Новые экстракционные системы для выделения и определения аминокислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Смирнова, Светлана Валерьевна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2002 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.02 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Новые экстракционные системы для выделения и определения аминокислот»
 
 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Смирнова, Светлана Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

1.1. Физические и физико-химические свойства аминокислот

1.2. Методы определения аминокислот

1.3. Методы выделения аминокислот

1.3.1. Сорбционные методы

1.3.2. Экстракция и мембранный транспорт

1.4. Применение макроциклических соединений для выделения и определения аминокислот

1.4.1. Применение краун-эфиров, каликсаренов и других макроциклов в экстракции и мембранном транспорте катионов аминокислот ' • '••.;»

1.4.2. Экстракция цвиттер-ионов аминокислот с использованием макроциклических и других специфических реагентов

1.4.3. Применение фенилборных кислот для связывания аминокислот

Глава 2. ИОННЫЕ ЖИДКОСТИ. ЭКСТРАКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ НА

ОСНОВЕ ИОННЫХ ЖИДКОСТЕЙ

2.1. Свойства ионных жидкостей

2.2. Применение ионных жидкостей в экстракции

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, АППАРАТУРА И ТЕХНИКА

ЭКСПЕРИМЕНТА

Глава 4. ЭКСТРАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ ДИЦИКЛОГЕКСИЛ-18-КРАУН-6 И КАТИОНООБМЕННЫМИ ЭКСТРАГЕНТАМИ ДИНОНИЛНАФТАЛИНСУЛЬФОКИСЛОТОЙ И ДИ-2-ЭТИЛГЕКСИЛФОСФОРНОЙ КИСЛОТОЙ

4.1. Экстракция аминокислот динонилнафталинсульфокислотой

4.1.1. Влияние рН и времени контакта фаз на экстракцию аминокислот с динонилнафталинсульфокислотой

4.1.2. Определение состава экстрагирующихся соединений. Расчет констант экстракции аминокислот динонилнафталинсульфокислотой

4.1.3. Экстракция аминокислот динонилнафталинсульфокислотой в присутствии краун-эфира

4.2.Экстракция аминокислот ди-2-этилгексилфосфорной кислотой

4.2.1. Влияние рН на экстракцию аминокислот ди-2-этилгексил- gj фосфорной кислотой

4.2.2. Концентрационные зависимости. Влияние концентрации ди-2этилгексилфосфорной кислоты, аминокислот на экстракцию.

Расчет констант экстракции

4.2.3. Экстракция аминокислот ди-2-этилгексилфосфорной кислотой в присутствии дициклогексил 18-краун

Глава 5. ЭКСТРАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ КАЛИКС[8]АРЕНОМ

5.1. Влияние рН и времени контакта фаз на экстракцию аминокислот каликс[8]ареном

5.2. Определения состава экстрагирующихся комплексов, расчет констант экстракции аминокислот каликс[8]ареном

5.3. Мешающее влияние катионов металлов и аминов на экстракцию аминокислот каликс[8]ареном

ГЛАВА 6. ЭКСТРАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ ФЕНИЛБОРНЫМИ

КИСЛОТАМИ

6.1. Экстракционные свойства производных фенилборной кислоты

6.2. Экстракция аминокислот 2,4-динитро-З-толилборной кислотой

6.3. Экстракция аминокислот 2,4-динитро-З-толилборной кислотой в присутствии ДЦГ18К

Глава 7. ПРИМЕНЕНИЕ ИОННОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ

АМИНОКИСЛОТ

7.1. Экстракция аминокислот в ионную жидкость с дициклогексил-18- ^о краун

7.2. Экстракция аминокислот другими реагентами в ионную жидкость

7.3. Возможности практического применения экстракции в ионную жидкость для извлечения аминокислот

ВЫВОДЫ

 
Введение диссертация по химии, на тему "Новые экстракционные системы для выделения и определения аминокислот"

Актуальность темы. Разработка методов выделения аминокислот -актуальная проблема аналитической химии и биотехнологии. Так, существует потребность в дешевых и эффективных способах извлечения аминокислот из растворов их микробиологического производства (культуральные жидкости). Универсальность, быстрота, технологичность и простота осуществления жидкостной экстракции обусловливают интерес к этому методу.

Основная проблема экстракционного выделения аминокислот состоит в том, что степень извлечения обычно невелика; часто недостаточна и селективность. Необходимы реагенты, способные полно и избирательно извлекать аминокислоты из растворов сложного состава, содержащих органические вещества других классов и неорганические ионы. Для решения этой проблемы в рамках данной работы использовали три подхода.

Во-первых, это применение макроциклических кислородсодержащих соединений в сочетании с катионообменными экстрагентами. Аминокислоты в катионной форме можно связывать и экстрагировать в виде комплексов "гость -хозяин" с краун-эфирами и каликсаренами. Во-вторых, это использование производных борной кислоты, которые способны образовывать комплексы с аминокислотами, а при достаточной гидрофобности реагента - и экстрагировать последние. Наконец, третий подход - это замена традиционных растворителей для экстракции на новые органические растворители с уникальными свойствами -ионные жидкости (органические соли, жидкие при комнатной температуре). Гидрофобные ионные жидкости могут служить неводной полярной средой в двухфазной экстракционной системе. Свойства ионных жидкостей - то, что они состоят из ионов, обладают высокой сольватирующей способностью и могут быть гидрофобны - делают их потенциально перспективными разбавителями для экстракции полярных веществ, в том числе аминокислот.

Цель работы состояла в достижении количественной экстракции и повышении селективности извлечения аминокислот при помощи реагентов (экстрагентов) различных классов: макроциклических соединений - краун-эфиров (экстракция катионообменными экстрагентами, ДННСК и Д2ЭГФК); замещенных каликс-8-аренов (экстракция аминокислот в отсутствие противоионов); производных фенилборной кислоты; ионной жидкости - гексафторфосфата метилбугилимидазолия (одновременно экстрагент и разбавитель). Лучшие из экстракционных систем предполагалось использовать для извлечения аминокислот из нативных растворов микробиологического производства и анализа последних.

Научная новизна. Получены данные о возможности применения реагентов различных классов для извлечения аминокислот. Установлено, что экстракция аминокислот катионообменными реагентами (ДННСК и Д2ЭГФК) значительно повышается в присутствии краун-эфира - дициклогексил-18-краун-6 (ДЦГ18К6). В случае ДННСК (промышленно применяемый экстрагент) экстракция становится количественной; кроме того, сокращается время достижения экстракционного равновесия и увеличивается скорость расслаивания фаз. Показана возможность экстракции аминокислот в виде цвиттер-ионов из нейтральных водных растворов адамантилзамещенным каликс-8-ареном, а также производными фенилборной кислоты. Изучена экстрагирующая способность производных фенилборной кислоты по отношению к аминокислотам и ее взаимосвязь с кислотностью и гидрофобностью реагента. Предложены условия оптимальной экстракции, изучен состав экстрагирующихся соединений.

В качестве разбавителя для экстракции аминокислот вместо традиционных растворителей предложено использовать ионную жидкость - гексафторфосфат метилбугилимидазолия. Показано, что ионная жидкость, содержащая ДЦГ18К6, количественно извлекает аминокислоты, в том числе и гидрофильные. Аминокислоты полностью реэкстрагируются из фазы ионной жидкости щелочными водными растворами.

Практическая значимость. При использовании нового класса органических растворителей - ионных жидкостей - достигнута количественная экстракция аминокислот. Разработана методика экстракционного выделения аминокислот в ионную жидкость, содержащую ДЦГ18К6, с последующей реэкстракцией и флуориметрическим определением аминокислоты в водной фазе. Проведено экстракционное выделение аминокислот с последующей количественной реэкстракцией и определением в технологическом объекте - нативном растворе микробиологического производства и в некоторых лекарственных препаратах. Правильность и воспроизводимость проверена методом "введено-найдено" и независимым методом.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения экстракции аминокислот из водных растворов в хлороформ и гептан катионообменными экстрагентами - динонилнафталинсульфокислотой и ди-2-этилгексилфосфорной кислотой в присутствии и в отсутствие дициклогексил-18-краун-6.

2. Результаты исследования экстракции аминокислот замещенным каликс-8-ареном, содержащим сложноэфирные и адамантильные заместители.

3. Результаты изучения экстракции аминокислот борсодержащими реагентами; данные об экстракционных свойствах фенилборной, нитрофенилборной, октилоксифенилборной, фенилазоборной, динитротолилборной кислот, о влиянии дициклогексил-18-краун-6 на экстракцию.

4. Результаты применения ионной жидкости - гексафторфосфата метилбутилимидазолия - в качестве экстрагента и разбавителя при извлечении аминокислот реагентами: дициклогексил-18-краун-6, производными фенилборкой кислоты, ди-2-этилгексилфосфорной кислотой.

5. Методики концентрирования аминокислот при помощи экстракции в ионную жидкость, содержащую дициклогексил-18-краун-6 из технологических объектов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены на X Всероссийской конференции по экстракции (Уфа, 1993), VII Всероссийской конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999), Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-99" (Москва,

1999), Международном симпозиуме по жидкостной экстракции (Москва, 1998), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва,

2000), XII Российской конференции по экстракции (Москва, 2001). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ: 3 статьи и

7 тезисов докладов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

 
Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

выводы

1. Аминокислоты экстрагируются по катионообменному механизму динонилнафталинсульфокислотой в отсутствие и в присутствии дициклогексил-18-краун-6 в гептан и хлороформ. Стехиометрическое по отношению к аминокислоте количество краун-эфира обеспечивает количественное извлечение при рН 1,0-2,5. Для Trp, Phe, lie, Gly соотношение аминокислота:ДННСК:ДЦГ18К6 в экстрагирующихся соединениях составляет 1:1:1, для Lys - 1:2:2. Рассчитаны значения констант экстракции. Изучено мешающее влияние катионов щелочных, щелочноземельных металлов, аминов.

2. Аминокислоты экстрагируются из водных растворов ди-2-этилгексилфосфорной кислотой в хлороформ. В области рН 1,5-3,5 извлекаются катионы, а при рН 3,0-5,5 - цвиттер-ионы Trp, Phe, Не, Leu, Ala, Gly. Glu извлекается в области рН 2-4 в виде цвиттер-иона, Lys и Arg - в катионной форме при рН 3-7. Соотношение аминокислота : Д2ЭГФК в экстрагирующихся соединениях для всех аминокислот составило1:1. Рассчитаны значения констант экстракции. Введение ДЦГ18К6 в экстракционную систему позволяет сократить время достижения экстракционного равновесия с тридцати до пяти минут и повысить степень извлечения на 15-30%.

3. Замещенный каликс-8-арен, содержащий сложноэфирные и адамантильные заместители, экстрагирует цвиттер-ионы аминокислот в хлороформ. Соотношение аминокислота : реагент в экстрагирующихся соединениях составляет 1:1 для Trp, Phe, Не, Gly, Glu, 1:2 для Lys. Рассчитаны значения констант экстракции. На эффективность экстракции не влияют значительные количества посторонних катионов.

4. Изучена экстракция цвиттер-ионов аминокислот арилборными кислотами: фенилборной, м-нитрофенилборной, п-октилоксифенилборной, м-фенилазофенил-борной, 3-(4-толилазо)фенилборной и 2,4-динитро-Зтолилборной. Экстракция аминокислот убывает в ряду: ДНТБК>ТАФБК>ФАБК>ПООФБК>НФБК>ФБК. Билогарифмическим методом установлено соотношение аминокислота: ДНТБК=1:1. Эффективность извлечения уменьшается в ряду: Trp>Phe>Leu>fle>Lys>Gly> Ala Ala Введение в систему ДЦГ18К6 позволило увеличить степени извлечения для всех аминокислот на 20%.

5. В качестве экстрагента и разбавителя для экстракции аминокислот можно применять ионную жидкость - гексафторфосфат метилбугилимидазолия. Аминокислоты, в том числе и наиболее гидрофильные, количественно экстрагируются в ионную жидкость, содержащую ДЦГ18К6, в катионном виде. Соотношение аминокислота: ДЦГ18К6 в экстрагирующихся соединениях составляет 1:1 для Тгр, Phe, Leu, Gly, Ala и 1:2 для Lys и Arg. Аминокислоты можно количественно реэкстрагировать щелочными водными растворами.

6. Предложен метод экстракционного выделения аминокислот из технологического раствора микробиологического производства (культуральной жидкости) и флуориметрического определения аминокислот после реэкстракции. Аминокислоты количественно экстрагируются краун-эфиром (ДЦГ18К6) в ионную жидкость - гекафторфосфат метилбугилимидазолия - из нативного раствора и количественно реэкстрагируются щелочными водными растворами. Показана возможность экстракционного выделения аминокислот с последующей количественной реэкстракцией и определением в лекарственных препаратах.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Смирнова, Светлана Валерьевна, Москва

1. Волькенштейн М.В. Биофизика.М.: Наука, 1988. 291С.

2. Марри P., Греннер Д., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, Т. 1. 381С.

3. Moore S., Stein. W.H. Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. // J.Biol. Chem. 1948. V.176. P. 367-388.

4. Коренман И.М. Методы определения органических соединений. М.: Химия, 1976. С. 176.

5. Филиппович Ю.Б. Химизм реакции аминокислот с нингидрином. // Научн. докл. Высш. шк. Химия и Хим. технология. 1958. Т. 1. С. 110-112.

6. Chen G.N. Study of the chemiluminescent characteristics of ninhydrin and its application. //Analyst. 1996. V. 122. P.37-41.

7. Smith A.M., Agiza A.H., Determination of amino acids colorimetrically by the ninhidrinreaction. //Analyst. 1951. V.76. P.623-627.

8. Kaweran E., Wieland T. Conservation of amino acids chromatograms. // Nature. 1951. V.168.P. 77-78.

9. Семенов А.Д., Ивлева И.Н., Дацко В.Т. Определение микрограммовых количеств аминокислот в природных водах. // Изв. АН СССР ОХН. 1961. №1. С. 184-186.

10. Ассатиани B.C. Новые методы биохимической фотометрии. М.: Наука, 1965. С 167.

11. Sadok S. Determination nunhydrin positive substances in sea-water and hemolymph. //Analyst. 1995. V.120. P.2097.

12. Furman N.H., Morrison G.H., Wagner A.F. Colorimetric procedure for amino acids. // Anal. Chem. 1950. V.22. P. 1561-1562.

13. Ahmed Y.Z., Abd-Elmottalb M., Abd-Ellah I.M. Spectrophotometric determination of microgram amounts of amino acids by indophenol reagents. // Acta Chim. Hung. 1986. V.122. №2. P. 111-117.

14. Riemschneider R., Henning., Wons T. l-Ethyl-2,3,5-triacetylbenzene a reagent for amino acids. //Monatsh. Chem. 1987. V.118. P. 831-835.

15. Roth M. Fluorescence reaction for amino acids. // Anal. Chem. 1971. V. 43. P.880-882.

16. Singh H.N., Hinze W.L. Micellar enhanced fluorimetric determination of 1-N, N-dimethylaminonaphtalen-5-sulphonylchloride and o-phthalaldehyde-2-mercaptoethanol derivatives of amino acids. // Analyst. 1982. V. 107. P. 1073-1080.

17. Simons S.S., Jonson P.F. Ethanethiol: a thiol conveying improved properties to the fluorescent product of o-phthalaldehyde and thiols with amines. // Anal. Biochem. 1977. V. 82. P.250-258.

18. Швядас В.Ю., Галаев И.Ю., Березин И.В. Взаимодействие аминокислот с о-фталевым альдегидом: спекгрофотометический метод количественного определения продукта реакции. //Биорг. Хим. 1978. Т. 4. С. 19-25.

19. Aminuddin Н. Some aspects of spectrophotometric determination of amino acids by using o-phthalaldehyde as a chromogenic reagent. // J. Chem. Soc. Pak. 1996. V. 18. P.8-11.

20. Froehlich P.M., Cunningham T.D. The enhancement of the fluorescence of fluorescamine derivatives in mixed dimethylsulfoxide-water solvents. // Anal. Chim. Acta. 1976. V. 84. P. 427-430.

21. Dubois P., Levillain P., Viel C. Le cis-a,J3-dinitrostilbene: un nouveau reactif pour le dosage colorimetrique des amines primaires et secondaires, des aminoacides et de thiols.// Talanta. 1981. V. 28. P.843-848.

22. Tapuhi Y., Schmidt D.E., Lindner W. Dansilation of amino acids for hight performance liquid chromatography analysis. // Anal. Biochem. 1981. V. 115. P. 123-129.

23. Mai K.I., Watanabe Y. Fluorimetric determination of secondary amino acids by 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole. // Anal. Chim. Acta. 1981. V.130. P.377-383.

24. Linget С., Netter С., Neems D. Online dialisis with HPLC for the automated preparation and analysis of amino acids, sugars, and organic acids in grape juice wines. // Analusis. 1998. V. 26. P. 35-39.

25. Высокоэффективная жидкостная хроматография. / Под ред. Березина И.В. М.: Мир, 1988. 688 С.

26. Radjai М.К., Hatch R.T. Fast determination of free amino acids by ion-pair high performance liquid chromatography using on-line post-column derivatisation.// J. Chromatogr. 1980. V. 196. P. 319.

27. Schuster R. Determination of free amino acids by high performance liquid chromatography. //Anal.Chem. 1980. V. 52. P. 617-620.

28. Foucault A., Caude M., Oliveros L. Ligand exchange chromatography of amino acids on copper (П) modified silica gel with ultraviolet spectrometric detection at 210nanometers. //J. Chromatogr. 1979. V. 185. P. 345.

29. Mondino A. Automatic ion-exchange chromatography of amino acids. // J. Chromatogr. 1970. V. 50. P. 260-273.

30. Rufini S., Ghebreqzabher M., Lato M. Application of reversed phase extraction and ion-exchange thin-layer chromatography for screening and aminoacidurias. // Anal. Chem. Symp. Ser. 1983. V.14. P.159-163.

31. Yang J.C., Fujitaki J.M., Smith R.A. Separation of phosphohydroxyaminoacids by high performance liquid chromatography. // Anal. Biochem. 1982. V. 122. P.360-363.

32. Gustavsson В., Betner I. Fully automated analisys for protein and peptide hydrolysates by precolumn derivatisation with 9-fluorenylmethylchlorformiate and 1-aminoadamantane. // J. Chromatogr. 1990. V. 507. P. 67-77.

33. Bayer E., Grom E., Kaltenegger B. Separation of amino acids by high performance liquid chromatography. // Anal. Chem. 1976. V.48. P. 1106-1109.

34. Kobayashi S., Imai K. Detarmination of fluorescent compounds by high performance liquid chromatography with chemiluminescence detection. // Anal. Chem. 1980. V.52. P.424-427.

35. Davis В. Dansylation of amines, phenolic and catecholic amines and aminoacids in aprotic solvents. //J. Chromatogr. 1977. V. 130. P. 151-160.

36. Watanabe Y., Imai K. High performance liquid chromatography and sensitive detection of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazole. // Anal. Biochem. 1981. V.116. P. 471-472.

37. Blakley C.R., Carmody J.J., Vestal M.L. Liquid chromatograph-mass spectrometer for analysis of nonvolatile samples. // Anal. Chem. 1980. V.52. P. 1636-1641.

38. Voyksner R.D., Hass J.R., Bursey M.M. An on-line liquid chromatograph/mass spectrometry experiment. // Anal. Lett. 1982. V.15. P.l-12.

39. Dabral S.K., Rawat J.P., Muktawat K.P. Ion-exchange chromatographic determination of amino acids on impregnated papers. // Anal. Lett. 1989. V. 22. P. 537-543.

40. Jakob K., Falkner C., Vogy W. Derivatization method for the high-sensitive determination of amines and aminoacids as dimethylthiophosphinic amides with alkali flame-ionisation. //J. Chromatogr. 1978. V.167. P.6775-6783.

41. Ishii S., Witkop B. Gramicidin A. Determination of composition and amino acid configuration by enzymatic and gas chromatographic methods. // J. Amer. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 1832-1834.

42. Siezen R.J., Mague Т.Н. Gas-liquid chromatography of the N-heptafluorobuturylisobutil esters of fifty biologically intresting amino acids. // J. Chromatogr. 1977. V. 130. P. 151-160.

43. Zlatkis A., Oro J.F. Amino acid analysis by reactor gas chromatography. // Anal. Chem. 1958. V.30. P. 1156-1156.

44. Zlatkis A., Oro J.F., Kimball A.P. Direct amino acid analysis by gas chromatography.//Anal. Chem. 1960. V.32. P. 162-164.

45. Duncan M.W., Poljak A. Amino acid analysis of peptides and proteins on the femtomole scale by gas chromatography/mass spectrometry. // Anal. Chem. 1988. V. 70. P.890-896.49.