Повышение эффективности лазерной флуоресцентной диагностики объектов микробной природы тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

□□34617ЭО

На правах рукописи

Васильев Евгений Николаевич

Повышение эффективности лазерной флуоресцентной диагностики объектов микробной природы

01.04.21 - Лазерная физика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2009

003461790

Работа выполнена в Учреждении российской академии наук Институте общей физики им. А.М. Прохорова РАН.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Кузьмин Геннадий Петрович

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Александров Михаил Тимофеевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Российский научный центр «Курчатовский институт»

Защита состоится 02 марта 2009 г. в 15:00 на заседании диссертационного совета Д 002.063.03 при Институте общей физики им. A.M. Прохорова РАН (119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 38)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОФ РАН. Автореферат разослан 02 февраля 2009 г. Ученый секретарь диссертационного

доктор физико-математических наук Романовский Михаил Юрьевич

доктор физико-математических наук, профессор Казарян Мишик Айразатович

совета Д 002.063.03, к. ф.-м. н.

Т.Е. Воляк

Общая характеристика работы

Флуоресцентный анализ и диагностика с применением лазеров привели к созданию эффективных методов дистанционного и безконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с большой чувствительностью. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазер-но-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTestO). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фотодинамической терапии онкологических заболеваний.

К настоящему времени в медицине наблюдается сокращение сроков лечения заболеваний микробной природы. Существующие микробиологические методы диагностики этих заболеваний не позволяют осуществлять экспрессную постановку диагноза и корректирование процесса лечения. Кроме этого, при анализах приходится иметь дело с совокупностью большого числа различных микробов - возбудителей заболевания, что требует обеспечения дифференциальной диагностики. Поэтому новые методы диагностики заболеваний, позволяющие быстро и эффективно проводить идентификацию микроорганизмов, актуальны и востребованы на сегодняшний день [1,2].

Недостатки существующих методов диагностики микроорганизмов заключаются в использовании лабораторной службы, удаленной от объекта исследования, дороговизне расходных материалов и диагностической аппаратуры, больших сроках проведения анализа и дополнительном использовании высококвалифицированных специалистов. Поэтому поиск новых, качественных и быстрых методов проведения скрининга и мониторинга заболеваний, особенно связанных с микробной инфекцией и лишенных указанных недостатков, обоснован и актуален [3,4]. В этой связи привлекательна лазерная флуоресцентная диагностика, которая обладает определенными преимуществами и большими возможностями для решения проблем скрининга населения в отношении заболеваний микробной природы. Эти преимущества ЛФД обусловлены следующим: экс-прессностью (процедура измерения занимает немного времени и позволяет проводить диагностику в режиме реального времени), хорошей чувствительностью

(позволяет обнаруживать небольшие концентрации флуоресцирующих веществ), дешевизной [1,5,6].

В задаче диагностики гнойных процессов, одонгогенной инфекции, сепсиса и туберкулеза на основании эмпирически выявленных закономерности изменений флуоресцентного отклика в пораженной ткани по сравнению с интактной бьши разработаны некоторые методики диагностики и контроля процесса выздоровления [3,6]. Но они основаны на малопараметрическом прогнозировании наличия ведущего патогена, т.е. индикации присутствия микробной флоры вообще, в то время как для определения видового состава микроорганизмов проб требуется дифференциальный диагностический подход.

Вследствие процессов неоднородного уширения колебательных линий электронных полос органических макромолекул спектрофлуоресценгаые данные, получаемые в результате измерения биологических объектов, не имеют характерных одиночных деталей, по которым можно охарактеризовать данный субстрат, что обычно имеет место для твердых веществ неорганического происхождения. Поэтому информационные свойства флуоресцентного сигнала при этом остаются в малодоступном для тонкого анализа качестве, что приводит к отсутствию информации, необходимой для выявления специфичности исследуемого объекта [5,7,8].

В диагностической практике необходимо иметь на вооружении экспрессную (диагностика по месту лечения и с большой скоростью) аналитическую сторону флуоресцентного метода, что позволило бы проводить качественную и количественную оценку специфики и функционального состояния (живой, мертвый) биологического вещества. Для повышения эффективности ЛФД необходимо развить устойчивые методы расчета видового, родового и иного состава диагностируемого субстрата (например, норма, патология, ведущий патоген и его концентрация). Существуют предпосылки, указывающие на возможность объективной дифференциальной диагностики микроорганизмов на основе лазерно-индуцированной флуоресценции. В частности, это методы классификационные и адаптационные, основанные на поиске и нахождении статистически обусловленных закономерностей соответствия вычисляемого параметра спектральным ингенсивностям объектов. Подобные подходы к анализу сложных по составу и экстремальных по значению данных развиты и используются в разных приложениях. Основная идея таких методов основана на использовании вычислительных моделей, построенных по принципу обучения исходя из опытных данных. Пред-

ставляет интерес возможность вычисления концентраций тех или иных флуоресцирующих веществ в биологическом веществе. Как показано в диссертации, это действительно возможно, если спектральные характеристики флуоресценции разных веществ имеют немного отличающиеся между собой значения [9,10,11].

Существуют объективные факторы, ухудшающие качество диагностики. Один из этих факторов заключается в оптической мутности среды. Поскольку флуоресцентный сигнал должен распространяться в объеме, заполненном биологическим веществом, его характеристики будут искажаться вследствие его рассеяния и поглощения неоднородностями и хромофорами вещества. Для повышения эффективности диагностики следует разработать соответствующие методы учета и устранения подобного искажения. Другая сложность возникает при исследовании суспензии микроорганизмов в малых для спектральных измерений концентрациях. Для флуорофоров, содержащихся внутри клетки, характерно наличие тушения, что не позволяет им эффективно преобразовывать поглощаемое лазерное излучение во флуоресценцию [5]. Возможным средством для увеличения чувствительности здесь могут оказаться способы воздействия, выводящие молекулы из потушенного состояния.

Таким образом, флуоресцентный метод, хотя он и является наиболее чувствительным из существующих способов лазерной диагностики [2], на момент начала проведенного исследования обладал невысокой эффективностью [6,10,12]. Однако существуют отдельные научные работы, показывающие возможность вычисления некоторых интересных с практической точки зрения параметров флуоресценции органических веществ на основе использования вычислений по регрессионно-статистическим моделям. Кроме этого, аналитические свойства флуоресцентного излучения биологических объектов, именно микроорганизмов, не были изучены в достаточной мере, что ограничивало область применения метода. Статистические методы количественного анализа к такому типу данных тоже не были успешно применены.

Цель работы

Целью диссертационной работы является исследование возможностей повышения эффективности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики за счет привлечения многофакторного статистического анализа спектральных данных и повышения чувствительности и селективности лазерной флуоресцентной диагностики за счет учета оптической экстинкции объекта исследования.

Научная новизна

В результате проведенных исследований был сформулирован принцип экспертной системы лазерноконверсионной диагностики таких сложных физических систем, как биологические жидкости человека и ассоциации микроорганизмов, с получением необходимых данных о состоянии и качестве последних на основе лазерно-индуцированной флуоресценции, а также контроля процессов микробной природы. В решении задач дифференциальной диагностики были применены методы статистической регрессии физических характеристик вещества по различному компонентному составу к интересным с точки зрения практики видо-концентрационным параметрам. Многовариашые методы анализа спектрофлуоресценгных данных и анализа специфики биологической материи были применены впервые.

В основу работы легли результаты автора, полученные им за последние три года. К числу приоритетных результатов относятся следующие:

1. Впервые показана возможность получения видо-концентрационных аналитических параметров специфики биологического вещества с применением дополнительных статистически устойчивых методов расчета по характеристикам лазерноиндуцированной флуоресценции.

2. Впервые показано увеличение эффективности и объективности специфического анализа при восстановлении характеристик флуоресценции с учетом оптических параметров вещества.

3. Впервые экспериментально установлено, что применение поверхностно активных веществ приводит к увеличению интенсивности флуоресценции клеток микроорганизмов, что повышает диагностическую эффективность ЛФД.

4. Впервые достигнута высокая эффективность дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики до 80-90%, что сопоставимо с альтернативными высокоточными методами.

Практическая значимость

Исследованные и развитые в работе методы диагностики имеют важное практическое значение, поскольку позволяют реализовать в медицине новые системы экспресс-диагностики заболеваний туберкулезом и микобактериозами, а также многими другими заболеваниями микробной природы. Такие системы могут позволить проводить диагноз соответствующих заболеваний в режиме ре-

ального времени и в клинических условиях. Это исследование является примером способа нахождения экспертных систем анализа материи с применением сверхбыстрых лазерных методов.

Защищаемые положения

1. Применение методов многомерного статистического регрессионного анализа данных лазерной флуоресцентной диагностики биологических веществ позволяет эффективно проводить дифференциальную диагностику ассоциаций микроорганизмов.

2. При восстановлешш спектров лазерноиндуцированной флуоресценции с учетом оптических характеристик вещества точность и эффективность дифференциальной диагностики повышается.

3. Добавление в суспензии микроорганизмов препарата на основе детергента увеличивает интенсивность флуоресценции и повышает чувствительность лазерной флуоресцентной диагностики.

Апробация работы

Результаты работы были опубликованы в следующих статьях и тезисах конференций:

1. М.Т. Александров, Е.Н. Васильев, А.В. Лебедев, Г.П. Кузьмин, Е.М. Хохлов, М.И. Воропаева. Многофакторньш анализ в лазерной флуоресцентной диагностике. Радиотехника и электроника, 2007, Том 52, № 4, с.с. 486-491; M.T.Alexandrov, E.N.Vasiliev, A.V.Lebedev, G.P.Kuzmin. E.M.Khokhlov and M.l.Voropaeva. Multifactor Analysis in Laser Fluorescence Diagnostics. Journal of Communications Technology and Electronics . 2007, Vol.52, No.4, pp. 457-461.

2. Alexandrov M.T., Kuzmin G.P., Gaponenko O.G., Khomenko V.A., Khokhlov E.M., Tikhonevich O.V., and Vasiliev E.N. Laser Fluorescence Spectroscopy and Factor Analysis in Diagnostics of Microbial Diseases. Laser Physics, 2007, Vol.17, No.3, pp. 290-295.

3. Alexandrov M.T., Gaponenko O.G., Ivanova M.A., Khomenko V.A., Kuzmin G.P., Makarova M.V., Pashkov E.P., Sorokoumova G.M., and Vasiliev E.N. Increasing Efficiency of Laser Fluorescence Diagnostics of Microbial Diseases. Laser Physics, 2007, Vol.17, No.12, pp. 1416-1423.

4. Alexandrov M.T., Gaponenko O.G., Khokhlov E.M., Khomenko V.A., Kuzmin G.P., Tikhonevich O.V. and Vasiliev E.N. Application of the multifactor analysis in diagnostics of microbe ethiology diseases on the basis of laser fluorescence spectroscopy 2006, Abst. of V International Symposium on Chemometrics, February 18-23, 2006, Samara, Russia.

5. Alexandrov M.T, Vasilev E.N., Ivanova M.A., Kuzmin G.P. and Makarova M.V. The increasing of efficiency of differential laser fluorescence diagnostics of deceases of microbe origin. Abst. of Symposium for Laser Applications in Life Science, June 11-14,2007, Moscow, Russia.

6. Александров M.T., Иванова MA., Васильев E.H., Хоменко B.A., Гапоненко О.Г. Лазерно-флуоресцентная медицинская технология исследования спектральных характеристик различных микобактерий и ее клиническая апробация. «Лазерная клиническая биофотометрия», М.: Техносфера, 2008, с. 460-477.

7. Александров М.Т., Васильев Е.Н. Перспективная лазерная технология определения скорости гибели живых микробов и экспресс-оценки их чувствительности к антимикробным препаратам. «Лазерная клиническая биофотометрия», М.: Техносфера, 2008, с. 478-484.

8. Александров М.Т., Васильев Е.Н., Миронов А.В. Метод оптической диагностики живых микрообъектов и их нанокомпонентов на основе конверсии оптического излучения в исследуемом материале. «Лазерная клиническая биофотометрия», М.: Техносфера, 2008, с. 553-569.

9. Александров М.Т., Быкова Ю.С., Васильев Е.Н. Повышение эффективности лазерно-флуоресценгной диагностики заболеваний и процессов микробной природы. «Лазерная клиническая биофотометрия», М.: Техносфера, 2008, с. 434-559.

Личный вклад автора

Цель работы была сформулирована Г.П. Кузьминым и М.Т. Александровым. Экспериментальные и клинические исследования проводились совместно с М.А. Ивановой. Личный вклад автора состоял в проведении части экспериментов, математического моделирования, расчетов и написания программного обеспечения. Все вошедшие в диссертацию научные результаты получены лично автором или при его непосредственном участии.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и содержит 107 страниц текста.

В первой главе диссертации приведен обзор литературы и обоснована научная новизна, актуальность и практическая значимость темы исследований. Изложена суть проблемы, представлен перечень экспериментальных и практических методов лазерной флуоресцентной диагностики для целей биологии и медицины, а также методы информационной обработки результатов диагностики. Обоснован выбор материалов и методов для исследования специфичности исследуемых объектов.

Сформулирована цель и задачи диссертационной работы и защищаемые положения.

Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в работе, а также приведена иллюстрация экспериментального подтверждения наличия характерных спектральных кривых флуоресценции различных микроорганизмов. Показано, что спектральные кривые флуоресценции монокультур и суспензий различных видов микроорганизмов, полученные при одних и тех же условиях лазерного возбуждения и измерения соответствующих величин, имеют много схожих черт. Эта схожесть приводит к малой специфичности и информативности и, следовательно, к недостаточной эффективности традиционных методов расчета материальных параметров исследуемого вещества. Однако некоторые микроорганизмы все же имеют различия в спектральном составе флуоресцентного сигнала, и эти различия в своей общности также могут быть свидетельством принадлежности различных видов микроорганизмов к двум группам, использующим кислородный и бескислородный типы метаболизма. Существующие различия могут быть использованы как основа для качественного и количественного анализа биологического субстрата в рамках статистических регрессионных методов.

Спектральные характеристики смесей молекул, очевидно, являются суммой спектральных характеристик соответствующих видов молекул. При наличии количественного описания мы имеем сумму характеристик ограниченного количества компонент, представляющих разные типы молекул в разных концентрациях. В этом случае можно формально описать закон сложения спектров флуоресценции, или характеристик, как векторную линейную форму от концентрационных переменных, равных концентрациям отдельных веществ. Это возможно, поскольку совокупность аппаратно разрешенных спектральных инген-сивностей одного образца можно собрать в числовой вектор. В реальности данная форма всегда будет содержать стохастический член, который от измерения к

измерению будет разным и будет описывать шумовую компоненту - шум приемника и фотонные колебания света. Из существующих математических приемов проведения шумоустойчивых количественно-качественных вычислений наиболее подходящими являются статистические линейные методы факторного анализа (ФА) или метода главных компонент (МГК). Суть этих методов состоит в том, что, имея в наличии большую совокупность спектральных данных для многих образцов и концентрационных параметров к ним, проведя ряд линейных преобразований, направленных на выделение статистически обусловленных независимых факторов для статистических вариаций спектров и отбрасывания шумовой компоненты, определяются соотношения спектральных характеристик к концентрационным параметрам (см. формулы (1) и (2)).

Формализм факторного анализа выражается в разложении матрицы данных на меньшие по размерам матрицы факторов и нагрузок:

X = Б (} + Е. ( 1 )

Здесь X - матрица данных, в которой по строкам уложены значения спектральных интенсивностей для разных образцов, имеет размерность (1*1) (I - количество образцов, 1 - количество спектральных каналов); Б - матрица, задающая факторы объектов в базисе главных компонент, имеет размерность (]>Р) (I - количество статистических факторов); <3 - матрица с размерностью (Рх.Г), являющаяся транспонированной матрицей нагрузок; Е - матрица остатков. При этом предложенный алгоритм предполагает исходный набор признаков центрированным, т.е. имеющим нуль системы координат пространства признаков в центре статистического разброса. Предполагается, что матрица остатков Е подчиняется р-мерному нормальному распределению с нулевым вектором средних значений и диагональной ковариационной матрицей Уе.

Из найденных соотношений между факторами и концентрационными параметрами, используя только матрицы факторов, нагрузок и концентраций, находится градуировочная матрица размерностью (1ХК), где К - количество определяемых биологических компонент (видов микроорганизмов) путем регрессии на главные компоненты (факторы ГК). Для образцов с неизвестным изначально содержимым видовые концентрации находятся по следующей формуле:

1

С^ск+£(хгт^к. (2)

Здесь Ск — концентрация к-го компонента (вида микроба), wok — значения нулевых коэффициентов регрессии, т, — значения компонент вектора, переводящего значения компонент вектора признаков Xj диагностируемого образца в центрированную систему координат признаков.

Способы детектирования спектральных кривых флуоресценции в нашем исследовании основаны на традиционном аппаратном оснащении, принцип действия которого состоит в создании и подводе к образцу возбуждающего излучения, приема флуоресцентного отклика, разложения его в спектр и регистрации полученных спектральных ингенсивностей. В состав использованного аппаратного комплекса для лазерной флуоресцентной диагностики, например «Спек-тролюкс», включены He-Ne лазер на 631.8 нм; сдвоенный оптоволоконный кабель, по которому идет подвод лазерного излучения и отвод флуоресцентного отклика; полихроматор, составленный из линз и отражательной дифракционной решетки; многоканальная полупроводниковая линейка детекторов, каждый из которых регистрирует каждый свой определенный спектральный диапазон излучения. Сигнал от многоканальной линейки детекторов усиливается в усилительной схеме, оцифровывается в аналогово-цифровом преобразователе и подается на порт ввода-вывода ЭВМ. С помощью приспособленного интерфейса измеряемый сигнал удобно отображать, сохранять и обрабатывать на ЭВМ. Программное обеспечение, написанное нами для обеспечения необходимой функциональности диагностического комплекса, соответствует следующим требованиям: реализация удобного интерфейса взаимодействия с оператором, возможность проведения операций пополнения базы данных новыми данными и использование старых данных, возможность использования базы данных для составления необходимой в дифференциальной диагностике экспертной информации и анализа новых данных, по которым в итоге ставится диагноз.

Мы учитываем, что степень экстремальности эксперимента и анализа его результатов накладывают строгие требования к аппаратной и методологической части. Поэтому для объективной диагностики необходимо соблюдать те же условия проведения измерений, что были поставлены во время накопления базы данных. Это относится к длине волны возбуждающего излучения, форме и материалу измерительных кювет, настройке спектральных и регистрирующих приборов. Также должны быть соблюдены одинаковые условия приготовления и обработки биологических образцов.

В то же время существует объективная причина, вносящая независимую от экспериментаторов степень искажения результатов измерений - наличие внутреннего рассеяния и поглощения флуоресцентного излучения самим образцом. Для того чтобы учесть поправку на указанные параметры вещества, дополнительно измеряли спектры пропускания образцов. В результате восстановленные спектры получали по формуле

а(Х)=С1фл.сД)/(а1+а2р(Щ (14)

где а (X) - восстановленный спектр флуоресценции, 1фл.с.М - регистрируемый спектр флуоресценции, Р(А.) - показатель экстинкции, коэффициенты ai и а2 определяются формой кюветы и расстоянием от торца оптоволокна.

Таким образом, на основе математической модели показано, что для сложных по составу биологических объектов возможно использование лазерно-индуцированной флуоресценции для их специфического анализа; выявлено, что для многих видов микроорганизмов флуоресценция имеет доступный специфический характер; обоснованы методы улучшения качества диагностики с использованием корректировок; разработаны концепция и программное обеспечение для дифференциальной диагностики содержимого биологических объектов.

В третьей главе рассмотрены результаты проведения эксперимента по накоплению базы данных флуоресценции суспензий 19 видов микроорганизмов. Для составления вычислительной модели и проведения распознавания видового состава суспензий были выбраны 17 видов из группы микобактерий и два неми-кобактериозных вида. Микобакгерии часто встречаются при так называемых мико бактериозах - заболеваниях, по форме и проявлению очень похожих на туберкулез и включая сам туберкулез. Показано, что практически все перечисленные виды микобактерий обладают флуоресценцией, исключение составляют 3-4 вида, для которых интенсивность флуоресценции на порядок меньше по сравнению с другими видами при пересчете на концентрационную величину, характеризующую количественную меру присутствия, - КОЕ/мл (колониеобразующие единицы на миллилитр). Также показано, что все спектральные характеристики имеют существенные отличия, хотя некоторые бактерии по своим флуоресцентным свойствам оказываются схожими. Эта схожесть проявляется также и в видовой близости по данным бактериологической классификации. Собраны спектральные характеристики по 108 образцам суспензий, в число которых входили

как образцы с чистыми культурами, так и образцы с микст-системами, представляющими собой смеси различных видов микроорганизмов. Всего проведено исследование с 19 видами бактерий, протестировано и анализировано более 200 спектрограмм. На основе этого показано, что уверенная дифференциация микроорганизмов на основе ЛФД для аппарата «Спектролюкс» проходит при концентрациях последних от 108 КОЕ/мл. Также приведены индивидуальные характеристики по каждому виду бактерий, показывающих точность приближения вычисленных концентраций к заданным для большого количества образцов. Один из видов представлен на рисунке 1.

Рис

О 200 400 600 800 1000 Видовая концентрация, отн. ед.

1. Зависимость концентрации,

640 680 720 Длина волны, нм

вычисленной дифференциальным лазерно-флуоресцентным методом, для микроорганизмов вида Мус. bovis в суспензиях со смесями и чистыми культурами живых клеток от заданной на этапе приготовления образцов. Этот вид определяется хорошо, иногда может определяться в суперпозиции с видом Мус. tuberculosis(H37Rv) вследствие близости их спектральных характеристик. На правом графике показан спектр флуоресценции суспензий микроорганизмов вида Мус. bovis в водной суспензии при концентрации 3-Ю9 КОЕ/мл.

В целом, как показало паше исследование, данные концентрации на практике можно использовать для определения присутствия специфических видов микроорганизмов в данном образце. Образец берется в диагностических целях от больного пациента. Вычисляя по данным флуоресцентной диагностики концентрационные параметры подобные этим, можно оценить присутствие видов в образце, беря доверительный интервал из статистических наблюдения. На рисунке 2 показан пример оценки присутствия микроорганизма в образце по результатам вычислений. Из рисунка следует, что вид, обозначенный номером 11, имеет наибольшую концентрацию, а остальные имеют концентрации, незначительно отличающиеся от нуля. Определив доверительный интервал в 150 отн.

ед., можно сделать вывод, что в образце присутствует только вид под номером 11. Полученный результат на 100% совпадает с реальным содержимым в качественном отношении. Т.е. данный вид можно считать ведущим патогеном (микроб с наибольшей концентрацией, который обычно и является этиологическим фактором заболевания). Виды пронумерованы с целью удобства иллюстраций.

С помощью дополнительного измерения спектров пропускания образцов (характеристики оптической экстинкции и рассеивания) были скорректированы спектры флуоресценции образцов с микробами, и при моделировании на основе таких спектральных данных было получено улучшенное прогнозирование видов и концентраций микробов в образцах со смесями. На рисунке 3 показаны вычисленные концентрации 5 видов микробов в двух образцах, по которым происходит их выявление, полностью совпадающее с набором видов в них.

I

4>

а я

о

э

а

Номер вида

Рис.2. Зависимость предсказанной концентрации микробов от номера обозначения вида микробов (19 видов микробов) в образце суспензии микробов чистой культуры 11-го вида (Мус. bovis). В данном образце видно хорошее совпадение предсказанных концентраций с присутствующим в образце одним только видом.

Присутствие на диаграмме отрицательных значений концентраций объясняется тем, что расчет делается на ЭВМ по проекционной алгебраической формуле. И если абсолютное отклонение от нулевой отметки лежит в пределах оцененного доверительного интервала, это можно считать нулевым значением, в противном случае необходимо скорректировать модель. Эффективность диагностики в данном случае достигает 80-90%.

В заключение главы показано, что одной из числовых величин, по которым можно сделать сравнительный анализ качества и объективности диагностики, является коэффициент корреляции вычисленных концентраций и задаваемых

20» •200

тй^-

□ поправка ■ начальная

Рис. 3. Иллюстрация вычисленных концентраций в виде гистограмм для 5-и видов микробов в 2-х образцах со смесями с учетом поправки на характеристики экстинкции среды (столбы слева в каждой паре) и без учета этих поправок (столбцы справа в каждой паре). В первом образце при приготовлении смеси были использованы 1-й, 3-й и 4-й вид, а во втором 1-й, 2-й и 4-й вид микроба. При учете поправок заметно более корректное вычисление концентраций видов микробов (до 80%, после 90%).

в эксперименте. В итоге работы по проведению улучшения эффективности диагностики с помощью учета оптических характеристик вещества был вычислен общий коэффициент корреляции для данных с коррекцией, который оказался равным 0.639. Также вычислен коэффициент корреляции по результатам данных без корректировки 0.589. Данный факт подтверждает большую объективность и точность данных спектрофлуоресцентной диагностики, которые были скорректированы с учетом оптических характеристик микробосодержащих субстратов.

В четвертой главе для повышения чувствительности дополнительно проводили добавление поверхностно активного вещества (ПАВ), детергента, для увеличения уровня чувствительности установки. Этот прием стал довольно актуальным на фоне приведенных в предыдущей главе результатов, где показывается, что аппаратная часть метода диагностики всегда накладывает ограничения на концентрационные границы обнаружения и распознавания. Объективно, это значения примерно 109 КОЕ/мл. Поэтому были исследованы деструктивные свойства нескольких детергентов: аламинола, тригона-Х, ЗОБ, гиппостабила и мирамистина. Многие из этих детергентов не дают прироста интенсивности флуоресценции при добавлении в суспензии с микроорганизмами. Исключением являются аламинол и мирамистин. Однако удобным в спектроскопическом отношении оказался мирамистин. На рисунке 4 продемонстрировано семейство кривых зависимости кратности увеличения интенсивности флуоресценции суспензий микобактерий Мус. йЛегсик^НЗТКу) от длительности экспозиции в растворах мирамистина с концентрациями 0.24 г/мл , 0.06 г/мл и 0.03 г/мл — они обозначены литерами ш1, тЗ и т4 соответственно.

9

£

X

и В

I

Я

Время, сутки

Рис. 4. Зависимость показателя интегральной флуоресценции суспензий микроорганизмов с добавлением водного раствора детергента (вертикальная шкала) от времени экспозиции детергента (горизонтальная шкала). Мус. шЬегси1о818(Н37Яу).

На рисунке видно, что увеличение интенсивности происходит до 20 крат, что подтверждает гипотезу о внутриклеточном тушении большей части флуоресцирующих эндогенных молекул, которые и высвобождают свою способность к флуоресценции после выхода из цитоплазмы во внешнюю среду.

Всего было измерено 28 образцов суспензий микроорганизмов и проанализировано 95 спектров с добавлением мирамистина в концентрации 0.12 г/мл и по измеренным спектральным характеристикам составлена модель концентраций видов микроорганизмов. Результаты проверки точности модели дают эффективность 77% определения полного видового состава произвольной суспензии с бактериями и 85% дифференциации туберкулезных микобактерий от остальных. На рисунке 5 приведены результаты вычислений видовой концентрации микобактерий в различных образцах. На этом графике значения концентраций для образцов, в которых присутствовал данный вид, обозначены квадратами со стрелками, а для остальных - квадратами без стрелок.

Из графика на рис. 5 видно, что образцы, в которых были микроорганизмы данного вида, имеют концентрации, вычисленные по спектрам лазерноиндуци-рованной флуоресценции, превышающие концентрации большинства остальных. Это означает, что в перспективе можно прогнозировать хорошую эффективность определения микобактерий данного вида в субстратах анализированного типа, поскольку по этому параметру с хорошей практической точностью можно определить присутствие данного биологического компонента в биологических жидкостях.

/

13

□

ее

0 Xя

□

□

□

□

□

□

□

а

□

□

5 «

□ □

□

Номер образца

10 15 20 25 Ж

Рис. 5. Вычисленные видовые концентрации для Мус. аушт в разных образцах суспензий микроорганизмов с добавлением мирамистина в концентрации 0.12 г/мл, выдержанных в течение двух дней. Образцы, в которых данный вид присутствовал, обозначены стрелками. Видна относительно хорошая согласованность вычисленных результатов с референтными данными.

В результате проведенных исследований и разработок было достигнуто увеличение чувствительности метода на той же аппаратной базе в 10-15 раз. Т. е. анализу по разработанной нами технологии поддаются образцы с микроорганизмами в концентрациях от 5-107-108 КОЕ/мл и выше с хорошей степенью точности идентификации и дифференциации.

В пятой главе рассмотрены практические приемы экспресс-индикации и экспресс-диагностики заболеваний человека микробной природы по лазерноин-дуцировашюй флуоресценции плазмы крови пациентов. Кровь легко взять у пациентов во время обследования и подвергнуть центрифугированию с тем, чтобы отделить хорошо флуоресцирующую плазму от непрозрачной для оптического диапазона сыворотки. В теоретическом плане все воспалительные процессы, происходящие в какой-нибудь локальной области организма, отражаются на биохимическом составе крови, поскольку при патологических процессах результаты жизнедеятельности патогенных и иных микроорганизмов выбрасываются в кровь, лимфу и иные транспортные жидкости. Поэтому результаты флуоресцентной диагностики плазмы крови будут отражать состояние и заболевания организма и процесса реабилитации человека.

Были проведены исследования по поиску информативных критериев ин-фицированности пациентов микобактериями туберкулеза по спектральным характеристикам флуоресценции плазмы крови. В результате найдены динамические поля величин, имеющих закон вычисления, определяемый эмпирической

градуировочной матрицей. Для исследований было взято множество объектов, являющихся пациентами с различными заболеваниями, плазма крови которых была протестирована методом ЛФД. Общая численность группы составляла 130 человек. Для каждого из лиц этой группы независимыми медико-биологическими исследованиями было установлено нозологическое досье, использовавшееся для нахождения нозологического параметра объектов по спектрам флуоресценции. Группа была разбита на две подгруппы: обучающая подгруппа (60 человек) и контрольно-тестовая подгруппа (70 человек). После проведения анализа главных компонент на обучающей подгруппе были выявлены главные факторы модели и проведена привязка областей локализации полученных данных к заранее известному из досье типу заболевания. Данная привязка приводила к соответствующим регрессионным соотношениям. На контрольной подгруппе оценивалась эффективность распознавания заболеваний путем сопоставления данных модели факторного анализа и фактических данных, взятых у пациентов этой группы из их истории болезни.

Типичные спектры лазерно-индуцированной флуоресценции проб, полученные при длине волны возбуждающего излучения 532 нм, приведены на рис. 6.

Как видно из рисунка, измеренные спектры флуоресценции на вид практически лишены характерных спектральных особенностей и малопригодны для диагностики, непосредственно опирающейся на обнаружение флуоресцирующих ферментных центров, вырабатываемых патогенными бактериями. Вместе с тем использование метода главных компонент для анализа массива таких спектров позволяет определить соответствующие классам диагностируемых заболеваний динамические поля значений параметров, которые описывают характерные пределы изменений этих параметров.

Процедура анализа главных компонент данных, накопленных в обучающей выборке, выявила наличие в пространстве признаков трёх главных компонент (р = 3) и соответствующих общих факторов, обусловливающих особенности измеренных спектров. Значение р = 3 взято по критерию Кэттеля [4], фиксирующего номер итерации, приводящей к максимальному замедлению убыли остаточной дисперсии.

В подпространстве общих факторов точки локализуются в областях, отвечающих определенному, известному из досье обучающей группы, диагностируемому заболеванию.

Рис. 6. Спектры флуоресценции плазмы крови пациентов больных туберкулезом (1,2), пациента с легочным заболеванием (3) и нормального пациента, не болеющего явными заболеваниями (4).

Рис. 7. Диаграмма расположения экспериментальных точек из обучающей (а) и контрольно-тестовой (б) выборки для двух групп пациентов: (+) пациенты, больные туберкулезом; (о) пациенты, больные другими воспалительными заболеваниями. Связь X, У-значеиий и координат образцов в базисе факторного пространства представлена соотношениями (6) и (7).

На рис. 7. представлены диаграммы распределения экспериментальных точек в Я-плоскости для обучающей выборки (4а) и для контрольно-тестовой выборки (46).

Начало двумерной системы координат в 8-плоскости взято в точке пересечения с ориенгационной осью. Ось X для удобства представления выбрана па-

раллельной плоскости первых двух ортов факторного пространства: связь X-проекции и координат образца П, Г2 в факторном базисе задана соотношением

X = ( А - 10 £2 ). (6)

С учетом сделанных замечаний связь У-проекции в 8-плоскости и координат образца П, О, В выражается соотношением

У=(П-4.1 £2+150 0). (7)

Видно, что области сгущения точек или динамические шля, найденные по обучающей выборке, имеют хорошее разделение в данном пространстве. По точкам контрольно-тестовой группы можно заметить, что их доминирующая часть лежит в определенных для своих групп полях. Это свидетельствует о приемлемой эффективности дискриминации пациентов по этим группам.

Подсчет количества точек в динамических полях Б-плоскости позволил оценить статистическую значимость диагностической процедуры, вычисленную как относительная частота правильного заключения при постановке диагноза в полном наборе проб контрольно-тестовой группы. Уровень выявления заболевания туберкулезом по результатам мониторинга с однократным отбором проб в контрольно-тестовой группе составил 80%.

В заключении приводятся основные результаты работы.

Основные результаты работы

1. Впервые для дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики смесей флуорфоров с нехарактерными спектрами успешно применена методика количественного и качественного статистико-регрессионного анализа.

2. Установлено, что учет спектров оптической экстинкции диагностируемого объекта в спектральном диапазоне флуоресцентного отклика приводит к повышению специфичности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики.

3. Для повышения чувствительности лазерной флуоресцентной диагностики предложено и реализовано увеличение интенсивности флуоресценции при выводе локализованных флуорофоров из потушенного состояния.

4. Проведенные клинические испытания подтвердили специфичность лазерно-флуоресцентной диагностики заболеваний микробной природы.

Список литературы

1 Юденфренд С. «Флуоресцентный анализ в биологии и медицине». М.: Мир 1965.

2 Левшин Л.В., Салецкий А.М. Люминесценция и ее измерения. М.: МГУ, 1989, 279 с.

3 Морозова О.А. Экспериментальное обоснование экспресс-метода лазерной флуоресцентной диагностики заболеваний микробной природы: Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 2001. 25с.

4 Воробьев А.А., Несвижский Ю.В. Микрофлора человека и иммунитет: единство и противоположность. Сборник трудов. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармаколопш. М. 1997, с.137-141.

5 Lakowiczh J. Fluorescence Spectroscopy. Wiley, 1982.

6 Александров M.T., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ №97100364 ot21.01.97.

7 Приезжев А.П., Тучин В.В. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989.

8 Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та 1998,350с.

9. Borisov V.B., Nemets V.M., Pol'anskij M.N., Solov'ev A.A. About an opportunity of laser-fluorescent identification of mixes organic compositions on the basis of application of the statistical multifactor analysis of spectra. Russian Symposium "Laser Diagnostics and Analytics in a Science and Technologies" Saint Petersburg, November, 2000. Laser analytics 01,4,3.16

10. Alexandrov M.T., Vasiliev E.N., Kuzmin G.P., Khokhlov E.M. et al. Application of the multifactor analysis in diagnostics of microbe ethiology diseases on the basis of laser fluorescence spectroscopy 2006. Abst. of V International Symposium on Che-mometrics, February 18-23,2006, Samara, Russia.

11. Martens H., Naes T. Multivariative Calibration. Wiley, 1998.

12. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М.: Мир, 1982, т. 1,2.

Подписано в печать £~~

Формат 60x84/16. Заказ № Тираж/^экэ. П. л. /,2!Г

Отпечатано в РИИС ФИАН с оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 499 783 3640

Актуальность

Цель и задачи работы

Защищаемые положения

1 Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику

1.1 Природа флуоресценции

1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры

1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологи и медицины

1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции

1.5 Методы обработки результатов ЛФД

1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД

2 Глава 2. Экспериментально-теоретическое исследование. Материалы и методы.

2.1 Проблемная база для выполнения работы.

2.2 Аппаратура спектральной лазерной флуоресцентной диагностики

2.3 Особенности флуоресценции биологических субстратов с микроорганизмами

2.4 Модель распознавания спектральных флуоресцентных данных и метод ее математического решения

2.5 Практическое и теоретическое планирование эксперимента по накоплению базы данных эталонных образцов для решения задачи распознавания

2.6 Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества

3 Глава 3. Наработка базы данных и исследование спектральных характеристик различных микобактерий для дифференциальной флуоресцентной диагностики.

3.1 Измерения и обработка спектров флуоресценции

3.2 Индивидуальные особенности микробов

3.3 Разработка модели с учетом корректировки спектральных данных с помощью спектров экстинкции исследуемых веществ

4 Глава 4. Применение детергента для повышения чувствительности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микроорганизмов.

4.1 Механизм увеличения интенсивности флуоресценции под действием детергента

4.2 Измерение флуоресценции микроорганизмов под влиянием различных детергентов и определение динамики

4.3 Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина

5 Глава 5. Диагностика заболеваний туберкулеза по измерению флуоресценции плазмы крови

5.1 Схема распознавания и классификации болезни

5.2 Сбор и организация данных лазерно-флуоресцентной диагностики

5.3 Экспериментальная установка и процедура тестирования

5.4 Результаты исследования 93 Выводы работы 99 Научная новизна и практическая значимость 100 Список литературы

Актуальность

Возникновение флуоресцентного анализа и диагностики с применением лазеров привело к созданию эффективных методов дистанционного и бесконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с достижением большой чувствительности метода. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTest©). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фото динамической терапии онкологических заболеваний. Основная задача, решение которой позволит увеличить возможности этих и подобных методов, заключается в разделении компонентных вкладов во флуоресцентный сигнал от многокомпонентной смеси сложных многоатомных молекул.

В связи с прогрессом в лазерных методах лечения заболеваний, связанных с микробной флорой, что привело к существенному сокращению сроков лечения, возникла острая необходимость в экспрессных методах диагностики заболеваний. Это необходимо по двум причинам. Первая — лекарственная терапия сильнодействующими препаратами в избыточных дозах приводит к ухудшению состояния жизненноважных органов. Поэтому необходимо, вовремя определить момент прекращения лекарственной терапии. Вторая - в процессе лечения очень важно отслеживать динамику лечения для его коррекции. Существующие методы диагностики, основанные на микробиологическом анализе, требуют длительного времени для установления диагноза (например, диагностика туберкулеза занимает от 3-х до 6-ти недель.)

Развитие новых методов диагностики на основе исследования характеристик конверсии (рассеяние, флуоресценция, рамановский и нелинейный эффекты и т.п.) лазерного излучения в биологическом веществе имеет проблемный и приоритетный характер в целях диагностики для медицины, и кроме нее также для биологии, промышленности и т.д., поскольку эти методы являются прямой базой новой экспресс - диагностики, которая лишена ряда недостатков остальных способов и имеет неоспоримые преимущества. Из них лазерная флуоресцентная диагностика может сочетать в себе приемлемые для задач диагностики чувствительность и специфичность. Однако сейчас наиболее часто флуоресцентный метод применяется с использованием специфических флуоресцирующих веществ, которые связываются с иммунными телами, специфическими к своему типу микроорганизмов [1,2]. Это связано с тем, что сама по себе эндогенная флуоресценция трудно поддается специфическому анализу. Но все-таки были разработаны методы диагностики для некоторых чистых культур [3].

Несмотря на это методы определения видов микроорганизмов в смесях не разработаны. Такие методы были бы полезны не только в медицинской диагностике, но и, например, в фармакологии для определения чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Так же это было бы востребовано в пищевой технологии, экологии, промышленности, в космических и биосферных исследованиях.

Разработка экспресс-методов индикации и идентификации микроорганизмов является приоритетным направлением в медицинской диагностике. По оценкам ВОЗ, болезни микробной природы продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения многих стран. Острые диарейные заболевания являются причиной более чем 30% смертных случаев среди детей до 5 лет. Острые респираторные заболевания (первичная пневмония) являются причиной смерти 2.2 млн. человек в год [4]. Существующие методы недостаточно быстро позволяют проводить диагноз. Бактериологическое исследование клинического материала от больного, одной из целей которого является выделение и идентификация бактерий, существенно зависит от качества работы на лабораторном и долабораторном этапах. Также здесь необходимо наличие аэробной и анаэробной микробиологической техники исследования материала, которая остается не всегда доступной лабораториям практического здравоохранения. Эти методы трудоемки и требуют слишком много времени. [5]

Выше сказанное обосновывает необходимость разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга заболеваний микробной природы. Целесообразным для решения указанной проблемы является, например использование метода ЛФД. ЛФД обладает рядом потенциальных преимуществ, благодаря которым возможно эффективное решение данной проблемы. Особенно важны здесь преимущества в скорости диагностики и потенциальной неинвазивности.

Однако при применении ЛФД есть несколько проблем, среди которых особенно важна проблема скрытой специфичности. Спектры флуоресценции биологических объектов, в частности микробосодержащих жидкостей, не имеют характерных деталей, посредством которых можно было бы идентифицировать их. Специфические особенности не проявляются в виде узких спектральных линий, а наоборот, рассредоточены по широким перекрывающимся пикам. Поэтому для их анализа требуются методы, позволяющие находить и учитывать эти особенности в широких спектрах. При этом кроме высокой специфичности необходимо добиться одновременно и большой чувствительности, поскольку порог обнаружения и определения концентраций микроорганизмов может оказаться слишком высоким, чтобы не определить содержание микроорганизмов в слабоконцентрированных суспензиях.

Все приведенные доводы указывают на необходимость поиска новых методов определения и идентификации микроорганизмов на основе экспресс-метода ЛФД. Также это относится к достижению необходимых качеств диагностики, таких как чувствительность, дешевизна и экспрессность.

Специфичность флуоресценции микробосодержащих взвесей слабо выражена и была недостаточно исследована к моменту начала работы, и это отражается в неспособности ЛФД без необходимого аналитического инструментария анализировать и диагностировать смеси различных микроорганизмов. Поэтому целью данного исследования является разработка метода и аппаратуры для объективной оценки специфичности флуоресценции нативных биологических субстратов (микробов) и их смесей в микробосодержащих жидкостях. В рамках достижения поставленной цели решаются задачи набора спектров флуоресценции нескольких видов микробов в зависимости от концентраций, составления метода, алгоритма и программного обеспечения дифференциальной диагностики микробов в составных взвесях и поиска способов улучшения диагностических качеств снимаемых данных при помощи использования детергента для увеличения относительной интенсивности флуоресценции и учета влияния некоторых оптических характеристик среды на спектры флуоресценции.

Цель и задачи диссертационной работы

Цель: Исследование и разработка метода дифференциальной диагностики объектов микробной природы на основе спектральных измерений лазерно-индуцированной флуоресценции. Задачи:

1. Экспериментально-теоретическое обоснование и метод обработки диагностических данных с целью дифференциации и видовой идентификации микробосодержащих биологических субстратов.

2. Экспериментальное и исследование флуоресценции биологических субстратов, взятых непосредственно от пациентов.

3. Исследование флуоресценции различных микробов и их дифференциация методами многомерного статистического анализа.

4. Повышение эффективности видовой идентификации микробов на основе учета характеристик рассеивания и поглощения биологического субстрата, содержащего флоурофоры микробов.

5. Осуществление программной реализации дифференциальной диагностики микробосодержащих биологических субстратов.

6. Тестовые испытания разработанной системы дифференциальной диагностики, возможности и перспективы.

Защищаемые положения

1. Применение методов многомерного статистического регрессионного анализа данных лазерной флуоресцентной диагностики биологических веществ позволяет эффективно проводить дифференциальную диагностику ассоциаций микроорганизмов.

2. При восстановлении спектров лазерноиндуцированной флуоресценции с учетом оптических характеристик вещества точность и эффективность дифференциальной диагностики повышается.

3. Добавление в суспензии микроорганизмов препарата на основе детергента увеличивает интенсивность флуоресценции и повышает чувствительность лазерной флуоресцентной диагностики.

Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику 1.1 Природа флуоресценции

Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от скорости процесса и природы основного и возбужденного состояний. В сингл етном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что спины этих электронов спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены по спинам, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция -это испускание, происходящее за короткое время, обычно при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически "разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них ~108 с"1. Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции-10"8 с (10 не). Фосфоресценция — это испускание, происходящее за более длительное время, обыкновенно при переходе между состояниями различной мультиплетности. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции — от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации. [6]

Длина волны, нм

Волновое число, см-'

РИС. 1.1. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина.

В органических веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях. Структуры типичных органических флуорофоров содержат одноядерные или многоядерные ароматические кольца. В отличие от молекул органических ароматических соединений ионы элементов в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе [6].

Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис. 1.1. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких как перилен, имеют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний [28].

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским [6] , Основное, первое и второе электронные состояния обозначают 80, 8ь и соответственно (рис. 1.2), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10"1э с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер (принцип Франка -Кондона).

Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.1). Относительное число молекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описывается распределением Больцмана:

Отношение Я числа молекул в двух состояниях с разностью энергий АЕ дается выражением

Я = е'АЕ/кТ (1.1) где к - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При комнатной температуре 300 К отношение Я равно-0,01. Следовательно, большинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном состоянии; именно такие молекулы и поглощают свет.

Рис. 1.2. Диаграмма Яблонского.

Из-за большой разности энергий между уровнями Бо и Б) по существу, ни у каких флуорофоров состояние Б] не может быть заселено термическим путем. Отметим, однако, что даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах [28].

За поглощениемета обычноедует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровнястояний ($1 либо 82). За некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация намый нижний колебательный уровеньстояния Б]. Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10"12 Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10" внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденногостояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов намый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденномустоянию (рис. 1.2). Термическое равновесие достигается за время порядка 10 " В большинствеучаев электронное возбуждение нельно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательныеруктуры, проявляющиеся вектрах поглощения и испускания, сходны [6].

Молекулы в состоянии 81 могут также подвергаться конверсии в первое триплетное состояние Т,. Испускание из Т, называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из Б, в Т, называется интеркомбинационной конверсией. Переход из ^ в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.2: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях [6].

Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения.

Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение — атомы в газовой фазе). Потери энергии между возбуждением и испусканием, которые и составляют феномен уменьшения энергий квантов испускания по отношению к квантам возбуждения, неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая колебательная релаксация. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. Столкновения между молекулами приводят к релаксации, а в жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния 81. Эта релаксация происходит за время порядка 10"12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания[6].

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из 8о в Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.1). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний Эо и 8].

Длина Волны, им

1 г 1 л А 1 1 ЛД о-о Поглощение -1. ,1 1 | \ ¡Испускание \ 1 1 I 1 ^^

1 0,

§ волновое число, с»'

Рис. 1.3. Спектры поглощения и испускания дифенила.

Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила.

Вслед за возбуждением фенольный протон в молекуле флуорофора переходит к акцепторам протона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что многие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы, называемые эксимерами (сокращение от excited dimers — возбужденные димеры). Испускание эксимеров смещено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура. Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с аминами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужденном состоянии, называют эксиплексами.[28]

Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений. Смысл этих параметров состоит в описании кинетики флуоресценции. Не указывая подробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию Si, большое внимание обращаем на процессы, которые ответственны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние So(k) [6].

Квантовый выход флуоресценции — это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Квантовый выход определяются выражением:

Q = Г/(Г+к), (1.2) где Г - константа скорости излучательной дезактивации флуорофора, 1с -скорости безызлучательной дезактивации в основное состояние [6].

Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испускания, т. е, к « Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь.

Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресценции Ю"10 не. Время затухания выражается следующей формулой т = 1/(Г +к) (1.3)

Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием любых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания [6].

Явления флуоресценции и фосфоресценции многих веществ, как в газовой так и в твердой и жидкой фазах, служат основой для их количественного и качественного анализа. Преимущества диагностики и анализа веществ на основе люминесценции перед другими методами заключаются в большой чувствительности и специфичности. В основном анализ флуоресцентных характеристик, как видно, происходит через прямое их измерение, например, в случае флуоресценции газообразных веществ идентификация возможна по спектральным интенсивностям на отдельных длинах волн.

1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры.

Применение явления флуоресценции для исследования веществ, определения их свойств, качественного и количественного анализа флуорофоров а также в различных задачах контроля процессов предполагает наличие методов и инструментария для возбуждения, измерения характеристик флуоресценции и процедуры пробоотбора исследуемого материала. Во-первых, флуоресценция — очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Это определяет задача исследования, соответственно выбор аппаратуры регистрации должен быть согласован с требованиями диапазона параметров эмиссии вещества. Во-вторых, для выбора источника возбуждения флуорофоров необходимо знать параметры возбуждения, которые можно получить, исследуя, например, спектры поглощения вещества, и этот источник должен быть достаточно интенсивным. Подготовка и дозирование исследуемого материала налагает некоторые ограничения на виды веществ и их относительную флуорофорную чистоту. Если производится анализ слабоконцентрированного флуорофора, то флуоресценция примесей должна иметь тоже небольшую величину, сравнимую с флуоресценцией аналита. Флуоресцентный метод дает основные преимущества, делающие его иногда почти единственным методом качественного анализа [6,7, 36].

Сейчас используют несколько способов возбуждения образцов флуоресцирующих веществ. В основном применяют возбуждение оптическим излучением относительно мощного источника, в традиционной схеме в качестве которого выступает тело, испускающее излучение со сплошным спектром. Этими могут быть наиболее универсальные источники ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 - 700 нм (рис. 2.3), за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы; этим обусловлены пики вблизи 450 им. Интенсивность испускания резко падает в области < 280 нм [8,9 3,4].

Л ли г, а им

РИС. 1.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых ламп.

Ртутные лампы высокого давления. Излучение этих ламп более интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр. Обычно необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для возбуждения данного флуорофора [10].

Ртутно-ксеноновые дуговые лампы имеют более высокие интенсивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы, а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Однако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых ламп (рис. 1.3). Ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра ртути, которые используются главным образом для целей градуировки [10].

Поскольку источники вышеприведенного вида обладают сплошными спектрами излучения, для выбора излучения необходимой частоты, задаваемого спецификой задачи, вырезают всю остальную часть излучения источников с помощью монохроматора, который называется монохроматором возбуждения [9]. При этом, конечно, относительная интенсивность возбуждающего излучения будет мала по сравнению с мощностью источника. Но существует другой тип источников излучения, обладающих высокой спектральной мощностью и монохроматичностью, называемых лазерами. При возбуждении такими средствами можно достигнуть не только большой чувствительности, но и стабильности измеряемых при этом характеристик флуоресценции, а в исследовании газообразных веществ также высокой селективности. Появление лазеров открыло расширенные возможности флуоресцентных методов в науке, промышленности, медицине и технике [12,13].

Для регистрации флуоресценции и измерения ее характеристик существуют несколько схем, в основе которых лежит оптическая обработка светового отклика вещества и детектирование получаемого обработанного оптического сигнала. Чаще всего необходимо измерить как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектр испускания представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света. Для измерения анизотропии флуоресценции на пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Для точного измерения анизотропии флуоресценции требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль может иметь дополнительный оптический путь в стороне от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом, более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополнительный оптический канал не требуется [11].

Появление импульсных лазерных источников расширило методы регистрации такой характеристики флуоресценции, как ее кинетика. Использование пикосекундных и фемтосекундных лазеров, имеющих короткие длительности импульсов, в сочетании быстродействующими оптическими затворами позволяет регистрировать временные зависимости флоуресценции многих органических флуорофоров. Такие измерения проводят для исследования динамики молекулярных процессов и химических реакций, а также для анализа вещества с большей специфичностью [13,14,15].

При использовании сильнофокусированных пучков света для возбуждения флуоресценции становится возможным применение метода флуоресцентной коррелометрии. Он основывается на принципе регистрации самокоррелированности флуоресцентного сигнала вследствие флуктуации плотности оптически задействованных молекул внутри пучка. Такой метод позволяет с большой точностью определять концентрацию вещества в растворе и специфику [16,17,18].

Для биофизических и медицинских исследований и других областей исследования и диагностики применяют в основном спектрофлуоресцентный метод при возбуждении биологического субстрата лазерным • излучением. Сигнал регистрирут при помощи полихроматора, соединенного с многоканальной ПЗС - линейкой, оцифровывают и подают на вход компьютера, который обрабатывает результаты измерений. Для удобства при эндокавитарных исследованиях возбуждающее излучение и флуоресцентный сигнал подводят к исследуемому участку через оптоволокно [19,20].

В большинстве практических задач биомедицинских исследований применение флуоресцентного метода требует наличия специфических флуоресцирующих веществ, вводимых в исследуемый материал в качестве зондов и маркеров. Такой подход сопряжен с дополнительными расходами и не является универсальным вследствие необходимости постоянной разработки флуоресцентных материалов для расширения области применения такой диагностики. Напротив, детектирование и спектральный анализ флуоресценции природных флуорофоров используется сравнительно узкоспециализированно, хотя сами методики на основе этого являются более универсальными и менее затратными и трудоемкими [46].

Получаемый сигнал во всех измерительных системах для осмысления несомой им информации требует наличия специфических методов его обработки и экспертной системы прогнозирования и диагностики на результатах информационного преобразования. При этом получаемый в результате измерений сигнал должен быть тоже хорошего качества. Эти качества задаются такими параметрами измерительных установок, как чувствительность (минимальная концентрация определяемых веществ), воспроизводимость (повторение сигналов в хорошем качестве от измерения к измерению), объективность (насколько производимый на основе получаемого сигнала анализ соответствует действительности). По сравнению с другими методами анализа, такими как бактериологический, флуориметрический, например реализуемый на аппарате «Спектролюкс МБ», уступает в чувствительности (102 против 10б КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл), однако намного превосходит по скорости (несколько недель против минут) и объективности (не всегда удается высевать материал бактериологическим методом). Аппаратура для диагностики должна снабжаться методическим обеспечением, доступным для использующего аппаратуру врача, или другого специалиста. Также важна стандартизация всех этапов диагностики, например пробоотбора, когда взятие образцов и их предварительная обработка происходит в одинаковых условиях. 1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологии и медицины.

Взаимодействия излучения с живым веществом протекают в основном с участием сил электромагнитного взаимодействия заряженных элементарных частиц атомов и молекул с полем излучения, а также дополнительно с участием их обменного взаимодействия друг с другом. При этом наблюдаются такие эффекты, как отражение, рассеяние, поглощение, генерация акустического поля, нелинейные эффекты, флуоресценция и.т.д. [6, 20, 37].

Свет, отраженный от организма, в первую очередь дает информацию о содержащихся в ткани фотохромах и структуре ткани. Если ткань содержит собственные или введенные извне флуорохромы, то индуцированная светом флуоресценция несет информацию о многих биологических процессах, протекающих в организме. Стандартной целью медицинской диагностики, основанной на флуоресценции вещества организма, является в конечном итоге принятие решения о принадлежности тестируемого больного к той или иной группе известных заболеваний [46].

Из большого числа видов биологических веществ есть достаточно много таких, которые являются природными, или естественными, флуорофорами. Это означает, что при соответствующих оптических способах возбуждения и регистрации можно наблюдать некоторый флуоресцентный отклик, характеризующий возбуждаемый материал. Иногда содержание эндогенных флуоресцирующих веществ в составе живых систем и организмов настолько велико, что флуоресценцию можно наблюдать визуально. Такую сильную флуоресценцию дают, например, все зеленые части фотосинтезирующих растений, поскольку пигмент хлорофилл состоит из ароматического порфиринового комплекса, обладающего кроме сильной окраски еще относительно большим квантовым выходом флуоресценции [22]. На основе регистрации лазерно-индуцированной флуоресценции фотосинтезирующих зеленых организмов существуют методы диагностики состояний садовых и культивируемых растений, наличие болезней, минеральной специфики питающих растения почв, а также дифференцирование различных типов водорослей, обитающих около поверхности океанических вод, и.т.д. [22,40]. Таким образом, диагностика на основе регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров может быть универсальным методом определения специфики и состояния живых организмов и их систем, таких как не только растения, но и все остальные организмы. Этот пример диагностики на основе флуоресценции растений не уникален в своем роде, поскольку кроме хлорофилла можно наблюдать флуоресценцию других природных органических веществ. Ниже приведены некоторые классы флуоресцирующих веществ, встречающихся в живых системах.

Большинство порфиринов дают флуоресцентный отклик, который можно наблюдать при возбуждении излучением из широкого диапазона длин волн. Порфирины и их производные входят в разнообразные биологически активные соединения, такие как белковые комплексы различных фотосинтетических аппаратов растений и водорослей, ферментирующие комплексы, осуществляющие различные звенья дыхательного внутриклеточного цикла (цитохромы, пероксидаза, оксидаза, каталаза), в состав различных гемопротеидов (гемоглобин, миоглобин) и мн. др. [65]. Они представляют собой производные тетрапиррола порфина, состоящего из 4-х пиррольных колец соединенных метиленовыми группами. Такая конфигурация позволяет этим молекулам разнообразным образом взаимодействовать с большим количеством видов минеральных и органических веществ, что и определяет их большую биологическую активность. В тоже время электроны, делокализованные в ароматических кольцах, могут эффективно возбуждаться оптическим путем и совершать флуоресцентную релаксацию возбужденных состояний. Флуоресценция порфиринов может быть индуцирована излучением с длиной волны от 250 нм до 700 нм [23].

В организме человека биологически-активными являются металлопорфирины; они, как правило, флуоресцируют слабо. При образовании комплексов с белками (гемоглобин) они даже гасят флуоресценцию. При отрыве атома железа от простетической группы внутриклеточные гемопорфирины начинают флуоресцировать. В тканях и препаратах ферментов, способных к осуществлению начальных этапов синтеза порфиринов, наблюдается усиление интенсивности флуоресценции. Протопорфирины — часть молекулы гемоглобина, найдены в свободной форме в эритроцитах, что придает им красную флуоресценцию низкой интенсивности. При недостаточности железа, например, при отравлении свинцом, содержание протопорфиринов растет [36]. Основным порфирином, присутствующим в норме в моче и кале, является корпропорфирин. Примерно половина корпропорфирина в свежей моче находится в не флуоресцирующей форме. При довольно мягких условиях окисления не флуоресцирующая форма переходит во флуоресцирующую. В результате распада порфиринов, проходящего в несколько этапов, образуется уробилиноген, часть которого из производных желчного сока вновь всасывается через стенки кишечника и удаляется из кровотока с кровью, но при некоторых патологических процессах выводится с мочой. На воздухе уробилиноген окисляется до уробилина, который флуоресцирует[37].

Белки флуоресцируют, как правило, во всех состояниях агломерации и почти для всех природных разновидностей. Триптофан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются следствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок -белок и денатурацию. Кроме того, максимумы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 —350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 не. Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флуоресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает испускание тирозина. Как и для фенола, энергия ионизации тирозина очень сильно уменьшается при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоянии. Флуоресценция белков наблюдается при возбуждении ультрафиолетовым излучением.

Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. 1БШАРЬе из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как У-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а время жизни ~6 не.

Кофакторы МА1)Н флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. не флуоресцирует. Время затухания флуоресценции ЫА1)Н в водном буфере составляет примерно 0,4 не. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании ИАОН с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза, что обычно интерпретируют как следствие связывания МАПН в вытянутой конформации, которое подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах.

Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглощают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD составляют 4,7 и 2,3 не соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплексы-ассоциаты, в которых флуоресценция флавина потушена аденином (статическое тушение). Флавопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.

Флуоресценция органических веществ имеет специфику, вследствие которой обычные спектрально-аналитические методы малопригодны для идентификации: флуоресцентные спектры таких объектов имеют контуры, не имеющие каких либо ярко выраженных, узкополосных характерных особенностей. Многие исследователи полагают, что флуоресцентная спектроскопия биологических сред сама по себе, (т.е. без привлечения дополнительного аналитического инструментария) не обладает достаточными аналитическими характеристиками и трудно интерпретируема в терминах медицинского обследования вследствие многих факторов, обуславливающих особенности спектра сред сложного молекулярного состава. Следует отметить также, что помимо многокомпонентности биологического субстрата, спектры флуоресценции неспецифичны вследствие однородного и неоднородного уширения линий, присущих конденсированной фазе вещества. Таким образом, теоретическая интерпретация спектров биологических объектов представляет значительные трудности[25,26].

Встречающиеся в живых системах классы флуорофоров меняют люминесцентные свойства в зависимости от различных факторов: сопряжения с ферментными центрами, кислотности среды, различных стадий биохимической активации. Все эти факторы в совокупности определяют форму кривых спектральных зависимостей флуоресцентного излучения таких систем. Определение параметров исследуемых объектов по данным спектрального анализа традиционными методами, учитывающим выделенные значения на отдельных длинах волн, невозможно из-за сильного перекрытия спектральных полос отдельных молекул [27,28,29].

Вместе с тем, несмотря на отмеченные недостатки, развитие методики количественного и качественного спектрального анализа для диагностики сложных органических сред продолжается, в особенности с привлечением дополнительных аппаратных и математических средств получения диагностических данных. Отчасти, это вызвано относительной дешевизной, быстротой и удобством метода. Например, флуоресцентный метод, вследствие высокой чувствительности, продолжает оставаться перспективным в отношении диагностики бактериологических заражений, позволяя предсказать распространение септического процесса уже на стадии его начального развития [3,30]. Примером может также служить работа [25], в которой метод лазерно-флуоресцентной диагностики был дополнен процедурой обработки спектров при помощи искусственных нейронных сетей [90,91].

Сейчас ЛФД биологических субстратов в основном применяется с использованием специфических флуоресцирующих индикаторных веществ [31], позволяющих по их флуоресценции определять содержание определенной компоненты. Не менее информативной является и эндогенная флуоресценция биологического субстрата, т.е. флуоресценция без маркирующих добавок [23,25].

К примеру, применение оптоволоконного катетера для возбуждения и измерения автофлуоресценции внутренней стенки артерий позволяет проводить диагностику атеросклероза [32]. Поскольку при заболевании атеросклерозом ткань начинает флуоресцировать со спектром, иным чем при норме, то на основании спектральных различий можно определять заболевание.

Рис. 1.5 Спектры флуоресценции стенки артерий норме (1) и при патологии (2).

Большой эффективностью обладает диагностика раннего рака и предрака, поскольку опухлевая ткань хорошо поглощает и накапливает препараты на основе порфиринов, обладающих выраженной флуоресценцией [33]. Результаты исследований на сегодняшний день позволяют проводить обнаружение микробной субстанции в пробах, взятых у больных пациентов.

Показано, что использование красного излучения Не-№ лазера в качестве возбуждающего света позволяет преимущественно возбуждать порфирины дыхательных ферментов и продуктов метаболизма микробов, что является основным признаком, по которому определяют присутствие микробов и их концентрацию в биологической жидкости. В зависимости от семейства порфиринов, участвующих в разных механизмах дыхания, кислородного или бескислородного, спектры их флуоресценции качественно меняют свой вид [65]. Это может быть продемонстрировано следующим экспериментом, выполненным в [65]. Одной из важных компонент в цикле синтеза природных порфиринов является аминолевуиновая кислота (ALA). Она служит исходным веществом для синтеза эндогенных порфиринов в цикле трикарбоновых кислот. Как следует из изменений в спектрах флуоресценции на рис. 1.5-1.8 добавление в агар ALA при культивировании стимулирует выработку порфиринов у представителей аэробной - Ps. aeruginosa и факультативно анаэробной микрофлоры со смешанным метаболизмом - S. aureus, вследствие чего флуоресценция увеличивается у Ps. aeruginosa в 2 раза, а у - S. aureus в 2.5 раза. В спектрах этих бактерии наблюдается увеличение амплитуды пика на длине волны 665 нм. У представителя анаэробов - В. uniformis и факультативного анаэроба с бродильным типом метаболизма Е. faecalis изменений интенсивности флуоресценции, а также характера спектра не выявлено. По всей видимости, флуоресценция на длине волны 665 нм отражает начальные этапы синтеза порфиринов из ALA в цикле Кребса. длина волны (нм)

Рис. 1.5 Увеличение интенсивности флуоресценции у Ps. aeruginosa после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева - отраженная лазерная компонента.

600 » длина волны (мм)

Рис. 1.6 Увеличение интенсивности флуоресценции у S. aureus после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева - отраженная лазерная компонента.

600 650 700 750 $ длина волны (нм)

Рис. 1.7 Отсутствие изменения интенсивности флуоресценции у Е. faecalis после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева - отраженная лазерная компонента.

600 650 700 7SO длина волны (нм)

Рис. 1.8 Отсутствие изменения интенсивности флуоресценции у В. uniformis после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева - отраженная лазерная компонента.

Таким образом, добавление ALA в агар стимулирует синтез порфиринов, приводящий к увеличению интегральной интенсивности флуоресценции у облигатных аэробов и факультативных анаэробов со смешанным типом метаболизма, и не оказывает влияния на флуоресценцию микроорганизмов с бродильным типом метаболизма. Использование этой методики позволит дифференцировать различные группы микроорганизмов по их метаболизму, особенно в тех случаях, когда необходимо быстро дать ответ о том является ли возбудитель аэробом или анаэробом [65].

Есть предложение использовать флуоресцентный метод для экспресс-анализа жизнеспособности донорского сердца до, во время и после операции. Хирургам-трансплантологам каждый раз приходится решать проблему, насколько подходят для пересадки донорские органы. Надо быстро понять, жизнеспособны ли органы или нет [24]. В качестве экспериментального материала использовали миокард сердца свиньи: облучили образцы миокарда свиньи лазерными лучами со специально подобранными параметрами и исследовали спектры индуцированного излучения. Образцы хранили при температуре 4 градуса в физиологическом растворе (в таких условиях жизнеспособность ткани с течением времени снижается). В спектре миокарда, облученного KrF-эксимерным лазером, всегда присутствует пик с максимумом на 330 нм, который возникает из-за свечения триптофана, и другой пик в области 450 нм. С течением времени спектр изменялся, интенсивность полосы 450 нм уменьшалась по сравнению с триптофановым пиком. При облучении азотным лазером, обнаружены два пика с максимумами на 380 и 470 нм. Первый, может быть связан с наличием в ткани коллагена и эластина, а второй - с флуоресценцией вещества NADH, которое участвует в дыхательной цепи митохондрий. Со временем интенсивность пика 470 нм существенно падала, что может быть информативным параметром жизнеспособности какого либо органа, в частности сердца [24].

Все перечисленные выше примеры эндогенной флуоресцентной диагностики основаны на найденных эмпирических закономерностях, которые остаются за рамками теоретического описания, что не могло бы придать им свойство универсальности и возможности контроля объективности получаемых числовых данных. Данное обстоятельство обусловлено вынужденностью подобного описания биологического вещества по свойствам флуоресценции, информационное содержание которой являются достаточно скрытой и не поддающейся существенному анализу простыми модельными математическими способами [35].

Однако измерение эндогенной флуоресценции обеспечивает спектральной информацией, качество которой может быть достигнуто до удовлетворительного для необходимого анализа уровня. Для такого типа данных необходимо подобрать подходящий аналитический инструмент, обладающий необходимой точностью, информативностью, устойчивостью и воспроизводимостью результатов анализа. Как отмечалось выше, вычислительные методы, применяемые для спектроскопии специфических эмиссионных линий, здесь не подходят, что вызывает необходимость поиска и разработки соответствующего инструментария [46].

Новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции - нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия [40]. Данный вид спектроскопии позволяет обойти несколько препятствий на пути использования флуоресценции для анализа молекулярных параметров органических веществ. Первое препятствие - малая специфичность из-за большой ширины полос флуоресценции органических веществ и перекрытия полос разных веществ, одновременно присутствующих в природных биологических субстратах. Обратим внимание на то, что в спектре помимо полос флуоресценции органических веществ почти всегда присутствует полоса комбинационного (рамановского) рассеяния света молекулами воды. Это очень важный компонент спектра, который широко используется для диагностики водных сред. В частности, он может выступать в качестве внутреннего репера, на который нормируется интенсивность флуоресценции вещества. Второе препятствие - идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса органических веществ, поскольку, как правило, флуоресцирующие центры в них одни и те же, например пигмент хлорофилл А в водорослях, составляющих фитопланктон. Третье препятствие — изменение состояния молекулярных органических комплексов, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации молекул по интенсивности флуоресценции и затрудняет проведение диагностики состояния комплексов [40].

Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики с использованием нелинейной флоуриметрии можно используя методы решения обратных задач. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. В рамках одного метода нелинейной флуориметрии (и, следовательно на одном приборе) могут быть одновременно определены несколько параметров путем обработки одной кривой насыщения. Правда, чем больше число этих параметров, тем более мощные математические методы решения обратных задач (такие, как метод искусственных нейронных сетей) необходимо применять для достижения удовлетворительной точности [41].

Применение вычислений по данным нелинейной флуориметрии дает большие возможности при исследовании чистых растворов флуоресцирующих веществ, например при определении параметров электронной структуры вещества и констант межмолекулярного взаимодействия. Однако применение таких данных для диагностики сложных по составу органических веществ является затрудненным, вследствие сложности, большого количества компонент и соответственно маленькой точности таких вычислений. Также большая интенсивность лазерного пучка будет мешать объективному процессу снятия спектральных данных живых биологических объектов, поскольку плотность энергии при этом близка к ионизирующей [46].

Существуют методы контроля качества пищевой продукции, основанные на флуоресценции, также контроля производственного процесса. Применяют метод флуоресцентной диагностики для определения степени загрязнения природных источников воды [46]. Например, посредством облучения микроорганизмов излучением красного видимого диапазона (например, излучением Не-№ лазера), когда наблюдается всегда преимущественная флуоресценция производных порфина.

Для проведения несложной оперативной и информативной диагностики и анализа биологического вещества на основе эндогенной флуоресценции лучше всего подходит методика снятия обычных спектральных характеристик лазерно-индуцированной флуоресценции в сочетании с устойчивыми методами специфической обработки информации. Приведенные выше примеры демонстрируют возможности применения эндогенной флуоресценции для оценки состояния, качества и диагностики различных биологических объектов. Существующие методы диагностики пока обладают малой явной информационной емкостью и применяются в частных случаях, таких как определение общей обсемененности кариозных полостей к примеру. Для проведения эндогенной диагностики микробосодержащих жидкостей необходимо установить одинаковую процедуру приготовления образцов, посредством центрифугирования или предварительного высевания материала, которые проводят при одинаковых условиях.

1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции.

В исследованиях биологических процессов на молекулярном уровне часто применяют искусственные флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие люминесцентные параметры: высокую квантовую эффективность, выраженные специфические спектральные свойства, избирательность и чувствительность к разным физико-химическим процессам. Для изучения свойств биологической клетки и ее составных химико-структурных частей разработано много флуоресцирующих молекулярных меток и зондов. Ниже приведены некоторые из них.

Изоцианаты и изоцианаты флуоресцина и родамина. Эти красители широко используют в качестве меток для белков. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков, особенно в тех случаях, когда проводят измерения поляризации. Это вещество давно известно и имеет удобное время жизни флуоресценции 10 не). На спектр испускания дансильной группы сильно влияет полярность растворителя. Нафтиламинсульфоновые кислоты, 1 -Анилино-8-нафталинсульфоновая кислота (1,8-ATS или ANS), 2-п-толуидинилнафталин-б-сульфоновая кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантрацен и 1,6-дифенилгексатриен (DPH). Другие зонды, как, например PATMAN, очень чувствительны к фазовому состоянию липидных бислоев. Нуклеиновые кислоты - при введении этиленового мостика флуоресценция АТФ и его производных становится более интенсивной. Таким образом, можно подобрать или синтезировать флуоресцентные метки, назначение которых отвечает целям биохимических исследований [28].

При диагностике микробов применяют флуоресцирующие метки и квантовые точки, снабженные специфическими антителами [1,38]. При помощи таких тел, которые могут быть снабжены также магнитными центрами, можно сортировать и проводить дифференциальную диагностику микроорганизмов практически в любой комбинации. Например, для решения проблем экспресс диагностики туберкулеза в [39] был разработан препарат иммуномагнитных частиц «Микосорб», который состоит из ферромагнитных частиц размером 2-5 микрон, связанных хелатным методом с большим количеством белка антител к микобактериям - иммуноглобулина IgG (80-90 мг на 1г магнитного носителя), полученного из высокотитражных сывороток кроликов, многократно иммунизированных инактивированными микобактериями. Препарат вносится в мокроту от пациента, где предположительно содержатся микобактерии туберкулеза. Поскольку частицы снабжены специфичными антителами, они присаживаются к стенкам микробных клеток. Обладая магнитными свойствами, эти частицы позволяют транспортировать большое количество микобактерий к телу, обладающему магнитным полем, которое можно погружать как внутрь образца, так и подводить к внешней стенке пробирки. Данный метод концентрирования микобактерий из мокроты с помощью магнитных частиц, связанных с антителами к микобактериям, используется для увеличения эффективности их обнаружения в мазках при люминесцентной микроскопии. Такой метод позволяет также провести селективную сепарацию микобактерий из материала мокроты и использовать их для проведения ПЦР, минуя стадию экстракции ДНК [39].

При использовании экзогенных флуоресцирующих веществ, как вспомогательных флуоресцентных агентов, улучшение диагностики в основном направлено на разработку и усовершенствование флуоресцирующих маркеров и зондов, что проводится для каждой задачи отдельно, и методы достаточно известны. Это обуславливает неуниверсальность методов экзогенной флуориметрии и дороговизну такой диагностики вследствие применения флуоресцентных веществ, разработка которых происходит для специального типа субстанции. Так как, например, микрофлора организма может содержать большое разнообразие варьируемых видов микроорганизмов, и применение экзогенной флуоресценции для ее диагностики наталкивается на существенные проблемы. Это приводит к большей целесообразности направления по исследованию возможностей преимущественно эндогенной флуориметрии.

1.5 Методы обработки результатов ЛФД.

Наиболее часто оптическая флуоресцентная спектроскопия применяется в биологии медицине для выявления физических и химических изменений в клетках и тканях, а также для дифференциации доброкачественных и злокачественных процессов в различных органах [33]. Большинство работ по изучению флуоресценции биологических объектов посвящены исследованиям в области онкологии. Сравнительный принцип, применяемый здесь для определения патологической специфики участка ткани, основан на вычислении прироста спектральной интенсивности флуоресценции в определенных спектральных диапазонах ее регистрации, вызванного специфически накопленными в пораженной ткани искусственными и естественными флуорофорами. В зависимости от значения этого прироста по отношению к аналогичному показателю интактной ткани можно судить о характере патологии и онкологического процесса[33].

В работах некоторых исследователей изучена возможность определения кариозных поражений зуба с помощью методов флуоресцентной эмиссионной спектроскопии. При проведении диагностики кариозных полостей, бляшек, зубного камня и налета вычисляется отношение интенсивностей флуоресцентного излучения и отраженного возбуждающего лазерного излучения от пораженной области зубной ткани и сравнивается с аналогичным показателем для интактной области. В зависимости от величины превышения показателя для пораженной области можно делать вывод о наличии патогенных микроорганизмов и сопутствующих им процессов [37].

Все микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией при возбуждении зондирующим излучением He-Ne лазера с длиной волны 633 нм, в том числе и те микроорганизмы, которые считаются как нефлуоресцирующие [87]. Наличие собственной флуоресценции объяснимо с позиции «биохимического единства», согласно которому клетки всех живых существ обладают систематической общей компонентной базой ферментирующих и других макромолекулярных элементов. Т. е. все варианты обмена веществ микроорганизмов можно свести к общей схеме и ее производным в частностях. Однако существуют различия во флуоресценции разных видов микробов. Выявлено, что интегральная интенсивность флуоресценции облигатных анаэробов и строгих аэробов выше, чем у факультативных анаэробов. В условиях эксперимента in vitro было предположено, что показатель интегральной флуоресценции, отнесенный к интенсивности обратно отраженного лазерного сигнала, практически линейно зависит от концентрации микробов. При исследовании особенностей спектральных характеристик можно заметить наличие двух характерных пиков: первый пик на длине волны 665 нм и второй пик на 695 нм. Соответственно для анализа патологических микробосодержащих субстратов предложено использовать четыре параметра: интегральную интенсивность флуоресценции, интенсивность обратно отраженной от объекта лазерной линии, и интегральные интенсивности флуоресценции в окрестностях точек 665 нм и 665 нм

Si = Jli(b)<ft S2 = J Ij QC) dA,.

По различным соотношениям таких параметров удается проводить диагностику некоторых инфекционных заболеваний, например туберкулеза [52].

Опыт показывает, что работа по изучению диагностических возможностей регистрации интенсивности флуоресценции биологических объектов, особенно биосистем микроорганизмов, ввиду большого количества разнообразных параметров, может наиболее успешно проходить лишь при наличии специально созданной базы данных, структура и математическое обеспечение которой соответствовали бы определенным целям исследования. Поэтому наряду с алгоритмизацией процесса и статистического анализа данных необходимо создание базы данных БД и ее системы управления СУБД. При создании БД необходимо наиболее эффективное структурирование накопленной информации, что ведет к проблеме комплексного рассмотрения спектрально-флуоресцентных и медико-биологических наблюдений. Единственным источником первичной информации, необходимой для построения алгоритма распознавания в диагностике, может быть статистически большая совокупность спектральных данных для проб с известным содержимым. Поэтому для реализации такого алгоритма должны быть привлечены статистические методы, способные по закономерностям в данных из БД определить многие диагностические параметры для анализируемых целевых образцов. Поскольку наличие БД может быть достигнуто только при изучении многих образцов анализируемого субстрата, то необходимо провести некоторое число измерений начального их набора с известными параметрами [23,3,62].

В изучении населенности обитающих в приповерхностных водах открытых водоемов микробиоценозов фотосинтезирующих водорослей часто применяется лазерно-флуоресцентная индикация с использованием трех лазеров с разными длинами волн, излучение каждого из которых эффективно возбуждает свою группу пигментов фотосинтезирующего аппарата водорослей: синее, А, = 400±40 нм, поглощаемое преимущественно хлорофилл-белковым комплексом зеленых и эвгленовых водорослей (хлорофиллы а, Ь), сине-зеленое, X =515±30 нм, для фукоксантина и хлорофилл-белкового комплекса диатомовых водорослей (хлорофиллы а, с) и зеленое, X— 540 ± 10 нм - для фикобилинового комплекса сине-зеленых водорослей. Для количественной оценки населенности разнотиповыми водорослями проводят расчет концентрационного содержания сине-зелёных, диатомовых и зелёных водорослей по алгоритму, основанному на решении системы линейных уравнений. Для этого сначала экспериментальным путем определяют зависимости уровней флуоресценции от длины волны возбуждения для каждого типа [85,86].

Общая схема математического моделирования заключается в следующем. Величины сигналов флуоресценции Фл400(чист.), Фл510(чист.), Фл540(чист.) подставляют в левую часть системы линейных уравнений:

Фл400(чист.)= Кс-з(400) •Сс-з+ Кд(400) ■ Сд +Кзел(400) ■ Сзел

Фл510(чист.)= Кс-з(510) •Сс-з+ Кд(510)-Сд+Кзел(510)-Сзел

Фл540(чист.)= Кс-з(540) •Сс-з+ Кд(540)-Сд+Кзел(540)-Сзел, где Кс-з, Кд, Кзел- Удельные вклады флуоресценции сине-зелёных, диатомовых и зелёных водорослей при возбуждении флуоресценции светом определённой спектральной области (400, 510, 540 нм ), С - концентрация хлорофилла а в мг/мЗ по каждому из отделов, нижний индекс - длина волны максимумов спектральных областей возбуждающего света. Решая систему относительно Са (концентрация одного из типов), находят количественное содержание пигмента в водорослях каждого из указанных отделов. Если в ходе решения получены отрицательные значения С а, их принимают равными нулю. Общее содержание хлорофилла а в пробе определяют как сумму концентраций пигмента в клетках водорослей трёх отделов [85,86].

Приведенные выше методы расчета параметров вещества по флуоресцентным показателям основаны на поиске информативных критериев, исходя их эмпирических зависимостей, которые обнаруживаются в некотором смысле случайным путем при исследовании разных биологических объектов. Однако существуют и феноменологические модельные методы расчета параметров флуоресцирующего вещества. Один из таких методов применен в нелинейной флуориметрии для поиска таких параметров, как сечение поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. В работе [42] рассмотрена теоретическая и практическая единственность результатов метода нелинейной лазерной флуориметрии и доказана теоретическая единственность определения трех основных фотофизических параметров. Важнейшим аспектом решения обратной задачи является ее единственность, а также устойчивость по отношению к погрешностям входных данных, что обуславливает в конечном итоге правильность определения искомых параметров. Решение обратной задачи осуществлялось путем минимизации функционала, оценивающего среднеквадратичное отклонение вычисляемых в рамках физической модели данных от измеряемых, и было установлено, что указанная функция многих переменных имеет несколько локальных минимумов, а также сложную «овражную» структуру, что сильно затрудняет процесс минимизации. Была также рассмотрена минимизация с помощью квазиньютновского метода, использующего аналитически вычисляемый градиент и специфику минимизирующей функции, заключающейся в свойствах представления функции в виде суммы квадратов [43].

Однако при использовании такого распространенного метода решения обратных задач, как метод наименьших квадратов, имеет место сильная неустойчивость при практическом уровне шумов. Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при относительно низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Проблему удалось решить с помощью современной компьютерной техники искусственных нейронных сетей (ИНС) [44]. Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор. Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с относительно высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных [47].

Применительно к обратной задаче флуориметрии насыщения принципиальное отличие техники ИНС от метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Это приводит к увеличению точности вычисляемого результата, поскольку вовлечение в расчет большого количества параметров приводит к статистической коррекции, осуществляемой в ИНС. Набор признаков ИНС формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Такую тактику распознавания трудно контролировать на наличие перегруженности некоторых каналов входных данных. Подобная ситуация возникает, когда уровень шумов во входных данных превышает уровня 4-5% или данные содержат редкие, но имеющие большие амплитуды флуктуации [45]. Современные приборы, даже самые точные, редко могут обеспечивать подобные требования к\качеству собираемых данных при проведении спектральной и нелинейной флуриметрии [40,47].

В случаях, когда стоит задача анализа многокомпонентных смесей сложных органических соединений, спектры которых, в том числе и флуоресцентные, имеют существенное перекрытие, возможности оптических методов, использующих приемы независимых измерений в аналитическом спектре, резко снижаются. Применение предварительного преобразования пробы делает процедуру анализа чисто лабораторной, трудоемкой, сложной и дорогой. Это лишает оптический метод анализа его главного достоинства -оперативности. Новый концептуальный момент в развитии метода лазерно-флуоресцентной диагностики (ЛФД) многокомпонентных биохимических объектов состоит в синтезе лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии и специальной статистической процедуры обработки большого количества спектральных данных в рамках модели линейных факторов, известной, как факторный анализ (ФА), или метода главных компонент (МГК) [35,46,53].

Значительно расширить возможности решения такого рода задач позволяет появление и развитие компьютерных методов обработки спектров и, прежде всего, методов, позволяющих обрабатывать спектры без использования априорной информации об их природе. Основной принцип при их использовании ориентирован на поиск схожих черт между спектром исследуемой смеси и спектром некоторого стандартного образца. Практически во всех случаях применение этих методов требует проведения статистического анализа большого числа спектров эталонных образцов с целью определения совокупности параметров, предназначенных для проведения распознавания. Такой подход, как известно, носит название метода распознавания образов (МРО) [48].

В работе [48] в рамках поставленной задачи изучались спектры возбуждаемой лазерным излучением флуоресценции таких смесей сложных органических соединений как бензины. В качестве параметра, по которому проводилась идентификация, было выбрано октановое число бензинов. Применение разработанного двухстадийного варианта МГК позволило надежно распределить все исследуемые бензины по октановому числу.

Исходя из перечисленных выше методов обработки данных измерения флуоресцентных свойств биологических веществ можно сделать вывод, что на текущий момент наиболее близкими и пригодными возможными реализациями алгоритма дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микробосодержащих биологических субстратов являются метод искусственных нейронных сетей и статистические регрессионные методы. Последние позволяют дифференцированно анализировать такой вид данных экстремальных измерений свойств биологических веществ.

Для таких статистических методов было придумано собирательное название Хемометрика [57]. Эти методы широко применяются в различных методах оптической диагностики, газо-ионной и -жикостной хроматографии, при анализе изображений, рентгено-диффракционных методах, и т. д.[57-64].

Все методы эндогенной диагностики связаны с проблемой небольшой специфичности характеристик флуоресценции, что приводит к необходимости прибегать к дополнительным физико-химическим методам, которые призваны дополнить лазерно-флуоресцентную диагностику, хотя в большом количестве случаев флуоресцентный метод дополняет указанные. Но есть примеры универсального подхода к анализу эндогенной флуоресценции, примером может служить работа [48]. В ней удается реализовать решение, подобное решению обратной задачи спектроскопии при помощи статистического метода, преимущественного перед методом ИНС в устойчивости к шумам и флуктуациям сигнала. Но пока эти методы не применены для решения задачи дифференциальной диагностики микробосодержащих жидкостей на основе ЛФД. Лучше всего реализовать вычислительные методы на программном обеспечении компьютера, использующего одинаковую для всех диагностических установок базу данных. Это можно обеспечить посредством соединения установок через глобальную компьютерную сеть.

1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД.

Многие изменения патологического характера в организме человека происходят под влиянием микробного фактора. В норме организм человека находится под минимальным действием субстратопроцессных механизмов многих микроорганизмов, большинство из которых являются перманентными обитателями человека в непатогенной форме. Часть микробной флоры человека под влиянием некоторых неблагоприятных условий может переходить из непатогенной в патогенную форму и вызывать заболевания. В зависимости от способности к симбиозу и специфичных адаптационных механизмов различные виды микробов подвергнуты определенной классификации, и диагностические критерии по отдельным видам могут изменяться [65].

С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающим многочисленные экологические ниши на коже и слизистых оболочках полостей макроорганизма [66,67].

Большинство авторов считают, что нормальная микрофлора сформировалась в процессе эволюции в результате взаимодействия между макроорганизмом и окружающими микробами, отбора определенных видов, способных к прикреплению и колонизации кожи и слизистых оболочек. Причем эволюция макро- и микроорганизмов проходила параллельно и в тесной взаимосвязи друг с другом [68,69].

Среди микроорганизмов, занимающих различные экониши в организме человека, исследователи выделяют группы патогенных, условно-патогенных и симбиотных непатогенных микробов. Патогенные микроорганизмы характеризуются выраженной агрессивностью и способностью защищаться от действия неспецифичных защитных механизмов при попадании в макроорганизм. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются менее выраженной агрессивностью, ограниченной возможностью к колонизации макроорганизма, персистенции и распространению и лишь в условиях ослабления системы антиинфекционной резистентности проявляют свои вирулентные свойства. Группа симбиотных непатогенных микробов использует организм хозяина как среду обитания. Среди этой группы имеются комменсалы - микроорганизмы, живущие за счет макроорганизма и неприносящие ему вреда, и синергисты - микроорганизмы, участвующие в формировании эубиоза [70,71,72].

Установлено, что нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, численность которых у взрослого человека составляет 1014 клеток, что на порядок превышает число клеток всех органов и тканей макроорганизма [73].

Известно, что качественный видовой и количественный состав микрофлоры зависит от ее локализации. Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки рта и носоглотки [74,75].

Совокупность всех микробиоценозов макроорганизма обозначается как нормобиоценоз или эубиоз, а также микробная экология. Микроэкология характеризует не только качественное и количественное состояние микробной флоры различных частей макроорганизма, но также и их биохимическое, метаболическое и иммунологичесоке состояние. Считается, что количество характеристических видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно [69,71,76].

Многочисленными исследованиями установлено, что микроорганизмы, присутствующие в организме хозяина, находятся между собой в разнообразных отношениях (нейтрализм, конкуренция, мутализм, синергизм, комменсализм, паразитизм и т. д.). Благодаря наличию сложной и разветленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма человека, в которой она локализована [74,76,77,78].

В медицинской клинической диагностике инфекционных заболеваний микробной природы существует проблема быстрой идентификации патогенной микрофлоры с выяснением ведущего патогена и его микробиологических ассоциантов. Для изучения микрофлоры в норме и при патологии в настоящее время разработано большое количество прямых и косвенных методов и приемов: микроскопия, определение состава микробиоценоза путем высева проб на соответствующие среды, изучение микробных метаболитов, присутствующих в биоматериале.

На сегодняшний день основным, широко применяемым в практической работе учреждений, лабораторным методом диагностики заболеваний микробной этиологии является классический бактериологический метод. Он заключается в посеве клинического патологического материала на искусственные питательные среды с целью выявления и идентификации чистых культур возбудителя (или возбудителей) и определения их чувствительности к антибактериальным и химикотерапевтическим препаратам. При исследовании клинического материала больных с гнойными заболеваниями, проводится выделение и идентификация всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале с целью определения этиологической значимости каждого микроба, при этом поиск сужается до определенного возбудителя [79,5,80,81].

флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.2: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях [6]. Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения. Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение атомы в газовой фазе). Потери энергии между возбуждением и испусканием, которые и составляют феномен уменьшения энергий квантов испускания по отношению к квантам возбуждения, неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая колебательная релаксация. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. Столкновения между молекулами приводят к релаксации, а в жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно. Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния Si. Эта релаксация происходит за время порядка 10"12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания[6]. Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из So в Si. Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.1). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний So и S\. 240 Длина волны, нм 260 280 300 320 340 360 I I I я л 0,8 0,2 44300 40300 36300 32300 Волновое число, см"1 23300 ?l 1 Рис. 1.3. Спектры поглощения и испускания дифенила. 11 Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. Вслед за возбуждением фенольный протон в молекуле флуорофора переходит к акцепторам протона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что многие полиядерные ароматические углеводороды таюке вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы, называемые эксимерами (сокращение от excited dimers возбужденные димеры). Испускание эксимеров смещено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура. Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с аминами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужденном состоянии, называют эксиплексами.[28] Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений. Смысл этих параметров состоит в описании кинетики флуоресценции. Не указывая подробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию Si, большое внимание обращаем на процессы, которые ответственны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние So(k) [6]. Квантовый выход флуоресценции это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Квантовый выход определяются выражением: Q T/(r+k), (1.2) где Г константа скорости излучательной дезактивации флуорофора, к скорости безызлучательной дезактивации в основное состояние [6]. Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испускания, т. е. к Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания 10 флуоресценции 10" не. Время затухания выражается следующей формулой т=1/(Г+к) (1.3) Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием любых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания [6]. 12 Явления флуоресценции и фосфоресценции многих веществ, как в газовой так и в твердой и жидкой фазах, служат основой для их количественного и качественного анализа. Преимущества диагностики и анализа веществ на основе люминесценции перед другими методами заключаются в большой чувствительности и специфичности. В основном анализ флуоресцентных характеристик, как видно, происходит через прямое их измерение, например, в случае флуоресценции газообразных веществ идентификация возможна по спектральным интенсивностям на отдельных длинах волн. 1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры. Применение явления флуоресценции для исследования веществ, определения их свойств, качественного и количественного анализа флуорофоров а также в различных задачах контроля процессов предполагает наличие методов и инструментария для возбуждения, измерения характеристик флуоресценции и процедуры пробоотбора исследуемого материала. Во-первых, флуоресценция очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Это определяет задача исследования, соответственно выбор аппаратуры регистрации должен быть согласован с требованиями диапазона параметров эмиссии вещества. Во-вторых, для выбора источника возбуждения флуорофоров необходимо знать параметры возбуждения, которые можно получить, исследуя, например, спектры поглощения вещества, и этот источник должен быть достаточно интенсивным. Подготовка и дозирование исследуемого материала налагает некоторые ограничения на виды веществ и их относительную флуорофорную чистоту. Если производится анализ слабоконцентрированного флуорофора, то флуоресценция примесей должна иметь тоже небольшую величину, сравнимую с флуоресценцией аналита. Флуоресцентный метод дает основные преимущества, делающие его иногда почти единственным методом качественного анализа [6,7, 36]. Сейчас используют несколько способов возбуждения образцов флуоресцирующих веществ. В основном применяют возбуждение оптическим излучением относительно мощного источника, в традиционной схеме в качестве которого выступает тело, испускающее излучение со сплошным спектром. Этими могут быть наиболее универсальные источники ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 700 нм (рис. 2.3), за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы; этим 13 обусловлены пики вблизи 450 им. Интенсивность испускания резко падает в области 280 нм [8,9 3,4]. 560 Длина 300 8ояш, 500 *м РИС. 1.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых ламп. Ртутные (Hg) лампы высокого давления. Излучение этих ламп более интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр. Обычно необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для возбуждения данного флуорофора [10]. Ртутно-ксеноновые дуговые лампы имеют более высокие интенсивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы, а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Однако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых ламп (рис. 1.3). Ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра ртути, которые используются главным образом для целей градуировки [10]. Поскольку источники вышеприведенного вида обладают сплошными спектрами излучения, для выбора излучения необходимой частоты, задаваемого спецификой задачи, вырезают всю остальную часть излучения источников с помощью монохроматора, который называется монохроматором возбуждения [9]. При этом, конечно, относительная интенсивность возбуждающего излучения будет мала по сравнению с мощностью источника. Но существует другой тип источников излучения, обладающих высокой спектральной мощностью и монохроматичностью, называемых лазерами. При возбуждении такими средствами можно достигнуть не только большой чувствительности, но и стабильности измеряемых при этом характеристик флуоресценции, а в исследовании газообразных веществ также высокой селективности. Появление лазеров открыло расширенные возможности флуоресцентных методов в науке, промышленности, медицине и технике [12,13]. Для регистрации флуоресценции и измерения ее характеристик существуют несколько схем, в основе которых лежит оптическая обработка светового отклика вещества и детектирование получаемого обработанного оптического сигнала. Чаще всего необходимо измерить как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектр испускания представляет 14 собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света. Для измерения анизотропии флуоресценции на пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Для точного измерения анизотропии флуоресценции требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль может иметь дополнительный оптический путь в стороне от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом, более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополнительный оптический канал не требуется [11]. Появление импульсных лазерных источников расширило методы регистрации такой характеристики флуоресценции, как ее кинетика. Использование пикосекундных и фемтосекундных лазеров, имеющих короткие длительности импульсов, в сочетании быстродействующими оптическими затворами позволяет регистрировать временные зависимости флоуресценции многих органических флуорофоров. Такие измерения проводят для исследования динамики молекулярных процессов и химических реакций, а также для анализа вещества с большей специфичностью[13,14,15]. При использовании сильнофокусированных пучков света для возбуждения флуоресценции становится возможным применение метода флуоресцентной коррелометрии. Он основывается на принципе регистрации самокоррелированности флуоресцентного сигнала вследствие флуктуации плотности оптически задействованных молекул внутри пучка. Такой метод позволяет с большой точностью определять концентрацию вещества в растворе и специфику [16,17,18]. Для биофизических и медицинских исследований и других областей исследования и диагностики применяют в основном спектрофлуоресцентный метод при возбуждении биологического субстрата лазерным излучением. Сигнал регистрирут при помощи полихроматора, соединенного с многоканальной ПЗС линейкой, оцифровывают и подают на вход компьютера, который обрабатывает результаты измерений. Для удобства при эндокавитарных исследованиях возбуждающее излучение и флуоресцентный сигнал подводят к исследуемому участку через оптоволокно [19,20]. В большинстве практических задач биомедицинских исследований применение флуоресцентного метода требует наличия специфических флуоресцирующих веществ, вводимых в исследуемый материал в качестве зондов и маркеров. Такой подход сопряжен с дополнительными расходами и не является универсальным вследствие необходимости постоянной разработки флуоресцентных материалов для расширения области применения такой диагностики. Напротив, детектирование и спектральный анализ флуоресценции природных флуорофоров используется сравнительно узкоспециализированно, хотя сами методики на основе этого являются более универсальными и менее затратными и трудоемкими [46]. 15 Получаемый сигнал во всех измерительных системах для осмысления несомой им информации требует наличия специфических методов его обработки и экспертной системы прогнозирования и диагностики на результатах информационного преобразования. При этом получаемый в результате измерений сигнал должен быть тоже хорошего качества. Эти качества задаются такими параметрами измерительных установок, как чувствительность (минимальная концентрация определяемых веществ), воспроизводимость (повторение сигналов в хорошем качестве от измерения к измерению), объективность (насколько производимый на основе получаемого сигнала анализ соответствует действительности). По сравнению с другими методами анализа, такими как бактериологический, флуориметрический, например реализуемый на аппарате «Спектролюкс МБ», уступает в чувствительности (10 2 против 10б КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл), однако намного превосходит по скорости (несколько недель против минут) и объективности (не всегда удается высевать материал бактериологическим методом). Аппаратура для диагностики должна снабжаться методическим обеспечением, доступным для использующего аппаратуру врача, или другого специалиста. Также важна стандартизация всех этапов диагностики, например пробоотбора, когда взятие образцов и их предварительная обработка происходит в одинаковых условиях. 1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологии и медицины. Взаимодействия излучения с живым веществом протекают в основном с участием сил электромагнитного взаимодействия заряженных элементарных частиц атомов и молекул с полем излучения, а также дополнительно с участием их обменного взаимодействия друг с другом. При этом наблюдаются такие эффекты, как отражение, рассеяние, поглощение, генерация акустического поля, нелинейные эффекты, флуоресценция и.т.д. [6, 20, 37]. Свет, отраженный от организма, в первую очередь дает информацию о содержащихся в ткани фотохромах и структуре ткани. Если ткань содержит собственные или введенные извне флуорохромы, то индуцированная светом флуоресценция несет информацию о многих биологических процессах, протекающих в организме. Стандартной целью медицинской диагностики, основанной на флуоресценции вещества организма, является в конечном итоге принятие решения о принадлежности тестируемого больного к той или иной группе известных заболеваний [46]. Из большого числа видов биологических веществ есть достаточно много таких, которые являются природными, или естественными, флуорофорами. Это означает, что при соответствующих оптических способах возбуждения и регистрации можно наблюдать некоторый флуоресцентный отклик, характеризующий возбуждаемый материал. Иногда содержание эндогенных флуоресцирующих веществ в составе живых систем 16 и организмов настолько велико, что флуоресценцию можно наблюдать визуально. Такую сильную флуоресценцию дают, например, все зеленые части фотосинтезирующих растений, поскольку пигмент хлорофилл состоит из ароматического порфиринового комплекса, обладающего кроме сильной окраски еще относительно большим квантовым выходом флуоресценции [22]. На основе регистрации лазерно-индуцированной флуоресценции фотосинтезирующих зеленых организмов существуют методы диагностики состояний садовых и культивируемых растений, наличие болезней, минеральной специфики питающих растения почв, а также дифференцирование различных типов водорослей, обитающих около поверхности океанических вод, и.т.д. [22,40]. Таким образом, диагностика на основе регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров может быть универсальным методом определения специфики и состояния живых организмов и их систем, таких как не только растения, но и все остальные организмы. Этот пример диагностики на основе флуоресценции растений не уникален в своем роде, поскольку кроме хлорофилла можно наблюдать флуоресценцию других природных органических веществ. Ниже приведены некоторые классы флуоресцирующих веществ, встречающихся в живых системах. Большинство порфиринов дают флуоресцентный отклик, который можно наблюдать при возбуждении излучением из широкого диапазона длин волн. Порфирины и их производные входят в разнообразные биологически активные соединения, такие как белковые комплексы различных фотосинтетических аппаратов растений и водорослей, ферментирующие комплексы, осуществляющие различные звенья дыхательного внутриклеточного цикла (цитохромы, пероксидаза, оксидаза, каталаза), в состав различных гемопротеидов (гемоглобин, миоглобин) и мн. др. [65]. Они представляют собой производные тетрапиррола порфина, состоящего из 4-х пиррольных колец соединенных метиленовыми группами. Такая конфигурация позволяет этим молекулам разнообразным образом взаимодействовать с большим количеством видов минеральных и органических веществ, что и определяет их большую биологическую активность. В тоже время электроны, делокализованные в ароматических кольцах, могут эффективно возбуждаться оптическим путем и совершать флуоресцентную релаксацию возбужденных состояний. Флуоресценция порфиринов может быть индуцирована излучением с длиной волны от 250 нм до 700 нм [23]. В организме человека биологически-активными являются металлопорфирины; они, как правило, флуоресцируют слабо. При образовании комплексов с белками (гемоглобин) они даже гасят флуоресценцию. При отрыве атома железа от простетической группы внутриклеточные гемопорфирины начинают флуоресцировать. В тканях и препаратах ферментов, способных к осуществлению начальных этапов синтеза порфиринов, наблюдается усиление интенсивности флуоресценции. Протопорфирины часть молекулы гемоглобина, найдены в свободной 17 форме в эритроцитах, что придает им красную флуоресценцию низкой интенсивности. При недостаточности железа, например, при отравлении свинцом, содержание протопорфиринов растет [36]. Основным порфирином, присутствующим в норме в моче и кале, является корпропорфирин. Примерно половина корпропорфирина в свежей моче находится в не флуоресцирующей форме. При довольно мягких условиях окисления не флуоресцирующая форма переходит во флуоресцирующую. В результате распада порфиринов, проходящего в несколько этапов, образуется уробилиноген, часть которого из производных желчного сока вновь всасывается через стенки кишечника и удаляется из кровотока с кровью, но при некоторых патологических процессах выводится с мочой. На воздухе уробилиноген окисляется до уробилина, который флуоресцирует[37]. Белки флуоресцируют, как правило, во всех состояниях агломерации и почти для всех природных разновидностей. Триптофан наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются следствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок белок и денатурацию. Кроме того, максимумы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 —350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 не. Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флуоресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает испускание тирозина. Как и для фенола, энергия ионизации тирозина очень сильно уменьшается при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоянии. Флуоресценция белков наблюдается при возбуждении ультрафиолетовым излучением. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNAPhe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а время жизни 6 не. Кофакторы NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD+ не флуоресцирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составляет примерно 0,4 не. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза, что обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, которое подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах. 18 Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглощают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD составляют 4,7 и 2,3 не соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплексы-ассоциаты, в которых флуоресценция флавина потушена аденином (статическое тушение). Флавопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения. Флуоресценция органических веществ имеет специфику, вследствие которой обычные спектрально-аналитические методы малопригодны для идентификации: флуоресцентные спектры таких объектов имеют контуры, не имеющие каких либо ярко выраженных, узкополосных характерных особенностей. Многие исследователи полагают, что флуоресцентная спектроскопия биологических сред сама по себе, (т.е. без привлечения дополнительного аналитического инструментария) не обладает достаточными аналитическими характеристиками и трудно интерпретируема в терминах медицинского обследования вследствие многих факторов, обуславливающих особенности спектра сред сложного молекулярного состава. Следует отметить также, что помимо многокомпонентности биологического субстрата, спектры флуоресценции неспецифичны вследствие однородного и неоднородного уширения линий, присущих конденсированной фазе вещества. Таким образом, теоретическая интерпретация спектров биологических объектов представляет значительные трудности[25,26]. Встречающиеся в живых системах классы флуорофоров меняют люминесцентные свойства в зависимости от различных факторов: сопряжения с ферментными центрами, кислотности среды, различных стадий биохимической активации. Все эти факторы в совокупности определяют форму кривых спектральных зависимостей флуоресцентного излучения таких систем. Определение параметров исследуемых объектов по данным спектрального анализа традиционными методами, учитывающим выделенные значения на отдельных длинах волн, невозможно из-за сильного перекрытия спектральных полос отдельных молекул [27,28,29]. Вместе с тем, несмотря на отмеченные недостатки, развитие методики количественного и качественного спектрального анализа для диагностики сложных органических сред продолжается, в особенности с привлечением дополнительных аппаратных и математических средств получения диагностических данных. Отчасти, это вызвано относительной дешевизной, быстротой и удобством метода. Например, флуоресцентный метод, вследствие высокой чувствительности, продолжает оставаться перспективным в отношении диагностики бактериологических заражений, позволяя предсказать распространение септического процесса уже на стадии его начального развития [3,30]. Примером может также служить работа [25], в которой метод лазерно-флуоресцентной диагностики был дополнен 19 процедурой обработки спектров при помощи искусственных нейронных сетей [90,91]. Сейчас ЛФД биологических субстратов в основном применяется с использованием специфических флуоресцирующих индикаторных веществ [31], позволяющих по их флуоресценции определять содержание определенной компоненты. Не менее информативной является и эндогенная флуоресценция биологического субстрата, т.е. флуоресценция без маркирующих добавок [23,25]. К примеру, применение оптоволоконного катетера для возбуждения и измерения автофлуоресценции внутренней стенки артерий позволяет проводить диагностику атеросклероза [32]. Поскольку при заболевании атеросклерозом ткань начинает флуоресцировать со спектром, иным чем при норме, то на основании спектральных различий можно определять заболевание. е0, 550 600 Рис. 1.5 Спектры флуоресценции стенки артерий норме (1) и при патологии (2). Большой эффективностью обладает диагностика раннего рака и предрака, поскольку опухлевая ткань хорошо поглощает и накапливает препараты на основе порфиринов, обладающих выраженной флуоресценцией [33]. Результаты исследований на сегодняшний день позволяют проводить обнаружение микробной субстанции в пробах, взятых у больных пациентов. Показано, что использование красного излучения He-Ne лазера в качестве возбуждающего света позволяет преимущественно возбуждать порфирины дыхательных ферментов и продуктов метаболизма микробов, что является основным признаком, по которому определяют присутствие микробов и их концентрацию в биологической жидкости. В зависимости от семейства порфиринов, участвующих в разных механизмах дыхания, кислородного или бескислородного, спектры их флуоресценции качественно 20 меняют свой вид [65]. Это может быть продемонстрировано следующим экспериментом, выполненным в [65]. Одной из важных компонент в цикле синтеза природных порфиринов является аминолевуиновая кислота (ALA). Она служит исходным веществом для синтеза эндогенных порфиринов в цикле трикарбоновых кислот. Как следует из изменений в спектрах флуоресценции на рис. 1.5-1.8 добавление в агар ALA при культивировании стимулирует выработку порфиринов у представителей аэробной Ps. aeruginosa и факультативно анаэробной микрофлоры со смешанным метаболизмом S. aureus, вследствие чего флуоресценция увеличивается у Ps. aeruginosa в 2 раза, а у S. aureus в 2.5 раза. В спектрах этих бактерий наблюдается увеличение амплитуды пика на длине волны 665 нм. У представителя анаэробов В. uniformis и факультативного анаэроба с бродильным типом метаболизма Е. faecalis изменений интенсивности флуоресценции, а также характера спектра не выявлено. По всей видимости, флуоресценция на длине волны 665 нм отражает начальные этапы синтеза порфиринов из ALA в цикле Кребса. 04Ор 035 030 02S и о:о 015 0 50 Ps, aeruginosa Ps. aeruginosa (ala) ОШ даЭ fflQ тго TSO Новый р Тип: PN( Размер: Разреше «30 длина волны (нм) Рис. 1.5 Увеличение интенсивности флуоресценции у Ps. aeruginosa после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева отраженная лазерная компонента. 21 »S, aureus S, aureus( ala) о» 0 6 тн, ex 0.4 0.2 0.0 60S §50 700 750 890 длина волны (мм) Рис. 1.6 Увеличение интенсивности флуоресценции у S. aureus после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева отраженная лазерная компонента. 025 0,20 оти 0.1S .«X -Efaecaiis HEJaecafts{ala) 0.10 0,0$ 000- eoo 650 700 750 «00 длима волны (нм) Рис. 1.7 Отсутствие изменения интенсивности флуоресценции у Е. faecalis после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева отраженная лазерная компонента. 22 В. uniformis B.uniformis(ala) 700 750 длина волны (нм) Рис. 1.8 Отсутствие изменения интенсивности флуоресценции у В. uniformis после культивирования на агаре с добавлением ALA. Пик слева отраженная лазерная компонента. Таким образом, добавление ALA в агар стимулирует синтез порфиринов, приводящий к увеличению интегральной интенсивности флуоресценции у облигатных аэробов и факультативных анаэробов со смешанным типом метаболизма, и не оказывает влияния на флуоресценцию микроорганизмов с бродильным типом метаболизма. Использование этой методики позволит дифференцировать различные группы микроорганизмов по их метаболизму, особенно в тех случаях, когда необходимо быстро дать ответ о том является ли возбудитель аэробом или анаэробом [65]. Есть предложение использовать флуоресцентный метод для экспрессанализа жизнеспособности донорского сердца до, во время и после операции. Хирургам-трансплантологам каждый раз приходится решать проблему, насколько подходят для пересадки донорские органы. Надо быстро понять, жизнеспособны ли органы или нет [24]. В качестве экспериментального материала использовали миокард сердца свиньи: облучили образцы миокарда свиньи лазерными лучами со специально подобранными параметрами и исследовали спектры индуцированного излучения. Образцы хранили при температуре 4 градуса в физиологическом растворе (в таких условиях жизнеспособность ткани с течением времени снижается). В спектре миокарда, облученного KrF-эксимерным лазером, всегда присутствует пик с максимумом на 330 нм, который возникает из-за свечения триптофана, и другой пик в области 450 нм. С течением времени спектр изменялся, интенсивность полосы 450 нм уменьшалась по сравнению с триптофановым пиком. При облучении азотным лазером, обнаружены два пика с максимумами на 380 и 470 нм. Первый, может быть связан с наличием в ткани коллагена и эластина, а второй с флуоресценцией вещества NADH, которое участвует в дыхательной цепи митохондрий. Со временем 23 интенсивность пика 470 нм существенно падала, что может быть информативным параметром жизнеспособности какого либо органа, в частности сердца [24]. Все перечисленные выше примеры эндогенной флуоресцентной диагностики основаны на найденных эмпирических закономерностях, которые остаются за рамками теоретического описания, что не могло бы придать им свойство универсальности и возможности контроля объективности получаемых числовых данных. Данное обстоятельство обусловлено вынужденностью подобного описания биологического вещества по свойствам флуоресценции, информационное содержание которой являются достаточно скрытой и не поддающейся существенному анализу простыми модельными математическими способами [35]. Однако измерение эндогенной флуоресценции обеспечивает спектральной информацией, качество которой может быть достигнуто до удовлетворительного для необходимого анализа уровня. Для такого типа данных необходимо подобрать подходящий аналитический инструмент, обладающий необходимой точностью, информативностью, устойчивостью и воспроизводимостью результатов анализа. Как отмечалось выше, вычислительные методы, применяемые для спектроскопии специфических эмиссионных линий, здесь не подходят, что вызывает необходимость поиска и разработки соответствующего инструментария [46]. Новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия [40]. Данный вид спектроскопии позволяет обойти несколько препятствий на пути использования флуоресценции для анализа молекулярных параметров органических веществ. Первое препятствие малая специфичность из-за большой ширины полос флуоресценции органических веществ и перекрытия полос разных веществ, одновременно присутствующих в природных биологических субстратах. Обратим внимание на то, что в спектре помимо полос флуоресценции органических веществ почти всегда присутствует полоса комбинационного (рамановского) рассеяния света молекулами воды. Это очень важный компонент спектра, который широко используется для диагностики водных сред. В частности, он может выступать в качестве внутреннего репера, на который нормируется интенсивность флуоресценции вещества. Второе препятствие идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса органических веществ, поскольку, как правило, флуоресцирующие центры в них одни и те же, например пигмент хлорофилл А в водорослях, составляющих фитопланктон. Третье препятствие изменение состояния молекулярных органических комплексов, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации молекул по интенсивности флуоресценции и затрудняет проведение диагностики состояния комплексов [40]. 24 Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики с использованием нелинейной флоуриметрии можно используя методы решения обратных задач. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. В рамках одного метода нелинейной флуориметрии (и, следовательно на одном приборе) могут быть одновременно определены несколько параметров путем обработки одной кривой насыщения. Правда, чем больше число этих параметров, тем более мощные математические методы решения обратных задач (такие, как метод искусственных нейронных сетей) необходимо применять для достижения удовлетворительной точности [41]. Применение вычислений по данным нелинейной флуориметрии дает большие возможности при исследовании чистых растворов флуоресцирующих веществ, например при определении параметров электронной структуры вещества и констант межмолекулярного взаимодействия. Однако применение таких данных для диагностики сложных по составу органических веществ является затрудненным, вследствие сложности, большого количества компонент и соответственно маленькой точности таких вычислений. Также большая интенсивность лазерного пучка будет мешать объективному процессу снятия спектральных данных живых биологических объектов, поскольку плотность энергии при этом близка к ионизирующей [46]. Существуют методы контроля качества пищевой продукции, основанные на флуоресценции, также контроля производственного процесса. Применяют метод флуоресцентной диагностики для определения степени загрязнения природных источников воды [46]. Например, посредством облучения микроорганизмов излучением красного видимого диапазона (например, излучением He-Ne лазера), когда наблюдается всегда преимущественная флуоресценция производных порфина. Для проведения несложной оперативной и информативной диагностики и анализа биологического вещества на основе эндогенной флуоресценции лучше всего подходит методика снятия обычных спектральных характеристик лазерно-индуцированной флуоресценции в сочетании с устойчивыми методами специфической обработки информации. Приведенные выше примеры демонстрируют возможности применения эндогенной флуоресценции для оценки состояния, качества и диагностики различных биологических объектов. Существующие методы диагностики пока обладают малой явной информационной емкостью и применяются в частных случаях, таких как определение общей обсемененности кариозных полостей к примеру. Для проведения эндогенной диагностики микробосодержащих жидкостей необходимо установить одинаковую процедуру приготовления образцов, посредством центрифугирования или 25 предварительного высевания материала, которые проводят при одинаковых условиях. 1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции. В исследованиях биологических процессов на молекулярном уровне часто применяют искусственные флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие люминесцентные параметры: высокую квантовую эффективность, выраженные специфические спектральные свойства, избирательность и чувствительность к разным физико-химическим процессам. Для изучения свойств биологической клетки и ее составных химико-структурных частей разработано много флуоресцирующих молекулярных меток и зондов. Ниже приведены некоторые из них. Изоцианаты и изоцианаты флуоресцина и родамина. Эти красители широко используют в качестве меток для белков. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков, особенно в тех случаях, когда проводят измерения поляризации. Это вещество давно известно и имеет удобное время жизни флуоресценции 10 не). На спектр испускания дансильной группы сильно влияет полярность растворителя. Нафтиламинсульфоновые кислоты, 1 -Анилино-8-нафталинсульфоновая кислота (1,8-ATS или ANS), 2-п-толуидинилнафталин-б-сульфоновая кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантрацен и 1,6дифенилгексатриен (DPH). Другие зонды, как, например PATMAN, очень чувствительны к фазовому состоянию липидных бислоев. Нуклеиновые кислоты при введении этиленового мостика флуоресценция АТФ и его производных становится более интенсивной. Таким образом, можно подобрать или синтезировать флуоресцентные метки, назначение которых отвечает целям биохимических исследований [28]. При диагностике микробов применяют флуоресцирующие метки и квантовые точки, снабженные специфическими антителами [1,38]. При помощи таких тел, которые могут быть снабжены также магнитными центрами, можно сортировать и проводить дифференциальную диагностику микроорганизмов практически в любой комбинации. Например, для решения проблем экспресс диагностики туберкулеза в [39] был разработан препарат иммуномагнитных частиц «Микосорб», который состоит из ферромагнитных частиц размером 2-5 микрон, связанных хелатным методом с большим количеством белка антител к микобактериям иммуноглобулина IgG (80-90 мг на 1г магнитного носителя), полученного из высокотитражных сывороток кроликов, многократно иммунизированных инактивированными микобактериями. Препарат вносится в мокроту от пациента, где предположительно содержатся микобактерии туберкулеза. Поскольку частицы снабжены специфичными антителами, они присаживаются к 26 стенкам микробных клеток. Обладая магнитными свойствами, эти частицы позволяют транспортировать большое количество микобактерий к телу, обладающему магнитным полем, которое можно погружать как внутрь образца, так и подводить к внешней стенке пробирки. Данный метод концентрирования микобактерий из мокроты с помощью магнитных частиц, связанных с антителами к микобактериям, используется для увеличения эффективности их обнаружения в мазках при люминесцентной микроскопии. Такой метод позволяет также провести селективную сепарацию микобактерий из материала мокроты и использовать их для проведения ПЦР, минуя стадию экстракции ДНК [39]. При использовании экзогенных флуоресцирующих веществ, как вспомогательных флуоресцентных агентов, улучшение диагностики в основном направлено на разработку и усовершенствование флуоресцирующих маркеров и зондов, что проводится для каждой задачи отдельно, и методы достаточно известны. Это обуславливает неуниверсальность методов экзогенной флуориметрии и дороговизну такой диагностики вследствие применения флуоресцентных веществ, разработка которых происходит для специального типа субстанции. Так как, например, микрофлора организма может содержать большое разнообразие варьируемых видов микроорганизмов, и применение экзогенной флуоресценции для ее диагностики наталкивается на существенные проблемы. Это приводит к большей целесообразности направления по исследованию возможностей преимущественно эндогенной флуориметрии. 1.5 Методы обработки результатов ЛФД. Наиболее часто оптическая флуоресцентная спектроскопия применяется в биологии медицине для выявления физических и химических изменений в клетках и тканях, а также для дифференциации доброкачественных и злокачественных процессов в различных органах [33]. Большинство работ по изучению флуоресценции биологических объектов посвящены исследованиям в области онкологии. Сравнительный принцип, применяемый здесь для определения патологической специфики участка ткани, основан на вычислении прироста спектральной интенсивности флуоресценции в определенных спектральных диапазонах ее регистрации, вызванного специфически накопленными в пораженной ткани искусственными и естественными флуорофорами. В зависимости от значения этого прироста по отношению к аналогичному показателю интактной ткани можно судить о характере патологии и онкологического процесса[33]. В работах некоторых исследователей изучена возможность определения кариозных поражений зуба с помощью методов флуоресцентной эмиссионной спектроскопии. При проведении диагностики кариозных полостей, бляшек, зубного камня и налета вычисляется отношение интенсивностей флуоресцентного излучения и отраженного возбуждающего лазерного излучения от пораженной области зубной ткани и 27 сравнивается с аналогичным показателем для интактной области. В зависимости от величины превышения показателя для пораженной области можно делать вывод о наличии патогенных микроорганизмов и сопутствующих им процессов [37]. Все микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией при возбуждении зондирующим излучением He-Ne лазера с длиной волны 633 нм, в том числе и те микроорганизмы, которые считаются как нефлуоресцирующие [87]. Наличие собственной флуоресценции объяснимо с позиции «биохимического единства», согласно которому клетки всех живых существ обладают систематической общей компонентной базой ферментирующих и других макромолекулярных элементов. Т. е. все варианты обмена веществ микроорганизмов можно свести к общей схеме и ее производным в частностях. Однако существуют различия во флуоресценции разных видов микробов. Выявлено, что интегральная интенсивность флуоресценции облигатных анаэробов и строгих аэробов выше, чем у факультативных анаэробов. В условиях эксперимента in vitro было предположено, что показатель интегральной флуоресценции, отнесенный к интенсивности обратно отраженного лазерного сигнала, практически линейно зависит от концентрации микробов. При исследовании особенностей спектральных характеристик можно заметить наличие двух характерных пиков: первый пик на длине волны 665 нм и второй пик на 695 нм. Соответственно для анализа патологических микробосодержащих субстратов предложено использовать четыре параметра: интегральную интенсивность флуоресценции, интенсивность обратно отраженной от объекта лазерной линии, и интегральные интенсивности флуоресценции в окрестностях точек 665 нм и 665 нм 670 700 Si Jli(k)dA. 660 690 По различным соотношениям таких параметров удается проводить диагностику некоторых инфекционных заболеваний, например туберкулеза [52]. Опыт показывает, что работа по изучению диагностических возможностей регистрации интенсивности флуоресценции биологических объектов, особенно биосистем микроорганизмов, ввиду большого количества разнообразных параметров, может наиболее успешно проходить лишь при наличии специально созданной базы данных, структура и математическое обеспечение которой соответствовали бы определенным целям исследования. Поэтому наряду с алгоритмизацией процесса и статистического анализа данных необходимо создание базы данных БД и ее системы управления СУБД. При создании БД необходимо наиболее эффективное структурирование накопленной информации, что ведет к проблеме комплексного рассмотрения спектрально-флуоресцентных и медикобиологических наблюдений. Единственным источником первичной информации, необходимой для построения алгоритма распознавания в 28 S2 Jli(A,)c&.диагностике, может быть статистически большая совокупность спектральных данных для проб с известным содержимым. Поэтому для реализации такого алгоритма должны быть привлечены статистические методы, способные по закономерностям в данных из БД определить многие диагностические параметры для анализируемых целевых образцов. Поскольку наличие БД может быть достигнуто только при изучении многих образцов анализируемого субстрата, то необходимо провести некоторое число измерений начального их набора с известными параметрами [23,3,62]. В изучении населенности обитающих в приповерхностных водах открытых водоемов микробиоценозов фотосинтезирующих водорослей часто применяется лазерно-флуоресцентная индикация с использованием трех лазеров с разными длинами волн, излучение каждого из которых эффективно возбуждает свою группу пигментов фотосинтезирующего аппарата водорослей: синее, X 400±40 нм, поглощаемое преимущественно хлорофилл-белковым комплексом зеленых и эвгленовых водорослей (хлорофиллы а, Ь), сине-зеленое, X =515±30 нм, для фукоксантина и хлорофилл-белкового комплекса диатомовых водорослей (хлорофиллы а, с) и зеленое, Х= 540 10 нм для фикобилинового комплекса сине-зеленых водорослей. Для количественной оценки населенности разнотиповыми водорослями проводят расчет концентрационного содержания сине-зелёных, диатомовых и зелёных водорослей по алгоритму, основанному на решении системы линейных уравнений. Для этого сначала экспериментальным путем определяют зависимости уровней флуоресценции от длины волны возбуждения для каждого типа [85,86]. Общая схема математического моделирования заключается в следующем. Величины сигналов флуоресценции Фл400(чист.), Фл510(чист.), Фл540(чист.) подставляют в левую часть системы линейных уравнений: Фл400(чист.)= Кс-з(400) -Сс-з+ Кд(400)-Сд+Кзел(400)-Сзел Фл510(чист.)= Кс-з(510) -Сс-з+ Кд(510)-Сд+Кзел(510)-Сзел Фл540(чист.)= Кс-з(540) -Сс-з+ Кд(540)-Сд+Кзел(540)-Сзел, где Кс-з, Кд, Кзел- Удельные вклады флуоресценции сине-зелёных, диатомовых и зелёных водорослей при возбуждении флуоресценции светом определённой спектральной области (400, 510, 540 нм С концентрация хлорофилла а в мг/мЗ по каждому из отделов, нижний индекс длина волны максимумов спектральных областей возбуждающего света. Решая систему относительно Са (концентрация одного из типов), находят количественное содержание пигмента в водорослях каждого из указанных отделов. Если в ходе решения получены отрицательные значения С а, их принимают равными нулю. Общее содержание хлорофилла а в пробе определяют как сумму концентраций пигмента в клетках водорослей трёх отделов [85,86]. Приведенные выше методы расчета параметров вещества по флуоресцентным показателям основаны на поиске информативных критериев, исходя их эмпирических зависимостей, которые обнаруживаются 29 в некотором смысле случайным путем при исследовании разных биологических объектов. Однако существуют и феноменологические модельные методы расчета параметров флуоресцирующего вещества. Один из таких методов применен в нелинейной флуориметрии для поиска таких параметров, как сечение поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. В работе [42] рассмотрена теоретическая и практическая единственность результатов метода нелинейной лазерной флуориметрии и доказана теоретическая единственность определения трех основных фотофизических параметров. Важнейшим аспектом решения обратной задачи является ее единственность, а также устойчивость по отношению к погрешностям входных данных, что обуславливает в конечном итоге правильность определения искомых параметров. Решение обратной задачи осуществлялось путем минимизации функционала, оценивающего среднеквадратичное отклонение вычисляемых в рамках физической модели данных от измеряемых, и было установлено, что указанная функция многих переменных имеет несколько локальных минимумов, а также сложную «овражную» структуру, что сильно затрудняет процесс минимизации. Была также рассмотрена минимизация с помощью квазиньютновского метода, использующего аналитически вычисляемый градиент и специфику минимизирующей функции, заключающейся в свойствах представления функции в виде суммы квадратов [43]. Однако при использовании такого распространенного метода решения обратных задач, как метод наименьших квадратов, имеет место сильная неустойчивость при практическом уровне шумов. Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при относительно низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Проблему удалось решить с помощью современной компьютерной техники искусственных нейронных сетей (ИНС) [44]. Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор. Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с относительно высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных [47]. Применительно к обратной задаче флуориметрии насыщения принципиальное отличие техники ИНС от метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Это 30 приводит к увеличению точности вычисляемого результата, поскольку вовлечение в расчет большого количества параметров приводит к статистической коррекции, осуществляемой в ИНС. Набор признаков ИНС формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Такую тактику распознавания трудно контролировать на наличие перегруженности некоторых каналов входных данных. Подобная ситуация возникает, когда уровень шумов во входных данных превышает уровня 4-5% или данные содержат редкие, но имеющие большие амплитуды флуктуации [45]. Современные приборы, даже самые точные, редко могут обеспечивать подобные требования кчкачеству собираемых данных при проведении спектральной и нелинейной флуриметрии [40,47]. В случаях, когда стоит задача анализа многокомпонентных смесей сложных органических соединений, спектры которых, в том числе и флуоресцентные, имеют существенное перекрытие, возможности оптических методов, использующих приемы независимых измерений в аналитическом спектре, резко снижаются. Применение предварительного преобразования пробы делает процедуру анализа чисто лабораторной, трудоемкой, сложной и дорогой. Это лишает оптический метод анализа его главного достоинства оперативности. Новый концептуальный момент в развитии метода лазернофлуоресцентной диагностики (ЛФД) многокомпонентных биохимических объектов состоит в синтезе лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии и специальной статистической процедуры обработки большого количества спектральных данных в рамках модели линейных факторов, известной, как факторный анализ (ФА), или метода главных компонент (МГТС) [35,46,53]. Значительно расширить возможности решения такого рода задач позволяет появление и развитие компьютерных методов обработки спектров и, прежде всего, методов, позволяющих обрабатывать спектры без использования априорной информации об их природе. Основной принцип при их использовании ориентирован на поиск схожих черт между спектром исследуемой смеси и спектром некоторого стандартного образца. Практически во всех случаях применение этих методов требует проведения статистического анализа большого числа спектров эталонных образцов с целью определения совокупности параметров, предназначенных для проведения распознавания. Такой подход, как известно, носит название метода распознавания образов (МРО) [48]. В работе [48] в рамках поставленной задачи изучались спектры возбуждаемой лазерным излучением флуоресценции таких смесей сложных органических соединений как бензины. В качестве параметра, по которому проводилась идентификация, было выбрано октановое число бензинов. Применение разработанного двухстадийного варианта МГТС позволило надежно распределить все исследуемые бензины по октановому числу. Исходя из перечисленных выше методов обработки данных измерения флуоресцентных свойств биологических веществ можно сделать вывод, что на текущий момент наиболее близкими и пригодными возможными 31 реализациями алгоритма дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микробосодержащих биологических субстратов являются метод искусственных нейронных сетей и статистические регрессионные методы. Последние позволяют дифференцированно анализировать такой вид данных экстремальных измерений свойств биологических веществ. Для таких статистических методов было придумано собирательное название Хемометрика [57]. Эти методы широко применяются в различных методах оптической диагностики, газо-ионной и -жикостной хроматографии, при анализе изображений, рентгено-диффракционных методах, и т. д.[57-64]. Все методы эндогенной диагностики связаны с проблемой небольшой специфичности характеристик флуоресценции, что приводит к необходимости прибегать к дополнительным физико-химическим методам, которые призваны дополнить лазерно-флуоресцентную диагностику, хотя в большом количестве случаев флуоресцентный метод дополняет указанные. Но есть примеры универсального подхода к анализу эндогенной флуоресценции, примером может служить работа [48]. В ней удается реализовать решение, подобное решению обратной задачи спектроскопии при помощи статистического метода, преимущественного перед методом ИНС в устойчивости к шумам и флуктуациям сигнала. Но пока эти методы не применены для решения задачи дифференциальной диагностики микробосодержащих жидкостей на основе ЛФД. Лучше всего реализовать вычислительные методы на программном обеспечении компьютера, использующего одинаковую для всех диагностических установок базу данных. Это можно обеспечить посредством соединения установок через глобальную компьютерную сеть. 1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД. Многие изменения патологического характера в организме человека происходят под влиянием микробного фактора. В норме организм человека находится под минимальным действием субстратопроцессных механизмов многих микроорганизмов, большинство из которых являются перманентными обитателями человека в непатогенной форме. Часть микробной флоры человека под влиянием некоторых неблагоприятных условий может переходить из непатогенной в патогенную форму и вызывать заболевания. В зависимости от способности к симбиозу и специфичных адаптационных механизмов различные виды микробов подвергнуты определенной классификации, и диагностические критерии по отдельным видам могут изменяться [65]. С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающим многочисленные экологические ниши на коже и слизистых оболочках полостей макроорганизма [66,67]. 32 Большинство авторов считают, что нормальная микрофлора сформировалась в процессе эволюции в результате взаимодействия между макроорганизмом и окружающими микробами, отбора определенных видов, способных к прикреплению и колонизации кожи и слизистых оболочек. Причем эволюция макро- и микроорганизмов проходила параллельно и в тесной взаимосвязи друг с другом [68,69]. Среди микроорганизмов, занимающих различные экониши в организме человека, исследователи выделяют группы патогенных, условно-патогенных и симбиотных непатогенных микробов. Патогенные микроорганизмы характеризуются выраженной агрессивностью и способностью защищаться от действия неспецифичных защитных механизмов при попадании в макроорганизм. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются менее выраженной агрессивностью, ограниченной возможностью к колонизации макроорганизма, персистенции и распространению и лишь в условиях ослабления системы антиинфекционной резистентности проявляют свои вирулентные свойства. Группа симбиотных непатогенных микробов использует организм хозяина как среду обитания. Среди этой группы имеются комменсалы микроорганизмы, живущие за счет макроорганизма и неприносящие ему вреда, и синергисты микроорганизмы, участвующие в формировании эубиоза [70,71,72]. Установлено, что нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, численность которых у взрослого человека составляет 10 14 клеток, что на порядок превышает число клеток всех органов и тканей макроорганизма [73]. Известно, что качественный видовой и количественный состав микрофлоры зависит от ее локализации. Наиболее сложные по составу микробиоценозы это микрофлора толстой кишки рта и носоглотки [74,75]. Совокупность всех микробиоценозов макроорганизма обозначается как нормобиоценоз или эубиоз, а также микробная экология. Микроэкология характеризует не только качественное и количественное состояние микробной флоры различных частей макроорганизма, но также и их биохимическое, метаболическое и иммунологичесоке состояние. Считается, что количество характеристических видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно [69,71,76]. Многочисленными исследованиями установлено, что микроорганизмы, присутствующие в организме хозяина, находятся между собой в разнообразных отношениях (нейтрализм, конкуренция, мутализм, синергизм, комменсализм, паразитизм и т. д.). Благодаря наличию сложной и разветленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма человека, в которой она локализована [74,76,77,78]. В медицинской клинической диагностике инфекционных заболеваний микробной природы существует проблема быстрой идентификации патогенной микрофлоры с выяснением ведущего патогена и его микробиологических ассоциантов. Для изучения микрофлоры в норме и при патологии в настоящее время разработано большое количество прямых и косвенных методов и приемов: микроскопия, определение состава микробиоценоза путем высева проб на соответствующие среды, изучение микробных метаболитов, присутствующих в биоматериале. На сегодняшний день основным, широко применяемым в практической работе учреждений, лабораторным методом диагностики заболеваний микробной этиологии является классический бактериологический метод. Он заключается в посеве клинического патологического материала на искусственные питательные среды с целью выявления и идентификации чистых культур возбудителя (или возбудителей) и определения их чувствительности к антибактериальным и химикотерапевтическим препаратам. При исследовании клинического материала больных с гнойными заболеваниями, проводится выделение и идентификация всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале с целью определения этиологической значимости каждого микроба, при этом поиск сужается до определенного возбудителя [79,5,80,81]. Эффективность бактериологического метода является невысокой вследствие большой длительности срока транспортировки материала для его посева, что приводит к гибели одних видов микробов и размножению других; из-за большой длительности культивирования высеянных микробных популяций результат диагностики может попросту потерять свою актуальность, поскольку для микрофлоры пациента это достаточно большой срок для вероятной трансформации микробиоценоза пациента в иную по видовому составу форму. Кроме того, значительные трудности для высева и выделения бактериологическим методом вызывает анаэробная флора, частота встречаемости которой при гнойных инфекциях составляет от 25% до 100%. Лабораториям практического здравоохранения последний вид исследования является экономически недоступным. Существуют и другие, более быстрые, лабораторные методы исследования микрофлоры человека и животных. К ним относятся газожидкостная и ионная хроматография, хромато-масс-спектрометрический анализ, высоковольтный электрофорез. Метод газо-жидкостной хроматографии позволяет косвенно выявлять аэробную и анаэробную микрофлору методом регистрации пиков летучих жирных кислот и других микробных метаболитов. Несмотря на достаточную оперативность, этот метод не получил широкого распространения из-за отсутствия однозначного подхода в оценке результатов исследований, а также из-за необходимости использования специального очень дорогого оборудования. Для проведения этих исследований необходимо приготовление исследуемых образцов специальными химическими методами [82,83,84]. Хромато масс спектрометрический анализ это метод диагностики дисбиоза и воспалительных процессов в организме человека по составу специфических микробных веществ маркеров класса жирных кислот и стеаринов, а также других липидных компонентов клетки и метаболитов жизнедеятельности 34 микроорганизмов. Преимущества и недостатки хромато масс спектрометрического анализа и газо- жидкостной хроматографии одинаковы и по тем же критериям это вызывает трудности в их использовании в практической клинической диагностике. Современное состояние лабораторной и клинической диагностики микробных инфекций может быть улучшено при постоянном поиске и нахождении новых сравнительно простых, дешевых и информативных экспресс методов индикации микроорганизмов, а также мониторинга состояния микрофлоры человека и продуктов ее жизнедеятельности в клинической практике, лишенных вышеперечисленных недостатков микробиологического и других методов исследования, что оправдано и в некоторых случаях необходимо. Поскольку все микробы обладают заметной эндогенной флуоресценцией, существует принципиальная возможность индикации и идентификации субстратов, населенных микробами. В работе [65] показано присутствие изначальной специфичности флуоресцентных показателей отдельных нативных микробов в чистых культурах. Однако на практике многие микробиоценозы представляют собой ассоциации микробов, число разнообразных видов в которых может достигать более 10 В связи с этими обстоятельствами актуальным является поиск и разработка нового метода флуоресцентной диагностики, позволяющего проводить дифференцированную идентификацию отдельных видов в микст-сисемах. При этом метод должен обеспечить оптимальное соотношение между качеством диагностики и ее скоростью, что может быть достигнуто аппаратными и методологическим решениями. Например, использованием предварительно концентрирующих жидкости технологий. Заключение. На основе изучения литературы можно сказать, что флуоресцентный метод диагностики биологических объектов имеет объективные возможности для идентификации и дифференциации этих объектов. Однако использование ЛФД наталкивается на одну существенную проблему, проявляющуюся в отсутствии или недостатке универсальных методов специфической обработки спектральных данных. Особенно это касается диагностики микроорганизмов: существующие нефлуоресцентные методы не обеспечивают достаточной скорости и неинвазивности диагностики, а метод ЛФД не был развит для видовой дифференциальной диагностики. Существующие методы обработки данных ЛФД микроорганизмов являются частными, узконаправленными, по отношению к проблематике. Было выяснено, что перспективными для этого методами являются метод искусственных нейронных сетей и более устойчивые к шумам статистические регрессионные методы. 35

Основные выводы по работе.

1. Впервые для дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики смесей флуорфоров с нехарактерными спектрами успешно применена методика количественного и качественного статистико-регрессионного анализа.

2. Установлено, что учет спектров оптической экстинкции диагностируемого объекта в спектральном диапазоне флуоресцентного отклика приводит к повышению специфичности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики.

3. Для повышения чувствительности лазерной флуоресцентной диагностики предложено и реализовано увеличение интенсивности флуоресценции при выводе локализованных флуорофоров из потушенного состояния.

4. Проведенные клинические испытания подтвердили специфичность лазерно-флуоресцентной диагностики заболеваний микробной природы.

Научная новизна

В результате проведенных исследований и разработок была сформулирован принцип экспертной системы диагностики таких сложных физических систем как биологические жидкости человека и ассоциации микроорганизмов с получением необходимых данных о состоянии и качестве последних на основе лазерноиндуцированной флуоресценции, а также контроля процесса лечения заболеваний микробной природы. В решении задач дифференциальной диагностики были применены методы статистической регрессии физических характеристик вещества к интересным с точки зрения практики видо-концентрационным параметрам по различному компонентному составу. Многовариантые методы анализа спектро флуоресцентных данных и анализа специфики биологической материи были применены впервые.

В основу работы легли результаты автора, полученные им за последние три года. К числу приоритетных результатов относятся следующие:

1. Впервые показана возможность получения видо-концентрационных аналитических параметров специфики биологического вещества с применением дополнительных статистически устойчивых методов расчета.

2. Впервые показано увеличение эффективности и объективности специфического анализа при восстановлении характеристик флуоресценции с учетом оптических параметров вещества.

3. Впервые экспериментально установлено, что применение поверхностно активных веществ приводит к увеличению интенсивности флуоресценции клеток микроорганизмов.

4. Впервые достигнута высокая эффективность дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики до 80-90%, что сопоставимо с альтернативными высокоточными методами.

Практическая значимость

Исследованные и развитые в работе методы диагностики имеют важное практическое значение, поскольку позволяют реализовать в медицине новые системы экспресс диагностики заболеваний туберкулезом и микобактериозами, а также многими другими заболеваниями микробной природы. Такие системы могут позволить проводить диагноз соответствующих заболеваний в режиме реального времени и в клинических условиях непосредственно у «постели больного». Это исследование может стать вариантом для изысканий экспертных систем анализа материи с применением сверхбыстрых физических методов.

Заключение

Комбинированный метод лазерно-индуцированной спектроскопии проб крови и линейного анализа главных компонент ( ЛФД-АГК ) опробован в качестве диагностического инструмента для вспомогательного определения возбудителей заболеваний.

Процедура ЛФД-АГК позволила выявить наличие статистически устойчивых закономерностей в структуре флуоресцентных спектров проб, отличающих субстраты пациентов с видами легочных заболеваний различной нозологии.

Уровень статистической значимости диагноза на основе ЛФД-АГК процедуры для субстратов от группы пациентов больных туберкулезом составляет « 80% в условиях мониторинга с однократным отбором проб, что позволяет надеяться на достижение смешанной ЛФД диагностики микробиологических проб и плазмы крови с эффективностью 90-95%.

1. Осин H. С., Храмов E. H., Злобин В. H. Технические средства индикации биопатогенов как основа обеспечения биологической безопасности, Молекулярная медицина №3 2006

2. Alexandrov М., Vorobjev A., Pashkov Е., Philotov М., et. al. The laser fluorescent diagnostics in medicine, food, industry, ecology. 2003, Electronics: NTB, 3, 43

3. Vandepitte, K.Engbaeck, P.Piot at al., Basic laboratory procedures in clinical bacteriology, World Health Organization, Geneva, 1994, vol. 132.

4. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. Меньшикова В.В., М., Медицина, 1987, 368с.

5. Л.В. Левшин, A.M. Салецкий Люминесценция и ее измерения. МГУ, 1989, 279 с.

6. Paul Westerhoff, Wen Chen and Mario Esparza, Fluorescence Analysis of a Standard Fulvic Acid and Tertiary Treated Wastewater Journal of Environmental Quality 30:2037-2046 (2001)

7. Хейфец B.X., Хролович А.Б., Каган О.Ф. фотодинамическая диагностика и ее использование для выявления и лечения злокачественных новооразований мочевого пузыря, российский медицинский журнал, т 5, СТ. 17 (стр. 260-263)

8. Беловолова Л.В., Глушков М.В., Виноградова Г.И. Особенности флуоресценции воды, активированной электролизом. Роль активных форм кислорода. ЭНЖ «Исследовано в России» http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/268.pdf

9. Брумберг Е.М. Применение ультрафиолетовых лучей в хроматографии. Успехи физических наук Т. XLIII, вып. 4, 1951.

10. Николаев И.В., Очкин В.Н., Савинов С.Ю., Спиридонов М.В., Цхай С.Н., Измерение поглощения двуокиси азота в атмосфере методом двулучевой диодной лазерной спектроскопии, Известия ФИАН, 2007.

11. Palmer GM, Keely PJ, Breslin TM, Ramanujam N, Autofluorescence spectroscopy of normal and malignant human breast cell lines, Photochemistry and Photobiology, 78: (5) 462-469 NOV 2003

12. Two-photon fluorescence excitation in detection of biomolecules, Soini E, Meltola NJ, Soini AE, Soukka J, Soini JT, Hanninen PE, Photochemical society transactions, 28: 70-74, Part 2 FEB 2000

13. Z Bajzer, AC Myers, SS Sedarous and FG Prendergast Pade-Laplace method for analysis of fluorescence intensity decay, Biophys. J. 56: 79-93.

14. К Clays, J Jannes, Y Engelborghs and A Persoons, Instrumental and analysis improvements in multifrequency phase fluorometry, 1989 J. Phys. E: Sci. Instriim. 22 297-305

15. Peter J. Verveer, Anthony Squire, and Philippe I. H. Bastiaens, Global Analysis of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Data, Biophys. J, April 2000, p. 2127-2137, Vol. 78, No. 4

16. Blom H, Johansson M, Gosch M, Sigmundsson T, Holm J, Hard S, Rigler R, Parallel flow measurements in microstructures by use of a multifocal 4x1 diffractive optical fan-out element, Applied Optics, 41: (31) 6614-6620 NOV 1 2002

17. Edman L, Mets U, Rigler R, Conformational transitions monitored for single molecules in solution, Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, 93: (13) 6710-6715 JUN 25 1996

18. Schwille P, MeyerAlmes FJ, Rigler R, Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution, Biophysical Journal, 72: (4) 1878-1886 APR 1997

19. Приезжев А.П., Тучин B.B., Лазерная диагностика в биологии и медицине, М.: Наука 1989

20. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях, Саратов Изд-во Сарат. Ун-та 1998, 350с.

21. V.A. Karavaev, I.B. Polyakova, М.К. Solntsev, Т.Р. Yurina, Effect of various chemical agents on photosynthesis studied by the method of fluorescence induction, Journal of Luminescence. 1998. V.76. P.335.

22. Александров M.T., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ №97100364 от 21.01.97.

23. Zengbush P. Molecular and cellular biology 1982, M, Mir, v. 1,2.

24. Luppa C. General histochemistry, 1980, M, Mir.

25. Lakowiczh J. Fluorescence spectroscopy p. 1982, Willey.

26. H. Schneckenburger Laser-Assisted Fluorescence Microscopy and Biomedical Screening 2006, Laser Physics 16, 5, 799

27. Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey.

28. Kloefer J.A., Mielke R.E., Wong M.S., et al. Quantum dots as strain- and metabolism-specific microbiological labels, 2003, Applied and environmental biology, 69, pp 4205-4213

29. Lucas A., Perk M., Wen Y., Smith C. Fluorescence spectroscopic detection of early injury-induced atherosclerosis, 1992, Proc. SPIE, v. 1642, p 183-190

30. V.V. Sokolov, E.V. Filonenko, L.V. Telegina, N.N. Bulgakova, V.V. Smimov, Quantum electroincs, 32, 11, c. 963-969.(2002)

31. T. Naes, H. Martens, Multivariate calibration.

32. Юденфренд С «флуоресцентный анализ в биологии и медицине» М., Мир 1965г.

33. Kanig К., Hibst R., Meyer Н., Laser-induced autofluorescence of carious regions of human teeth and cariesinvolved bacteria. Proc. of SPIE, 1993, 2080: 170-180

34. Kloepfer JA, Mielke RE, Wong MS, Nealson KH, Stucky G, Nadeau JL, Quantum dots as strain- and metabolism-specific microbiological labels, Applied Environmental Microbiology, 69: (7) 4205-4213 JUL 2003

35. Владимирский M.A., Шипина, JI.K., Филиппов В.И., Иртуганова О.А., Стаханов В.А. патент РФ № 2140084, 1998 г. «Матрица иммуносорбента».

36. Фадеев В.В. //Вестн. МГУ. Сер. 3, Физика, астрономия. 1998. № 4. С. 4958.

37. Ежов А.Н., Шумский С.А. Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. М.: МФТИ, 1998Л

38. О.В. Козырева, К.В. Попов, О единственности решения обратных задач флуориметрии насыщения сложных органических соединений. «Квантовая электроника», 30, № Ю, 2000.

39. Тихонравов А.В., Трубецков М.К. В сб. Компьютеры в лаборатории (М., изд-во МГУ, 1992, с 32).

40. Ежов А.Н., Шумский С.А. Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. М.: МФТИ, 1998

41. Н.М. Гальберштам, И.И. Баскин, В.А. Палюлин, Н.С. Зефиров. Нейронные сети как метод поиска зависимостей структура свойство органических соединений Успехи химии, 72, 706 (2003).

42. Zengbush P. Molecular and cellular biology 1982, M, Mir, v.l, 2.

43. Luppa C. General histochemistry, 1980, M, Mir.

44. Lakowiczh J. Fluorescence spectroscopy p. 1982, Willey.

45. H. Schneckenburger Laser-Assisted Fluorescence Microscopy and Biomedical Screening 2006, Laser Physics 16, 5, 799

46. Alexandrov M., Vorobjev A., Paslikov E., Philotov M., et. al. The laser fluorescent diagnostics in medicine, food, industry, ecology. 2003, Electronics: NTB, 3, 43

47. Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey.

48. Beeb K. R., Pell R. J., Seasholtz M. B. Chemometrics A Practical Guide., Wiley.

49. Eriksson L., Johansson E., Kettaneh-Would N., Would S. Multi and Megavariate Data Analysis. 2001, Umetrics AB.

50. Cattell, R. B. The screen test for the number of factors. 1966, Multivariate Behavioral Research, 1, 629-637.

51. P. Geladi, K. Esbensen. Chemometrics, a growing and maturing discipline (Editorial).

52. Chemom. Intell. Lab. Syst., 7, 197 (1990)

53. M.A. Шараф, Д.Л. Иллмэн, Б.Р. Ковальски. Хемометрика, Пер. с англ. М. Мир: 1987 М. Sharaf, D. Illman, В. Kowalski. Chemometrics. NY: Wiley. 1986.

54. B.G. Osborne, T. Feam. Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific and Technical, Harlow, Essex, England, 1986.

55. T. Naes, C. Irgens, H. MartensComparison of linear statistical methods for calibration of

56. NIR instruments. Appl. Stat., 35,195 (1986)

57. P. Geladi, H. Grahn. Multivariate Image Analysis, Wiley, Chichester 1996

58. G. Molenberghs. Biometry, Biometrics, Biostatistics, Bioinformatics,., Bio-X Biometrics,61, 1 (2005)

59. A. Bogomolov, M. McBrien. Mutual peak matching in a series of HPLC/DAD mixtureanalyses, Anal. Chim. Acta, 490, 41 (2003)

60. Морозова O.A. Экспериментальное обоснование экспресс-метода лазерной флуоресцентной диагностики заболеваний микробной природы: Автореф. Дис. Кнд. Мед. Наук. -М., 2001. 25с.

61. Грачева Н. М., Гончарова Г.И., Аваков А.А. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика, лечение дисбактериоза кишечника. Метод. Рекомендации, М., 1986, 24 с.

62. Bennet R., Nord С.Е., Infection, 1988, vol. 18, p.332-336.

63. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В.Микрофлора человека и иммунитет: единство и противоположность. Сборник трудов. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии., М. 1997, с.137-141

64. Воробьев A.A., Пак С.Г., и др. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов, М. 1998, 64 с.

65. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях. Микробиология, 1997, №4, с.20-25.

66. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологичекие и иммунные нарушения у детей: диетическая коррекция. АМН СССР, М., Медицина, 1991, 240 с.

67. Шендеров Б.А. Значение колонизационной резистентности в патогенезе инфекционных заболеваний. В кн.: Иммунология инфекционного процесса. Под ред. В.И. Покровского и др., М. 1994.

68. Luckey T.D. Overview of gastrointensial mikroecology. Die Nahurg, 1987,vol. 31.5-6

69. Savage D.C. The normal human microflora composition-In: The regulatory and protective role of the normal microflora (eds. Grubb R. et al.) M Stocton Press, New York, 1989.

70. Simon G.L., Gorbach S.L. Intensial flora in heath and disease. Gastroentorology, 1984, vol. 86.

71. Шендеров Б.А Медицинская микробная экология и функциональное питание, т. 1, М., 1998, 287с.

72. Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. и др. Анализ межмикробных взаимоотношений в биоценозе толстой кишки. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов., М., 1997, с.272-273.

73. Rush V.C. Das konzept symbiose: Eine übersieht über die terminologie zur beschreburng von lebensgemeinschaften ungleichnamiger Organismen. Microecol. Theraphy., 1989, vol. 19.

74. M3 СССР, приказ №535, 22.04.1985г., «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебго-профилактических учреждений, М., 1985

75. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология, М., Гэотар медицина, 1999, с 1200

76. Vandepitte, К. Engbaek, P. Pilot at al. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology, Worlf Health Organization, Geneva, 1994, vol. 132

77. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоцации микроорганизмов. Патент РФ №2086642. C12N 1/100, 1/20, C12Q Ул. Приоритет от 24 дек 1993 г.

78. Kanig k. et al., " Laser induced auto fluorescence of carious regions of human teeth and canesinvolved bacteria", Proceedings SPIE Budapest. 2080., 1993

79. Миронов А.Ю., Пашков Е.П. Использование газожидкостной хроматографии в анаэробной бактериологии //Лаб. Дело, 1988, №3, с. 3-9.

80. Осипов Г.А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах// Вестник РАМН. -1996, Т.13, № 2, С. 52-59.

81. V. Moskalenko, N.A. Molodtsov., Laser-based point detector for on-line identification of biological warfare materials., NATO advanced research workshop (Brno, Czech Republic, 2006) p. 13-14.