Применение и развитие метода планарной гельхроматографии на основе исследования макромолекулярного состава ячменей и получаемых из них продуктов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЗАОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи

Палуцки Гжегож Станиславович

ПРИМЕНЕНИЕ И РАЗВИТИЕ МЕТОДА ПЛАНАРНОЙ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИИ НА ОСНОВЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОГО СОСТАВА ЯЧМЕНЕЙ И ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Ю.А.Клячко,

кандидат химических наук, доцент Е.А.Гурковская

Москва -1999

Содержание

Введение......................................................................................................'..... 4

1. Обзор литературы........................................................................................7

1.1. Химический состав зерна различных злаковых культур......................7

1.1.1. Структура и биохимические компоненты ячменного зерна...........8

1.2. Пивоваренный ячмень..........................................................................20

1.2.1. Требования к качеству сырья.........................................................21

1.2.2. Белковые характеристики различных сортов ячменя...................24

1.2.3. Влияние содержания белковых компонентов на качество зерна ячменя........................................................................................................29

1.3. Химический состав и технологические свойства продуктов переработки ячменя....................................................................................31

1.4. Аналитические методы определения качественного и количественного содержания белков в ячмене..........................................35

1.4.1. Химические методы........................................................................35

1.4.2. Физические и физико-химические методы.....................................39

1.5. Гель-фильтрация. Гель-проникающая хроматография......................43

1.6. Заключение по обзору литературы и характеристика последующей работы..........................................................................................................47

2. Экспериментальная часть.......................................................................... 50

2.1. Характеристика материалов и объектов исследования......................50

2.1.1. Реактивы и материалы, использованные в работе........................50

2.1.2. Объекты исследования....................................................................50

2.1.3. Носители для ПГПХ.......................................................................52

2.2. Технические вопросы анализа методом ПГПХ..................................52

2.2.1. Аппаратура для ПГПХ...................................................................54

2.2.2. Техника определения......................................................................56

2.3. Оптимизация угла наклона камеры при хроматографировании стандартных белков....................................................................................61

2.4. Метод анализа белковых комплексов ячменного зерна, муки и солода

в условиях ПГПХ........................................................................................71

2.4.1. Экстракция белка и экстрагирующие системы..............................71

2.4.2. Белковые комплексы ячменного зерна, муки, солода и рН элюента 75

2.4.3. Качественный анализ содержания белковых фракций ячменного зерна и продуктов его переработки.........................................................78

2.4.4. Количественный анализ белков ячменного зерна и продуктов

его переработки........................................................................................83

2.5. Водо- и солерастворимые протеины....................................................87

2.6. Высокомолекулярные запасные белки ячменя....................................93

2.7. Сорта пивоваренного ячменя и их белковая характеристика............98

2.8. ПГПХ пива и пивной пены....................................................................113

2.9. Метрологическая обработка результатов экспериментов...................116

2.10. Сравнительная характеристика методов фракционирования

белков............................................................................................................123

3. Общее обсуждение итогов работы...........................................................128

Выводы..........................................................................................................130

Приложение..................................................................................................142

Введение

Актуальность темы. Анализ химического состава, химического строения и надмолекулярной структуры продуктов питания и сырья для их получения является актуальной современной задачей как в отношении основных полимерных составляющих этих веществ, так и их макро- и микрокомпонентов. Наибольшее значение при этом имеет оценка содержания, состояния, структуры, комплексообразования и распределения белков. Для установления этих характеристик прежде всего требуется обеспечить ненарушение выделения из аналита характерного данного нативного белка. Для этого в химии белков предложен ряд методов: высаливание, избирательное осаждение, ультрацентрифугирование, диализ, электрофорез и т.д.

Одним из мощных методов выделения, разделения и аналитического определения белков является предложенный впервые в 1959 году метод гель-проникающей хроматографии (молекулярно-ситовой процесс). Этот метод считается в настоящее время важнейшим и эффективнейшим способом разделения белков, т.к. он отличается рядом необходимых особенностей: независимость от рН среды, температуры, сохранение нативных состава и структуры. Метод предложен, как и другие формы хроматографии, в двух вариантах — колоночном и планарном (тонкослойном). Широко применяется первый вариант, но он имеет ряд сравнительных недостатков: использование большого количества сравнительно дорогих материалов (порядка килограммов сорбента) и анализируемого вещества, длительность аналитического процесса. Тонкослойная гель-проникающая хроматография более чувствительна, требует минимального количества реагентов (граммы); аналитический процесс завершается в течение нескольких часов. Процедура анализа своеобразна, отличается и от колоночной гель-хроматографии, и от техники обычной тонкослойной хроматографии. Очевидно, по этой причине она сравнительно редко используется даже за рубежом. ("По использованию тонкослойной гель-проникающей хромато-

графии имеется сравнительно мало литературы" (Д.Фрайфельдер. Физическая биохимия).

В нашей стране всего несколько эпизодических работ опубликовано с использованием тонкослойной гель-проникающей хроматографии (ТСГПХ); вообще очень мало работ проведено с применением гель-проникающей хроматографии. К тому же и в мировой литературе ТСГПХ преимущественно занимались медики, что вследствие игнорирования ими профессионального химико-аналитического подхода ограничивало возможности всестороннего развития этого гибкого и многообещающего метода.

На кафедре аналитической химии МГЗИПП в течение нескольких лет при исследованиях по технической химии пищевых производств наряду с широким использованием колоночной гель-проникающей хроматографии развивался в полном масштабе метод ТСГПХ, включая проблемы аппаратуры, пробоотбора, техники и областей применения.

Настоящая диссертация посвящена актуальному вопросу полимерного анализа компонентов зерновых культур в тесной связи с проблемами их агротехники, технологии промышленной переработки и использованием в соответствующих отраслях пищевой промышленности.

Цели работы. Разработка метода исследования белкового и белково-комплексного анализа состава пивоваренного ячменя на основе тонкослойной гель-проникающей хроматографии, выяснение в процессе исследования основных аналитических характеристик этого нового метода (ТСГПХ); установление закономерностей белкового состава ячменя в зависимости от условий его производства и при учете требований пивоваренной промышленности.

Научная новизна диссертации заключается в разработке технологии анализа белков ячменя методом планарной гель-проникающей хроматографии (ПГПХ). Установлены оптимальные условия осуществления методики анализа белковых фракций в сортовых пивоваренных ячменях, полученных из них продуктах переработки — муке и солоде. Установлены за-

кономерные сортовые различия в составах белковых компонентов ячменей и их изменений в процессах переработки.

Практическое значение работы. Впервые метод ПГПХ был применен для непосредственного анализа высокомолекулярных соединений в зерне ячменя и продуктах его переработки. Разработанная методика разделения и определения низкомолекулярных и высокомолекулярных белковых фракций в зерне ячменя, муке и солоде. Полученная динамика результатов фракционирования белковых фракций при разных значениях рН среды позволяет рекомендовать моделирование технологического процесса получения пива соответственно анализу белкового состава, что повысит экономичность процесса пивоварения и органолептические показатели готовой продукции.

На защиту выносится:

- Методы анализа (разделения и определения) белковых фракций ячменного зерна, муки и солода;

- Метод анализа стандартных белков и определения результатов относительно стандарта;

- Результаты анализа белковых компонентов (определения молекулярных масс, фракционного разделения белков) ячменя пивоваренных сортов Польши, Чехии и России, полученных из них ячменной муки и солода и интерпретации результатов.

1. Обзор литературы

1.1. Химический состав зерна различных злаковых культур

Культивируемые человеком злаки являются основным источником белка в пище человека и кормах сельскохозяйственных животных. Исследование белковых веществ злаков представляет особый интерес для биохимиков-технологов, поскольку именно белковый состав является основополагающим фактором влияния на процесс переработки зерна в готовые пищевые продукты.

При рассмотрении общего химического состава зерна (табл. 1) следует учесть, что он колеблется в широких пределах в зависимости от внешних и внутренних факторов. Большое влияние на процесс накопления белка оказывают почвенно-климатические условия в широком смысле этого понятия, агротехника, количество осадков, выпадающих в период полива зерна [3,25].

Таблица 1

Химический состав зерновок различных злаков, %

Культура Белки Углеводы (кроме клетчатки) Клетчатка Жиры Мин. вещ-ва

Пшеница озимая 10,0 70,0 1,6 1,7 1,7

Пшеница яровая 13,2 66,1 1,8 2,0 1,9

Рожь 7,2 73,2 1,6 1,5 1,5

Овес: с пленками 10,3 56,4 10,3 4,8 3,6

Просо: с пленками 10,6 58,6 8,1 3,9 3,8

Кукуруза 9,0 69,2 2,2 4,4 1,3

Рис без пленок 7,4 75,6 0,8 0,4 0,8

Ячмень с пленками 9,5 67,0 4,0 2,1 2,5

Наряду с факторами внешней среды, немаловажное значение имеют и генетические особенности сорта. Например, некоторые сорта пшеницы и ячменя обладают ярко выраженной особенностью накапливать в определенных условиях в эндосперме большое количество белка [24, 25].

Как показывают данные анализа химического состава злаков (табл. 1), многие зерновые культуры отличаются высоким содержанием углеводов (основной крахмал) и довольно небольшим содержанием белков и жиров. В связи с бурным развитием в последние десятилетия пивоваренной промышленности, возникла потребность в обеспечении продукции качественным сырьем. Многие исследователи, разрабатывая новые технологии пивоварения, использовали в качестве добавки несоложеное или соложеное зерно пшеницы, кукурузы, риса (Голикова, Вртелова, Тхай Ха). Однако, все единогласно признавали ячмень основным и незаменимым сырьем для приготовления пива. Объясняется это довольно широкой распространенностью ячменя (возделывается почти во всех странах мира), нетребовательностью его к почве и климату, а также анатомическим строением ячменной зерновки [6, 7, 19].

1.1.1. Структура и биохимические компоненты ячменного зерна

Зерно ячменя является зерновкой, состоящей из трех основных частей — зародыша, эндосперма и оболочки, каждая из которых имеет свое специальное назначение.

Зародыш со щитком и всасывающим эпителием состоит главным образом из белка и является живой частью зерна. Пригодность зерна для со-лодования определяется жизнеспособностью и развитием зародыша.

При прорастании зерна в зародыше образуются вещества, повышающие ферментативную активность; отсюда начинаются все биохимические процессы, в результате которых нерастворимые вещества эндосперма превращаются в растворимые, необходимые для развития зародыша [6, 86].

Эндосперм, мучнистое тело, состоит главным образом из тонкостенных клеток, заполненных крахмальными зернами, и служит резервом пита-

тельных веществ для зародыша во время его жизнедеятельности; передача этих питательных веществ происходит при помощи щитка со всасывающим эпителием. Эндосперм окружен слоем алейроновых клеток, содержащих белковые, минеральные вещества и жиры.

Алейроновый слой снаружи покрыт оболочкой, состоящей в свою очередь из нескольких клеточных слоев, в которых различают семенную, плодовую и мякинную оболочки. Семенная оболочка (теста) представляет собой полупроницаемую перепонку, пропускающую внутрь зерна воду и задерживающую растворенные в воде вещества, выполняя этим очень важную функцию в жизни ячменного зерна.

Мякинная оболочка состоит из почти нерастворимых веществ, которые во время замочки ячменя лишь очень слабо выщелачиваются и в пивоварении являются материалом фильтрующего слоя для отделения сусла от затора [6, 30, 113].

Вещества, входящие в состав ячменного зерна, распределяются в нем неравномерно (табл. 2).

Таблица 2

Распределение основных химических составных частей в ячменном зерне (в %)

Показатели в % Все зерно Оболочка Зародыш Эндосперм

Масса частей зерна 100 6 10 84

Азотистые вещества 12,6 6,6 21,7 12,4

Жир 4,3 1.6 29,6 ЬЗ

Углеводы 79,4 74,1 34,7 85,0

Сырая клетчатка 2,0 164 2,9 0,6

Минеральные вещества 1,7 1,3 11,1 0,7

Химический состав зерна ячменя зависит от сорта и сильно изменяется в зависимости от экологических (климатических и почвенных) и метеоро-

логических условий. Совокупность этих условий и определяет разнообразие химического состава зерна [6, 20].

Основным компонентом, составляющим 85% сухой массы зерновки ячменя, являются органические вещества, главным образом углеводы и белки, кроме них содержатся жиры, органические кислоты, витамины и около 2-3% неорганических веществ.

Важной составной частью зерна ячменя является вода. Влажность ячменя в зависимости от метеорологических условий уборки урожая колеблется от 12 до 20%. Среднее содержание влаги в ячмене составляет около 14%. Ввиду значительного колебания влагосодержания зерна химический состав его выражают в пересчете на сухое вещество.

Избыточная влага в зерне — балласт, который приходится транспортировать и оплачивать. Каждый процент воды уменьшает выход экстракта в среднем на 0,76% [19].

Влажное и сырое зерно подвергают сушке на зерносушилках, избегая нагрева семян выше 40 - 45 °С. При большем нагреве падает жизнеспособность клеток зародыша, вследствие чего понижается прорастаемость семян. При этом имеют в виду, что для сохранения жизнеспособности зерна содержание влаги в ячмене не должно быть ниже 10%. Дальнейшее уменьшение влажности может привести к необратимым процессам свертывания белков клеточной протоплазмы и также ослабить прорастаемость зерна [35].

Весьма важной составной частью зерен ячменя являются азотистые вещества, из которых большую производственную ценность имеют белки. Они оказывают большое влияние на технологические процессы пивоварения и на качество готового пива [49].

Азотсодержащие вещества подразделяются на природные (истинные) белковые вещества, промежуточные продукты их распада и аминокислоты.

Природные белковые вещества очень сложны, имеют молекулярную массу от 20 000 до 300 000 [35]. При кипячении они коагулируют, что является их важнейшим признаком. Белковые вещества могут также выделяться

из их растворов при высокой концентрации солей [6, 30].

Промежуточные продукты (альбумозы, пептоны, полипептиды) представляют собой продукты расщепления белков и занимают место между природными белками и аминокислотами [30, 72].

Альбумозы — первые продукты расщепления белков. Они при кипячении не выделяются из раствора, но осаждаются при насыщении их растворов сернокислым аммонием [35].

Пептоны — продукты дальнейшего расщепления белков, которые уже не выделяются из раствора сернокислым аммонием, но могут осаждаться фосфорномолибденовой кислотой и танином [35].

Полипептиды — продукты более глубокой стадии расщепления белка, чем пептоны, но предшествующей образованию аминокислот Их роль в реакциях осаждения точно не известна [31].

Пептиды и аминокислоты — последние продукты ферментативного расщепления белков. Эти азотистые вещества солями не осаждаются [30].

Несмотря на то, что белковые вещества образуют только незначительную часть экстракта сусла (3,1 до 5,6%) [49], они в ходе технологических процессов пивоварения оказывают чрезвычайно большое влияние на другие экстрактивные вещества ячменя и солода. Их можно рассматривать как важнейшие составные части ячменя, которые влияют на производственные процессы и на конечный продукт.

Определенные комплексы соединений азотистых веществ, склонные к выделению, должны вследствие этого быть удалены из пива и, наоборот, азотистые вещества, обеспечивающие полноту вкуса и стойкую пену, должны быть сохранены в пиве. Следовательно, изучение различного рода азотсодержащих веществ очень важно