Получение С-реактивного белка и изучение его иммунорегуляторных свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ггв

од

На правах рукописи

ЗОТОВА ЕЛЕНА ГЕННАДИЕВНА

• ПОЛУЧЕНИЕ О-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ШШНОРЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ

02.00.10. - Биоорганическая химия, химия природных и фивиологичвски активных веществ 14.00.36. - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в группе иммунофармэкологии ВИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и на кафедре химии и технологии тонких органических соединений ШШСТ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: д.х.н., проф. Серебренникова Г.А.

к.м.в., вед.в.о. Ыысякин Е.В.

Официальные оппоненты: д.х.н., проф. Шибнев В.А.

к.м.н., о.н.о. Николаева Т.Н.

Ведущая организация: Институт Виоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Защита диссертации состоится ______ 1995 г.

I

в _ часов на заседании диссертационного совета Д 063.41.01.

в Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, просп. Вернадского, 86.

О диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке МИТХГ им. М.В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. Ы.Пироговокая, 1). Автореферат разослан _____■ - 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. С-реактивный белок (СРВ) - наиболее характерный представитель семейства острофазных протеинов человека. Впервые он был.обнаружен в сыворотке крови больных пневмококковой пневмонией благодаря своей способности связываться в присутствии ионов Са2+ с соматическим С-полисахаридом клеточЕой стенки S.pneumoniae, чему он и обязан своим названием.

, В последние годы широко развернулись исследования по изучении иммунорегуляторных свойств С-реактивного белка. Однако данные об его иммунобиологической активности нередко противоречивы, скорее всего, из-за различий в степени чистоты используемого белка. Присутствие даже незначительного количества примесей, например, липощютеинов, может существенно влиять на некоторые показатели иммунореактивности организма, в частности, на пролиферативную активность лимфоидных клеток.

Получение,С-реактивного белка высокой степени чистоты осложняется тем, что в исходной белковой смеси присутствуют соединения, с которыми еозможно его специфическое взаимодействие.

Наиболее успешно задача по выделению С-реактивного белка из различных биологических жидкостей решается с помощью аффинной хроматографии, использующей специфическую способность СРВ в присутствии ионов Са2+ связываться с соединениями, содержащими фосф.холи-Еовые группировки.. Поскольку существующие способы получения С-реактивного белка на основе фэсфохолинсодержащих биоспецифических сорбентов не удовлетворяют всем требованиям (простота лолучения и стабильность биоспецифического сорбента, чистота получаемого СРВ), в настоящее время продолжаются исследования по разработке более эффективных способов получения С-реактивного белка.

. Работа выполнена в соответствии'с планом научно-йсследова-тельских работ группы иммунофармакологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи ■ РАМН по теме N 100 В "Изучение роли острофазного ответа в поддержании иммунного гомеостаза организма путем изучения иммунорегуляторных свойств его основных сывороточных реактантов" (номер государственной регистрации 0.67.07.а также в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры ХТТОС ЩТХТ им. М.В.Ломоносова по теме N 1Б-18-865 "Получение.липидов, биорегуляторов липид-ной природы и их конъюгатов, изучение поведения в биологических

- г -

системах, использование для создания физиологически активных ли-пидных препаратов и липосомальных форм" (номер государственной регистрации 01920018492). Данное исследование дополнительно финансируется Министерством Обороны РФ по теме "Получение высокоэффективных препаратов на основе эндогенных иммунорегуляторных факторов для иеспецифической профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний".

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. 1).Получение биоспецифичэских сорбентов для выделения ОРБ путем ковалентного присоединения производных вп-гли-церо-З-фосфохолина к аминозамещенным агарозным матрицам; выявление факторов, влияющих на эффективность полученных сорбентов;

2). Разработка схемы получения С-реактивного белка высокой степени чистоты;

3). Изучение влияния С-реактивного белка на формирование первичного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа; исследование митогенного и комитогенного действия С-реактивного белка 1л vivo и In vitro.

МУЧНАЯ НОВИЗНА. Предложены новые способы получения фосфо-холинсодержащих вффинных сорбентов на основе доступных производных згх-глицеро-3-фосфохолина, получаемых при его взаимодействии о NalO^ или ВгСЛ, и далее ковалентно присоединяемых к аминозамещенным агарозным матрицам. Показана высокая стабильность биоспецифи-чесяих сорбентов, содержащих двойные связи по типу Шиффовых оснований. Получены биоспецифические сорбенты с различным содержанием фосфохолиновых группировок, определена оптимальная концентрация иммобилизованного лиганда, охарактеризовано влияние катионных группировок в составе спейсера на степень чистоты выделяемого О-реактивного балка. Отработана схема получения СРВ высокой степени чистоты. Показана способность С-реактивного белка модулировать, формирование первичного иммунного ответа и гиперчувствитель-нооти замедленного типа у мышей в зависимости от его дозы и сроков введения животным. Впервые обнаружено свойство СРВ In vivo подавлять пролиферативную активность лимфоцитов в ответ на фитогемагг-дютанин (ФГА). Установлено, что С-ревктивный белок усиливает спонтанную пролиферацию лимфоидных клеток In vivo и обладает выраженным митогенным эффектом in vitro. Впервые показано, что макрофаги способны угнетать пролиферацию ФГА-стимулированных лимфоцитов в

присутствии СРВ и подавлять митогенноэ действие С-реактивного белка in vitro.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Предложен новый удобный сто-ооб получения биоспецифических сорбентов для выделения О-реактшз-ного белка на основе гликольфосфохолина, ковалентно присоединяемого к аминозамещенным агарознкм матрицам. Данный метод может быть использован для выделения С-реактивного белка в промышленных условиях. Полученные биоопецифические сорбенты также могут быть применены для очистки других белков, имеющих сродство к фосфохолиновым группировкам, например, фосфолипазы 0 или миеломных IgA. С-реак-тивный белок, выделенный посредством аффинной хроматографии на синтезированных биоспецифических сорбентах, может использоваться для иммунизации животных о целью получения специфических антисывороток, в также в качестве стандарта при определении концентрации С-реактивного белка различными методами. Результаты, полученные при изучении митогенной и комитогенной активности СРВ, могут позволить прогнозировать нарушения иммуногенеза и развитие патологических состояний на фоне гиперпродукции острофазных белков при инфекционных заболеваниях или онкопатологии. Данные об иммунорегу-ляторной активности СРВ in vivo открывают дальнейшие перспективы его использования в качестве эндогенного иммуномодулятора. Ш^АЩОТУ^ЖОСЯТСЯ следующие основные положения: новые способы получения биоспецифических сорбентов для выделения С-реактивного белка на основе доступных производных вп-глицеро-З-фосфохолина, ковалентно иммобилизуемых на аминозаме-щенных агарозных матрицах;

получение С-реактивного белка высокой степени чистоты (более 99 %) путем сочетания методов аффинной и ионообменной хроматографии;

иммуномодулирупцее действие С-ревктивного белка на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа;

, способность С-реактивного белка усиливать пролиферацию ЛйМфоидных клеток In Tiro и in vitro;

способность С-реактивного белка модифицировать пролифе-ративнув активность лимфоцитов в ответ на Т~ и В-мйтогены;

оупреооивное влияние макрофагов на пролиферацию лимфоидных клеток, стимулированную СРВ и его сочетанием с аитогемагглютинином.

АПРОБАЦИЯ. Результаты, изложенные в диссертации, докладывались на IV Международной конференции по воспалению (Швейцария, 1991), на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата. 1992), на I Международной конференции по иммуномодуляторам бактериального происхождения и синтетическим адъювантам (Румыния, сентябрь, 1993). Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 26'октября 1995 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов. Получено решение о выдаче патента на изобретение.

•ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на стр. машинописного текота, содержит 11 таблиц, 12 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, обсуждений результатов, экспериментальная часть, выводы, список литературы, включающий ссылок. ,

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Получение биоспецифичесвдх сорбентов

1.1. Характеристика анинозамещенных агарозных матриц

Й качестве исходных матриц в работе использовались вга$б&£й# £ели - наиболее широко применяемые носители в аффинной хрог<й?е?|йфии белков. Химичеокая отруктура агарозы позволяет гфймеи#№ различные способы для ее активации и последующей иммобилизаций Лйгандов или спейсерных груш. В известных способах полубайт биеспецифических сорбентов для выделения О-реактивного белка в болышШотве олучаев применяются ВгСЫ-активированные агарозные , матрицы.

На начальных этапах работы представляло интерес получить-амййозамещенные■матрицы на основе коммерческой ВгСЫ-активирован-!-кой сефарозы 4В ( матрица типа I ) и сефарозы 4В, активированной5* ВГСК 6 лабораторных условиях (матрица типа II), характеризующихся различной степенью активации геля (охема 1). Использование ове-кеприготовленной ВгСН-ективированыой сефарозы 4В позволяло получать вминозамещенные сорбенты о больном содержанием аминогрупп по сравнению с коммерческой ВгСН-активированной сефарозой 4В. Определение аминогрупп проводили методом кислотно-основного титро-

вания.

/ мн,

-о-с-глЫсНаЭа-кНа

Схема 1

I N«2^=51 шиоль/г Сын-,)-¡-£>198 шшоль/г

матрица типа I или II

-ОСН2СНСИаО(СНя)чОСНаСНСНяГЖ(СНя)вКНя 1^Нг)111=40 ЦКЫОЛЬ/Г

он он

матрица типа III

-СНя-КН-(СН2)В~№НЯ

матрица типа IV

ЫЕМОЛЬ/Г

Несмотря на традиционное использование ВгСН-активирован-ных агарозных гелей в аффинной хроматографии, они- обладают рядом существенных недостатков. Активация агарозных матриц с помощью ■ ВгСЫ однозначно приводит к получении, сорбента с ионообменными свойствами. Это обусловлено образованием заряженных изомочевинных групп в результате присоединения аминокомпоненты к активированному гелю. .

"В связи о этим в дальнейшем представлялось целесообразным при получении вминозвмещенных агарозных матриц опробовать способы активации агарозы и присоединения аминокомпоненты, не приводящие к появлении в структуре геля заряженных группировок и характеризующиеся более прочной связью диамина с носителем. Такими способами являлись активация агарозы с помощью эпоксисоединений и метод периодатного окисления агарозы. . .

.На следующем этапе работы при получении биоспецифических сорбентов была использована промшленно доступная эпоксиактивиро-ванная аминогексилагароза -. ЕАН-агароза 4 % (матрица типа III).

Однако наиболее удобным и эффективным при получении амино-замещенных матриц оказался метод периодатного окисления агарозы. Обработка сефарозы 4 В мета-периодатом натрия переводила ее вици-нальные диольные группы в альдегидные, реагирующие далее о первичными аминами с образованием Шиффовых оснований. Двойные связи оснований Шиффа и непрореагировавшие альдегидные группы затем восстанавливались борогидридом натрия. Содержание аминогрупп в замещенных матрицах на основе периодатноокисленной агарозы (матрица типа IV) более, чем вдвое превышало концентрацию NHg-групп в матрице типа III, полученной на' основе эпоксиактивированной агарозы. Определение аминогрупп проводили кулонометрическим методом после разложения проб по Кьельдалю, а также с помощью метода кислоттно-основного титрования. -

1.2. Получение и иммобилизация лигандов на

ашнозаыещенных агарозиых матрицах Следующим этапом при получении биоспецифических сорбентов для выделения С-реактивного белка являлось получение лигандов, содержали функциональные группы, необходимые для ковалентной иммобилизации на аминозамещенных носителях.

Среди лигандов, обычно используемых при получении сорбентов для выделения СРВ можно - выделить две основные группы. Первая - фосфохолинсодержащие лиганда, а именно, О-полисахарид клеточной стенки S.pneumoniae, и различные синтетические производные фосфо-холина, такие как, п-диазонийфенилфосфохолин, капроилфосфохолин, , конъюгат гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином и другие. Вторую группу составляют 'лиганда, не содержащие фосфохоли-новых остатков. Это - фосфоэтаноламин, аргинин, антитела к СРВ и прочие. . , ' ' '

Наиболее перспективны фосфохолинсодержащие лиганда, так как они обладают высоким сродством к С-реактивному.белку и позволяют проводить его сорбцию и,элюцию в условиях, наиболее близких к физиологическим. Описанные в литературе 'фосфохолинсодержащие аффинные сорбенты предполагают сложный многостадийный синтез лиганда, а в ряде случаев и модифицированной матрицы, применение труднодоступных реагентов. , - -

В данной работе использовались1 более .'доступные в препара-

тивном отношении лиганды - производные зп-глицеро-З-фосфохолина (1), получаемые при его взаимодействии с ВгСИ (2) или МаЮ4 (3) (схема 2). Эти соединения далее достаточно просто иммобилизуются на аминозамещенных агарозных матрицах.

Схема 2

ВгСЫ

сня-6н

но-сн

/0-СНя

™=с\о-сн в

I ° +, ч

СНя-0-Р-0-СНя-СНя-Ы(СН3)а (2)

имидокарбонатное производное зп-глицеро-З-фосфохолина

СНя-0-Р-0-СНя-СНя-М(СНа)а

О

(1)

Л.

ЫаЮи

вп-глицэро-З-фэофохолин

сня-о-р-о-сня-сня-м(сн3)а (3)

гликольфосфохолин

Исходное соединение (зп-глицеро-3-фосфохолин) получали путем омыления выпускаемого промышленностью яичного фосфэтидилхоли-на. При взаимодействии зп-глицеро-З-фосфохолина с бромцианом получали лиганд (2) - циклическое имидокарбонатное производное зп-глицеро-З-фосфохолина. Это высокореакционноспособное, но неустойчивое соединение, повтому его без обработки иммобилизовали на аминозамещенных матрицах типа I и II (схема 3).

В зависимости от соотношения вминозамещенной матрицы и лиганда (2), а также времени иммобилизации были получены биоспецифические сорбенты типа (1-4) с разной степенью посадки лиганда: 7, 12, 26 и 50,8 мкмоль/г соответственно (схема 3). Количество иммобилизованного лиганда определяли по содержанию фосфора методом Бартлета.

Однако в результате ковалэнтного присоединения этого лиганда (2) к вминоззмецанным матрицам типа (I) и (II) появлялась дополнительная изомочевинная группировка. Это способствовало усилению ионообменных свойств сорбентов, а ггри высокой степени посадки лиганда (2), например, (более 60 мкмоль/г ) наблюдалось прзоб-

ладанна ионообменных свойств над бпоспецифическим взаимодействие! с О-реактивным белком.

В , , • нм=с\ 1

0-С-ИН-(СНа)в-НН2 О-СН 0

'матрица типа I или II _

Схема 3

о-сн3

НМ=С\

11 , СНя-0-Р-0-СН3-СИа-М(сн3)я

о-

НИц ин2 он о

? II . и I И

У. -0-С-^Н-(С!!2)п-^Н-С-0-СН2-СН-СИа-0-р-0-СНа-СН3-М(СН3)а У 1 -

I

биоспецифические сорбенты типа (1-4)

В дальнейшем при синтезе биоопацифических сорбентов были . разработаны подходы, позволяющие избеяать образования заряженных группировок как в процессе приготовления матрицы, так и при посадке лиганда. С этой целью в качестве лиганда использовали гликоль-фосфохолин (3), получаемый путем окисления исходного эп-глицеро-3-фосфохолина (1) мета-периодатом натрия (схема 2). Содержащий альдегидную группу гликольфосфохолин далее ковалентно иммобили-зовывалн на аминозамещенных агарозннх матрицах с образованием Шкф~ фовых оснований (схема 4). ~

з

Первоначально проводили восстановление образовавшейся двойной связи -№=СН- с помощью НаВН4,однако в экспериментах о невосстановленной формой сорбентов была выявлена их высокая стабильность (более 22 циклов выделения СРВ), что позволило впоследствии отказаться от дополнительной стадии восстановления. Устойчивость Ши4Фова основания в данном случае может быть объяснена тем, что выделение СРВ проводилось в слабощелочных условййЬ, 'а гидролиз этого основания, как правило, осуществляется в кислой среде.

В случае использования аминозамещенных матриц типа (I) шк (II) были получены биоспэцифические сорбенты типа (5-9) с разлэт-ннм содержанием гликольфосфохолина: Т, 11, 24, 48 и 109 мкмоль/г сухого сорбента" соответственно. Дашше сорбенты в отличие от пре-

дыдущих содержали в структуре спейсера только одну катионную группировку (схема 4).

Схема 4

матрица типа I или II ^

f

с/ матрица типа III

Г" s~

NHa О

и я II •,

-0-C-NH-R-N~CH-CHa-0-P-0-(СНа)aN(СНа)я

0~

биоспецифические сорбенты типа (5-9)

-ОСНаСНСНяО(СНя )i»OCHaCHCHaNHRN=CHCHa®X ОН ОН

CH,-o-P-o-(cHa)aN(cH3)3 биоспецифический сорбент (10)

о (3)

матрица типа IV ^

-CHa-NH-R-N"CH-CHa-0-P-0-CHa-CHa-N(СН3)3

биоспецифический сорбент (114

п *

ФХ т - 0-P-0-CHa-CHa-N(CHa)3; R - -(СНа)в

о"

В результате иммобилизации гликольфосфохолина (3) на ами-нозамещенных матрицах типа III и типа IV были получены биоспеци-фкческие сорбенты типа (10) и (11), спейсерные группы которых не были заряжены.

Таким образом, на основе четырех вариантов аминозамещенных агарозных матриц (типы I-IV) и двух фосфохолинсодеркащих лигандов (2,3) нами было получено 11 биоспецифических сорбентов, отличающихся концентрацией иммобилизованных лигандов и степенью заряжен-ности геля. Как будет показано далее эти различия оказывали влияние на эффективность полученных сорбентов при выделении СРВ.

- loll. Получение C-peактивного белка В наотоящее время наиболее аффективным и распространенным методом выделения О-реактивного белка является аффинная хроматография. В ее основу положено использование овойства С-ревктивного белка в присутствии ионов кальция специфически и обратимо взаимодействовать с фосфохолиновыми группировками. Применение метода биоспецифической хроматографии в огромной степени облегчает задачи исследователей по выделению СРВ, особенно при использовании исходного сырья с невысоким его содержанием.

В качестве источника О-реактивного белка нами использовалась всцктнвя жидкость человека, полученная от больных с онкопатологи-ей. Концентрация СРВ в ее разных партиях колебалась от 20 до £0 мкг/мл.

Ход вффинной хроматографии С-реактивного белка на полученных биоспецифических сорбентах представлен па рис.1.

СРЕ .

АН

мкг/мл

V, НА О 25 fo IS о

йО

Буфер А: Буфер Б:

трис-Н01, рН 7,8 (20 мМ), трис-НС1, рН 7,8 (20 мМ),

N301 (140 мМ), Са012 (2 мМ) №01 (140 мМ), цитрат натрия

(60 мМ)

Рис. 1. Элюентные профили аффинной хроматографии СРВ

- - Общий белок (А 280) { _ СМ0Н0 буф0ров

---_ _ о-реактивный белок (мкг/мл)

Сорбцию СРВ и вымывание несвязавшихся компонентов асцитной

2+

кидкооти проводили используя Са -содержащий трис-буфэр (буфер А:

трис-НС1,рН Т,8 (20 шМ), Иа01 (0,14 М), Са019 (2 шМ)). Элюцшо

2+'

С-реактивного белка обеспечивало удаление ионов Са , что вызывало разрушение аффинного комплекса СРВ-лиганд. Для удаления ионов Са2+ использовали цитратсодержащий буфер (буфер В: трис-НС1, рН 7,8 (20 шМ), КаС1' (0,14 М), цитрат натрия (50 шМ)).

В ходе экспериментов было выявлено, что не все полученные биоспецифические сорбенты эффективны при выделении С-реактивного белка (табл.1). Биоспецифические сорбенты (1) и (Б), характеризующиеся низкими концентрациями иммобилизованных лигандов (около 7 мкмоль/г), слабо связывали С-реактивный белок. Сорбенты (4) и (9) проявляли высокую неспецифическую сорбцию белков, вызванную, вероятно, преобладанием ионообменных свойств сорбентов вследствие слишком высокой плотности лиганда (более 50 мкмоль/г). Остальные сорбенты (2,3,6-8,10,11) с промежуточными значениями отепенп посадки лигандов (11-26 мкмоль/г) позволяли вполне успешно.выделять С-реактивный белок.

Таблица 1

„^ Биоспецифическая хроматография С-реактивного белка

Тип био- Количество Концентра-

специфи- катионных ция иммо- Выход С-реак- Чистота С-ре-

ческого груш в билизован. тивного белка, активного бел-

сорбента спейсерв лиганда, мкмоль/г % ка, %

1 ++ 7 слабо свж 1ЫВ2Л СРВ

2 ++ 12 62 52

3 ++ 26 47 49

4 ++ 50,8 ' ■ высокая нэспецифическая сорбция

5 + 7,3 слабо связывал СРВ

б + 11 67 72

Т + 24 59 68

8 + 48 68 57

9 + 109 высокая неспецифическая сорбция

10 - 17,7 73 88

11 - ' 15 76 91

Полученные биоспецифические сорбенты отличались по степени варяженности геля, то есть количеству катионных группировок в структуре спейсера. Это в значительной мере определяло величину неспецифической сорбции сорбентов, и в конечном счете, влияло на чистоту выделяемого С-реактивного белка. Например, сорбенты (6,7), содержащие только одну катионную группировку в составе опейоера позволяли получать СРВ большей степени чистоты (60-70 Ж) по сравнению о сорбентами о двумя катионными зарядами в спейсерной группа. Чистота О-реактивного белка, выделенного на сорбентах последнего типа составляла около 60 %. Также следует отметить, что при выделении О-реактивного белка на сорбентах о одним катионным зарядом в спейсерной группе заметное преобладание неопецифической сорбции наблюдалось при концентрации иммобилизованного лиганда, -равной 109 мкмоль/г (сорбент 9), а в случае оорбентов о двумя положительными группировками в спейсерной группе это обнаруживалось уже при концентрации 60,8 мкмоль/г (оорбент 4).

Наилучшие результаты при выделении С-реактивного белка (чистота белка 88-91 %) были получены с помощью оорбентов (10 и 11), спейсерные группы которых не заряжены.

Таким образом, представленные в таблице данные о выделении С-реактивного белка на полученных биоспецифических сорбентах, позволили нам оделать выводы о том, что эффективность сорбента зависит как от концентрации иммобилизованного лиганда, так и от количества катионных группировок в составе спейсера. Оптимальной степенью посадки лиганда можно считать*значения в диапазоне 11-26 мкмоль/г оорбента, при этом наиболее эффективны оорбенты о незаряженными спейсерными грушами.

"Существующие в наотоящее время способы получения С-реактивного белка с высокой степенью чистоты (более 95 %) р большинстве олучаев предполагают сочетание аффинной хроматографии о другими методами очистки. В настоящей работе для получения СРВ с высокой отепенью чистоты использовали сочетание биоспецифической и ионоббменной хроматографии. О учетом характера примесей в качестве дополнительной очистки белка наш была применена хроматография на DEAS-сефадексв А-50 (рис.2),

Элюцию белка осуществляли о помощью градиента NaOl (0,14-0,70 М) в цитратсодержащем буфере В, рН 7,8.

h*,

М 2P

щ

Ш, М '

4,0

0,3?

0,5

№

0 £ö Й G0 00 100 Ш М Ш 460 ZOO

РИо. 2. Ионообменная хроматография полученных в результате аффинной хрома то графш элюатов С-ре активного бежа пик I - сывороточный амилоид П, 1бС, компоненты комплемента

Оц, С3. С4. "нормальные" белки сыворотки крови; пик Ц - С-ревктивный белок человека

О помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии по. Оухтерлони было показано, что в соотав первого пика входили сывороточный амилоид П, Сц, Од, Од, и "нормальные" белка сыворотки крови человека. Второй пик предстьалял собой О-реактивный белок, гомогеннооть которого подтверждена о привлечением методов иммуно-элетрофореза и зйэ-алвктрофэреза в полиакриламидном геле (рис. 3). На конечном этапе чистота полученного СРВ составляла не менее

III.Изучение шшунорагуляторных свойств С-реактивного белка III.1. Изучение влияния С-реактивного белка на формирование гуморального и клеточного шшунного ответа

Для решения вопроса о наличии у С-реактивного белка

99 %.

свойств эндогенного иммуномодулятора в данной работе при проведении исследований использовались модели, отражающие два основных типа иммунореактивности - формирование гуморального и клеточного иммунного ответа.

Т П ш w

Рис.3. Sds-электрофорез в полиакриламидном геле

I - белки с известными молекулярными массами: 14, 20, 30,

43, 67, 94 кД;

II - СРВ, полученный на сорбенте 6 (концентрация лиганда

11 мкмоль/г, одна катионнная группа в спейсере);

III - СРВ, полученный на сорбенте типа 11 (концентрация ли-

ганда 15 мкмоль/г, спейсерная группа не заряжена);

IV - ОРБ, полученный о помощью аффинной и последующей

аффинной хроматографии

В период острой фазы воспаления происходит быстрое нара-отЕние концентрации С-реактивного белка, что создает возможность •. его воздействия на иялунокомпетентные клетки на всех этапах иммуногенеза. Поэтому в данной работе при изучении влияния СРВ на формирование первичного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам баранв (ЭБ) у мышей, обработку кивотных препаратами СРВ проводили в различные сроки относительно момента введения антигена.

В опытах использовали мышей-гибридов первого поколения. (СВАхС57В1/6)Р1 .самцов в возрасте от 8 до 16 недель, полученных

из питомника лабораторных животных "Столбовая" РАМН.

Для оценки влияния СРВ на формирование первичного иммунного ответа к ЭВ у мышей использовали метод локального гемолиза в геле. Определение числа антителообразующих клеток проводили на 4-ые сутки после иммунизации мышей ЭВ в дозе 150x106 клеток. Препараты СРВ в дозах 2, 10, 20 и 100 мкг/мышь вводили тавотным за 1, 3 и 7 суток до иммунизации, одномоментно с введением антигена и через 1 и 3 суток после него. Исходя из полученных результатов, определяли индекс стимуляции ИС=0/К, где 0 - число внтителообразующих клеток в опытных, а К - в контрольных группах. При предварительном и одномоментном введении СРВ с антигеном наб-лвдалось угнетение антителообразования, наиболее выраженный вффект отмечался при введении СРВ за 3 суток до иммунизации (табл.2). Максимальное онижение числа внтителообразущих клеток отмечалооь при введении СРВ в дозе 100 мкг/мышь (ИС=0,38; P<Q,01).

Таблица 2

Действие С-реактивного белка на формирование первичного иммунного ответа к эритроцитам барана (ЭВ)у мшпей

Время введения СРВ животным, сутки Индекс стимуляции, ИО

СРВ, 2 мкг/мышь СРВ, 10 мкг/мышь СРВ, 20 мкг/мышь СРВ, 100 мкг/мышь

- 7 0,96х 0,83 0,88 0,86

- 3 0,69х 0,63* 0,44* 0,38*

- 1 0,83 0,68х 0,58* 0,51*

0 0,75 0,92 1,07 1,07

+ 1 0,97 1,50* 1,35х 1,36х

+ 3 1,38х 1,58* 2,03* 2,15*

"-" - введение СРВ до иммунизации животных;

"+" - введение СРВ после иммунизации животных;

Для значений с индексом* Р<0,01; с индексом х Р<0,05

При обработке животных СРВ после иммунизации был обнаружен противоположный эффект - стимулирувдее действие СРВ на анти-телогенез. Наиболее выраженное увеличение числа аитителопродуцен-тов наблюдалось при введении СРВ спустя 3 суток после имммуниза-

ции. Действие СРВ линейно возрастало с увеличением его дозы, достигая максимального значения при введении 100 мкг/мышь (ИС-2,15; Р<0,01).

Следует предполагать, что реализация иммунорегуляторных свойств О-реактивного бежа в процессе формирования первичного иммунного ответа монет осуществляться как при прямом, так и при опосредованном действии СРВ на иммунокомпетентные клетки. Так, одно из возможных объяснений иммунооупрессорного действия СРВ при его предварительном введении. - индукция образования Т-супрессо-ров.

Вместе с тем следует учитывать и другие возможные механизмы, вызывающе в конечном счете угнетение антитвлогенеза. Например, под влиянием СРВ в макрофагах стимулируется метаболизм врахи-доновой кислоты, приводящий к образованию проотагландинов, способных, как известно, подавлять некоторые важные для развитая иммунного ответа процессы, такие как, продукция ИЛ-1 и экспрессия 1а-антигенов. Не исключено также, что подавление иммунного ответа под действием СРВ связано о его способностью увеличивать фагоцитарную активность макрофагов, что могло привести к чрезмерной деструкции антигена и таким образом'к нарушению процеооа его презентации.

Дальнейшие исследования показали, что С-реактивный белок способен модифицировать не только гуморальный, но и клеточный иммунный ответ.

В качестве модели клеточного иммунитета нами использовалось одно из характерных его проявлений - гиперчувотвительность ва- " медленного типа (ГЗТ), развивающаяся у мышей после внутривенного введения ЭБ. Мышей-гибридов (СВАх057.В1/б)Р1 сенсибилизировали ЭБ в дозе 5x105 клеток/мышь. Препараты СРВ вводили внутривенно за 1, 2 и 3 суток до сенсибилизации животных, одновременно о ней и спустя ■ .1 и 3 суток после нее. Разрешающую дозу ЭБ (108 клеток) вводили через 4 суток в подушечку задней лапки, в контрлатеральную лапку вводили аликвотное количество изотонического раствора хлористого натрия. Результаты реакции ГЗТ учитывали через 24 часа по весу лапок. Индекс стимуляции определяли как отношение величины отека лапок в опытных и контрольных группах.

С-реактивный белок при введении в организм мышей в,различные сроки по отношению к моменту сенсибилизации животных ЭБ оказы-

вал разнонаправленное действие (табл.3). Однако направленность действия (стимуляция или угнетение) была противоположна той, которая наблюдалась в модели энтителогендза (табл.2).

Таблица 3

Влияние О-реактивного белка на развитие гиперчувствительпостк замедленного типа к эритроцитам барана у мшлей

Сроки введения СРВ животным, сутки Индекс стимуляции, ИС

СРВ, 2 мкг/мышь СРВ, 10 мкг/мышь СРВ, 20 мкг/мышь СРВ, 100 мкг/мышь

. - 3 0,95 1,20 1,35х 1 ,38х

- 2 1 ,05 1,03 1 ,07 1 ,03

- 1 1,22 1,15 1,17 1 ,20

0 0,85 0,82 0,78 0,75

+ 1 0,95 1 ,08 1 ,10 1,12

+ 3 0,90 0,62 0,53 0,47

- введение СРВ до сенсибилизации животных; "+" - введение СРВ после сенсибилизации животных; Для значений о индексом* Р<0,05 ' • . '

Предварительная обработка животных СРВ усиливала кожнуи тест-реакции, максимальный стимулирующий эффект отмечался при введении СРВ в дозе 100 мкг/мышь за 3 суток до сенсибилизации (величина отека 138^8,2 %). Можно предполагать, что такой временной интервал необходим для образования биологически активных тафтсино-подобных пептидных фрагментов СРВ и реализации их действия. В настоящее время установлено, что тафтцкноподсбные пептидные фрагменты С-реактивного белка и в некоторой" степени его субъединицы увеличивают продукцию ШМ, вызывающего, как известно, стимуляцию синтеза ИЛ-2, способного, в свою очередь, усиливать активность Т-лимфоцитов и макрофагов.

Введение О-реактивного белка одновременно с ЭБ, а также кисло сенсибилизации 'животных приводило к подавлении реакции ГЗТ. ёупреосивннй эффект был наиболее выражэн при введении СРВ в доге 100 мкг/мышь спустя 3 суток после сенсибилизации (величина отока 47¿11,7 %). Возможным объяснением супрессивного действия СРВ может

являться его способность угнетать образование одного из основных эффекторных медиаторов - фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ). Более того, обработка макрофагов СРВ снижает их чувствительность к дейотвию МИФ. Вместе о тем вполне вероятно, что подавление ГЗТ под действием СРВ может быть вызвано появлением Т-супрессоров.

Поскольку формирование гуморального и клеточного иммунного ответа является результатом оложных межклеточных взаимодействий, заключающихся в кооперации различных типов лимфоидных клеток и макрофагов, а также высвобождении цитокинов, трудно однозначно интерпретировать эффекты, полученные, при введении С-реактивного белка в организм.

Далее в работе нами была предпринята попытка рассмотреть один из основных механизмов, обеспечивающих.развитие иммунного ответа любого типа, - пролиферативную активность лимфоидных клеток, через которую, по-видимому, реализуется действие С-реактивного белка как эндогенного иммуномодулятора.

III.2. Влияние С-реактивного белка на пролиферативную активность опленоцитов и их ответ на Т- и В-ыитогевы

In vivo и In vitro В связи с тем, что изучение действия СРВ на формирование клеточного и гуморального иммунного ответа проводилось In vivo, на начальном этапе было решено исоледовать пролиферативную активнооть сплэноцктов мышей,. обработанных С-реа&тивным белком, по аналогичной схеме (табл.4).

С-реактивный белок вводили внутривенно "¿мшам+гибридам (0ВДх05ТВ1/6)Р1 в дозах 2, 10, 20 и 100 мкг/мыщь за^П.ЗУксТ. суток до тестирования. Уровень пролиферативной . активности^ жкфоцагэв^ оценивали с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов'.(РБТЛ^)bs культуре спленоцитов. Интенсивность РБТЛ определяли радиометрическим методом по включению %-тимидина в делящиеся клетки. При btom-í изучали спонтанную пролиферативную активность клеток селезенки и их ответ на стимуляцию Т- и В-митогенами, в качестве которых использовали фитогемагглютинин (ФГА) и липополисахарид Е. coli (ЛПС).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что СРВ при введении в организм мышей способен стимулировать спон-

тайную пролиферации спленоцитов (табл.4). Наибольший индекс стимуляции отмечался через сутки после введения СРВ в дозе 100 мкг/мышь И0=7,70; Р<0,01). Увеличение пролиферативной активности спленоцитов мышей, наблюдаемое во все сроки введения СРВ, может быть обусловлено разными факторами. Например, при введении СРВ за 1 и 3 суток до тестирования выявляются собственно митогенные свойства СРВ, а при тестировании пролиферативной активности через 7 дней после введения белка уже можно говорить о действии СРВ как антигена.

Таблица 4

Действие С-реактивного белка на спонтанную и митоген-инду-цированную пролиферацию спленоцитов мышей

Сроки введения СРВ животным, сутки Дозы СРВ, мкг/мышь Индекс стимуляции, ИС

среда культивирования ФГА, ' 1 мкг/мл ЛПС, 10 мкг/мл

1 - 2 1,02 1,00 0,90

10 0,80 0,94 1,80

20 3,80* 0,91 1,60*

100 7,70* 0,85 1,58х

3 2 2,20* 0,66х 1,60*

10 2,10* 0,54* 1,58*

20 1,40х 0,35* 1,70*

100 1,75* . 0,31* 1,72*

7 2 . 3,20* . 0,94 1,75*

ю 2,10* 0,80 1,25

20 2,75* 0,73х 0,98

100 2,65* 0,79 1,00

ФГА - фитогемагтлютинин; ЛПС - липополисахарид E.coll;

■ Для значений с индексом1 Р<0*05; с индексом* Р<0,01; радиоактивность в опытных грушах. ,

, ио~ радиоактивность в контроле ' ,

: При изучении влияния СРВ на митоген-индуцированную проли-

ферацию лимфоидных клеток наблюдалось выраженное угнетение проли-феративной активности спленоцитов мышей, обра0ота1шых СРВ, в ответ на ФГА и слабая, но достоверная стимуляция их ответа на ЛПС. Максимальное подавление пролиферации ФГА-стимулированных лимфоцитов отмечалось при введении СРВ в дозе 100 мкг/мшь за 3 суток до тестирования (ис-0,31; p<o,oi).

В экспериментах In vitro (табл.5) О-реактивный белок также обладает выраженным митогенным эффектом (максимальный ИС~6,74), интенсивность которого увеличивалась почти вдвое после удаления из культуры фагоцитирующих и прилипающих клеток (максимальный ИС» 12,44). Для удаления фагоцитирующих и прилипающих клеток использовали метод двукратной адгезии на пластике и метод о использованием "карбонильного" железа. ■ - .. ..'',■

Было показано, что пролиферативный отатуо ФГА- и ЛПС-оти-мулированных лимфоидных клеток в полной ' популяции спленоцитов практически не изменялся в присутствии СРВ (табл.5). Однако после удаления из культуры спленоцитов фагоцитирующих и прилипающих'клеток наблюдалось резкое усиление пролиферативной активности ФГА-сткмулированных (максимальный ИС=8,16), но не ЛПС-активироЕанных лимфоцитов (максимальный ИС-1,27). . ' .

Таблица 5

Митогенное и комитогеиное действие О-реактивного белка In vitro

Условия тестиро- . вания ■ Дозы СРВ, • мкг/мл Индекс стимуляции, ИС

среда культивирования ' ФГА, ' 1 мкг/мл .ЛПС,'. 10 мкг/мл

в полной культуре спленоцитов мыши 2 1,10 1,06 1,00 '

10 1,80 : 1 ,20 ■ г 1,15

20 2,10 1,34 1.14 '

100 6,74 1,34 ; 1,14 ..

в культура ■ спленоцитов после удаления фагоцитирующих и прилипающих клеток 2 1,43 : 1,80 ' 0,88

10 2,28 2,26 :' 1,09 .

20 4,12 V 3,52 1 ,15 ;

100 12,44 8,16 1 ,27

ФГА - фитогемагглютинин; ЛПС - лкпополисахарид E.coli

- 21 -

Роль макрофагов в процессе пролиферации митоген-стимулиро-ванных лимфоцитов сложна и многопланова. По литературным данным известно, что макрофаги могут оказывать супреосивное действие на пролиферации лимфоцитов, отимулированнув ЛПО. В таком случае удаление фагоцитирующих и прилипающих клеток из культуры спленоци-тов должно приводить к усилению пролиферации стимулированных мито-генами лимфоцитов. Однако этого не происходит, что, вероятно, может быть вызвано удалением популяции макрофагов, выступающих в роли акцессорных клеток, присутствие которых, как известно, необходимо для пролиферации ЛПС-активированных В-клеток.

Усиление ответа на ФГА в культуре спленоцитов, лишенных фагоцитирующие и прилипапцих клеток, возможно, объясняется существованием двух ФГА-отвечающих популяций лимфоцитов, пролиферация одной из которой запускается при прямом воздействии ФГА, в то время как для пролиферации другой еще необходимо и взаимодействие с акцессорными клетками.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что С-реактивный белок обладает иммунорегуляторной активностью, Он способен модафицировать формирование гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей, обладает митогенными свойствами, а также модулирует пролиферативную активпость лимфоидннх клеток в ответ на Т- и В-митогены как In vivo, так и in vitro.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны новые способы получения фосфохолинсодержаших биоспецифических сорбентов на основе доступных производных.вп-гли-церо-3-фосфохолина и аминозамещенных агарозных матриц.

2. Определена оптимальная концентрация иммобилизованных лигандов, охарактеризовано влияние катионных группировок в структуре спейсвра на степень чистоты выделяемого С-реактивного. белка. Показано, что наиболее аффективны сорбенты о незаряженными спей-серными грушами.

3. Разработана схема получения О-реактивного белка высокой степени чистоты путем сочетания методов аффинной и ионообменной хроматографии.

4. Показано, что ОРБ модулирует формирование первичного иммунного ответа и гшерчувствительность замедленного типа к ЭВ у мышей. Предварительное введение СРВ животным вызывает подавление антителообразования и стимулирует формирование ГЗТ, а обработка животных после введения антигена, наоборот, усиливает иммунный ответ и угнетает кожную тест-реакцию.

5. Обнаружено, что СРВ усиливает спонтанную пролиферацию лимфоидных клеток In vivo и обладает выраженным митогенным аффектом In vitro, интенсивность которого увеличивается в отсутствие фагоцитирующих и прилипающих клеток.

Б. Установлено, что при введении в организм мышей ОРВ модифицирует способность лимфоидных клеток отвечвть на Т- и В-мито-гены. Впервые обнаружено свойство СРВ In vivo подавлять пролиферацию спленоцитов в ответ на ФГА. Отмечена слабая, но достоверная стимуляция ответа спленоцитов на ЛПС.

7.Впервые показано, что в результате удаления из культуры спленоцитов фагоцитирующих и прилипающих клеток в присутствии ' О-реактивного белка возрастает пролиферативная активнооть ФГА-сти-мулированных, но не ЛПС-активированных лимфоидных клеток. "

- 23 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молчанова (Зотова) Е.Г., Токсамбаева О.Ж., Мысякин Е.Б., Евсг-ратова Н.Г., Серебренникова Г.А. Способ получения аффинного сорбента для выделения О-реактивного белка.-Решение о выдаче патента на изобретение.-Заявка N 5036543/13/017084 от 08.04.92.

2. Зотова Е.Г., Дружинина И.В., Токсамбаева СЛ., Мысякин Е.Б., Рубцов К.С., Серебренникова Г.А, Выделение С-реактивного белка методом аффинной хроматографии // Биотехнология.- 1995.-

N 3-4.- 0. 15-19.

3. Зотова Е.Г., Мысякин Е.Б., Токсамбаева С.Ж., Рубцов К.О.,. Серебренникове Г.А. С-реактивный белок: отроение, свойства и способы получения // Биоорганическая химия.-1995.-N 10.-С.739-752.

4. Myslakine Е.В., Toksambaeva S.G., Krasnyanskaya Т.A., Molcha-nova E.G. (Зотова Е.Г.), Stefanl D.V., Bouvet J-P., Barot-Oior-baru R. Action in vivo of C-reactive protein (OKP) on immune response in mice // Abstr. for the 4 Interscience World Con-renoe on Inflammation.- Geneva, 1991.- aba. 126.

5. Молчанова Е.Г.- (Зотова Е.Г.), Мысякин E.B., Токсамбаева и.Ж. Моделирование образования комплексов С-реактивного белка человека о р-липопротеинами. // Тез. докл. Мевдународного симпозиума по аллергологии и клинической иммунологии.- Алма-Ата, 1992.- 0. 205.

6. Myslakine Е.В., Toksambaeva S.G., Krasnyanskaya Т.A., Molcha-nova H.G. (Зотова Е.Г.), Hyabova Е.А., Barot R. Studies on mechanism of imnunoregulatory aobion of human C-reactive protein // Abstr. for the International conference on cell wall-derived immunomodulatore and synthetio adjuvants.- Sinaya, Roma-mia, 1993.- P.45-46.