Особенности определение стероидов в физиологической жидкости газохроматографическимметодом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Орлов Евгений Николаевич

РГБ ОД

2 2 иШ Ш

Особенности определение стероидов в иологической жидкости газохроматографическим

методом

Специальности: 02.00.02. - " Аналитическая химия", 02.00.03 - «Органическая химия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Институте нефтехимического синтеза им. Л. В. Топчиева Российской академии наук.

Академик РАН Н. А. Плат:

доктор химических наук профессор Е. М. Антипов

доктор химических наук профессор В. Г. Березкин

доктор химических наук, Л. К. Шпигун

доктор химических наук Л. Д. Белякова

Государственный химико-технологический университет им. Д. И.Менделеева

Защита состоится 30 мая 2000 года в 11 часов на заседай! диссертационного совета К 002.37.01. В Институте общей и неорганическ« химии им. Н. С. Курнакова РАН по адресу: 117809, ГСП-1, Москв Ленинский проспект, 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общ и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН по адресу: Моске Ленинский проспект, 31.

Автореферат разослан " 27 " апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 002.37.01

Кандидат химических наук Л. X. Мнначева

рз^г юг о

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Актуальность темы. Прогресс в области диагностики многих серьезных олеваний базируется на развитии новых методологических подходов в ана-ической технике. Сегодня хорошо известна чрезвычайно важная роль роидных гормонов в биохимических процессах и патогенезе многих олеваний. Именно поэтому в настоящее время интенсивно разрабатываются личные способы их определения в биоорганических субстанциях, агностика заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма :роидных гормонов в эндокринологии, гинекологии и онкологии, немыслима ( определения содержания гормонов в организме. Постоянно возрастающее :ло больных бесплодием, которое часто оказывается связанным с эмональными нарушениями, резко повышает актуальность проблемы.

Как правило, медики, строя свои суждения об эндокринной патологии, эаничиваются простым измерением уровня гормонов в крови. Причина вышенного внимания именно к крови, как биологической субстанции, язана с созданием автоматизированных аппаратов, принципиально нованных на использовании высоко специфической реакции антиген -титело, позволяющих делать анализы в большом количестве, быстро и чественно. Моча в качестве объекта исследования осталась на втором плане: к правило, при ее анализе ограничиваются лишь определением суммы 17-тостероидов (17-КС), реже суммы 17-оксикетостероидов и дегид-опиандростерона (ОНЕА).

Однако, после довольно длительного периода "тотального увлечения" оп-делением гормонов в крови выявились и серьезные недостатки этого метода, :новные из которых перечислены ниже: Моментальные колебания концентрации гормонов в крови, связанные с цир-кадными ритмами и другими возможными физиологическими процессами в организме, приводят к ложным выводам.

Значительные вариации нормативных показателей в зависимости от применяемой разновидности иммунологического метода существенно снижают надежность определения.

-23. Ассортимент доступных, особенно в условиях современной России, наборов реактивов, необходимых для использования с максимальной эффективностью данного метода недостаточен. К тому же дороговизна и ограниченное время хранения наборов накладывает дополнительные ограничения на их практическое применение в клинических условиях. 4. Наконец: анализ крови не являясь неинвазивным методом диагностики, всегда создает некоторую вероятность случайного заражения пациента и врача лаборанта вирусами СПИДа, гепатита В и др.

70 - 80-е годы можно без преувеличения назвать "Золотым веком" развития методик определения стероидов в биологических жидкостях с использованием всевозможных химических и хроматографических способов. Именно в этот период были решены основные проблемы по практическому применению подобного анализа. Однако, несмотря на ряд успешных разработок в этом направлении, иммунологический метод все же "одержал верх" над химическим, причем основной причиной этой "победы" оказалась трудоемкость процессов, многоступенчатость стадий проведения химического анализа, и, как следствие, трудность их автоматизации.

Основные преимущества использования мочи в качестве объекта исследования связаны прежде всего с тем обстоятельством, что с мочой экскретируется большое количество стероидов, несущих обширную информацию не только о железах, в которых они синтезируются, но и о состоянии печени, где преимущественно стероиды подвергаются катаболизму. Кроме того, определение стероидов в суточной моче позволяет избежать влияния на результаты измерений циркадных ритмов, которые часто бывают значительными.

Анализ литературных данных позволяет заключить, что одним из наиболее мощных инструментов эффективного анализа стероидов в моче на современном этане является капиллярная газовая хроматография. Это обусловлено, прежде всего, высокой чувствительностью и разрешающей способностью данного метода.

Хроматографическая кривая сложной смеси стероидов в моче - стероид-1ый профиль (СП), как оказалось, является наиболее ценным диагностическим естом при целом ряде заболеваний, связанных с нарушением синтеза и <етаболизма стероидов, причем некоторые из заболеваний могут быть (иагностированы только этим методом. К сожалению, широкому применению ГП в клинике препятствует длительность аналитического процесса, его шогостадийность и, как следствие, высокая стоимость. Поэтому целью шстоящей работы является поиск и разработка новых методологических юдходов, позволяющих быстро и надежно определять стероиды в моче, фичем существенным дополнительным требованием в условиях специфики слинической практики в России должна быть относительная дешевизна >азработанного метода, а, следовательно, и его общедоступность. В целом ¡стественно ожидать, что внедрение разработки позволит существенно шучшить выявляемость ряда заболеваний, снизить репродуктивные потери и >существить качественный мониторинг за ходом проведения лечения.

Постановка задачи. Наиболее трудоемкой, дорогостоящей и длительной 1роцедурой является подготовка образца для газохроматографического 1сслед0вания. Именно эта стадия препятствует широкому внедрению метода в 1рактику. Совершенствование и упрощение этого этапа, без потери 1рицизионности и надежности измерений, и является основной задачей данного исследования, решение которой позволит применить газовую хроматографию ггероидов для диагностики в широких масштабах.

Для выполнения основной задачи требуется решить несколько вопросов. В частности, сейчас чаще всего для извлечения конъюгатов из биологической жидкости применяют так называемые С|8-картриджи, которые уже сами по себе являются дорогостоящими изделиями, а работа с ними представляет собой грудоемкий процесс, требующий достаточно высокой квалификации оператора. По нашему мнению, применение экстракции типа "жидкость-жидкость", взамен использования С|8 картриджей могла бы оказаться гораздо менее трудоемкой, а шачит и дешевле. Особенно длительной и недостаточно совершенной стадией подготовки пробы является ферментативный гидролиз конъюгатов стероидов,

поэтому применение комбинированного с экстракцией кислотного гидролиза (ККГ) могло бы значительно ускорить этот процесс и улучшить воспроизводимость метода. После изучения и анализа литературных данных стало ясно, что данный подход хотя и был предложен ранее, но не был достаточно разработан и не изучен детально. Оптимизация условий и способов проведения ККГ, подбор подходящего метода дериватизации для стероидов, полученных после такого гидролиза, а также совершенствование стадий очистки, позволит значительно ускорить процесс подготовки пробы и удешевить его, без потери при этом качества получаемых результатов.

Ранее хроматографические исследования проводили после ККГ, как правило, с использованием обычных насадочных колонок, что отрицательно сказывалось на качестве разделения пиков, то есть на разрешении метода и, в конечном счете, на его эффективности. Нами предложено использование гораздо более эффективных капиллярных колонок, имеющих ряд преимуществ, и, как оказалось, открывающих широкие перспективы для развития и совершенствования методики.

Таким образом, решение вышеперечисленных вопросов позволяет решить основную задачу настоящего исследования, что в свою очередь может обеспечить достижение главной цели работы широкого использования газовой хроматографии для диагностики ряда заболеваний.

Научная новизна работы. Впервые разработан надежный и эффективный метод определения стероидных гормонов в биологических жидкостях методом газовой хроматографии, отличающийся от известных способов простотой методологического подхода, дешевизной, экспрессностью и высокой информативностью. Автор защищает:

процесс оптимизации экстракции конъюгатов стероидов из биологического материала типа "жидкость-жидкость"; >- разработку способа комбинированного с экстракцией кислотного гидролизе (ККГ) конъюгатов стероидов;

-5> метод газохроматографнческого определения стероидов в образце, полученного после проведения ККГ;

> обоснование и выбор метода дериватизации клинически важных стероидов;

> модернизацию хроматографа JIXM-80;

> применение данного методологического подхода для диагностики ряда конкретных заболеваний;

Практическая значимость работы. Разработанный в диссертационной работе анализ концентрации профилей стероидных гормонов газохроматографическим методом в биологической жидкости человека апробирован на практике и успешно внедрен в 8-й городской больнице Москвы, 29-ом род доме Москвы, а также используется для диагностики причин гиперандрогении в Центре акушерства и гинекологии, на кафедре акушерства и гинекологии РГМУ. Кроме того, метод применяется для диагностики заболеваний в ряде частных медицинских учреждений г. Москвы.

Апробация работы. Результаты работы доложены на следующих конференциях и симпозиумах: «7th European Conference on Clinical Oncology and Cancer Nursing», Jerusalem, Israel, 1993; «V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике», Москва, 1995; «Laboratory medicine '1995», 11th IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, Finland, 1995; «X конференция по экстракции», Уфа, 1994; «Юбилейная научная сессия, посвященная 60-летию основания Института», Москва 1994; «Хроматографические методы в химии, биологии и медицине», Минск 1995; «III всероссийский симпозиум по жидкокристаллическим полимерам», Черноголовка 1995; «Научно-практическая конференции молодых ученых и врачей, посвященная 125-летию фирмы Schering» Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, 1996; Институт медицинской физики, Минздрав России, Москва, 1996; Городская клиническая больница № 8, Москва, 1996; «International congress on analytical chemistry» Moscow, 1997, «Национальные дни лабораторной медицины России», Москва, 1997, «Проблемы эндокринологии в акушерстве и гинекологии», Центр акушерства и гинекологии. Москва, 1997; «XI Российская конференция по экстракции»,

Москва, 1998г; «Юбилейная конференция, посвященная 65-летию ИНХС РАН и 275-летию РАН», Москва, 1999; Основные результаты также представлены на выставках: Общественное собрание Российской академии наук; «Экология. Здравоохранение» Москва, 1998; XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Санкт-Петербург, 1998; Результаты работы регулярно докладывались на лабораторных коллоквиумах ИНХС РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ (из них 11 статей в реферируемых отечественных и международных журналах), список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, завершающегося постановкой задачи, экспериментально-методической части, двух глав, посвященных обсуждению полученных экспериментальных результатов и главы, в которой представлены некоторые аспекты практического использования разработанного метода, выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 192 страницах, содержит 8 таблиц, 23 рисунков и список цитируемой литературы, состоящий из 322 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В первой главе, обзоре литературных данных, критически рассмотрено состояние проблемы вплоть до настоящего времени. Собрана и проанализирована вся литература, имеющая отношение к тем или иным стадиям или этапам разрабатываемого метода и, в конечном счете, к его практическому применению. Вторая глава посвящена методическим вопросам проведения эксперимента. В третьей и четвертой главах изложены результаты изучения химических аспектов прецизионного получения стероидного профиля. Причем методология, описанная в этих главах, значительно различается между собой Так, если третья глава посвящена изучению процессов извлечения стероидов гидролизу конъюгагов и вопросам, связанным с очисткой образца, то четверта) касается получения соответствующих производиых стероидов, хроматографш и метрологии. В пятой главе описаны возможности использованш предлагаемого метода для диагностики ряда заболеваний и проводится ег

сравнение с уже существующими, что в конечном итоге, представляют наибольший интерес именно с точки зрения практического медицинского применения.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз проводили в специальном устройстве, (рис. 1) представляющий собой конусообразную колбу со шлифом, снабженную обратным холодильником, которую помещали в термостат. Предварительно, в колбу, на дне которой находился осадок

(конъюгаты стероидов), наливали

"Ч 80°С

|Шг Бсшол

Стальной шарик

Термостат

Комькматы стероидов

хлористо-водородную кислоту,

помещали металлический шарик для обеспечения равномерного кипения и добавляли бензол. Условия проведения реакции показаны на схеме (рис. 8).

Рис. 1. Устройство для проведения комбинированного с экстракцией кислотного гидролиза конъюгатов стероидов.

Модернизация хроматографа ЛХМ-80. Конструкция серийного хроматографа

ЛХМ-80 не предусматривает возможности использования

капиллярных колонок. С целью присоединения капиллярных колонок-хроматограф был модернизирован. Схема после модернизации показана на рис 2.

Рис. 2. Схема присоединения к хроматографу ЛХМ-80 капиллярной колонки.

-81 - капиллярная колонка подведена к детектору ионизации в пламени (ДИП); 2 - ДИП; 3 - испаритель; 4 - штуцер второго испарителя; 5 - штуцер первого испарителя; 6 - камера расщепления потока газа; 7 - дроссель; 8 - капиллярная колонка; 9 - тройник для поддува газа.

Модернизированный таким образом хроматограф ЛХМ-80 успешно использовался для изучения стероидных профилей мочи.

ПОДГОТОВКИ ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ Экстракция конъюгатов стероидов. Для экстракции конъюгатов стероидов в данной работе была выбрана экстракция типа "жидкость -жидкость". В качестве растворителя использовали - этилацетат. По сравнению с другими возможными полярными растворителями," этилацетат имеет следующие преимущества: является хорошим растворителем, как для сульфатов, так и для глюкуронидов стероидов; имеет относительно невысокую температуру кипения при нормальных условиях (77,1°С); обладает незначительной токсичностью, а также недорог и доступен.

Необходимо отметить, что конъюгаты стероидов хорошо растворяются и в водной фазе. Однако для количественного их извлечения из биообъекта приходится применять многоступенчатую экстракцию, что существенно усложняет процедуру. Этот недостаток был преодолен нами следующим образом. В биологическую жидкость (мочу) вводили избыток хлорида натрия для снижения растворимости конъюгатов (высаливание). Далее конъюгать: экстрагировали многократным избытком этилацетата в течение 5 минут. Е результате конъюгаты стероидов перераспределялись из мочи в этилацетат Чувствительность детектора ДИП вполне достаточна для того, чтобь определять содержание стероидов всего лишь в нескольких миллилитра) биологической жидкости. Поэтому большой избыток растворителя, в сущности почти не сказывается на себестоимости процедуры. Тем не менее, с цельк предельно сократить расход используемого реагента, необходимого дл: экстракции конъюгатов, количество этилацетата было оптимизировано.

12 10

1 8 §

5

2 0

Рнс. 3. Зависимость количества экстрагированного прегнандиола глю-куроннда (РсЮ1) от используемого объема этилацетата. (Концентрация РсЮ1 в модельной смеси составляет

—|—|—I—|—|—|—|—I—|—| 10 Мкмоль/ л) 0 5 10 15 20 25 Э0 35 40 45 50 55 Ш

На рис. 3 приведена зависимость количества экстрагированного Р<Ю1 (см табл. 1) от количества используемого этилацетата. Как оказалось, кривая хорошо апрокснмируется логарифмической зависимостью. Соответствующая оценка показала, что оптимальное количество этилацетата, необходимое для удовлетворительной экстракции глюкуронидов стероидов равно, «20 мл, т.е. составляет 5 - кратный избыток от объема, из которого производили извлечение. При этом не извлеченным остается лишь около 10% РсЮ1, что является вполне удовлетворительным для практической работы.

Естественно, что глюкурониды и сульфаты стероидов обладают разной способностью к растворению в водной среде и этилацетате. Следовательно, можно ожидать, что и полнота извлечения того или иного соединения также будет различной. Для определения степени извлечения в каждом конкретном случае необходимо построить аналогичный график для каждой индивидуальной субстанции. К сожалению, необходимые для этой операции стандарты крайне дороги и малодоступны. Для того чтобы преодолеть эти препятствия в данной работе было предложено использовать стандартную биологическую жидкость с заведомо известным содержанием таких практически важных стероидов, как Ап, Е^ БНЕА и СЬ (см. табл. 1), с использованием которой и проводили процедуры аналогичные вышеописанной.

В результате проведения соответствующей процедуры установлено, что конъюгаты Е1, Ап и ОНЕА обладают примерно одинаковой способностью экстрагироваться из мочи этилацетатом, тогда как СЬ экстрагируется несколько труднее. Тем не менее, как было нами установлено, 20 мл этилацетата (т.е. 5

кратный избыток) вполне достаточное количество для уверенной экстракции, не менее 90% конъюгатов всех клинически важных стероидов.

Комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз конъюгатов стероидов. Сущность, ККГ конъюгатов состоит в том, чтобы как можно быстрее осуществить переход образующихся в процессе гидролиза в водной среде свободных стероидов в органическую гидрофобную фазу и тем самым защитить стероиды от деструктивного влияния сильной ионизирующей протонной среды.

Для успешного решения поставленных в работе задач следовало решить следующие вопросы:

1- подобрать оптимальный растворитель, являющийся наименее токсичным, дешевым и доступным, обладающий максимальной способностью экстрагировать свободные стероиды, имеющий невысокую температуру кипения и не образующий эмульсии.

2- определить оптимальную концентрацию кислоты для достижения наибольшей конверсии процесса превращения стероидов при условии их наименьшей деструкции, для чего, в свою очередь, необходимо проконтролировать влияние природы кислоты на деструкцию тех или иных стероидов.

Выбор растворителя. Сравнительный анализ соответствующих характеристик ряда растворителей, опробованных в работе, позволил остановиться на таком недорогом и доступном растворителе, как бензол, обладающий подходящей температурой кипения, высокой способностью растворять изучаемые стероиды (к тому же увеличивающейся с повышением, температуры) и, наконец, менее токсичном по сравнению с, например, галогенпроизводными углеводородов. В бензоле отсутствуют ионы и поэтому разрушения стероидов не происходит. Стероиды очень хорошо растворяются в бензоле, особенно кипящем. Поэтому сразу после гидролиза гидрофильной молекулы коныогата образовавшаяся гидрофобная молекула стероида быстро переходит в объем растворителя, и, тем самым, надежно защищается в дальнейшем от деструктивного влияния кислой среды. После процедуры

экстракции и удаления растворителя стероиды находятся на дне конусообразной колбы (рис. 1) в виде сульфатов и глюкуронидов.

Определение оптимальной концентрации кислоты и контроль за процессом деструкции стероидов. Главными критериями, по которым осуществлялся выбор кислоты для проведения ККГ, явились следующие: это, во-первых, способность не растворяться в органическом растворителе, во-вторых - не образовывать плохо разделяемые взвеси и эмульсии с растворителем, в-третьих, химическая инертность реагента по отношению к растворителю и, наконец, доступность и низкая стоимость реактива.

С учетом столь жестких требований нами была выбрана в конечном итоге соляная кислота. Сравнительная экспериментальная проверка ряда реагентов показала, что в этом случае после выдувания органического растворителя током азота в осадке не обнаруживалось даже следов хлористого водорода. Изучение кинетики и механизма реакции гидролиза с использованием соляной кислоты было проведено на примере расщепления РсЮ1.

Рис. 4 демонстрирует накопление свободного Рс1 и его деструкцию в зависимости от времени в условиях обычного кислотного гидролиза (а) и ККГ (б) при 80° С. Некий продукт деструкции Р<Г в процессе проведения эксперимента постоянно накапливается. Из рисунков видно, что ККГ в значительной степени защищает Рс1 от деструктивного влияния кислоты. Максимальная же конверсия Рс! глюкуронида достигает своего максимума примерно на 20-й минуте процесса.

Рис. 4. Зависимость деструкции Рс1 от времени в условиях обычного кислотного

гидролиза (а) и ККГ (б).

Как и ожидалось, концентрация кислоты оказывает существенное влияние на процесс гидролиза: если концентрация слишком высокая,то может, произойти чрезмерная деструкция стероидов, тогда как в обратном случае, конверсия процесса может оказаться недостаточно полной. Поиск оптимальной концентрации кислоты проводили на примере гидролиза Рс1 глюкуронида, (рис. 5).

Рис. 5. Влияние 36%, 18%, 9% концентрации кислоты на процесс гидролиза глюкуронида Рс1.

Т-1-1-1-1-1-1-1-1

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ми

■18%

-36% -ь-9%

Для выяснения влияния концентрации соляной кислоты на процесс гидролиза варьировали ее концентрацию: 37%, 18% и 9%. Из рис.5 видно, что в первом случае максимальная конверсия достигается уже на 5-й минуте процесса, после чего начинается заметная деструкция. При концентрации кислоты 18% - максимальная конверсия происходит на 20-й минуте, а в последнем случае (9% концентрация) - лишь на 40-й минуте процесса. Важно также отметить, что выход свободного Рс1 в случае применения концентрированной кислоты ниже по сравнению с использованием разбавленной в два раза, что указывает на повышенную кислотную деструкцию стероидов в первом случае, по сравнению с последним.

Таким образом, если использовать концентрированную кислоту, то конверсия происходит слишком быстро, что технологически неудобно.

Напротив, если концентрация кислоты мала, то гидролиз протекает слишком

/

медленно. Сравнение двух крайних случаев указывает на то, что оптимальной концентрацией в данном случае является величина 18%. Степень

гидролитическои конверсии конъюгатов стероидов при этом достаточно высока так, например, при восстановлении An и Et из их глюкуронидов и сульфатов, степень конверсии колеблется от 75% до 90% в зависимости от условий проведения реакции.

Поскольку важно иметь представление о степени кислотной деструкции и для других клинически важных стероидов, таких как An, Et, DHEA, Pt, THF и Ch, нами была проведена серия экспериментов, в которых первоначально создавали заданную концентрацию (50 мг/л) каждого индивидуального стероида в бензоле, а затем проводили стандартную процедуру гидролиза при 80°С. Через заданный промежуток времени отбирали пробу, в которой стероид после стандартной процедуры очистки и дериватизации анализировался количественно относительно внутреннего стандарта. Результаты измерений представлены на рис. 6.

♦ Pd

■ DHEA

д Ch

х Pt

ж THF

• Et

Рис. 6. Кинетические кривые деструкции стероидов в условиях комбинированного с экстракцией кислотного гидролиза

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Мин

Из рис. 6 видно, что наименьшей деструкции подвержен СЬ, далее стероиды располагаются в следующем порядке: Е1>Ап=ОНЕА>Рс1>Р£>ТНР, причем стабильность Ап и ЭНЕА оказалась практически одинаковой.

Температурный фактор, естественно, оказывает существенное влияние на сам процесс гидролиза. Поскольку верхний предел температурного интервала ограничен температурой кипения растворителя - бензола, нами проведено изучение влияния температуры на поведение стероидов при гидролизе на примере глюкуронида Рс1 при температурах ниже 80°С.

Рнс. 7. Влияние температуры на процесс гидролиза

т—I—I—I—I—I—I—I—I

Мин

70 -.Мг/л

бо 4 _ . _

0, глюкуронида Ра. -70°

Из рис. 7 видно, что максимальная конверсия Рс1 при 80 С0 достигается на 200 10 20 30 40 50 60 70 80 90 й минуте гидролиза. При

снижение температуры до 70°С максимальная конверсия происходит на 70-й минуте процесса. Если температура гидролиза еще больше снижается, до 50°С, максимальная конверсия не достигается и на 90-й минуте процесса. Из этих данных следует, что оптимальная температура проведения процесса гидролиза составляет 80°С, то есть, фактически совпадает с точкой кипения бензола, что создает дополнительное удобство, поскольку в этом случае не требуется поддержания стабильной температуры в водяной бане.

Усовершенствование методики проведения гидролиза. В процессе проводимого гидролиза образуется система, состоящая из двух фаз: нижняя это разбавленная соляная кислота, верхняя - бензол, причем при температуре проведения реакции 80°С нижняя фаза является неподвижной, тогда как верхняя - интенсивно кипит. Существование неподвижной нижней фазы является отрицательным фактором, поскольку гидролизующиеся стероиды длительное время находятся в агрессивной среде и поэтому подвержены относительно большему разрушению.

Для устранения данного затруднения нами была предложена следующая методика. В реакционную среду вводился металлический шарик, изготовленный из стали ШХ15 (0 3,175 мм). Металл, естественно, взаимодействует с разбавленной соляной кислотой (да еще и при повышенной температуре 80°С), в результате чего и системе образуются мельчайшие пузырьки водорода, являющиеся в то же время центрами кипения. В этом случае вся смесь интенсивно кипит, хорошо перемешиваясь, что в свою очередь приводит к

увеличению числа переноса в процессе гидролиза. Таким образом, образующиеся свободные стероиды гораздо быстрее переносятся в углеводородную фазу, где они уже надежно защищены от разрушительного влияния соляной кислоты. В серии контрольных опытов было показано, что присутствие металла не сказывается на качестве проводимого гидролиза.

Очистка образца. После проведения кислотного гидролиза, полученные в результате подобной процедуры свободные стероиды нельзя сразу вводить в хроматограф, так как экстракт содержит массу всевозможных примесей. В настоящей работе в качестве основного метода очистки выбран способ промывки гидролизата раствором щелочи с целью удаления кислотных и других примесей. После щелочной обработки экстракт промывался дистиллированной водой, при этом удалялся остаток щелочи. С целью достижения наименьших потерь стероидов, стадия очистки гидролизата была также оптимизирована. Результаты представлены на обобщенной диаграмме (рис. 8).

Получение производных. С целью улучшения качества разделения клинически важных стероидов, полученных после ККГ, проведено изучение трех способов дериватизации: это образование двойных метилоксим-

триметилсил ильных

о

n

/0С"3 (МО-ТМС) производ-

ных,

о

о

триметилсил иль-

ных производных с

частичной защитой функциональных групп

о

но

мятрл

но'

тмио '

отмя

и полной защитой функциональных групп в виде енол-триметилси-лильных производных.

Причина выбора этих способов, главным образом, определяется их практической распространенностью, а, следовательно, и наибольшей отработанностью е методическом плане.

Газовая хроматография стероидов. В настоящей работе были испытань два вида колонок - традиционные насадочные и высокоэффективные капиллярные. Поскольку к преимуществам капиллярных колонок относятся высокая селективность и долговечность, от применения насадочных колонок, е конечном счете, пришлось отказаться.

Таким образом, в дальнейшей работе в основном использовались капиллярные колонки.

Кроме того, было проведено сравнительное изучение возможности разделения различных производных стероидов на тех или иных неподвижных фазах. Целью этой трудоемкой и скрупулезно проведенной методической работы являлось стремление добиться удовлетворительного разделения клинически важных стероидов, полученных после ККГ, что и было достигнуто при использовании в качестве неподвижной фазы - БЕ-ЗО.

Идентификация стероидов с использованием метшеновых единиц. Величины удержания исследуемых стероидов представлены в табл. 1. Табл. 1. Номер пиков на хроматограмме, тривиальное название стероидов, а также их величины удержания, выраженные в метиленовых единицах.

№ Аббревиа- Тривиальное название Метиленовые еди-

пика тура ницы

I II III

1 Ап Андростерон 24,52 25,74 25,34

2 Е1 Этиохоланолон 24,71 25,82 25,40

3 ОНЕА Дегидроэпиандростерон 25,29 26,39 26,15

4 11-кеЮ-Ап 11-Кетоандростерон 25,34 26,69 26,53

5 11-кеЮ-Е1 11-Кетоэтиохоланолон 25,42 26,69 26,50

6 Рп Прегнанолон 26.45 27,49 27,41

7 1 ф-ОН-Ап 11 Р-Гидроксиандростерон 26,65 27,38 27,04

8 11Р-011-Е1 11 Р-Гидроксиэтиохоланолон 26.86 27,46 26,98

9 аИо-Рс1 /)лло-прегнандиол 27,62 27,62 27,62

10 Рс1 Прегнандиол 27.73 27,73 27,73

11 Р1 Прегнантриол 29,23 28.23 28,23

12 СЬ Холестерин 31,22 31,22 31,22

I. Триметилсилильные производные стероидов с оставшимися не защищенными стерически затрудненными гидроксильными группами.

II. Енол-триметилсилильные производные.

III. Двойные метилоксим-триметилсилильные производные.

Сравнительный анализ данных, полученных тремя способами I, II и III,

позволяют сделать вывод о том, что наиболее подходящим способом дериватизации стероидов из трех изученных, является I способ. Действительно, из табл. 1 видно, что лишь данный подход позволяет разделять клинически важные стероиды, такие как llß-OH-An и 11-OH-Et. Впрочем, как можно видеть, и другие стероиды разделяются в этом случае также достаточно хорошо. При этом, правда, остаются незащищенными две стерически затрудненные функциональные группы.

Несмотря на последнее обстоятельство, именно данный метод, являющийся к тому же относительно простым (одностадийным) и не требующим применения дорогих импортных реагентов, был выбран в данной работе в качестве основного.

Выбор внутреннего стандарта. При выборе внутреннего стандарта принимались во внимание такие факторы, как доступность и дешевизна препарата, а также стабильность выбираемого вещества в условиях проведения ККГ. В результате сравнительного исследования ряда веществ, таких как холестанон, различные эфиры холестерина и т.д., в конечном счете, в качестве внутреннего стандарта был выбран н-алкан С24 (тетракозан), поскольку именно в этом случае вышеперечисленные требования соблюдались наиболее оптимальным образом.

Воспроизводимость метода. Воспроизводимость метода была установлена путем проведения 10 последовательных анализов одной и той же суточной мочи женщины взятой в лютеиновую фазу. Результаты представлены в табл. 2.

Табл. 2. Воспроизводимость метода. Средняя величина X (мкМоль/сутки), стандартное отклонение Д и коэффициент вариации К.В. % для выборки (п=10).

Название стероида X Д К.В. %.

Андростерон 14 0,3 2,1

Этиохоланолон 10 0,2 2,0

Дегидроэпиандростерон 3 0,05 1,7

11-Кетоандростерон 8 0,2 2,5

11-Кетоэтиохоланолон 7 0,2 2,9

Прегнанолон 7 0,3 4,3

1 lß-Гидроксиандростерон 5 0,12 2,4

1 lß-Гидроксиэтиохоланолон 6 0,11 1,8

Алло-прегнандиол 3 0,1 з,з

Прегнандиол И 0,3 2,7

Прегнантриол 3 0,11 3,7

Холестерин 18 0,9 5,0

Из табл. 2 видно, что коэффициент вариации колеблется в пределах от 1,7 до 5,0 %, что, на наш взгляд, свидетельствует в пользу хорошей воспроизводимости результатов. Для сравнения Setchell K.D.R. et al. [J.Steroid biochem. 1976,- Vol.7, P.615] приводит значение коэффициента вариации 3 -23%, Shackleton and Honour [Clin.Chem.Acta. 1976. -Vol.69. P.267.] - 2,4 - 16,6, a Leunissen [Quantitative aspects of the determination of steroid profiles from urine by capillary gas chromatography. 1979] - 6,2 - 9,6. Более высокий уровень воспроизводимости в нашем случае, по-видимому, связан с применением ККГ вместо ферментативного гидролиза, используемого в цитируемых работах. Последнее предположение подтверждается заключением ряда авторов о том, что ферментативный гидролиз характеризуется относительно плохой воспроизводимостью.

В окончательном виде диаграмма получения СП выглядит так, как представлено на рис. 8.

Л

Экстракция коиъюгатов стероидов

4 мл мочи взятой из суточного количества 20 мл этилацетата с введенным в него Сл

4 грамма №С1 выпаривание органической фазы в токе N2

4

)акане

Комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз

2 мл НС1 (разбавление 1:1) металлический шарик 0 3,175 сталь ШХ15 5 мл бензола

Водная фаза отбрасывается

Промывка щелочью

2 мл, 0,5 N раствор

иллнро

Промывка дистиллированной водой

2 мл воды центрифугирование органическая фаза выпаривается в токе N2 при 60°С

Л

Кап

ДернватнзацнйТГМС эфир)

ТМХС-ГМДС-пиридин (2:1:5 \Мч) Упаривание

Раствореннеосадкав2 мл гексана

Перенесение в 2 мл сосуд выпаривание мстворителя

оренне

ПерераствореТше остатка

в 10 мл гептана и ввод в испаритель хроматографа

а

Газовая хроматография

1ллярная колонка БЕ-ЗО, толщина 0,19 мм эффективность 5300 теоретических тарелок на

метр.

Te^ пература инжектора - 290 С, детектора - 300 С, начальная температу ра колонки - 170ЛС, скорость нагрева 3 град/мин, разделение потока 30: 1, скорость поддува на выходе из колонки 1 25 мл/ мин, скорость подачи водорода - 25 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин

Рис. 8. Основные этапы процесса получения стероидного профиля биологической жидкости.

Нормы экскреции стероидов женщин репродуктивного возраста. Для установления нормативных величин экскреции стероидных гормонов нами были отобраны женщины репродуктивного периода (60 человек), возрастной категории 15-45 лет без признаков какой бы то ни было эндокринной патологии. Полученные результаты представлены в табл. 3. Проведено их сравнение с литературными данными.

Табл. 3. Нормы экскреции клинически важных стероидов.

Название стероидов Млмоль/24 часа

Установленные нормы Литерату рные данные

Средняя величина Пределы

Андростерон 9,5 3,8-15,1 2,3-9.7

Этиохоланолон 8,9 3,0-14,8 2,4-9,4

Дегидроэпиандростерон 1,4 0-1,3 0,2-1,6

11-Кетоандростерон 1,5 0,3-2,7 0,3-1,9

11-Кетоэтиохоланолон 1,5 0,4-2,5 0,3-1,8

Прегнанолон 1,25 0,1-2,4 -

1lß-Гидроксиандростерон 3,6 2,0-5,2 1,3-4,8

11 ß-Гидроксиэтиохоланолон 1,8 0,5-3,1 0,5-2,7

Ллло-прегнандиол 0,7 0,2-1,2 -

Прегнандиол 5,0 0,6-9,4 0,7-7,1

Прегнантриол 0,4 0-0,5 1,0-3,9

Холестерин 7,7 5,6-9,8 -

Нормы установлены при выборке п=60 человек, при уровне значимости р<0,05

При анализе табл. 3 вндно, что нормы экскреции ряда стероидов для разработанного нами метода выше по сравнению с литературными данными [см. например, Weykamp C.W. et al. //Clin. Chem. -1989.-Vol.35, N 12. P.2281-2284]. Вероятно, это расхождение связано с меньшей степенью конверсии конъюгатов стероидов, достигаемой в работах, где применяли ферментативный гидролиз по сравнению с нашим подходом (ККГ). Важно отметить, что полученные в нашей работе нормы для Pt, наоборот ниже, чем у цитируемых авторов, что, на наш взгляд, может быть связано со значительной деструкцией Pt при ККГ.

ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОКРИННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Данный метод, как выяснилось, целесообразно применять для диагностики целого ряда эндокринных, гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с количественными и качественными нарушениями биосинтеза и катаболизма стероидных гормонов. Метод также представляет ценность, как тест для суждения об эффективности лечения, подавления или стимуляции сте-роидогенной функции коры надпочечников и или яичников, а также для установления оптимальных доз рекомендуемых медикаментов при проведении заместительной терапии.

В качестве демонстрационного примера рассмотрим диагностику причин гирсутизма, для которого особенно широко в настоящее время используется данный диагностический метод.

Dil ЕЛ

Си

L

См

?г

= i V

4J

щ!

Рис. 9. СП мочи женщины в фолликулярную фазу менструального цикла

Рис. 10. СП мочи больной синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) (низкий уровень ЭНЕА)

Типичный СП женщины в возрасте 21 года без клинических проявлений эндокринной патологии характеризуется доминированием двух пиков главных андрогенов - Ап и Е1 (рис. 9). В отличие от нормы, СП больных, страдающих

СПЬСЯ, как и следовало ожидать, имеют некоторые особенности. На рис. 10. показан СП больной в возрасте 22 лет с ярко выраженным гирсутизмом. Анализируя хроматограмму, можно отметить повышенное содержание An и Et, нарушение соотношения An/Et в пользу An и наличие интенсивного пика DHEA, являющегося маркером гиперандрогении надпочечникового происхождения. В дальнейшем, после подавления синтеза андрогенов индивидуально подобранными дозами дексаметазона, интенсивность пика DHEA снижается до нормального уровня, что подтверждает надпочечниковый генез ГА, а не яичниковый, при котором должно повышаться лишь содержание An и Et. Последнее обстоятельство имеет решающее значение при выборе методов терапевтического вмешательства, обеспечивая в итоге успех лечения в целом.

Кроме того, разработанный метод применялся для установления возможных критериев важных для диагностики рака эндометрия, измерения 5а-редуктазной активности печени, для оценки эффективности терапии гормональной недостаточности плаценты, а также для выявления других патологических состояний связанных с нарушением метаболизма стероидов в организме человека.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан простой, быстрый и надежный способ одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости газохроматографическим методом путем предварительного извлечения конъюгатов (высаливание в этилацетат) и их комбинированного (с экстракцией) кислотного гидролиза с использованием для разделения высокоэффективной капиллярной колонки.

2. На основании подробного изучения и оценки количественных факторов проведения процесса, оптимизированы условия комбинированного с экстракцией кислотного гидролиза конъюгатов стероидов. Установлено, что стабильность стероидов в процессе гидролиза располагается в ряд: Ch>Et>An=DHEA>Pd>Pt>THF.

-233. Установлено, что удовлетворительное газохроматографическое разделение целого ряда клинически важных стероидов, (в том числе таких трудно разделяемых, как 11-кетоандростерон и 11-кетоэтиохоланолон) возможно после их превращения в триметилсилильные эфиры с оставшимися незащищенными, стерически затрудненными функциональными группами.

4. Получена лучшая воспроизводимость результатов при более высокой экспрессности метода по сравнению с традиционными способами определения стероидов при относительной простоте новой методики и дешевизне используемых реагентов.

5. Показана высокая надежность диагностики предлагаемого метода ряда эндокринных, гинекологических и онкологических заболеваний, продемонстрирована пригодность для широкого клинического использования.

6. Разработан и патентуется способ определения суммы 17-КС в биологической жидкости воспроизводимым, дешевым и удобным для клинического применения способом.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в следующих печатных изданиях:

1. Orlov E.N., Loginova К.В., Antipov Е.М., Makarov O.V., NikolaevN.N. Adenocarcinoma of Endometrium: Interrelation Between Etiocholanolonc and An-drosterone // Europ.J.Cancer.- 1993.-Vol.29A.- Sappl.6-P.S 128

2. Orlov E.N., Antipov E.M., Beriozkin V.G, Loginova K.B. The gas-liquid chromatography in definition of hormonal states of patients with the adenocarcinoma of the endometrium HClin. Biochem. Revs.-1993.- Vol.14 Nov.P.307.

3. Орлов E.H., Николаев H.H. Анализ стероидов мочи методом газожндкост-нон хроматографии ИКлиническая лаб. диагностика -1993.- N 2, Стр. 20

4. Орлов E.H., Антипов Е.М., Николаев H.H. Некоторые аспекты получения стероидных профилей мочи //Вопросы мед. Хгси. -1993.- Vol.39, N. 5, Стр. 7.

5. Чмож Л.А., Орлов E.H., Николаев H.H., Макаров О.В., Антипов Е.М. Попы-шение 5а-редуктазнон активности у женщин с наличием гирсутшма и

угрозон прерывания беременности //Тезисы конференции. Репродуктивнш функция в супружеской паре г. Екатеринбург -1994.-Стр.113.

6. Орлов E.H., Антипов Е.М. Березкин В.Г. Анализ стероидных гормоно! биологических жидкостей: комбинированный с экстракцией кислотны! гидролиз конъюгатов //Тезисы Хконф. по экстракции -1994 г. Стр. 326.

7. Орлов E.H., Николаев H.H., Антипов Е.М., Чмож JI.A., Макаров О.В. Диагностическое значение стероидных профилей мочи // Проблемы эндокринологии -1995.-T.41.N 2, Стр. 35.

8. Orlov Е., Chmozsh L. Screening of urinary steroids: diagnostics of hirsutism //The Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation -1995.- Vol.55. Suppl.223. S.809

9. Орлов E.H., Чмож JI.A., Макаров O.B., Николаев, Антипов Е.М. Скрининго-вая диагностика причин гирсутизма по стероидным профилям мочи //Тезисы V Российского съезда специалистов по лабораторной диагностике Москва.-1995.-ч. 11. Стр.212-213.

10. Орлов E.H., Антипов Е.М. Применение хроматографа JIXM-80 для анализа стероидов мочи // Медицинская техника -1995.- №5, С. 38-39.

11. Орлов E.H. Жидкокристаллические полимеры в газовой хроматографии стероидных гормонов ¡/Тезисы 111 Всероссийского симпозиума по жидкокристаллическим полимерам 20-23 февраль 1995 г. Черноголовка стр. 46.

12. Орлов E.H. Капиллярная газовая хроматография: анализ стероидов мочн И Тезисы V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике Москва 24-26 мая 19995 г. -1995.- Часть 2, стр. 212.

13. Орлов E.H., Антипов Е.М., Березкин В.Г. Экспресс-метод подготовки пробы для газохроматографического анализа стероидов мочи в виде их метнл-трнметнленлильных производных ПХроматографическиеметоды в химии, биологии и медицине. /Материалы конференции 16-17 ноября 1995 г. Минск-1995,-стр. 130.

14. Орлов E.H., Антипов Е.М., Березкин В.Г., Николаев H.H. Комбинированный (с экстракцией) кислотный гидролиз конъюгатов стероидов для по-

лучення смеси стероидов в моче ¡¡Журнал аналитической химии -1996.-том. 51, N 7, стр. 741.

15. Орлов E.H., Антипов Е.М., Макаров О.В., Николаев H.H., Чмож J1.A., Дол-магамбетов A.A.. Диагностика причин гнрсутизма по стероидному профилю мочи // Проблемы репродукции. -1996.- N 3, Стр. 90.

16. Орлов E.H., Долмагамбетов A.A., Макаров О.В.. Некоторые особенности метаболизма стероидов при ОПГ-гестозах // Тезисы докладов. Проблемы ОПГ-гестозов. Чебоксары 15-17 октября -1996.- Стр. 69.

17. Долмагамбетов A.A., Орлов E.H.. Патогенетически обоснованная терапия гнрсутизма препаратом ДИАНЕ-35 //Тезисы научно практической конференции молодых ученых и врачей. 30 октября -1996.- Schering. Стр. 9.

18. Orlov Е., Antipov Е., Beriozkin V. Methanolysis of conjugates of steroids of obtain chromatograms of urine steroids mixtures // Abstracts of International congress on analytical chemistry Moscow June 15-21. -1997.-Vol.2, P.28.

19. Орлов E.H., Семенова T.A., Долмагамбетов A.A. Опыт применения стероидных профилей мочи для диагностики причин невынашивания беременности //Клиническая лабораторная диагностика -1997.-№6, Стр. 41.

20. Орлов E.H., Долмагамбетов A.A., Макаров О.В. Диагностическое значение определения экскретируемых стероидов в акушерстве и гинекологии //Проблемы эндокринологии в акушерстве и гинекологии. М. Academia. -1997.- Стр.85.

21. Victor G. Berezkin, Elena Yu. Sorokina, Irina V. Malyukova, Evgenii N. Orlov, Evgenii M. Antipov Nitrous Oxide as Carrier Gas in Capillary Gas-Liquid Chromatography HJ. High Resol. Chromatogr. -1998.- Vol. 21, N 7, P.407.

22. Орлов E.H., Антипов E.M., Подтетенев А.Д. Изучение процесса одностадийной экстракции 17-кетостероидов из биологических жидкостей //Тез. докладов XI Российской конферен. по экстракции Москва. 1998 г. Стр.263.

23. Орлов E.H., Антипов Е.М., Макаров О.В., Николаев H.H., Чмож JI.A., Долмагамбетов A.A. Возможности улучшения диагностики причин гнрсутизма // Некоторые актуальные вопросы акушерства и гинекологии. Сбор-

ник научных статей. Москва. 1998 г. РГМУ Кафедра акушерства и гинекологии N 1 лечебного факультета. Стр. 52.

24. Макаров О.В., Орлов E.H., Николаев H.H., Логинова К.Б. Клиннко-днагно-стнческое значение стероидного профиля мочи у больных гиперпластн-ческими процессами и раком эндометрия в постменопаузальном периоде // Некоторые актуальные вопросы акушерства и гинекологии. Сборник научных статей. Москва. 1998 г. РГМУ Кафедра акушерства и гинекологии N 1 лечебного факультета. Стр. 200.

25. Орлов E.H., Николаев H.H., Подтетенев А.Д. Применение стероидных профилей мочи для оценки эффективности терапии гормональной недостаточности плаценты. IIКлиническая лабораторная диагностика -1998,-№8, Стр. 45.

26. Макаров О.В., Николаев H.H., Подтетенев А.Д., Орлов E.H. Изучение фе-тальиых гормонов в амниотической жидкости при слабости родовой деятельности //Современные проблемы диагностики и лечения нарушений репродуктивного здоровья женщин. Сборник научных трудов II съезда акушеров - гинекологов Северного Кавказа 9-11 сентября 1998 г. Ростов-на-Дону. 1998.

27. Николаев H.H., Подтетенев А.Д., Брачникова Т.В., Хубецова М.Т., Комарова Е.Е., Орлов E.H. Анализ стероидов амниотической жидкости с целью поиска новых путей снижения частоты аномалий родовой деятельности и перинатальной патологии //Новые технологии в акушерстве и гинекологии. Материалы научного форума. Москва. 1999 г. Стр. 191-192.

28. Макаров О.В., Николаев H.H., Попова J1.B., Петрушина В.А., Подтетенев А.Д., Соколовская В.В., Орлов E.H. Влияние медицинского озона на синтез и метаболизм стероидов фетоплацентарного комплекса. Юбилейный сборник, посвященный 90-летию кафедры. Российский государственный медицинский университет. Кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета. Москва. 1999 г. Стр. 52-54.

29. Макаров О.В., Подтетенев А. Д., Николаев H.H., Орлов E.H., Братчикова Т.В., Попова Л.В. Значение 16-гидроксистероидоп при проведении

объективнон оценки внутриутробного состояния плода. Юбилейным сборник, посвященный 90-летию кафедры. Российский государственный медицинский университет. Кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета. Москва. 1999 г. Стр. 84-85. 0. Телунц A.B., Богданова Е.А., Орлов E.H. Роль фермента 5 альфа редуктазы в развитии нднопатнческого гирсутнзма у девочек в период полового созревання IIГинекология. -2000.- № 1, Стр. 14-15.