМ2 для експрессии <ТДЭ")Г. Условные обозначения: В=В§111, Н=ВатН1, К=ЕооК1, М=МЪо1. Кодирующая последовательность кДНК ФДЭ7 заштрихована.

ФДЭ7 приведена на рис. 1. Фрагмент кДНК ФДЭ7 размером 750 п.о., содержащий кодирующую последовательность гена без 9 N-концешх кодонов и часть 3'-нетранслируемой области, шделяли из плазмида РТ20 (клонотека кДНК сетчатки быка) после расщепления рвстриктазой Mbol и встршшали в экспрессионзшй вектор pTISIP. Затем в полученную плазмнду pPGS1 клонировали двухцепочечний синтетический олигонуклеотид с целью восстановления недостающих N-концевых кодонов гена. Таким образом был получен экспрессиошшй вектор pPGS2, содержащий идентичную природной кодирующую последовательность гена ФДЭ7, поставленную под контроль промотора Рг и синтетического участка связывания рибосом. Полную структуру гена ФДЭ7 и прилегащих участков векторной ДНК подтверждали определением нуклеотидной последовательности.

Кроме того, ген ФДЭ7 был клонирован в секреторный экспресси-онный вектор рЕР2Т в виде гибрида с кодирущей последовательностью лидерного пептида щелочной фосфатазы Е. соII (рис.2). При этом недостающую N-концевую область гена в Mbol фрагменте плазмида рт20 также восстанавливали путем клонирования двухцепочечного синтетического олигонуклеотида в промежуточную плазмидную конструкцию pEPG7. В соответствии со структурой полученного вектора pEPG1 аминокислотная последовательность продукта экспрессии, в случае корректного отщепления лидерного пептида pho А лидерной пептидазой Е. coll отличалась бы от природной ФДЭ7 наличием остатка Arg вместо остатка ацетилметиони-на в N-концевой части молекулы.

В качестве клетки-хозяина использовали штаммы E.coll ИВ 101 и J0 7623. При использовании штамма HB 101 и плазмида pPGS2 детектируемого (western blotting) уровня экспрессии рекомбинантной ФДЭ7 не наблюдалось (рис.3). (Примененный способ детекции позволял идентифицировать рекомбинантный белок в количестве 0,001» от тотального белка E.coll). Одной из возможных

Рис.2. Схема конструирования плазмиднного вектора pEPG1 для экспрессии ФДЭ7. Условные обозначения: Н=ВашН1, A=AvaI, M=MboI, ter - терминатор транскрипции. Кодирующая последовательность кДНН ФДЭ7 заштрихована.

причин отсутствия белкового продукта в клетках может быть быстрая деградация экспрессируемого белка клеточными протеиназами. 'Для частичной защиты от протеолиза рекомбинантных белков применяются мутантные по гену Ion штаммы Е. coli. Использование нами одного из этих штаммов, JC 7623, оказалось успешным (рис.З).

Концентрацию рекомбинантной ФДЭ7 определяли количественной иммуноидентификацией (western blotting) с использованием [12Ь11белка А. Радиоактивность полосок нитроцеллюлозных фильтров

измеряли в сцинтилляционном счетчике и (или) при сканировании авторадаограмм. По известным количествам ФДЗ7 из сетчатки бика строили калибровочную кривую, затем определяли нвизвестноо количество рекомбинантной ФДЭ7 в лизатах 2. coli. Метод был пригоден для определения количества ФДЭ7 в диапазоне 10-2Ю нг.

Одним из подходов к повышению уровня экспрессии является увеличение дозы гена клонируемого белка путем его амплификации. С этой целью ген ФДЗ7 в составе вектора pPGS2 был дуплицирован с образованием плазмиды pPGM2 (рис.1), аналогичным способом были

кДа

66-*

Ф. Рис.3. Иммуноидентификация рекомби-

45— нантной ФДЭ7 (western blotting).

1 - ФДЭ7 наружных сегментов палочек

36— сетчатки быка (50 нг гомогенного

29— белка). 2,3 - рекомбинантная ФДЭ7

24— (плазмида pPGS2, по 100 ыкг общего

белка E.colt). В качестве клетки-

В|ИР «-ФДЭухозяина использовались штамиы НВ 101

(2) И JC 7623 (10П~)(3). 4. реком-

бинантная ФДЭ7 в составе гибридного

- белка с лидеряыы пептидом щелочной

фосфатазы E.colt (JO 7623/pEPG1, 10

1 2 3 4 мкг общего белка E.colt).

получены плазмиды pPGM3 и pPGM5, содержащие 3 и 5 копий гена ФДЭ7, соответственно. Применение конструкции pPGM2 привело к .увеличению уровня экспрессии ФДЭ7 в 4 раза , однако, при дальнейшем увеличение копий гена ФДЭ7 происходило уменьшение количества рекомбинантного белка.

Нами были подобраны оптимальные для экспрессии ФДЭ7 условия культивирования клеток К. coll, учитывающие влияние температуры.

времени к плотности культуры клеток при термоиндукции промотора Рг. Максимальный уровень экспресии ФДЭ7 наблюдался через 30 мин инкубации при 42°0. Дальнейшая инкубация (до 2 час) при 42 либо 37°С приводила к уменьшению количества экспрессированной ФДЭ7. Проведение термоиндукции только при 37°С оказалось неэффективным. Максимальный уровень экспрессии ФДЭ7 наблюдался при начальной плотности А_КГ1=0,5 O.E.

ЭЭО

В оптимальных условиях термоиндукцш при использовании экспрессирущего вектора pPGS2, трансформированного в JC 7623, количество детектируемой рекомбинантной ФДЭ7 составляло около 0,05% от общего белка Е. colt.

С целью увеличения количества рекомбинантной ФДЭ7, ее ген был клонирован в секреторный экспрессионный вектор рЕР2Т в виде гибрида с кодирующей последовательностью лидерного пептида щелочной фосфатззы E.coli (рпс.2). Последующее отщепление в периплазме целевой последовательности лидерной пептидазой Е. coll должно было бы привести к получению рекомбинантной ФДЭ7.

Потенциальными преимуществами использования секреторного вектора для экспрессии ФДЭ7 являются уменьшение опасности деградации экспрессируемого продукта бактериальными протеазами и упрощение его выделения из биомассы за счет секреции в периплазматическое пространство.

При использовании в качестве клетки-хозяина штамма Е. coït 1отГ (JC 7623) количество экспрессированного гибридного белка составляло 1% от общего белка Е. coll, что было значительно выше (в 20 раз), чем при использовании вектора pPGS2, содержащего ген негибридной ФДЭ7. Однако, отщепление лидерного пептида от гибридного белка не происходило (рис.3).1

Таким образом, плазмида pPGS2 оказалась наиболее пригодной для экспрессии ФДЭ7 в клетках Е. coït.'-''Достигаемый при ее использовании уровень экспрессии позволяет с 1 литра, культуры

получать 50 мкг рекомбинантного бежа, что вполне достаточно дли фуНКЦИОНаЛЫШХ ИССЛаДОВШШЙ ФДЭ7.

2. Синтез 0ДЭ7 in vitro.

Фрагмент кДНК размером 700 п.о..содержащий полную кодирующую последовательность гена ФДЭ7, выделяли из плазмида pPGS2 (рис. 1) после расщепления рвстриктазами Bglll, Pstl и встраивали в плазмиду рСШ2 (Promega-Blotec), обработа1шую BamHI и PatI, иод контроль промотора SP6, спещфпного дня РШ полиморази бактериофага SP6. Полученную плазмиду pGEM-7 (рис. 4) линеаризовали рестрнктазой НШ1111 в дистальной части полилинкора и синтез рекомбинантной ФДЭ7 осуществляли путем последовательной транскрипции и трансляции , tri vitro (рис. 4). В качестве бесклеточной системы трансляции использовала экстракт эародшой пшеницы (WGE).

Два метода были использованы для определения количества рекомбинантной ФДЭ7: 1)- ингибирование активированной трипсином ФДЭ с использованием ФДЭ7, выделенной из сетчатки, в качестве стандарта; 2)- определение включения (14C]Leu в рекомбинантную ФДЭ7 после разделения электрофорезом В SDS-ПААГ с последупцим просчитыванием радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции. Оба метода дали сходные результаты и выход рекомбинантной ФДЭ7 составил приблизительно 30 мкг/мл смеси WGE.

3. функциональная активность рекоибинантных форм ФДЭу.

Функциональную активность рекомбинантных форм ФДЭ7, полученных в клетках Б.coli или в системе (n vitro определяли по их способности ингибировать каталитическую активность ФДЭ, активированную трипсином (ФДЭсф), (рис.5, а) и взаимодействовать с а-субьединицей трансдуцина; в комплексе с GTP7S (Ta-GTF^S) (рис.5, 0). Для определения функциональной активности использовали неочищенные препараты рекомбинантной ФДЭ7. Собственную фосфодиэстеразную активность E.colI в лизатах

Bg

X.

ФДЭ5 кДНК

SP6 промотор

БРб-лолимераэа

I »ДЭ} мРНК

экстракт зародышей ...........

пшеницы й-

Определение функциональной активности

Рис.А. Схема синтеза in vitro ФДЭ7. Условные обозначения: B=BglII, Ps=PstI, B=BatnHI, P=PvuII, S=SmaI, H=HinclIII.

подавляли добавлением даизопропилфторфосфата. .

Видно, что характер ингибирования каталитической активности сдалр различными концентрациями рекомбинантных форм ФДЭ7 и ФДЭ7,

[ВДЭт), нМ

1-2 -*-Э

ta I СЗг Е~)з

Рис.5. Функциональная активность рекомбинантных форм ФДЭ7. а -зависимость активности ФДЭ, активированной трипсином (ФДЭсф), от концентрации добавленной ФДЭ7. 1 - ФДЭ7, выделенная из сетчатки быка , 3 - ФДЭ7, экспрессированная в клетках в. ооН, 3- ФДЭ7, синтезированная in uttro (WOE), б - связывание ФДЭ7 с а-субъединицей трансдуцина (TCI.-GTP7S), очищенной гель-фильтрацией высокого разрешения. 1 - ФДЭ7, выделенная из сетчатки быка , 2 - ФДЭ7, экспрессированнаяв клетках В. call , 3 - ФДЭ7, синтезированная in vitro (WGE). T0-GTP7S иммобилизовали на платах для иммунОферментного анализа И добавляли к ней ФДЗ7. Связавшуюся ФДЭ7 элюировали в щелочных условиях и определяли- ее количество по способности ингибировать активность фД5сф. I - специфическое связывание ФДЭ7 с Ta-GTP7S, II - не специфическое связывание ФДЭ7 в отсутствие TCÍ.-GTP7S (лунки содержали иммобилизованный1 бычий сывороточный альбумин), III- к иммобилизованному TCI-GTP7S ФДЭ7 не добавляли.. Величина столбика отражает количество ФДЭ7, содержащееся в препарате Ta-GTP7S. На вставке. - профиль олюгдаи "трансдуцина с колонка Superóse 12 HR 10/30 (FPIC). Пик a содержал Ta-GTPJS, пик Р -(З7 субъедикицы трансдуцина.

¡шдолошюа из сетчатки, оказался сходным. Равновесная константа (К1) во всех трех случаи составляла 0,0510,02 нМ. (К1 отражает концентрацию ФДЭу при которой наблюдается ингнбирование активности ВДЭсф на БОЯ).

Для опрэделения связывания ФДЭ7 с Та-СТР73 нами был разработан новый метод, основанный на использовании шюОшщзованной на платах для ишуноферментного анализа Га-стРтЗ. Гель-фильтрация высокого разрешения препарата трансдуцина позволила разделить Та-СГРтЗ и Тр? (пики аир, соответственно, на вставке рис. 8, 0). Чистота полученной Та-СТР^Б составляла 80-»» по данным количественного сканирования влоктрофо; ограда, окрашенных серебром. Сорбция на платах выделенной Та-СТР7$ составляла 0,2610,04 мкг на лунку и не вависела от концентрации белке в диапазоне 1-5 мкг. В вксаеримантах по оптшизводи условий связывания ФДЭ7 с иммобилизованной на плате Та-СТРтБ сшш подобраны условия отмывки (время в количество отшвок), позволившие снизить концентрацию не специфически связанной ФЛЗ? до 0,1* от добавленной и сохранить приаилашй уровень стивЗичасхого связывания (рис.8, б). Величину саацнфАчоского связывания ФДЭ7 с Та-СТРтБ (рис. 8, о, I) определяли как разницу между общим связыванием я неспеци^ичоским связыванием в отсутствие Та-СТР^Е (рис. 8, б, II). Рекомбинантные фории ФДЗ7 связывались с Та-СТРтБ аналогично ФДЗ7, выделенной из с&тчатки. Величина связывания во всех трех случаях составляла 0,6310,05 нмоль/иг Та-СТРтБ при добавлении к иммобилизованной Ха-О^Р^В 100 нЫ каждой из форм ФДЗк>

Таким Образом, нам» были получены в клетках Е. сои ив бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы рекомбинантные функционально активные формы ФДЭ7. Это позволило, приступить к направленному мутагенезу ФДЭ7.

4. Олпгонуклеогнд-направленпый мутагопсз СДЭ7.

Три мутантние формы ФДЭ7 (Lys39-»-Thr, Lyo41->Thr и Lys44-VThr) были получены с помощью направленного мутагенеза и экспрвссированы в метках E.coll. Экспрессироватше мутантныо формы ФДЭ7 были количественно идентифицированы в лизате клеток методом western blotting с использованием поликлональных (ко всей молекуле ФДЭ7) и моноклональных (к С-концевой части молекулы ФДЭ7) антител. Уровень экспрессии различных мутантов в клетках Е. coli варьировал. В противоположность этому все мутанты ФДЭ7 синтезировались со сходным уровнем в системе трансляции In vitro (WGE). Кроме того, система In vitro позволяла прямо определять уровень экспресии благодаря количественному включению меченной аминокислоты, добавляемой в трансляционную смесь. Тагам образом, система синтеза ФДЗ7 in vitro оказалась более удобной для изучения рекомбинантшх мутантных форд ФДЭ7 и в дальнейшей работе мы использовали только ее.

Для введения аминокислотных замен мы выбрали центральный участок молекулы ФДЭ7 (рис. 6), обогащенный основными

24 29

с т

33 39 41 44 45 + + + + + " + + -- -

т тт » т

с т т I Т

С-Т-0-1-Т-7-1-С-Р-Э-г-А-Р-Н-Н-Ь-Е-Ь-Н-Е-1г-А-д-У-С-1-1 87

Рис. б. Первичная структура ФДЭ7 из палочек сетчатки быка. Стрелками указаны аминокислотные замены в рекоыбинантных 'мутантных формах ФДЭ7.

аминокислотами, что косвенно свидетельствует о его функциональной . роли. С другой стороны, ранее в совместной работе лабораторий

Дуцлер И.Л. (ИЭФБ АН СССР) и Липкина В.М. (ИБХ АН СССР) с помощью моноклональных антител к ФДЭ7 и синтетических пептидов ФДЭ7 было

Рио. 7. Обща* охема олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

Уоловные обозначения: 8=SmaI, P=PvuII. Кодирупцая последова-

• .

тельнооть кДНК ФДЭ7 заштрихована.

показано, что центральный фрагмент ФДЭ7 (24-45) участвует во взаимодействии с Та. Из 10 основных аминокислот, присутствующих * на учаотке 24-45, мы заменили 7 из них на незаряженные гидрофильные аминокислоты: Gly (для Arg) и Thr (для Lys) с целью

выяснить влияние положительных зарядов в этой части молекулы на функционирование ФДЭ7.

Направленный мутагенез проводили по т.н. методу "дуплексов с брешью", описанному Poss с соав.(рис.7). Структура использованных олигодезоксинуклеотидов, синтезированых с помощью ДНК-синтезатора Applied. Blosyatems 380А, показана на рис.8. Плазмидную ДНК

Arg-24-*Gly

Lys-29->-Thr

Arg-33-*Gly

Lye-39—«-Thr Lys-41-*-Thr Lys-44—»-Thr Lys-45—»-Thr

24

таят

A G

AAA GGG CC

5 CCC GTC ACC CCG Г С

, 29

5 GGG CCC CCGrJCTlTTT AAA CAG С

I aa) G

33

5'AAA ИТ AAA СААГССТ1САА ACC AGG G G С G

5 CAG TTC

39

ШТ A

AGC AAG CC

41

5 TC AAG AGC 44

ШГ A

CCC CCC

5 CCC CCC

mr

A

5 CCC CCC AAG

AAA GGT GT

45

ШГ AA

GGG GTC CAA G T

Рис.8. Синтетические олигодезокГсинуклеотпда, использованные при

создании мутантов ФДЭ7. Замененные кодоны выделены рамкой. Нуклеотиды гена ФДЭ7 из сетчатки быка показаны ниже каждой последовательности.

рСЕМ~7 обрабатывыли в одном случае РтиП для получения линейной форш, в другом случае Бта1 для получения фрагмента ДНК с брешью. Отжиг, нефосфорилировашшх олигонунлеотидов-мутагснсв (40 го.«оль)с линейной ДНК рСЕИ-7_(0,04 пмоль) и фрагментом ДНК с брешью (0,4 пмоль) проводили в 20 шел реакционной смеси, содержащей 100 и*1

HaCl; 20 мМ Тг1в-НС1,рН 7,5; 5 мМ ïgCl2; 0,5 мХ DIT. После отжига реакционной смесью трансформировали В.coli (HB 101). Клоны, содержащие мутантный ген ФДЭ? идентифицировали методом гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах с згР-меченыы соответствующим олигонуклеотидом-мутагеном. Нуклеотидную последовательность мутантных генов определяли по модифицированному методу Ыаксама и Гилберта.

Основные продукты синтеза рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7 в системе WGE обладали электрофоретичвской подвижностью сходной с ОДЭ7, выделенной из сетчатки (рис. 9).

кЛа

66-» 45- i 36-* j

29-» ' !

24—-

ё

ä й

Рио.9 Электрофорез (SDS-IUAT) образцов 14С-меченых продуктов трансляции синтезированных (n nitro транокриптов мутантных

генов ФДЭ7.

Функциональную активность рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7 определяли по их способности ингибировать активированную трипсином ФДЭ (ФДЭоф) и связываться с T01-GTP7S (рис.10, 11). Из

-К- ?A3f -a- Arg2*-Cly . '-*■ 1у»29-П» Afj33-Oy

-Л- lytjj-Th, -О- 1)>»41-Т»т lyiM-Thr -*- Ly»«-Thr

Рио .10. Зависимость активности ФДЭ, активированной трипсином ■ (ФДЭсф), от концентрации добавленных рекомбккангнйх мутантшх форм ФДЭ7, синтезированных in vitro. Соответствующие концентрации каждого типа ФДЭ7 добавлялись к 0,1 от. ФДЭсф в объеме 0,1 мл.Каталитическая активность определялась по гидролизу [3H]oGMP

кривых зависимости иигиСирования ФДЭсф от количества добавленных мутантов ФДЭ7 определяли их значения (рис. 10.).

Активности мутантов Lys39-VThr, Ьуз41 -»Thr и Lys44-*Thr были, идентичны активности ФДЭ7- выделенной из сетчатки (1^=0,05+0,02 нМ). Связывание мутанта Arg24-í-Gly с Tcx-GTPtS было слабым (10% от связывания ФДЭ7) и его способность ккгибировать ФДЭар была-значительно меньше (К^О нМ), чем у' ФДЭ7, выделенной из сетчатки. В серии мутантов Arg24-»Gly, Lys29-»-Thr (^=0,5*0,1 дМ) и Arg33-*Gly (KÍ=0,2±0,1 нМ) эффект мутации на способность ФДЭ7 ингибировать ФДЭар и связываться с Ta-GT?7S постепенно уменьшался. Активность мутанта Lys45-yftir (1^=0,10*0.05 ilM) практически совпадала с активностью ФДЭ7, выделенной из сетчатки.

G целью проверить участвует ли остаток Arg24 в связывании

Рио.11. Функциональная активность рекомбинантных мутантных форм

ФДЭ7.1 - действие ФДЭ7 на ФДЭ.акгивировшшую трипсином (ФДЭа£). 3 нг ФДЭ-f каждого типа было добавлено к 0,1 мл'раствора PDBafi (1нг/мл).2 - специфическое связывание ФДЭ7 с Ta-GTi-fS. Ta-CTP7S была иммобилизована на платах для иммуноферментного анализа и связывалась со 100 нг ФДЭ7. Рекомбинантная ФДЭ7 (pPDE7) и мута-

35 —

нты PDE7 содержали [ S]Uet. Количество ФДЭ7 из сетчатки быка связанной с Ta-GTPTS определяли из стандартной кривой ингибиро-вания РИВсф. Количество связанных рекомбинантных мутантных форм [ S]PDE7 определяли просчетом радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции. Связывание PDBy из сетчатки быка принято за

100S.

ФДЭ7 с ФДЭоф или только в ингибировашш их каталитической активности, мы изучили способность мутанта Arg24-*Cly конкурировать с ФДЭ7, выделенной из сетчатки, в процессе ингибирования ФДЭоф. В качестве контроля использовалась мутантная форма ФДЭ7, содержащая делецию в С-концевой области (481-07). (Этот мутант был ранее получен в нашей лаборатории и было известно, что С-концевая часть молекулы ФДЭ7 отвечает за ингибиррвание ФДЭоф и не принимает участия в связывании с ФДЭсф)

Показано, что в то время как Л81-87 действительно конкурировал с природной ФДЭ7 (уменьшал ее ингибирупций эффект), мутант Ar^4-*Gly этими свойствами не обладал. Таким образом, уменьшение ингибиторной активности Arg?4-»Gly объясняется уменьшением его способности формировать комплекс с ФДЭсф.

ВЫВОДЫ.

1. Получена прямая экспрессия гена ФДЭ7 в клетках E.coll й в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшенигч.

2. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 7 ре-комбинантных мутантных форм ФДЭ7: Arg24-fcGly, Lys29-*Thr, Arg33-»Gly, Lys39-»Thr, Lys41-*Thr, Lys44-»Thr И Ьуз45-«-Т1н\

3. Показано, что в процессе фототрансдукции Та активирует ФДЭ, конкурируя с каталитическими субъединицами ФДЭ за один и тот se центр на ФДЭ7 (24-33). Среди исследованных аминокислотных остатков наибольшую роль во взаимодействии ФДЭ7 с Та я ЩЭсф играет остаток Arg24. В ряду Arg£4, 1уз29, Arg33 влияние остатков на функционирование ФДЭ7 уменьшается.

Основные__результаты__йиссертации__изложены__ в___следующих

публикациях.

1. Удовиченко И. П., Бондаренко В. А., Нато чин М. Ю., Юровская А. А., Зозуля С. А., Широкова Б. П., СкибаН.Р. Экспрессия и сайт^специфический мутагенез 7 суОъединицы сСМР-фосфодивстёра-зы из сетчатки быка. - Конференция молодых ученых, Пущино. Тез. докл., 1988, о. 100-104.

2. Зозуля С.А., Широкова Е.П., Гуревич В.В., Харитонов С.И., Удовиченко И.П., Звяга Т.А., Наточин М.Ю., Бадалов П.р., Рекомбшантаая шазмидная ДНК p!TISP6, кодирузсщая скатез РНК-полимеразы фага SP б Salmonella typhtmur tum., способ ее. конструирования и штамм.бактерий Beohortahia ooit - продуцент РНК-полиыеразы фага SPS. - Заяка на изобретение No 443-2063/31-13/ /078837 от 23.05.1988 г., положительное решение от 29.11.1988 г. • ,

3. Skiba N. P., Udoviohenko I. Р., Bondarenko V. A., Shirokova Е. P., Zozulya S. А., Lipkin V.M. Expression and eite-Bpeoifio alteration ot .. cGMP phosphodiesterase J submit from oattle

- хх. -

retina. - J. Cell. Bioohem., 1989, Supplement 13А. p. 100.

4. Udoviohenko I.P., Bondarenko Y.A.; Natoohin M.Yu., Yurovekaya A. A., Zozulya S.A., Shlrokova B.P., Skiba N.P. Site-direoted mutagenesis of the 7 subunit of the oGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. - 6th Conferenoe of young soientists on organio and bioorganio ohemistry, Beohyne, CSSR. Abstracts, 1989, p. 68-69.

5. Lipkin V.M., Shamborant 0. N.. Cubanov V. V., Muradov K. 0., Udoviohenko J.P., Bondarenko V.A., Natoohin M.Yu., Skiba N.P. Struotural and functional studies of oyolio GMP phosphodieete- ' rue. - J. Protein Chemistry, 1989, v. 8, No 3, p. 406-408.

6. Skiba N. P., Udoviohenko I. P., Natoohin M. Yu., Bondarenko V.A., Muradov H.G., Yurovskaya A.A., Telnykh S.Y., Lipkin Т.Н. 0-protein - effeotor ooupling: interaotion' of recombinant Inhibitory 7 subunit and its mutant forms with transduoin and oatali .io subunits of the oGMP phosphodiesterases - J. Cell. Bioohem., 1990, Supplement 140. p. 119.

7. Lipkin V.M., Udoviohenko I.P., Bondarenko V.A., YUrovskaya

A.A., Telnykh B.V., Skiba N.P. Site-direoted mutagenesis of inhibitory subunit of retinal rod oyolio GMP phosphodiesterase.

- Biom. Soi., 1990, 7.1, No 3, p. 305-308.

8. ОкиОа Н.П., Удовиченко И.П., Бондаренко B.A., Наточхв M.D., Юровская А.А., Зозуля С.А., Широкова Е.П., Липкнн В.М. Эксдре-ооня гена 7-субъеданицы фоофодиестеразы oGMP наружных оегыевтов палочек сетчатки быка в клетках seohrrtohia ooli. -Виол, мембраны, 1990, т. 7, No 3, о. 230-242.

9. Еровокая А. А., Удовиченко И. П., Бондаренко В. А.. Тельных

B. Е.. Скиба Н.П., Липкин В.М. Локализация активных #урстковц оубъединицы фоофодиеотеразы oGMP методом направленного мутагенеза. - Всесоюзный симпозиум по химии белка, Тбилиси. Тез. докл., 1990 , 0.171.

10.Lipkin V.M., Udoviohenko I.P.,. Bondarenko V.A., Yurovskaya A.A., Telnykh B.V., Khramtsov N.V., Skiba N.P. Site-direoted mutagenesis of inhibitory subunit of retinal rod oyolio, GMP phosphodiesterase. - 9 th International congress of eye research, Helsinki, Finland. Abstracts, 1990, p. 53.

11.Bondarenko V.A., Udoviohenko I.P., Yurovskaya A.A., Telnykh E.V., Skiba N.P. Expression and .site-direoted mutagenesis of inhibitory subunit of retinal rod oyolio GMP phosphodiesterase;

- 7th Conferenoe of young soientiats on organio and bioorganio ohemistry, Varna, Bulgaria. Abstracts, 1390. p. 56798^