Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность

Степнова, Евгения Александровна

Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Степнова, Евгения Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность»

Автореферат диссертации на тему "Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИМ. А.Н. НЕСМЕЯНОВА РАН

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ -.

'¡¡¡УР

003466561

СТЕПНОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ВЫСОКО- И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

специальность 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения 02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

О 9 ДП?

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории физиологически активных биополимеров

Учреждения Российской академии наук Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научные руководители:

доктор химических наук,

профессор Ямсков Игорь Александрович

кандидат химических наук,

доцент Тихонов Владимир Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится « 23 » апреля 2009 г. в^г часов на заседании диссертационного совета Д 00.250.02 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Учреждении Российской академии наук Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Вавилова д. 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭОС РАН Автореферат разослан марта 2009 г.

РХТУ им. Менделеева, г. Москва

доктор химических наук, профессор

Пономарев Игорь Игоревич ИНЭОС РАН, г. Москва

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 00.250.02 кандидат химических наук

А. Ю. Рабкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хитозап - нетоксичный, биодеградируемый полимер. Несмотря на то, что хитозан привлекает внимание ученых уже сравнительно давно, свойства этого уникального полимера до конца не изучены.

В ряде областей применение хитозана ограничено из-за его высокого молекулярного веса и, как следствие, низкой растворимости в воде и разбавленных кислотах, а также высокой вязкости растворов даже при низких концентрациях хитозана. Медицинское применение нашли хитозаны низкого молекулярного веса с высокой растворимостью и низкой вязкостью водных растворов при физиологических значениях рН. Микробиологическая активность хитозана была определена в отношении ряда микроорганизмов. Однако эти исследования показали, что биологическая активность хитозана сложным образом зависит от его молекулярного веса и степени ацетилирования. Указанные факторы влияют не только на растворимость хитозана, но и на взаимодействие макромолекул хитозана с клеточной стенкой микроорганизмов. Амфифильные производные хитозана, которые находят применение в качестве загустителей, поверхностно-активных веществ и пенообразователей обладают пониженной растворимостью по сравнению с самим хитозаном. В связи с этим получение новых производных хитозана, обладающих повышенной растворимостью и биологической активностью, является актуальной научной и практической задачей.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение амфифильных производных высоко- (ВМ) и низкомолекулярного (НМ) хитозана, изучение их физико-химических и биологических свойств в сравнении с ^модифицированным хитозаном. Для достижения данной цели нами были определены основные задачи:

1. проанализировать имеющиеся источники хитина и выбрать предпочтительные источники и параметры их обработки для получения хитозана;

2. согласно выбранным параметрам осуществить переработку биоотходов, содержащих хитин;

3. разработать методику получения амфифильных производных хитозана, обладающих повышенной растворимостью, и изучить их основные физико-химические свойства;

4. разработать методику модификации хитозана и его амфифильных производных путем селективного введения бетаиноильных групп для увеличения растворимости при физиологических значениях рН;

5. разработать методику получения и получить серию низкомолекулярных хитозанов и их амфифильных производных для изучения влияния молекулярной массы и степени замещения на их свойства;

6. исследовать активность полученных соединений против ряда бактерий, дрожжей и

грибов.

Научная повизна работы

1. Разработана оригинальная технология получения амфифнльного производного хи-тозана - Ы-[2(3)-(додец-2 -ен-1 -ил)сукциноил]хитозана, обладающего повышенной растворимостью, и изучены его физико-химические свойства;

2. Предложен новый метод кватернизации хитозаяа и его амфифильных производных с использованием 2-этокси-1-этоксикарбошш-1,2-дигидрохинолина в качестве конденсирующего агента, который позволяет вводить бетаиноильные группы селективно по аминогруппам хитозана и получать производные хитозана растворимые при физиологических значениях рН;

3. Впервые обнаружено и подтверждено химическими и физико-химическими методами, что 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин способен взаимодействовать с аминогруппами хитозана с образованием М-(этоксшсарбонил)хитозана;

4. Впервые получен ряд амфифильных производных низкомолекулярного хитозана и показана зависимость их физико-химических свойств и биологической активности от степени замещения.

Практическая значимость работы

1. Показано, что среди ряда исследованных источников хитина предпочтительным источником для получения хитозана медицинского назначения является гладиус кальмара;

2. Разработана методика получения низкомолекулярного хитозана с высокими выходами и низкой полидисперсностью из производимого в больших количествах высокомолекулярного хитозана;

3. Получены амфифильные и кватернизованные производные хитозана, которые могут быть использованы в качестве носителей биологически активных веществ. Гидрофобные лекарственные средства могут быть солюбилизироваяы внутри агрегатов таких частиц, а противоположно заряженные (анионные) полиэлектролиты, такие как ДНК, могут образовывать комплексы с такими производными при физиологических значениях рН;

4. Показано, что полученные соединения обладают высокой биологической активностью по отношению к некоторым видам бактерий и грибов, особенно по отношению к Candida kruisei и Pénicillium vermoesenii.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Восьмой и Девятой Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хи-

тина и хитозана», Казань, 14-16 июня 2006 и Ставрополь, 13-17 октября 2008, VI съезде биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря 2006, Молодежной конференции "Молекулярный дизайн и синтез веществ с заданной физиологической активностью", 15 ноября 2006, МГУ; на молодежном конкурсе ИНЭОС РАН 2006. Работа была удостоена 1 премии имени академика П.П. Шорыгина на ежегодном конкурсе работ молодых ученых в области хитина и хитозана Российского хитинового общества в 2007 году.

Личный вклад соискателя.

Экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Определение молекулярных масс и антибактериальной активности хитозанов проводили совместно с лабораторией инженерии ферментов проф. Варламова В.П. (Центр Биоинженерии РАН). Выделение хитозана из креветки южноатлантической (Cragnon cragnon), кальмара (Loligo vulgaris), каракатицы (Sepia officinalis), моллюсков (Mytilus galloprovincialis и Cerastroderma edule) проводили на базе Лаборатории патологии растений (Департамент морских наук и прикладной биологии, Университет г. Аликанте, Испания). Определение размера частиц кватернизованных хитозанов проводили на базе Лаборатории фармацевтического факультета института Луи Пастера, г. Страсбург, Франция.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых российских (3) и зарубежных журналах (3), 1 статья в сборнике трудов Российского хитинового общества, 2 тезисов докладов на научный конференциях.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 38 рисунков, библиографию из 153 наименований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение хитина из различных источников и получепие хитозана

С целью получения хитозана и переработки хитиносодержащих биоотходов нами был проведен анализ рада источников хитина: отходов креветки южноатлантической (Cragnon cragnon), креветки североморской (Pandalus borealis), кальмара (Loligo vulgaris), каракатицы (Sepia officinalis), моллюсков (Mytilus galloprovincialis и Cerastroderma edule) и речного рака (Actacus leptodactylus).

В нашей работе используемые биоотходы были предварительно измельчены до размера частиц от 1 до 3 мм, а затем были подвергнуты щелочному депротеинированию 0,5-1,5 М раствором гидроокиси натрия при 80°С в течение двух часов. По окончании процесса щелочного депротеинирования отделяли супернатант и полностью промывали частицы депротеинированного хитина.

Для деминерализации хитина мы использовали 0,5-1 М соляную кислоту, которую вводили порциями в перемешиваемую водно-хитиновую смесь до полного прекращения выделения углекислого газа, а затем оставляли на 1-2 часа. Для снижения ценообразования добавляли незначительные количества бутилового спирта. Таким образом, основньми стадиями получения хитина являются измельчение, промывка и отделение несвязанного белка, депротеинирование, деминерализация, промывка водой, высушивание. Гладиус кальмара, который не содержит карбоната кальция, не требовал деминерализации.

Деацетилирование хитина проводили 50% NaOH при 90°С в течение трех часов. Полученный хитозан промывали водой и высушивали на воздухе. Требуемое количество сырья для получения 1 кг хитозана составило соответственно: креветки цельные (90-110 кг), креветки отходы (50-70 кг), гладиус кальмара (4-5 кг), рудимент раковины каракатицы (80-85 кг), моллюски (1400-1600 кг), речной рак (80-100 кг).

Результаты наших экспериментов показали, что для получения хитозана в промышленных масштабах нецелесообразно использовать моллюски, так как выход хитозана при использовании этого источника невелик из-за высокого содержания в нем карбоната кальция. Отходы креветок и раков могут быть использованы в качестве источников для получения хитозана. Однако, по нашему мнению, наиболее перспективным сырьевым источником для получения хитозана, пригодного для использования в медицинских целях, является хитин, выделяемый из гладиуса кальмара. Так как гладиус кальмара содержит значительные количества легко перерабатываемого ß-хитина, для получения которого не требуются стадии деминерилизации и обесцвечивания.

2. Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом. Физико-химические свойства полученных соединений

Как правило, для получения гидрофобномодифицированных производных хнтозана используют реакцию ацилирования ангидридами или хлоридангвдридами карбоновых кислот, или используют метод восстановления оснований Шиффа боргидридом или циано-боргидридом натрия. Однако введение длинного алкильного заместителя в молекулу хнтозана приводит к уменьшению его растворимости. Увеличить растворимость гидрофоб-но-моднфицированного хитозана можно его М,0-карбоксиметалированисм или К-сукцинилированием. Присутствие карбоксильных групп частично компенсирует потерю растворимости, связанную с введением в молекулу хитозана гидрофобных алхильных групп.

Реакцию взаимодействия хитозана (М№ 450 кДа), полученного из гладиуса кальмара, с (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом (ДЦЯА) проводили в водной слабокислой среде, содержащей метанол, при 50°С. В этих условиях хитозан и ДЦЯА полностью растворимы. После завершения реакции продукт легко осаждается насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. При этом образовавшийся К-/2(3)-додец-2'-ен-1 '-ил)сукциноил/хитозан (ДЦС-хитозан) представляет собой сильно набухший гель. Продукты гидролиза ДЦЯА полностью растворимы в слабощелочном водном растворе и таким образом могут быть полностью отделены от ДДС-хитозана. На рис. 1 приведена схема получения N-/2(3)-додец-2'-ен-]'-ил)сукциноил/хитозана (ДДС-хитозана). Как видно, (2-додецен-1-ил)янтарный ангидрид имеет несимметричную структуру, и обе его карбонильные группы могут реагировать с аминогруппами хитозана, образуя 2-изомер или 3-изомер. Вероятно преимущественно образуется 3-изомер, т.к. образованию 2-изомера препятствуют пространственные затруднения, вызваемые длинными алифатическими цепями (2-додецен-1-ил)янтарного ангидрида. К сожалению, определение соотношения этих изомеров с использованием методов ЙК и ПМР спектроскопии невозможно. Так, в ПМР-спектрах сигналы -СИ, -СНг, -и СНз протонов 2- и З-изомеров лежат очень близко друг к другу. К тому же, при использовании метода ПМР спектроскопии мы наблюдали сильное уширение сигналов в спектре вследствие наличия ассоциативных процессов в водных растворах ДДС-хитозана.

о=с, ,

I 2 3

СН-СН2-СООМа 2СН2

(рнг сн

сн

СаН«

2н5отег

СН2ОН

АСгО МеОН 1% АсОН

ЗСН-СОСЖа

сн2 сн

сн

З-вотег

г- СН2ОН

Рис.1. Схема синтеза ДЦС-хитозана.

Для подтверждения структуры ДЦС-хитозана использовали ИК-спектроскопию. Наряду с полосами поглощения, характерными для хитозана, в ИК-спектре ДЦС-хитозана присутствуют полосы 3200-3500 (О-Н и Ы-Н-колебания), 2870-2930 (С-Н колебания), 1664 (СЮ амид I), 1578 и 1410 (С02"), 1154 (С-О-С мостиковые колебания) и 1075 см"1 (С-0 колебания). ИК-спектр хитозана и ДЦС-хитозана, содержащего 30 мол.% додеценилсук-циноильных групп, представлен на рис.2. Отсутствие сигнала сложноэфирной связи в области 1720-1760 см"1 показывает, что имеет место исключительно Ы-замещение даже при использовании избытка ДДЯА.

Рис.2. ИК-спектр хитозана и ДДС-хитозана, содержащего 30 мол.% ДДС-групп.

Определение степени замещения и содержания ДДС-групп было проведено методами ПМР спектроскопии, титрования и микроанализа (С/Ы). В таблице 1 представлены результаты определения степени замещения, определенные методами титрования и микроанализа, синтезированных ДДС-хитозанов. Как хорошо видно, результаты, полученные этими методами, совпадают в пределах ошибки экспериментов. Необходимо отметить, что результаты титрования и микроанализа согласовывались и с данными ПМР - спектроскопии.

ДДЯА/ Титрование Микроанализ Растворимость

аминогруп Степень Степень в воде-

(моль/моль) замещения ±0.5 замещения (±1) (мг/мл)

(мол.%) мол.%

0,0 - - 0,03

0,1 5,8 6 1,12

0,2 9,1 8 0,95

0,3 12,7 12 0,8

0,5 15,9 16 0,22

0,7 20,1 20 0,09

1,0 25,1 26 0,03

1,2 31,1 30 -

Таблица 1. Содержание ДДС-групп и растворимость в воде ДДС-хитозана при рН 6,5.

Изучение растворимости полученных соединений показало, что ДДС-хитозаны обладают повышенной растворимостью в воде в сравнении с исходным хитозаном, и их растворимость зависит от степени замещения. Из этих данных становится очевидным, что наличие карбоксильных 1рупп несколько увеличивает растворимость гидрофобно- модифицированных хитозанов в воде и что это увеличение более заметно при низких степенях замещения.

3. Изучение реологических свойств растворов ДДС-хитозапа

Измерение вязкости проводили в слабо кислой среде при рН 4,5, т.е. в условиях, при которых растворимость ДЦС-хитозана не зависела от степени замещения. Как было показано, степень замещения и концентрация полимера сильно влияют на реологические свойства растворов ДЦС-хитозана.

™ 700

- 600 л

& 500£ 400 ш К

га у

о ф

га

300200 -I 100-

—I

Содержание ДДС-групп, мол.%

Рис.3. Влияние содержания ДЦС-групп на динамическую вязкость растворов ДЦС-хитозана в ацетатном буфере (рН 4,5). Концентрации: (а) 8х10"5 г/мл, (б) 16х10"5 г/мл.

На рис.3 показана зависимость динамической вязкости раствора ДЦС-хитозана от содержания ДДС-групп. Из рисунка видно, что динамическая вязкость возрастает с увеличением степени замещения и это особенно заметно в случае более концентрированного раствора (рис.Зб). В особенности этот эффект становится более значительным при степени замещения ~>10 мол.%, что указывает на наличие сильных внутримолекулярных взаимодействий в водных растворах макромолекул ДДС-хитозанов.

На рис.4 представлена зависимость динамической вязкости от концентрации раствора хкгозана и ДЦС-хитозаяа (14 мол.% ДДС-групп) в 1% уксусной кислоте. В то время как динамическая вязкость исходного хитозана увеличивалась вплоть до концентрации 10"3

г/мл (рис.4а), вязкость раствора сильно замещенного ДЦС-хитозана (14 мол.% ДЦС-групп) резко возрастала уже с концентрации 2х10'5 г/мл (рис.46), что, по-видимому, связано с процессами ассоциации, вызванными гидрофобными взаимодействиями додецениль-ных групп и ионными взаимодействиями основных протонированных аминогрупп хито-зана с карбоксильными группами ДЦС-фрагментов.

Рис.4. Зависимость динамической вязкости от концентрации для растворов в 1%-ой уксусной кислоте: (а) хитозана, и (б) ДЦС(14 мол.%)-хитозана.

Полученные результаты показьшают, что модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом позволяет получить растворимые в кислых и нейтральных водных средах амфифильные производные хитозана, склонные к ассоциации и образованию сильно вязких растворов.

4. Поверхностно активные и пснообразующие свойства ДДС-хитозана На рис.5 приведены изотермы поверхностного натяжения водного раствора хитозана и его ДДС-производных, показывающие, что незамещенный хитозан не проявляет поверхностно-активных свойств (рис.5а), а ДЦС-хитозан с 5% степенью замещения как в кислой, так и в нейтральной среде обладает большей поверхностной активностью (рис.5 г, б) по сравнению с ДЦС-хитозаном со степенью замещения 14 мол.% (рис.5 в). Конформация молекул ДЦС-хитозана в кислых водных средах при относительно низких степенях замещения (менее 10 мол.%) может рассматриваться как линейная из-за отталкивания между положительно заряженными аминогруппами. Одновременное взаимодействие гидрофобных додеценильных групп и ионные взаимодействия между противоположно заряженными аминогруппами полисахарида и ионизированными карбоксильными группами ДДС-фрагмента (при высоком содержании ДДС-компонента) могут приводить к внутримолеку-

1000-,

5 £ го

1 0,1-1-------1---1---■---1

СГ 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Концентрациях 103, г/мл

лярной ассоциации и, как следствие, к уменьшению поверхностной активности (рис. 5 в) и увеличению вязкости раствора ДЦС-хитозана (рис. 46).

* а

о. ш ш о С

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Концентрация х 102, г/мл

Рис.5. Зависимость поверхностного натяжения от концентрации полимера: (а) хитозан в ацетатном буфере рН 4,5; (б) ДДС-хитозан (ДЦС 5 мол.%) в воде; (в) ДДС-хитозан (ДДС 14 мол.%) в ацетатном буфере при рН 4,5; (г) ДДС-хитозан (ДЦС 5 мол.%) в ацетатном буфере при рН 4,5.

Пенообразующие свойства близкородственны поверхностной активности молекул, т.к. уменьшение поверхностного натяжения способствует ценообразованию. Способность раствора ДДС-хитозана к ценообразованию была охарактеризована изменением объема образуемой им пены и зависела от степени замещения. На рис.6 показана зависимость объема и стабильности пены от содержания ДДС-групп.

В то время как незамещенный хитозан имеет низкую пенообразующую способность, молекулы хитозана, содержащие небольшое количество жирноалифатических алкильных групп, обладают высокой поверхностной активностью и стабилизируют пену благодаря необратимой адсорбции на поверхности раздела фаз воздух-вода. Факторы, которые уменьшают эту адсорбцию - это ассоциация гидрофобномодифицированных макромолекул хитозана, внутри- и межмолекулярная агрегация.

0 5 10 15 20 25 30

Содержание ДДС-групп, мол.%

Рис.б. Влияние содержания ДДС-групп в хитозане на объем образуемой пены в ацетатном буфере при рН 4,5.

В нашем случае наибольшую пенообразующую способность показали ДДС-хитозаны со степенью замещения 5-7 мол.%. Дальнейшее увеличение степени замещения сопровождается уменьшением пенообразующей способности. В результате пенообразующая способность высокозамещенных ДДС-хитозанов (содержание ДДС-групп >25 мол.%) была даже ниже, чем у исходного хитозана. По-видимому, одновременное взаимодействие гидрофобных додеценильных групп и ионные взаимодействия между заряженными аминогруппами полисахарида и ионизированными карбоксильными группами ДЦС-фрагмента (при высоком содержании ДДС-компонента) могут приводить к внутримолекулярной ассоциации и, как следствие, к уменьшению поверхностной активности и полной потере молекулами ДДС-хитозана поверхностно-активных и пенообразующих свойств.

Методом динамического светорассеяния были исследованы агрегативные свойства № [2(3)-додец-2 -ен-1 '-ил) сукциноил]хитозана в водных растворах при 0,1% концентрации раствора ДДС-хитозана в зависимости от рН раствора.

Так, для раствора ДДС-хитозана с концентрацией 0,1% была определена зависимость размера образующихся частиц от рН раствора ДЦС-хитозана (рис.7). Как видно на рис.7, эта зависимость линейна на отрезке рН от 0,75 до 4,68.

I х:

о:

2202001801601401201008060-40-I

рН

Рис.7. Зависимость гидродинамического радиуса образующихся частиц ДДС-хитозана от рН раствора (Мта 4,6 кДа; индекс полидисперсности 1,6; степень ацетилирования 5 мол.%, содержание ДДС-групп 15 мол.%). При этом агрегационная устойчивость частиц данного образца при рН 6,0-6,5 оказалась достаточно высокой: размер частиц не изменялся в течение 3 суток.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что протонвроваяие аминогрупп хи-тозана способствует уменьшению склонности макромолекул ДДС-хитозана к агрегации и получению более мелких агрегатов.

5. Деполимеризация хитозана

Наряду с образцами высокомолекулярного (ВМ) хитозана нами был получен набор НМ-хитозанов. Для получения широкого по молекулярному весу спектра низкомолекулярных (НМ) хитозанов мы использовали кислотный метод деполимеризации ВМ-хитозана. Деполимеризацию ВМ-хитозана соляной кислотой проводили в 5% растворе хитозана в 1% уксусной кислоте/ 1М соляной кислоте при 50 °С. Этот процесс приводит к расщеплению гликозидных связей и образованию смеси молекул хитозана различного молекулярного веса в зависимости от времени проведения гидролиза. На рис.8 показано, что, меняя концентрацию соляной кислоты при постоянном времени реакции, можно успешно контролировать молекулярную массу получаемого НМ-хитозана.

Концентрация HCl, М

Рис.8. Зависимость молекулярного веса НМ-хитозана от концентрации соляной кислоты при гидролизе ВМ-хитозана (Mw 90 кДа, 20 мол.% ацетильных групп) в течение 5 ч при температуре 50°С.

Выходы гидрохлоридов соответствующих НМ-хитозанов составляли при этом 50-70%. После кислотного гидролиза молекулярные веса и полидисперсности полученых НМ-хитозанов были определены методом высокоэффективной гель-хроматографии. Химическое строение НМ-хитозанов было подтверждено ИК- и ПМР- методами.

Предлагаемая нами методика получения НМ-хитозана позволяет получать образцы хи-тозана практически любого молекулярного веса в интервале от 0,7 до 20 кДа, при этом индекс полидисперсности (М№/М„) полученных образцов находится в пределах 1,14-1,91.

б. «Кватернизация» хитозана и его амфифильных пронзводпых

Введение четвертичных аммониевых групп в молекулы хитозана обычно называют общим словом «кватернизация» хитозана, а сам продукт - «кватернизованным хитоза-ном». Далее мы будем пользоваться этими условными терминами, отдавая себе отчет в том, что кватернизацией в классическом смысле называют реакцию взаимодействия амина с галоидным алкилом, приводящую к образованию четвертичной аммониевой соли.

Для увеличения растворимости хитозана и его производных нами было изучено взаимодействие хитозана и его амфифильных производных с бетаином при действии конденсирующего агента 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина (ЭЭДХ). Реакцию проводили в водно-метанольной смеси при pH 5,0-5,5, т.е в среде, в которой растворим хитозан и ЭЭДХ. В этих условиях происходила конденсация бетаина исключительно с

амино-группами хитозана с образовшшем полностью растворимых во всей области рН «кватернизованных» производных хитозана (рис.9).

С9Н,9

Рис.9.Строение кватернизованного хитозана

В таблице 2 представлены результаты «кватернизации» хитозана и его производных, содержащих Сп алифатическую группу. Как видно , при мольном соотношении хитозан (по аминогруппам):бетаин=1:2 степень кватернизации увеличивалась с увеличением количества используемого ЭЭДХ и достигала максимума -60-65 мол.%, в то время как степень кватернизации ДЦС-хитозана определяется еще и содержанием заместителя. Увеличение содержания заместителя приводило к уменьшению степени кватернизации при прочих равных условиях синтеза.

Моле- Степень Содержа- Соотно- Степень Содержание Раствори-

куляр- ацети- ние ДЦС шение кватерни- К-этоксикар- мость в

ный лиро- групп, Ш2/ зации, бонильных воде при

вес, кДа вания, мол.% бетаин/ мол.% групп, рН 6,5

мол.% ЭЭДХ мол.%

90±5 20 - 1:2:1 10 5 гель

90±5 20 - 1:2:2 20 12 гель

92±5 20 - 1:2:4 45 20 гель

92±5 20 - 1:2:6 50 25 Р-

92±5 20 - 1:8:2 30 12 р./гель

4,7±0,1 5 - 1:2:2 44 20 Р-

4,7±0,1 5 - 1:2:4 60 30 Р-

4,7±0,1 5 12 1:2:2 25 36 Р-

4,7±0,1 5 6 1:2:2 36 42 Р'

93±5 20 6 1:2:2 20 22 гель

93±5 20 12 1:2:2 12 25 гель

Таблица 2. Состав и свойства производных хитозана: р.-растворяется в воде; гель-набухает в воде

Для подтверждения структуры кватернизованных хитозанов использовали метод ИК-спектроскопии (рис.10), кроме полос характерных для хитозана, ИК-спектр продукта показал присутствие характерной полосы при 1471 см'1, которая соотносится с С-Ы-. Более интенсивная полоса при 1692 см'1 относится к карбонильным группам уретанового фрагмента -КН-С(=0)(да.

Рис. 10. ИК спектр кватернизованного НМ-хитозана

Чтобы химически подтвердить присутствие карбамоильных групп в хитозане после реакции хитозана (СЬШН2) с ЭЭДХ полученный продукт (рис.116) был подвергнут ряду последовательных химических превращений:

СЫйШ2^СЫШНС(=0)0ЕЬ+ СЬпХНС(=0)0^та-^СЬкКНС00Н—»СЫ<ЫН2.

Функциональный состав промежуточных продуктов и идентичность выделенного на конечной стадии хитозана исходному была подтвеждена методами ИК- и ПМР- спектроскопии.

_в _х/~

4000 ЗООО 2000 юоо

Волновое число (см-1)

Рис.11. ИК- спектры: а) СИШНг'НС!, б) СЫ1ШС(=0)0Ег, в) СЫ1ШС(=0)(Жа, г) СЫ1ЫН2'НС1

Так, ПМР- спектр кватернизованного хитозана содержит два специфических сигнала: триплет при 1,05 мд и мультиплет при 3,94 мд, которые соответствуют метальным и ме-тиленовьм протонам М-этоксикарбонильного остатка.

В результате была экспериментально подтверждена возможность образования урета-нов при использовании ЭЭДХ. Насколько нам известно, образование (этоксикарбонил)хитозана представляет собой первое свидетельство того, что ЭЭДХ может непосредственно реагировать с амином. По нашему мнению, такую реакцию следует принимать во внимание в тех случаях, когда ЭЭДХ предполагается использовать для модификации слабоосновных аминов, включая глюкозамин-содержащие олигосахариды, и гликопротеины, а также получения аффинных сорбентов на их основе, по крайней мере, в слабокислых водных растворах.

Таким образом, взаимодействие хитозана с бетаином в присутствии ЭЭДХ может приводить не только к получению продукта конденсации аминогрупп хитозана с бетаином с образованием М-бетаиноильных производных, т.е. к кватернизации хитозана, но и к образованию ]\т-этоксикарбонильных производных хитозана. Количественное соотношение между этими продуктами зависит от количества ЭЭДХ, вводимого в реакцию. Увеличение количества ЭЭДХ с 1 до б мольных эквивалентов приводит к увеличению степени кватернизации (содержания бетаиноильных групп) хитозана с 10 до 50 мол.%. При этом также возрастает количество образующихся К-этоксикарбонильных групп с 5 до 20 мол.%. При

степени кватернизации 50 мол.% и выше все производные были легко растворимы в воде при всех значениях рН, т.е. в нейтральной, кислой и щелочных средах.

7. Биологическая активность хитозапа н ДДС-хитозана

В нашем исследовании бактерицидная активность низкомолекулярного хитозана и трех его ДЦС-производных была определена по отношению к ряду грамположительных и грамотрицательных бактерий, низшим грибам и дрожжеподобным грибам Candida kruisei. Результаты определения биологической активности НМ-хитозанов, содержащих ДЦС-группы, по отношению к некоторым бактериям и С. kruisei, представленные в таблице 3 .

По сравнению с контрольным экспериментом количество выживших клеток С. kruisei уменьшилось на пять порядков. В случае Ent. Agglomérons - на четыре порядка, а В. sub-tilis - на два порядка. Активность, ДЦС-НМХ против дрожжей C.kruisei в значительной мере зависела от содержания ДЦС-групп и была максимальной при степени замещения -3-6 мол.% (рис.12).

Микроорганизм Процент погибших клеток по отношению к исходному количеству

НМ-хито-зан ЦЦС(3%)-НМ-хито- зан ДДС(9%)-НМ-хито-зал ЦДС(16%)-НМ-хитозан

E.coli Грам(-) 91,6% 89,5% 75,0% 76,8%

P.aureofaciens Грам(-) 90,4% 86,5% 96,0% 92,0%

B.subtilis Грам(+) 64,6% 99,9% 96,0% 98,0%

Ent. agglomérons Грам(-) 99,99% 99,996% 99,997% 99,995%

С. kruisei 99,999% 99,998% 99,999% 99,9998%

Таблица 3. Биологическая активность НМ-хитозанов (М^ 4,6 кДа), содержащих ДДС-группы, по отношению к ряду бактерий и дрожжеподобным грибам С. кгиЬе1. Концентрация НМ-хитозана и ДДС-НМ-хитозана: 1% вес. (10 мг/мл).

80-

Е 20-

о с

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Содержание ДДС-групп, мол.%

Рис.12. Активность ДДС-хитозана (Mw 4,6 кДа) по отношению к клеткам дрожжепо-добного гриба С. Kruisei в зависимости от содержания ДДС-групп. Концентрация ДДС-хитозана: 0,1% (1мг/мл).

Кроме того были проведены сравнения фунгистатической активности НМ-хитозанов методом радиального роста колоний грибов. Сначала были проведены испытания одного образца НМ-хитозана (Mw 4,7 кДа) по отношению к таким фитопатогенным грибам, как Pénicillium vermoessenii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Py-thium ultimum, Trichoderma harzianum, Helmintosporum gramineum, Espacie aspergillus, Botrytis cinerea, Gaeumannomyces graminis (рис.13). В качестве контроля использовали агаровую среду без добавок НМ-хитозана. После того, как колония гриба достигала края чашек Петри (0 90мм), ее исключали из эксперимента. Как видно, наблюдается эффект ингиби-рования роста грибов, особенпо заметный на более поздних стадиях. В зависимости от вида гриба ингибирование достигало 30-99% по сравнению с соответствующим контролем. Однако НМ-хитозан с молекулярным весом 4,7 кДа оказался малоэффективным по отношению к G.graminis и практически не подавлял рост T.harzianum. Данные результаты показывают, что возможно одновременное применение НМ-хитозана в качестве фунгиста-тика и T.harzianum, используемого в сельском хозяйстве в качестве антогониста фитопа-тогенных грибов. Одними из наиболее восприимчивых к действию хитозана фитопатоген-ных грибов оказались P. vermoesenii и R. solani. P.vermoesenii - это широко распространенный в тропическом и субтропическом климате низший гриб, который вызывает угнетение и/или гибель пальмовых деревьев. Фунгистатическая активность хитозана, имеющего молекулярный вес от 1,2 кДа до 90,0 кДа, по отношению к Р. vermoesenii была опреде-

лена путем измерения диаметра роста колоний в присутствии хитозана при ставнении с контролем (рис.14).

90 4

80 4

701

60-

ci 50-

ь 40-

(1)

го 30-

CL 20-

10-

1 2 3 4 5

5дней 1Одней 15дней

9 1011121314151617181920

Образец

Рис.13. Рост грибов в присутствии 0.1% (вес/об) хитозана (Mw 4,7 кДа) через 5, 10 и 15 дней после инокуляции.

1 -R. solani - контроль; 2- R.solani; 3-V.dahliae - контроль; 4- V.dahliae; S-F.oxysporum -контроль; б - F.oxysporum; 1 - P.ultimum-контропь; 8 - Р. ultimum; 9 - G.graminis - контроль; 10 - G. graminis; 11 - T.harzianum-v.0нтродь; 12 - T.harzianum; 13 - H.gramineum-Kompom,; 14 - H.gramineum-, 15 - E.aspergillus-коктроль; 16 - E.aspergillus; 17 - B.cinerea-контроль; 18 -В.cinerea; 19 - P.vermaessenii-коктроль; 20 - Р. vermoesenii.

5дней 1Одней 15дней

123456789 1011 12 13 14 15 16

Образец

Рис.14. Фунгистатическая активность хитозана различного молекулярного веса (концентрация: 0,1%) по отношению к P.vermoesenii через 5,10 и 15 дней после инокуляции.

1-контроль; 2-глюкозамин; далее хитозан с Mw: 3 -1,2; 4 -1,3; 5 -1,5; 6 -1,7; 7 -2,8; 8 -4,1; 9 -5,1; 10 -7,5; 11 -9,9; 12 -15,0; 13 -24,2; 14 -29,2; 15 -40,5; 16 -90,0 кДа.

Как видно, что на 5-й день измерений рост колонии P.vermoesenii незначительно подавляется глюкозамином и сильно подавляется всеми тестируемыми хитозанами. Через 7 дней после инокуляции Р. vermoesenii колония гриба в контрольной среде (без внесения образцов хитозана) достигла края чашек Петри и после этого была исключена из дальнейшего эксперимента. Как показано, хитозан ингибирует рост колонии гриба, и ингиби-торный эффект зависит от молекулярного веса хитозана. Так, образцы хитозана 3-7 (Mw 1,2-2,8 кДа) незначительно, а образец 8 (Mw 4,1 кДа) в несколько большей степени, подавляют рост колоний гриба, тогда как в случае использования образцов 9-11 (Mw 5,2-9,9 кДа) практически не наблюдается рост гриба. Дальнейшее увеличение молекулярного веса хитозана вплоть до 90 кДа (образцы 12-16) ведет к увеличению роста колоний гриба. Даже по истечении 15 суток 0,1 % растворы образцов 9-11 (Mw 5,1-9,9 кДа) полностью подавляли рост гриба.

Таким образом, была установлена эффективность хитозана с Mw 4-10 кДа, имеющих низкую полидисперсноть, по отношению к Р. vermoesenii.

Выводы

1. Показано, что перспективным источником для получения хитина является гладиус кальмара.

2. Разработана методика получения амфифильных производных хитозана, содержащих додеценильные и карбоксильные группы и обладающих повышенной растворимостью, и изучены их основные физико-химические свойства;

3. Разработана методика кислотного гидролиза хитозана и получен ряд низкомолекулярных хитозанов с Mw 0.7^20 кДа, а также низкомолекулярные производные хитозана, содержащие М-(додеценил)сукциноильные группы, с низкой полидисперсностью 1,2-1,9 и выходом 50-70 %;

4. Взаимодействием хитозана и его амфифильных производных, содержащих додеценильные группы, с бетаином при действии 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина разработана новая методика кватернизации этих соединений, что позволяет использовать их при физиологических значениях pH;

5. Впервые показана возможность взаимодействия конденсирующего агента 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина с аминогруппами хитозана, приводящего к

образованию N-этоксикарбонилхитозана;

б. Изучена фунгицидная и бактерицидная активость низкомолекулярных хитозанов и их додеценилсукциноильных производных по отношению к ряду фитопатогенных грибов, к дрожжеподобным грибам C.krusei и ряду Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий. Показано, что максимальной активностью обладают амфи-фильные производные хитозана, содержащие 5-^9 мол.% додеценильных групп. При сравнении активности ряда пизкомолекулярных хитозанов по отношению к Pénicillium vermoesenii было продемонстрировано, что наибольшей активностью обладают хито-заны с молекулярной массой от 4 до 10 кДа.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tikhonov V. Е., Stepnova Е.А., Babak V. G, Yamskov I. A, Palma.-Guerrero J., Jansson H.-B, Lopez-Llorca L.V., Salinas J., Gerasimenko D. V., Avdienko I. D., Var-lamov V. P. Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-/2(3)-(dodec-2-enyl)succinoyl/-derivatives // Carbohydrate Polymers.- 2006.-V64.-P. 66-72.

2. Stepnova E. A., Tikhonov V. E., Babushkina T. A., Klemenkova Z..S., Yamskov I. A. Unexpected reaction of chitosan with 2-ethoxycarbonyl-l,2-dihydroqunoline // Mendeleev Communication.- 2006.-V16, №5.-P. 271-273.

3. Степнова E.A., Тихонов B.E., Бабак В.Г., Краюхина М.А., Бабиевский К.К., Ямсков И.А. Биологически активные амфифильные производные хитозана // Химические волокна.- 2006.-Т. 5.-С. 57-59.

4. Степнова Е.А., Тихонов В.Е., Лопатин С.А., Ямсков И.А., Варламов В. П. Особенности получения низкомолекулярного хитозана и его антимикробная активность // Материалы VI съезда биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря 2006,- С. 252-253.

5. Степнова Е.А., Тихонов В.Е., Бабак В.Г., Ямсков И.А. Кватернизация хитозана и его амфифильных производных // Материалы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», 2006 (Казань).-С. 57-61.

6. Stepnova Е. A., Tikhonov V. Е., Babushkina T. A., Vorontsov E. V., Babak V. G., Lopatin S. A., Yamskov I. A. New approach to the quaternization of chitosan and its amphophilic derivatives H European Polymer Journal- 2007.- V.43.-P. 2414-2421.

7. Степнова Е.А., Тихонов В.Е., Лопатин С.А., Варламов В.П.., Ямсков Независимость фунгицидяой активности хитозана от его молекулярного веса // Вестник Московского Университета-2007.- Химия.- Т. 5, Серия 2.- С. 314-316.

8. Tikhonov V. Е., Stepnova Е. A., Babak V. G., Krayukhina М.А., Berezin В. В., Yamskov I. A. Ampliiphylic N-/2(3)-dodec-2-enylsuccinoyl/chitosan: synthesis and properties // React.&Fmc. Polym.- 2008.- V.68.-P.436-445.

9. Степнова E.A., Тихонов B.E., Благодатских И.В., Бабак В.Г., Ямсков И.А. Наночастицы гидрофобно модифицированного кватернизованного хитозана 1! Материалы Девятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», 2008 (Ставрополь).- С. 106-107.

Заказ №585. Объем 1 и.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Введение диссертация по химии, на тему "Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность"

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1.1 Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства и применение.10

1.1.1. Строение и физико-химические свойства.10

1.1.2. Области применения хитозана.13

1.1.2.1. Применение хитозана и его производных в медицине.13

1.1.2.2. Доставка лекарственных средств.15

1.1.2.3. Применение хитозана в косметике.15

1.1.2.4. Применение хитозана в пищевой промышленности.16

1.1.2.5. Очистка сточных вод.16

1.2. Получение хитина и хитозана из различных источников .16

1.2.1. Выделение хитозана из ракообразных и моллюсков.18

1.2.2. Получение хитина и хитозана из грибов.21

1.2.3. Получение хитина и хитозана из других источников. 23

1.3. Способы деполимеризации хитозана.23

1.3.1. Химические способы деполимеризации.23

1.3.1.1 Кислотный гидролиз.23

1.3.1.2. Окислительная деполимеризация.25

1.3.1.2.1. Перекись водорода.25

1.3.1.2.2. Азотистая кислота.27

1.3.2. Ферментативные способы деполимеризации хитозана .28

1.4. Активность хитозана и его производных.29

1.4.1. Антибактериальная активность.30

1.4.2. Фунгицидная активность хитозана и его производных. 33

1.4.3. Противовирусная активность хитозана.36

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.38

2.1. Материалы и методы.38

2.1.1. Исходные материалы.38

2.1.2. Определение молекулярной массы.38

2.1.3. Культуры для противомикробных тестов.39

2.1 АОпределение фунгицидной активности.39

2.1.5. Прорастание конидий F. oxysporum.40

2.1.6. Измерение поверхностного натяжения растворов.40

2.1.7. Динамическое рассеяние света.40

2.1.8. Определение пенообразующей способности растворов.41

2.1.9. Измерение вязкости растворов.42

2.1.10. Спектрофотометрические измерения.42

2.2. Выделение хитина и получение хитозана.43

2.3. Получение М-[2(3)-(додец-2,-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.43

2.4. Получение Щ2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил)сукциноил] хитина .44

2.5. Титрование N-[2(3)-( додец-2'-ен-Г-ил)сукциноил]хитина .44

2.6. Кватернизация хитозана. .44

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.46

3.1. Выделение хитина из различных источников и получение хитозана.46

3.1.1. Измельчение.47

3.1.2. Депротеинизация.48

3.1.3. Деминерализация.49

3.1.4. Обесцвечивание.53

3.1.5. Деацетилирование.54

3.2. Синтез гидрофобномодифицированных хитозанов и изучение их свойств.59

3.2.1. Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом.59

3.2.2. Анализ полученных соединений.61

3.2.3. Изучение реологических свойств растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.66

3.2.4. Поверхностно-активные свойства растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана.69

3.2.5. Изучение пенообразующих свойств №[2(3)-(додец-2'-ен-l'-ил) сукциноил] хитозана в водных растворах.70

3.2.6. Изучение ассоциации №[2(3)-додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил]хитозана в водных растворах.73

3.3. Деполимеризация хитозана и К-[2(3)-(додец-2,-ен-1,-ил) сукциноил] хитозана.74

3.4. Кватернизация хитозана, олигохитозана и ^[2(3)-(додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.79

3.4.1. История проблемы.79

3.4.2. Метод смешанных ангидридов.84

3.4.3. Карбодиимидный метод.85

3.4.4. Использование 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в методе смешанных ангидридов.86

3.4.5. Получение и изучение строения кватернизованных хитозанов.88

3.4.5.1. Кватернизацш хитозана.88

3.4.5.2. Кватернизация Н-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил]хитозана .95

3.5. Биологическая активность хитозана и ]Ч-[2(3)-додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил]хитозана.102

3.5.1. Описание тестируемых микроорганизмов.104

3.5.2. Результаты определения микробиологической активности.108

3.5.2.1. Фунгистатическая активность низкомолекулярного хитозана .108

3.5.2.2. Фунгицидная и антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана и его производных.119

3.5.2.3. Бактерицидная активность низкомолекулярного хитозана и его Ы-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] производного.122

4. ВЫВОДЫ.126

5. ЛИТЕРАТУРА.128

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Хитозан - нетоксичный, биодеградируемый полимер. Несмотря на то, что хитозан привлекает внимание ученых уже сравнительно давно, свойства этого уникального полимера до конца не изучены.

В ряде областей применение хитозана ограничено из-за его высокого молекулярного веса и, как следствие, низкой растворимости в воде и разбавленных кислотах, а также высокой вязкости растворов даже при низких концентрациях хитозана. Медицинское применение нашли хитозаны низкого молекулярного веса с высокой растворимостью и низкой вязкостью водных растворов при физиологических значениях рН. Микробиологическая активность хитозана была определена в отношении ряда микроорганизмов. Однако эти исследования показали, что биологическая активность хитозана сложным образом зависит от его молекулярного веса и степени ацетилиро-вания. Указанные факторы влияют не только на растворимость хитозана, но и на взаимодействие макромолекул хитозана с клеточной стенкой микроорганизмов. Амфифильные производные хитозана, которые находят применение в качестве загустителей, поверхностно-активных веществ и пенообразователей обладают пониженной растворимостью по сравнению с самим хитозаном. В связи с этим получение новых производных хитозана, обладающих повышенной растворимостью и биологической активностью, является актуальной научной и практической задачей.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение амфи-фильных производных высоко- (ВМ) и низкомолекулярного (НМ) хитозана, изучение их физико-химических и биологических свойств в сравнении с немодифицированным хитозаном. Для достижения данной цели нами были определены основные задачи:

2. согласно выбранным параметрам осуществить переработку биоотходов, содержащих хитин;

3. разработать методику получения амфифильных производных хитоза-на, обладающих повышенной растворимостью, и изучить их основные физико-химические свойства;

6. исследовать активность полученных соединений против ряда бактерий, дрожжей и грибов.

Научная новизна работы

1. Разработана оригинальная технология получения амфифильно-го производного хитозана - 1\Г-[2(3)-(додец-2-ен-1-ил)сукциноил]хитозана, обладающего повышенной растворимостью, и изучены его физико-химические свойства;

2. Предложен новый метод кватернизации хитозана и его амфифильных производных с использованием 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в качестве конденсирующего агента, который позволяет вводить бетаиноильные группы селективно по аминогруппам хитозана и получать производные хитозана растворимые при физиологических значениях рН;

Практическая значимость работы

3. Получены амфифильные и кватернизованные производные хитозана, которые могут быть использованы в качестве носителей биологически активных веществ. Гидрофобные лекарственные средства могут быть солюбилизированы внутри агрегатов таких частиц, а противоположно заряженные (анионные) полиэлектролиты, такие как ДНК, могут образовывать комплексы с такими производными при физиологических значениях рН;

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Восьмой и Девятой Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Казань, 14-16 июня 2006 и Ставрополь, 13-17 октября 2008, VI съезде биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря 2006, Молодежной конференции "Молекулярный дизайн и синтез веществ с заданной физиологической активностью", 15 ноября 2006, МГУ; на молодежном конкурсе ИНЭОС РАН 2006. Работа была удостоена 1 премии имени академика П.П. Шорыгина на ежегодном конкурсе работ молодых ученых в области хитина и хитозана Российского хитинового общества в 2007 году.

Личный вклад соискателя.

Экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Определение молекулярных масс и антибактериальной активности хитоза-нов проводили совместно с лабораторией инженерии ферментов проф. Варламова В.П. (Центр Биоинженерии РАН). Выделение хитозана из креветки южноатлантической (Cragnon cragnon), кальмара (Loligo vulgaris), каракатицы (Sepia officinalis), моллюсков (Mytilus galloprovincialis и Cerastroderma edule) проводили на базе Лаборатории патологии растений (Департамент морских наук и прикладной биологии, Университет г. Аликанте, Испания). Определение размера частиц кватернизованных хитозанов проводили на базе Лаборатории фармацевтического факультета института Луи Пастера, г. Страсбург, Франция.

Объем и структура работы

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

4. ВЫВОДЫ

1. Показано, что перспективным источником для получения хитина является гладиус кальмара.

3. Разработана методика кислотного гидролиза хитозана и получен ряд низкомолекулярных хитозанов с Mw 0.7—20 кДа, а также низкомолекулярные производные хитозана, содержащие N-(додеценил)сукциноильные группы, с низкой полидисперсностью 1,2-1,9 и выходом 50-70 %;

5. Впервые показана возможность взаимодействия конденсирующего агента 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина с аминогруппами хитозана, приводящего к образованию N-этоксикарбонилхитозана;

6. Изучена фунгицидная и бактерицидная активость низкомолекулярных хитозанов и их додеценилсукциноильных производных по отношению к ряду фитопатогенных грибов, к дрожжеподобным грибам C.krusei и ряду Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий. Показано, что максимальной активностью обладают амфифильные производные хитозана, содержащие 5-9 мол.% додеценильных групп. При сравнении активности ряда низкомолекулярных хитозанов по отношению к

Penicillium vermoesenii было продемонстрировано, что наибольшей активностью обладают хитозаны с молекулярной массой от 4 до 10 кДа.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Степнова, Евгения Александровна, Москва

1. Larry L.H. Biomaterials: a forecast for the future // Biomaterials. - 1998.-V.19.-P. 1419.

2. Cauchie H-M.Chitin production by arthropods in hydrosphere // Hydrobiolo-gia.- 2002.-V. 470. P. 63.

3. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.-2002.-С. 112-118.

4. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi М., Alagui A., Vincendon М., Vottero P., On the influence of deacetylation process on the phycochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41, №7.- C. 2463.

5. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori) pupa exuvia// Int. J. Biological Macromolecules.- 2000.-V.-27, №1.- P. 99.

6. Феофилова Е.П. //Клеточная стенка грибов-М.; Наука.- 1983.-С. 248.

7. Нудьга JI.A. Производные хитина и хитозана и их свойства // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.-С. 141-177.

8. Тихонов B.E. Определение терминов в области хитина и хитозана // Материалы Девятой Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана Ставрополь, 13-17 октября, 2008.-, С. 42-48.

9. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli С., Terbojevich М. Chitin chemistry upgrading renewable resource // Carbohydrates in Europe.- 1997.- V.I.- C. 10.

10. Baxter A., Dillon M., Taylor K.D.A., Roberts G.A.F. Improved method for IR determination of the degree of N-acetylation of chitosan // Int. J. Biol. Mac-romol.- 1992.-V.14.-P. 166.

11. Maghami G.A., Roberts G.A.F. Studies on the adsorption of anionic dyes on chitosan // Macromol. Chem. 1988.- V. 189.- P 2239.

12. Domard A. Circular dichroism study on Nacetylglucosamine oligomers // Int. J. Biol. Macromol.- 1986.- V.8.- P. 243.

13. Domard A. pH and c.d. measurements on a fully deacetylated chitosan: application to Cun-polymer interactions // Int. J. Biol. Macromol.- 1987.- V.9.-P. 98.

14. Wei Y.C., Hudson S.M. Binding of sodium dodecyl sulfate to a polyelectro-lyte based chitosan // Macromolecules.- 1993.- V.26.- P. 4151.

15. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Ogawa R., Tokura S. Distribution of the acetamido group in partially deacetylated chitins // Carbohydr. Polym.-1991.-V.16.-P.291.

16. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Tokura S. N-Acetyl group distribution in partially deacetylated chitins prepared under homogeneous conditions // Carbohydr. Res.- 1993.- V. 242.- P. 167.

17. Raymond L., Morin F.G., Marchessault R.H. Degree of deacetylation of chitosan using conductometric titration and solid-state NMR // Carbohydr. Res.-. 1993.- V.243.- P. 331.

18. Niola F., Basora N., Chornet E., Vidal P.F. A rapid method for the determination of the degree of N-acetylation of chitin-chitosan sample by acid hydrolysis and HPLC // J. Therm. Anal.- 1983.- V.28.- P. 189.

19. Majeti N.V., Kumar R. A rewiew of chitin and chitosan applications // Re-act.&Funct. Polym.- 2000.- V. 46.- P. 1.

20. Kumar А. В. V., Tharanathan R. N., A comparative study on depolymeriza-tion of chitosan by proteolyc enzymes // Carbohydrate polymers.- 2004.-V. 58, №3.-P. 275.

21. Pangburn S.H., Trescony P.V., Heller J. Lysozyme degradation of partially deacetylated chitin, its films and hydrogels // Biomaterials.- 1982.-V. 3, № 2.- P. 105.

22. Ильина A.B., Варламов В.П. Полиэлектролитные комплексы хитозана обзор //Прикладная биохимия и микробиологияю.- 2005.- 41 № 1.- С. 5.

23. Biangini G., Bertani A., Muzzarelli R., Damadei A., DiBenedetto G., Belligolli A., Riccotti R., Zucchini C., Rizzoli C. Wound management with N-carboxybutyl chitosan // Biomaterials.- 1991.- V.72, № 3.- P. 281.

24. Ilium L., Gill J., Hinchcliffe M., Fisher A.N., Davis S.S. Chitosan as novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev.- 2001.- V. 51.-P. 81.

25. Thanou M., Florea B.I., Geldof M., Junginger H.E., Borchard G. Quater-nized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials.- 2002.- V. 23, P. 153.

26. Kim Y.H., Gihm S.H., Park C. R. Structural characteristics of size-controlled self-aggregates of deoxycholic acid-modified chitosan and their application as a DNA delivery carrier // Bioconjugate Chem.- 2001.- V. 12.-P. 932.

27. Knorr D. Recovery and utilization of chitin and chitosan in food processing waste management // Food Technol.-1991.-Jan.- P. 114.

28. Nair K.G.R., Madhavan P. Chitosan for removal of mercury from water // Fishery Tech.- 1984.- V. 21.- P. 109.

29. Percot A., Vilton C. & Domard A. Optimiation of chitin extraction from shrimp shells // Biomacromolecules.- 2003.- V. 4.- P. 12.

30. Aye K.N.& Stevens W.F. Improved chitin production by pretreatment of shrimp shells // Journal of Chemical Technology and Biotechnology.- 2004.-V.79.- P. 421.

31. Kurita K., Tada Т., Ishii S., Nishimura S-I.& Shimoda K. Squid chitin as potential alternative chitin source: deacetylation behavior and characteristic properties // Journal of Polymer science Part A: Polymer chemistry.- 1993.- V. 31.- P. 485.

32. Zentz F., Bedouet L., Almeida M. J., Milet C., Lopez E. & Giraud M. Characterization and quantification of chitosan extracted from nacre of the abalone Haliotis tuberculata and the oyster Pinctada maxima // Marine Biotechnology.-2001.- V.3.- P. 36.

33. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 44-63.

34. Zaworska М. & Konieczna Е. The influence of supplemental components in nutrient medium on chitosan formation by the fungus Absidia orchidi // Applied Microbiology and Biotechnology.- 2001.- V. 56.- P. 220.

35. Andrade V. S., Neto B.B., Souza W. & Campos-Takaki G. M. A factorial design analisis of chitin production by Cunninghamella elegans // Canadian Journal of Microbiology.- 2000.-V. 46.- P. 1042.

36. Nadarajah К., Kader J., Mazmira M. & Paul D. C. Production of chitosan by fungi // Pakistan Journal of Biological Sciences.- 2001.- V. 4, № 3.- P. 263.

37. Da Silva-Amorim R.V., Souza W., Fukushima K. & Campos-Takaki G. M. Faster chitosan production by Mucoralean strains in submerged culture // Brazilian Journal of Microbiology.- 2001.- V. 32.- P. 20.

38. Hu K-J., Hu J-L., Ho K-P. & Yeung K-W. Screening of fungi for chitosan producers and copper adsorption capacity of fungal chitosan and chitosanaceous materials // Carbohydrate Polymers.- 2004.- V. 58.- P. 45.

39. Synowiecki J.& Al-Khateeb N.A.Q. Mycelia of Mucor rouxii as a source of chitin and chitosan // Food Chemistry.- 1997.- V. 60, № 4.- P. 605.

40. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лари-ков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора пчел- новый продукт пчел // Пчеловодство.- 2001.- V. 5.- С. 50.

41. Феофилова Е. П. Ключевая роль хитина в образовании клеточной стенки грибов // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 91-99.

42. Varum К.М., Ottoy М.Н., Smidsrod О. Acid hydrolysis of chitosan // Carbhyd. Polymers.- 2001.- V. 46.- P. 89.

43. Nagasawa K., Tohira Y., Tanoura N. Reaction between carbohydrates and sulfuric acids // Carbohydr. Res.- 1971.-V. 18.- P. 95.

44. Hasegawa M., Isogai A., Onabe F. Preparation of low-molecular-weight chitosan using phosphoric acid // Carbohydr. Polym.- 1993.- V. 20.- P. 279.

45. Qin C.Q., Du Y.M., Xiao L. Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan // Polymer Degradation and Stability.-2002.- V. 76.- P. 211.

46. Liang K., Chang В., Tai M.-C. and Cheng F.-H. Kinetics and Products of the Degradation of Chitosan by Hydrogen // J.Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.-P. 4845.

47. Tian F., Liu Y., Ни K., Zhao В. Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide // Carbohydrate Polymers.- 2004,- V. 57.- P. 31.

48. Муллагалиев И.Р., Кабальнова H.H., Галиаскарова Г.Г., Покало Е.И., Шерешовец В.В., Монаков Ю.Б. Окислительная деструкция хитозана при озонировании // Журнал прикладной химии.- 1997.- Т. 70, №10.- С. 1709.

49. Tommeraas К., Varum К. М., Christensen В. Е., Smidsrod О. Preperation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisa-tion of chitosans // Carbohydr. Research.- 2001.- V. 333,- P. 137.

50. Allan G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan I: kinetics of depolymerization by nitrous acid // Carbohydr. Research. 1995.- V. 277.- P. 257.

51. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V. 30, №11.- P. 627.

52. Zang H., Neau S.H. In vitro degradation of chitosan by commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation // Biomate-rials.- 2001.- V. 22.-P. 1653.

53. Zang H., Du Y., Hu Y., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligo-saccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohyd. Res.- 1999.- V. 320.-P. 257.

54. Kumar A.B., Varadaraj R.G., Lalitha R.G., Yharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with aid of papain and characterization // Bio-chim. Biophy. A.- 2004.- V. 1670.- P. 137.

55. Muzarelli R.A.A., Wenshui X., Tomasetti M., Ilari P. Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation //Enz. Microb. Technol.- 1995.- V. 17, № 6.- P. 541.

56. Kittur F., Kumar A.B., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Chitosanolysis by pectinase isozyme of Aspergillus niger- a non-specific activity // Carbohydr. Po-lym.- 2003.-V. 53.-P. 191.

57. Ragnhild J., Kjell N, Varum M.& Smidsrod O. Degradation of fully water-soluble, partially N-acetylated chitosans with lysozyme // Carbohydr. Polymers.-1994.- V. 23.- P. 253.

58. Varum K.M., Holme H.K., Izume ml, Stokke B.T.& Smidsrod O. Determination of enzymatic hydrolysis specifity of partially N-acetylated chitosans // Biochemica et Biophysica Acta.- 1996.- V., 1291.- P. 5.

59. Давыдова B.H., Ермак И.М., Гобарча В.И. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексоооб-разования // Биохимия.- 2000.- V. 65.- Р. 1278.

60. Vaara М. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Revs.- 1992.- V. 56, №3.- P. 395.

61. Wang G.H. Inhibition and inactivation of five species of foodborne pathogens by chitosan // J. Food Prot.- 1992.- V. 55.- P. 916.

62. Yalpani M., Johnson F., Robinson L.E. Antimicrobial activity of some chitosan derivatives // In: Brine С J., Sandford P.A., Zikakis J.P. (Eds.), Advances in Chitin and Chitosan.- 1992.- Elsever, London, P. 543-548.

63. Tsai G.J., Su W.H. Antimicrobial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli // J. Food Prot.- 1999.- V. 62.- P. 239.

64. No K.H., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // International J of Food Microbiology.- 2002.- V. 74.- P. 65.

65. Jeon Y.J., Park P.J., Kim S.K. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor // Carbohydr. Polym.- 2001.- V. 44.- P. 71.

66. Jung B.-O., Kim C.-H., Choi K.-S., Lee Y. M., Kim J.-J. Preparation of am-phiphilic and their antimicrobial activities // Applied Polymer Science.- V. 72, № 3.-P. 1713.

67. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydrate Research.- 2001.- V. 333.- P. 1.

68. Ignatova M., Starbova K., Markova N., Malonova N., Rashkov I. Elec-trospun nano-fibre mats with antibacterial properties from quaternised chitosan and poly(vinylalcohol) // Carbohydrate Research.- 2006.- V. 341.-P. 2098.

69. Benhamou N. Elicitor-induced plant defence pathways // Trends Plant Sci.-1996.- V.I.- P. 233.

70. Cheah L.H., Page B.B.C., Sheperd R. Chitosan coating for inhibition of sclerotina carrots //N. Z. J. Crop Hort. Sci.- 1997.- V. 25. P. 89.

71. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci.- 2001.- V. 79.-P. 1324.

72. Stossel P., Leuba J. A. Effect of chitosan, chitin and some amminosugars on growth of various soilborne phytopathogenic fungi // Physiopathology.- 1984.- V. Ill, № 1.- P. 82.

73. Cuero R.G., Osuji G., Washington A, N-carboxymethylchitosan inhibition of aflatoxin production: role of zinc // Biotechnol. Lett.- 1991.- V. 13, № 6.- P. 441.

74. Laflamme P., Benhamou N., Bussieres G., Dessureault M. Differential effect of chitosan on root rot fungal pathogens in forest nurseries // Can J. Bot. 1999.-V. 77.- P. 1460.

75. El Ghaouth A., Pannampalam R., Castaigne F., Arul J. Chitosan Coating to Extend the Storage Life of Tomatoes // J. Hortscience.- 1992.- V. 27.- P. 1016.

76. Reddy В., Arul J., Angers P., Couture L. Chitosan Treatment of Wheat Seeds Induces Resistance to Fusarium graminearum and Improves Seed Quality // J. Agric. Food Chem.- 1999.- V. 47, № 3,- P. 1208.

77. Freepons D. // In Application of Chitin and Chitosan; Goosen M.F.A., Ed.; Technomic.- 1997.- Basel, Swizerland.- P. 129.

78. Guo Z., Chen R., Xing R., Liu S., Wang P., Li C., Li P. Novel derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro // Carbohydrate Research.- 2006.-V. 341.- P. 351.

79. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F., Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica // Biomacromolecules.- 2001,- V. 2.- P. 165.

80. Чирков C.H. Противовирусные свойства хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 327-338.

81. Pospieszny Н., Chirkov S., Atabekov J. Induction of antiviral resistance in plant by chitosan // Plant. Sci.-1991- V. 79.- P. 64.

82. Сургучова Н.А., Варитсев Ю.А., Чирков Н.А. Хитозан ингибитор системных вирусных инфекций картофеля и томатов // Журнал Российского фитопатологического обществаю- 2000.- Т. 1.- Р. 59.

83. Pospieszny Н., Atabekov J. Effect of chitosan on the hypersensitive reaction of bean to alfalfa mosaic virus // Plant Sci.- 1989.- V. 62.- P. 29.

84. Gama Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A. N-Carboxymethylchitosan-N,0-sulfate as an anti-HTV-l agent // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1991.- V. 174, № 2.- P. 489.

85. Pastor de Abram A. Qitina у Quitosano: abtencion, carecterizacion у aplicaciones // Pontifica Universidad Catolica del Peru.- 2004.- Lima-Peru.- P. 105.

86. Babak V G., Rinaudo M., Desbrieres J., Vikhoreva G.A., Michalski M.G. The effect of alkyl length of a polysoap on the surface activity of its complexes with cationic surfactants // Mendeleev Commun.- 1997.-V 4.- P. 149.

87. Philippova O.E., Volkov E.V., Sitnikova N.L., Khokhlov A.R. Two types of hydrophobic aggregates in aqueous solutions of chitosan and its hydrophobic derivative // Biomacromolecules.- 2001.- V. 2.- P. 483.

88. Miwa A., Ishibe A., Nakano M., Yamahira Т., Itai S., Jinno S., Kawahara H., Development of novel chitosan derivatives as micellar carriers of Taxol // Pharm. Res.- 1998.-V. 15.-P. 1844.

89. Lee K.Y., Kim J.-H., Kwon I.C., Jeong S.Y. Self-aggregates of deoxy-cholic acid-modified chitosan as a novel carrier of Adriamycin // Colloid Po-lym.Sci.- 2000.- V. 278.- P. 1216.

90. Lee K.Y., Kwon I.C., Kim J.-H., Jo W.H., Jeong S.Y. Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system // J. Controlled Release.- 1998.- V. 51.- P. 213.

91. Sakairi N. Synthesis of a novel polymeric surfactant by reductive N-alkylation of chitosan with 3-O-dodecyl-D-glucose // Polymer.- 2004.- V. 45,- P. 837.

92. Saito K., Tanioka A. Polyamphoteric membrane study: potentiometric behaviour of succinyl chitosan aqueous solution // Polymer.- 1996,- V. 37.- P. 5117.

93. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Depolymerization of N-succinyl-chitosan by hydrochloric acid // Carbohydr. Res.- 2002.- V. 337.- P. 561.

94. Holme K.R., Perlin A.S. Chitosan N-sulfate: a water-soluble poyelectro-lyte // Carbohydr. Res.- 1997.- V. 302.- P. 7.

95. Hu Y., Jiang X., Ding Y., Ge H., Yuan Y., Yang C. Synthesis and characterization of chitosan-poly(acrylic acid) nanoparticles // Biomaterials.- 2002.-V. 23.-P. 3193.

96. Hirano S., Ohe Y., Ono H. Selective N-acylation of chitosan // Carbohydr. Res.- 1976.-V 47.- P. 315.

97. Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. Dynamic surface tension and dilational viscoelasticity of adsorption layers of a hydrophobically modified chitosan // Colloids and Surface A: Physicochemical and Engeneering Aspects.-2005.-V. 255.-P. 119.

98. Desbrieres J., Rinaudo M., Babak V., Vikhoreva G. Surface activity of water soluble amphiphilic chitin derivatives // Polym. Bull.- 1997- V. 39.- P. 209.

99. Babak V., Lukina I., Vikhoreva G., Desbrieres J., Rinaudo M. Inter-facial properties of dynamic association between chitin derivatives and surfactants // Colloids & Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects.- 1999.- V. 147.-P. 139.

100. Babak V.G., Desbrieres J. Dilational viscoelasticity of the adsorption layers of hydrophobically modified chitosans // Mendeleev Commun.- 2005.- P. 35.

101. Благодатских И.В., Молодцова Ю.А., Позднякова Ю.А., Щеголихина О.И., Хохлов А.Р. Нанодисперсные системы как переходное состояние при формировании кристаллических органометаллосилоксанов // Коллоидный журнал.- 2008.- V. 70, № 4.- Р. 447.

102. Muzzarelli R., Tarsi R., Filippini О., Giovanetti E., Biagini G., & Varaldo P.E. Antimicrobial properties of N-carboxy-butylchitosan // Antimicrobial Agents & Chemotherapy.- 1990.- V. 34.- P. 2019.

103. Rhoades J., & Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied & Environmental Microbiology.- 2000.- V. 66.- P. 80.

104. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F. & Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica // Biomacromolecules.- 2001.- V. 2.- P. 165.

105. Badawy M.E.I, Rabea E.I., Rogge T.M., Stevens C.V., Smagghe G., Steur-baut W.& Hofte M. Synthesis and fungicidal activity of new N,0-acyl chitosan derivatives // Biomacromolecules.-2004.- V. 5.- P. 589.

106. Rabea E.I., Badawy M.E.T., Stevens C.V., Smagghe G. & Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromolecules.- 2003.- V.4.- P. 1457.

107. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана (обзор) II, Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- V. 38.- Р.1.

108. Tokura S., Ueno К., Miyazaki S. & Nishi N. Molecular weight dependent antimicrobial activity by chitosan // Macromolecular Symposiums.- 1997.- V. 120, P. 1.

109. Gerasimenko D.V., Avdienko I.D., Bannikova G.E., Zueva O.Y. & Var-lamov V.P. Antibacterial effects of water-soluble low-molecular-weight chitosans on different microorganisms // Applied Biochemistry & Microbiology.-2004.- V. 40.- P. 253.

110. Zheng L.-Y. & Zhu J.-F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weight // Carbohydrate Polymers.- 2003.- V. 54.- P. 527.

111. Kyung W.K., Thomas R.L., Chan L.& Park H. Antimicrobial activity of native chitosan, degraded chitosan and O-carboxymethylated chitosan // Journal of Food Protection.- 2003.- V. 66.- P. 1495.

112. Khill С J., Kennedy J.F., Mistry J., Miraffab M., Smart G., Groocock M. R., Williams H.J. Acid hydrolysis of commercial chitosan II J. Chem. Technol. Biotechnol.- 2005.- V. 80.- P. 1291.

113. Belleau В., Malek G.J. New convenient reagent for peptide syntheses // J.Am Chem Soc.- 1968.- V. 90.- P. 1651.

114. Hang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate // Carbohydrate Res.- 2003.- V. 338.- P. 483.

115. Lim S.-H., Hudson S.M. Synthesis and antimicrobial activity of a water soluble chitosan derivative with a fiber-reactive group // Carbohydrate Res.-2004.- V. 339.- P. 313.

116. Rabea E.A., Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action // Bio-molecules.- 2003.- V. 4.- P. 1457.

117. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternaty ammonium salt of chitosan // Carbohydrate Research.- 2001.- V. 333.- P. 1.

118. Muzzarelli R.A.A., Tanfani F. The N-permethylation of chitosan and the preparation of N-trimethyl chitosan iodide // Carbohydrate Polymers.- 1985.- V. 5.- P. 297.

119. Sieval A.B., Thanou M., Kotze A.F., Verhoef J.C., Brussie J., Junginger H.E. Preparetion and NMR characterization of highly substituted N-trimethyl chitosan chloride // Carbohydrate Polymers.- 1998.- V. 36.- P.157.

120. Snyman D., Hamman J.H., Kotze J.E., Rollings J.E., Kotze A.F. The relationship between the absolute molecular weight and the degree of quaternisation of N-trimethyl chitosan chloride // Carbohydrate Polymers.- 2002.- V. 50.-P. 145.

121. Hamman J.H., Kotze A.F. Effect of the type of base and number of reaction steps on the degree of quaternization and molecular weight of N-trimethyl chitosan chloride // Drug Development and Industrial Pharmacy.- 2001.- V. 27, № 5. P. 373.

122. Polnok A., Borchard G., Verhoef J.C., Sarisuta N., Junginger H.E. Influence of methylation process on the degree of quaternization of N-trimethyl chitosan chloride // Eur.J.Pharm.Biopharm.- 2004.- V. 57.- P. 77.

123. Dung P.L., Milas M., Rinaudo M., Desbrieres J. Water soluble derivatives obtained by controlled chemical modifications of chitosan // Carbohydrate Polymers.- 1994.-V. 24. P. 209.

124. Domard A., Rinaudo M., Terrassin C. New method for the quaternization of chitosan // Int J.Biol.MacromoL- 1986.-V. 8.-P. 105.

125. Domard A., Rinaudo M., Terrassin C. 13C and !H n.m.r. spectroscopy of chitosan and N-trimethyl chloride derivatives // Int.J.Biol.Macromol.- 1987.- V. 9. P. 233.

126. Нудьга Л.А., Плиско E.A., Данилов C.H. Цианэтилирование хитозана // Ж.Общ.Хим.- 1973.- V. 43.- Р. 2756.

127. Loubaki Е., Sicsic S., LeGoffic F. Modification chimique du chitosan avec la 5-gluconolactone la P-propiolactone et le glycidol // Eur.Polymer J.- 1989.- V. 25.- P. 379.

128. Loubaki E., Ourevitch M., Sicsic S. Chemical modification of chitosan by glycidyl trimethylammonium chloride. Characterization of modifiedchitosan by С and H-NMR spectroscopy // Eur.Polymer J.- 1991.- V. 27.- P. 311.

129. Ling X., Mu F., Yuming D., Rong-Hua H. Controlled synthesis of gly-cidyltrimethylammonium chloride chitosan // Wuhan Peop. Rep. China. Fenxi Kexue Xuebao.- 2004.- V. 20, № 4.- P. 357.

130. Beilstein Handbuch Der Organische Chemie , ed. F.Richter, Verlag von Julius // Springer.- 1929.- V. 4. P.- 10.

131. Johnson S.L. and Morrison D.L. Kinetics and mechanism of decarboxylation of N-arylcarbamates, Evidence for kinetically important zwitterionic car-bamic acid species of short lifetime // J. Amer. Chem. Soc.- 1972.-V. 94.- P. 1323.

132. Hirai A., Odani H., Nakajima A. Determination of degree of deacetylation of chitosan by !H NMR spectroscopy // Polym Bull.- 1991.- V. 26, № 1.- P. 87.

133. Ben-Ishai D. and Berger A. Cleavage of N-Carbobenzoxy Groups by dry Hydrogen Bromide and Hydrogen Chloride // J. Org. Chem.- 1952.- V. 17.- P. 1564.

134. Spinelli V. A., Laranjeira C.M.and Favere V. Т. Preparation and characterization of quaternary chitosan salt: adsorption equilibrium of chromium(VI) ion // React.& Func Polym.- 2004.- V. 61.- P. 347.

135. Stepnova E.A., Tikhonov V.E., Babushkina T.A., Klemenkova Z.S., Yam-skov I.A. Unexpected reaction chitosan with EEDQ // Mendeleev Commun.-2006.- V. 16, №5.-p. 271.

136. Elliott M.L.; Brodchat Т.К.; Uchida J.Y.; Simone G.W. Compendium of Ornamental Palm Diseases and Disorders //APS Press: MN.- 2004.- USA.

137. Aragaki A.,; Broschat Т.К., Chase A.R., Ohr H.D, Simone G.W., Uchida J. Diseases and Disorders of Ornamental Palms //, APS Press: St.Paul.-1991.-USA.