Синтез дейтеромеченных фосфатидилхолинов для изучения структурной организации мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



^ На правах рукописи

Брагина Наталья Александровна

СИНТЕЗ ДЕЙТЕРОМЕЧЕНЫХ ФОСФАТИДИЛХОЛИНОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МЕМБРАН.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук,

доцент Чупин В.В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Каплун А.П., кандидат физико-математических наук Горделий В.И.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " Ф'+^ЯьЬУ ¡998 г. в часов на заседании диссертационного Совета Д 063.41.01 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (117571, Москва, пр. Вернадского, д. 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии (119831, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1).

Автореферат разослан " •• ЛШ^О- ¡998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник * Лютик А.И.

7! Ли^ ТН-^____

Общая характеристика работы.*

Актуальность проблемы. Бурное развитие молекулярной биологии и, частности, науки о биомембранах определяет всё возрастающий интерес ^следователей к синтезу и использованию дейтеромеченых липидов. шние структурной организации и функционирования биологических ембран, играющих ключевую роль в координации всех биологических роцессов клетки, позволяет целенаправленно воздействовать на многие изиологические процессы, создавать мембранотропные медицинские репараты, конструировать биосенсоры.

К настоящему времени считается, что биологические мембраны редставляют собой "жидкий" липидный бислой, в который погружены ембранные белки, обеспечивающие протекание определенных иохимических реакций.Однако, высокая гетерогенность состава липидного ислоя не согласуется с представлениями о пассивной роли липидов в ачестве структурной матрицы мембраны. В частности, в мембранах широко редставлены липиды с простой эфирной связью, являющиеся близкими груктурными аналогами липидов диацильного типа. Выяснение иологической роли и механизма функционирования этих липидов остается есьма актуальной задачей в липидологии на сегодняшний день.

Для изучения структуры и динамики мембран в настоящее время птроко используются методы дифракции нейтронов и ЯМР-спектроскопии.

При использовании спектроскопии ЯМР широкое распространение олучил подход, основанный на селективном введении изотопных меток в юлекулы компонентов биологических мембран.

Сокращения: ФХ-фюсфатидилхолин, ДМ-димиристоил, ДТ-дитетрадецил, Щ-дипальмитоил, ДГ-дигексадецил, квадрупольное расщепление.

Дейтерий представляет собой стабильный изотоп, который можно избирательно ввести в гидрофильную или гидрофобную области липидной молекулы, что дает возможность селективно проследить за поведением не только отдельных типов молекул, но и молекулярных фрагментов даже в составе биомембран. При этом свойства липидных молекул не изменяются, что выгодно отличает дейтериевые метки от спиновых и флуоресцентных зондов.

К настоящему времени созданы все основные предпосылки для изучения вторичной и третичной структуры мембранных белков методами двумерной !Н ЯМР-спектроскопии. Для реализации данного метода необходимо использовать липидные бислои, построенные из полностью дейтерированных лигтидов, то есть бислои, "прозрачные" для методов 'Н ЯМР.

К сожалению методы дифракции нейтронов и ЯМР-спектроскопик обладают малой чувствительностью и требуют значительного расходе дейтеромеченых липидов (10-100 мг/эксперимент).

В связи с этим, разработка и усовершенствование методов синтез: дейтеромеченых липидов, а также их синтонов представляет практически! интерес.

Данная работа выполнялась в соответствии с планом научны; исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им. М.В.Ломоносова по теме N 1Б-18-865 "Получение липидов, биорегуляторов липидной природы и и: конъюгатов, изучение поведения в биологических системах, использовани для создания физиологически активных липидных препаратов и липосомны; форм" (номер государственной регистрации 01920018492).

Целью работы явилась разработка удобных в препаративно! отношении способов синтеза селективно и полностью дейтерированны фосфатидилхолинов с простой и сложной эфирной связью и и

[ейтерированных синтоист, а также сравнительное изучение поведения юсфатидилхолинов алкилъного и адильного типов в составе мембран.

Выполнение работы включало решение следующих основных задач: ) Разработка методов синтеза и получение холинов с дейтериевыми

метками в различных положениях. :) Синтез набора фосфатидилхолинов алкильного и ацильного типа со структурно-эквивалентными дейтериевыми метками в гидрофильной области молекулы.

1) Разработка удобного в препаративном отношении подхода к синтезу

полностью дейтерированных фосфатидилхолинов диацильного типа. I) Сравнительное изучение свойств фосфатидилхолинов с простой и сложной эфирной связью в составе мембран методом 2Н-ЯМР.

Научная новизна и практическая ценность. В результате гровед енных исследований разработан новый метод получения 5-дейтеромеченого холина. Предложен удобный способ синтеза фосфатидилхолинов с использованием холина в форме тетрафенилборатной ¡оли, позволяющий получать в одну стадию с высокими выходами липиды с .ребуемьгм набором гидрофобных и гидрофильных заместителей. Данным ;пссобом осуществлен синтез ряда фосфатидилхолинов с простой и сложной >фирной связью, имеющих дейтериевые метки в гидрофильной области молекулы. Предлагается универсальный подход к синтезу полностью ^Итерированных фосфатидилхолинов диацильного типа, основанный на использовании полностью дейтерированного бп-глицеро-З-фосфохолина. При изучении поведения липидов с простой и сложной эфирной связью в ;оставе мембран методом 2Н-ЯМР впервые показаны различия в информации фосфохолиновой группы липидов этих типов, обусловленные электрическими свойствами бислоя.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1) Методы синтеза дейтеромеченых холинов.

2) Методы синтеза фосфатидилхолинов, меченных дейтерием по холиновом> остатку и полностью дейтерированных фосфатидилхолинов диацильноп типа.

3) Особенности поведения фосфатидилхолинов ацильного и алкильноп типов в составе мембран.

Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационно! работе, докладывались на Международном семинаре "Investigation of th biological and lipid membranes, amphiphiles by means of neutron scattering (Дубна 1992, 1996); Международной школе по биоорганической хими (Москва 1996); Научных семинарах в Центральном институте травматологи и ортопедии (1996, 1997).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, том числе, 1 обзор.

Содержание работы: Диссертационная работа изложена на M с-П и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, обсуждени результатов, экспериментальной части, выводов и списка литератур! Диссертация содержит /J рисунков и 3 таблиц.

Результаты работы и их обсуждение

Фосфатидилхолины являются основными липидными компонентам мембран млекопитающих. В составе мембран фосфатидилхолии представлены липидами ацильного, а также алкилыюго типов, которь отличаются способом присоединения гидрофобных остатков к глицерш (сложная эфирная и простая эфирная связь). Было показано, что в отличие < ацильных липидов, фосфатидилхолины диалкильного типа в состоянии ге. формируют фазу со взаимным проникновением цепей (interdigitated phase).

кидкокристаллическом состоянии, т.е. в таком фазовом состоянии, в сотором функционируют биологические мембраны, существенных различий s структурной организации бислоев из ацильных и алкильных липидов эбнаружено не было.

На основании экспериментальных данных, полученных на монослоях 1 бислойных липидных мембранах ("черные мембраны"), было показано, что знутренний электрический потенциал бислоя из фосфатидилхолинов шацильного типа значительно выше по сравнению с фосфатидилхолинами злкилыюго типа (приблизительно 100 мВ на каждую карбонильную группу).

Известно, что электрические свойства мембран играют важную роль в формировании и поддержании структуры интегральных мембранных белков, 1 также в трансмембранном транспорте различных ионов. В работах Seelig '1987) был разработан эффективный метод изучения электрических свойств мембран методом 2Н-ЯМР с использованием фосфатидилхолинов, меченных дейтерием по холиновому остатку.

В связи с этим, задачей данной работы явился синтез фосфатидилхолинов диацильного и диалкильного типов с дейтериевыми метками в а-, (3- и у-положениях холинового остатка и сравнительное изучение поведения этих липидов в составе мембран методом 2Н-ЯМР.

Исследования пространственной структуры мембранных белков методами !Н-ЯМР требуют использования полностью дейтерированных фосфолипидов. Нами предлагается новый подход к синтезу полностью дейтерированных фосфатидилхолинов диацильного типа.

1.1.Синтез дейтеромеченых холпнов.

Холин является гидрофильной частью природных глицерофосфолипидов - фосфатидилхолинов. Для обозначения положений в

холиновом остатке принято придерживаться следующей системь обозначений:

ар у

НО-СН2-СН2-1Ч+(СНз)з

Ранее мы предложили способ получения у-дейтеромеченого холина 1 форме тозилата путем алкилирования Ы,Ы-диметилэтаноламина [2Н3] метиловым эфиром и-толуолсульфокислоты. Однако, этот способ имее-ограниченное применение и позволяет получать холины лишь с одной С2Н3 группой в у-положении.

К настоящему времени известны методы, позволяющие получат холины, селективно меченные дейтерием по а-, Р-, у-положением, а такж< полностью дейтерированный холин. Однако, известная схема синтез; Р-холина является весьма трудоемкой. Способ основывается на методе предложенном первоначально для синтеза 14С-меченого этаноламина. П< этому методу, конденсацией цианида натрия и формальдегида получаю' нитрил гидроксиуксусной кислоты, который бензоилируют и затеи восстанавливают в [Р-2Н2]-этаноламин. Исчерпывающее Ы-метилировани приводит к иодиду [р-2Н2]-холина.

В связи с этим представлялось целесообразным исследовать боле удобные в препаративном отношении пути синтеза р-дейтерированноп холина. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы являете реакция кватернизации триметиламина р-галогензамещенным] производными этанола. Для реализации этой схемы подвижные протоны метиловом эфире монохлоруксусной кислоты обменивали на дейтерий среде сн3о2н в присутствии СНзОЫа в качестве основания. Метиловы эфир восстанавливали ГРАНИЦ и полученным [Р-2Н2]-хлорэтаноло1 кватернизировали триметиламин. К сожалению, реакция кватернизаци

;опровождалась образованием окиси [2Н2]-этилена, при алкилировании готорой триметиламином получали смесь ос- и р-дейтеромеченых холинов.

Поэтому нами был изучен другой способ, основанный на введении (ейтерия в этиловый эфир ЫД^-диметилглицина (схема 1). Подвижные фотоны в этиловом эфире Ы,Ы-димегилглицина (1) обменивали на дейтерий ( среде СНз02Н в присутствии СНзСЖа. Ход реакции контролировали 1етодом |3С-ЯМР по исчезновению сигнала СНг-группы и появлению игнала С2Н2-группы. Метиловый эфир (2) восстанавливали при помощи лА1Н4 до спирта (3), который алкилировали иодкстым метилом и получали юдид Р-дейтеромеченого холина (4). Целевой продукт выделяли в виде етрафенилборатной соли (5) путем осаждения холина (4) из водного детвора тетрафенилборатом натрия.

^хема 1

ВООССНда)2 с'Ь02Н/СН3СЖа_

(I) (2)

носн2с2н2м(сн3)2-^~ НОСН2С2Н2Ы+(СПЗ)3 Г РЬ4ВМа-

(3) (4)

ПОСН2С?Н2ЬГ(СНз).гРЬ4В"

(5)

Получение и использование холина в виде гетрафенилборатной соли >ыло предложено ранее и реализовано в синтезе а-, у- и полностью ^итерированного холина (Harbison, Griffin, 1984). Данная соль холина оличественно выделяется из водных реакционных сред, негигроскопична и орошо растворима в таких органических растворителях, как пиридин, что гозволяет использовать ее в синтезе фосфатидилхолинов.

Разработанный нами метод синтеза Р-дейтеромеченого холина позволил дополнить эту схему синтеза и сделал возможным получение дейтеромеченых холинов с любым положением дейтериевых меток при помощи однотипных реакций.

Данная схема была использована нами в синтезе а-, Р-дейтеромеченого холина (схема 2). Исходное соединение - этилцианформиат (6) восстанавливали 1лА12Н4 до аминоэтанола (7), который алкилировали иодистым метилом с получением иодида [а-,Р-2Н4]-холина (8). Целевой продукт осаждали из водного раствора в виде тетрафенилборатной соли (9).

Схема 2

еоосси ь1а'2н1 нос2н2с2н2ш2-^£-(6) (7)

нос2н2с2н2м!(сн3)3г нос2н2с2н2ы+(снз)зрь4в-

(В) (9)

По аналогичной схеме был получен полностью дейтерированный холин (10) исходя из этилцианформиата (6). Контроль за структурой дейтеромеченых холинов осуществляли методами масс-спектрометрии и 13С-ЯМР. Изотопная чистота дейтерированных холинов определялась содержанием дейтерия в используемых 1лА12Н4 (98%) и С2Нз1 (99%). Изменяя соотношение меченого С2Н^1 и немеченого СНз1 на стадии алкилирования, можно варьировать содержание дейтерия в у-положении холина, что также использовалось нами при синтезе дейтеромеченых холинов.

Полученные дейтеромеченые холины использовали для синтеза ФХ щалкилъного и диацильного типа.

1.2. Синтез фосфатидилхолинов.

Для синтеза дейтеромеченых фосфатидилхолинов использовали пвестный метод фосфорилирования производных холина фосфатидной сислотой в присутствии конденсирующих агентов (схема 3) и разработанный тми способ, заключающийся в фосфорилировании 1,2-дизамещенного тшцерина хлороксидом фосфора с последующим взаимодействием щхлорфосфата с тетрафенилборатной солью холина (схема 4).

Схема 3

RCOO-

—OCOR Н

О* "он

(5) ТРБ

(П)

рОСОЯ

ясоо-]— н

1~0^ОСН2С2Н2^(СН3)3 О* "О"

(12) II—(СП2)7€Н=СН(СН2)7€Нз

По схеме 3, исходя из фосфатидной кислоты (11), был получен 1,2-диолеошт-зп-глицеро-3-фосфо-[р-2Н2]-холин (12), который использовали для изучения влияния трансмембранного потенциала на структуру бислоя.*

* Leenhouts J.M. (1993), Utrecht University, Centre for Biomembranes and Lipid Enzymology

Реализация данной схемы синтеза (схема 3) требует использования фосфатидной кислоты, которая не всегда является доступным реагентом. В связи с этим нами предлагается удобный способ синтеза фосфатидилхолинов, в соответствии с которым, 1,2-дизамещенные глицерины (13 а-с1) обрабатывали хлороксидом фосфора, образующиеся дихлорфосфаты (14 а-с1) без выделения вводили во взаимодействие с тетрафенилборатными солями холина (9 или 10) (схема 4). После ионообменной и колоночной хроматографии липиды (15 а-с!) кристаллизовали из ацетона. Структура полученных соединений была подтверждена методами 'Н-, |3С-, 31Р-ЯМР и масс-спектрометрии.

Схема 4

г-СЖ

(9)

_ок РОС1у

г—011

—(Ж

НОС2Н2С2Н2К+(С2Нз)з- ВРЬ4-(10) __

или

—ОН

(13а-(1)

(14а-с1)

(15ач1)

Предлагаемый способ синтеза не требует предварительногс получения фосфатидной кислоты и позволяет получать дейтеромеченьк фосфатидилхолины с требуемым набором гидрофобных и гидрофильны>

¡аместителей. Реакция осуществляется в одну стадию без выделения лромежуточных продуктов и протекает с высоким выходом (60-70 %).

1.3. Подход к синтезу полностью дейтерированных фосфатидилхолинов диацильного типа.

Одной из самых перспективных областей применения полностью тейтерированных липидов является использование их в качестве 'прозрачной" матрицы при изучении структуры мембранных белков методами ЯМР высокого разрешения. Так, в работе (Вах, 1997) был предложен оригинальный метод изучения структуры мембранных белков, эснованный на использовании модельных мембран, построенных из смеси фосфатидилхолинов, отличающихся длиной цепей жирггакислогных эстатков: 1,2-димиристоил-зп-глицеро-3-фосфохолина и 1,2-дигексаноил-зп-глицеро-3-фоофохолина.

Полностью дейтерированные липиды на сегодняшний день не являются коммерческими продуктами, поэтому их синтез представляется актуальной задачей. К настоящему времени описан лишь один способ синтеза таких липидов (Кл1^1еу, Ре1§сп50п, 1979). В соответствии с этим методом, исходя из полностью дейтерированиой фосфатидной кислоты (1,2-димиристоил-зп-глицеро-З-фосфата) синтезировали набор полностью дейтерированных фосфолипидов, отличающихся полярными группами (ВегБсЬ, 1993). Однако, коммерческие дейтерированные кислоты относительно дороги, поэтому было бы целесообразнее вводить эти синтоны в состав молекулы липида на последней стадии синтеза.

На основании данного метода мы предлагаем иной подход к получению полностью дейтерированных фосфатидилхолинов. Он основан на использовании дейтерированного Бп-глицеро-З-фосфохолина,

ацилированием которого ангидридами или имидазолидами полностью дейтерированных жирных кислот можно получать полностью

дейтерированные фосфатидилхолины с необходимыми гидрофобными заместителями. Метод ацилирования глицерофосфохолина многократно использовался для синтеза природных и модифицированных фосфатидилхолинов. Эта реакция легко воспроизводится и протекает с высокими выходами. По предлагаемой нами схеме полностьк дейтерированные жирные кислоты вводятся в состав молекулы липида нг последней стадии синтеза. Подобные жирные кислоты достаточно труднс получать в обычных лабораторных условиях, т.к. полный неспецифическт обмен протонов жирных кислот достигается лишь при использованш высоких значений температуры и давления в присутствии катализаторов i течение нескольких суток. Что касается синтонов для синтеза полностьк дейтерированного sn-глицеро-З-фосфохолина, то глицерин-«^ являете доступным реагентом и может быть легко получен из немеченых соединена восстановлением при помощи LiAl2FL|. В свою очередь, получение любы: дейтеромеченых холинов в настоящее время не представляет трудностей.

Для создания определенной стереоконфигурации в замещенно; глицерине мы использовали метод, основанный на ферментативно! фосфорилировании глицерина^ (16) глицерокиназой (АТФ-зависимой 3 фосфотрансферазой) (схема 5). Реакция проходила с высоким выходом приводила к глицерофосфату природной стереоконфигурации. Контроль з ходом реакции осуществляли при помощи метода 31Р-ЯМР. По мер протекания реакции наблюдалось уменьшение сигналов АТФ и увеличена интенсивности сигналов глицерофосфата и АДФ (рис.1).

Глицерофосфат выделяли осаждением бариевой соли из водно! раствора, которую переводили в пиридиниевую соль (17) и ацилировал ангидридом миристиновой кислоты (18) в среде пиридина в присутств* ЫЛЧ-диметиламинопиридина. Фосфатидную кислоту (19) конденсировали полностью дейтерированным холином в виде тетрафенилборатной соли (11 в присутствии TPS и получали 1,2-димиристоил-5П-глицеро-3-фосфохоли,

dis (20). Омылением последнего получали полностью дейтерированный sn-глицеро-3-фосфохолин (21).

Схема 5

НО-С2Н2-С2Н-С2Н2-ОН (16)

он

АТР, глицерокиназа

2Н2С-ОН НО-С-2Н О 2Н2С-0-Р-0Н Ру (17) ОН

Н3С-(СН2)12-С

он

о

DCC

Н3С-(СН2)12-С Н3С-(СН2)12-С

о

о (18)

'О

О

II

о

II

н2с-0-с-(сн2)12-сн3

Н3С-(СН2)12-С-0-С

2н2С-О

Н о

~ I II

I

он (19)

он

Ру, TPS 10

о

II

О 2Н2С-0-С-(СН2)12-СН3

Н3С-(СН2)12-С-0-С-'гН о

2H2C-0-P-0-C2H2-C2H2-N(C2H3)3+ (20) О"

N(Bu)4OH

2н2с-он но-с-2н о

2н2с -о - р -о -c2h2-c2h2-n(c2h3)3+ (21) о"

В отличие от ранее предложенного метода, данная схема позволяет получать любые полностью дейтерированные фосфатидилхолины диацильного типа, при этом дорогостоящие полностью дейтерированные гидрофобные компоненты вводятся на последней стадии синтеза.

4л.

¿1

-5

ррм

-10

-15

Рис.1. Контроль за ходом ферментативного фосфорилирования глицерина методом 31Р-ЯМР: а - через 1 час от начала реакции; Ь - через 10 часов; с -после выделения целевого продукта.

2. Сравнительное изучение свойств фосфатидилхолинов диацильного и диалкильпого типов в составе мембран методом 2Н-ЯМР.

С целью сравнительного изучения свойств липидов алкильного и ацилыюго типов в составе мембран методом 2Н-ЯМР были синтезированы структурно аналогичные дейтеромеченые фосфатидилхолины (15 а-с1), отличающиеся способом присоединения гидрофобных заместителей к глицерину (простая или сложная эфирная связь).

Биологические и модельные мембраны обладают анизотропией физических свойств, что находит отражение в появлении в спектрах 2Н-ЯМР широкого анизотропного сигнала с двумя максимумами, частотное расстояние между которыми называется квадрупольным расщеплением (ДУ(}). Величина наблюдаемого квадрупольного расщепления в спектрах 2Н-ЯМР зависит как от усредненных движений, совершаемых дейтериевой меткой, так и от ориентации метки относительно плоскости липидного бислоя:

= -О 4

е^СЗ

(1)

ч

Где: е^СУЪ - статическая константа квадрупольного расщепления, равная для связи С—2Н 170 кГц;

Б =<1/2(Зсо5^- 1)) - молекулярный параметр порядка, равный отношению наблюдаемого и максимально возможного квадрупольного расщепления;

0; - угол между ¡-той осью динамического усреднения и направлением связи С-2Н, угловые скобки означают усреднение по 1 движениям.

В случае 2Н-ЯМР основной вклад в спин-решеточную релаксацию вносит квадрупольная релаксация, что позволяет непосредственно из скорости релаксации определить время корреляции тс для движения дейтеронов или подвижность в составе различных молекулярных фрагментов. Для движения с частотами, превышающими ларморову частоту, значения тс прямо пропорциональны скорости релаксации 1/Хх:

1 _

Т]~ 2

(О^2'

Ь 12 2

(2)

В цикле работ (Seelig) был разработан эффективный метод исследования электрических свойств мембраны с помощью фосфатидилхолинов, меченных дейтерием по а- и р-положениям холина.

При появлении на поверхности фосфолипидного бислоя отрицательного заряда положительно заряженный М-триметильный фрагмент фосфохолинового диполя притягивается к поверхности мембраны, что приводит к изменению ориентации холиновой группы и увеличению Аус} для а-метки и уменьшению ДУд для Р-метки. Эффект положительного заряда на поверхности мембраны прямо противоположен: для а-метки уменьшается, а для р-метки увеличивается (рис.2).

Для изучения конформации холинового фрагмента использовали липиды, содержащие дейтериевые метки в а-, Р- и у- положениях.

При изучении температурной зависимости спектров 2Н-ЯМР фосфатидилхолинов (15 а - ф наблюдалось характерное для фазового перехода гель-жидкий кристалл изменение параметров спектров 2Н-ЯМР. Определяемые из данных спектров температуры фазового перехода совпали с литературными данными, известными для немеченых фосфатидилхолинов.

ис.2. Схематическое представление возможных изменений ориентации осфохолиновой группы относительно плоскости бислоя. Стрелками казаны внзтримолекулярные вращения вокруг одинарных связей.

Наличие дейтериевых меток в а-, Р- и у-положениях холина позволяет дновременно проследить за структурой и динамикой всего холинового »рагмента и избежать систематических ошибок, возможных при риготовлении отдельных образцов с использованием селективно меченых ипидов.

На рис.3 представлен спектр 2Н-ЯМР ДГФХ-с!п (15 с!) в шдкокристаллическом состоянии. В данном случае пиковая интенсивность игнала Ы(С2Нз)з-группы значительно превышает интенсивность пиков !-С2Н2- и Р-2Н2-групл, что затрудняет наблюдение за этими сигналами.

L_L

£_i_I_s_

0

hertz

Рис. 3. Спектр 2Н-ЯМР ДГФХ-сЗп в Н20 при температуре 48 °С.

В связи с этим для проведения мембранных исследований были синтезированы фосфатидилхолины с пониженным содержанием дейтерия в у-положении (10 % дейтерия на триметиламмониевую группу).

Спектры 2Н-ЯМР для ДМФХ-й, (15 а) и ДТФХ-й (15 Ь) существенно отличаются (рис.4), что отражает различия в ориентации фосфохолииовой группы этих липидов относительно плоскости мембраны.

Сигнал МС2Нз-группы имеет наименьшее квадрупольное расщепление из-за участия этой группы в большем количестве внутримолекулярных усредняющих движений по сравнению с метками в а- и Р-положениях (см. рис.2). Для отнесения сигналов от а- и |3-С2Н2-грунп мы проводили релаксационные измерения и исследовали температурную зависимость наблюдаемой величины Дуд.

!

а

Wl

ь

b™L

г " 1 I

-10C00

10000

0

hertz

Рис. 4.2Н-ЯМР спектры мембран из ДТФХ-й4 (а) и ДМФХ-с1, (Ь) при 30°С.

Так как вклад внутримолекулярных вращений в подвижность меток уменьшается в ряду у- > (3- > а-метка, то скорость спин-решеточной релаксации 1/ТГ| также должна уменьшаться в этом ряду. Повышение температуры пр иводит к уменьшению значений Дур для всех меток. Однако, этот эффект в большей степени выражен для (3-С2Н2-группы по сравнению с а-С2Н2-группой, что также согласуется с вкладом внутримолекулярных вращений в величину Аур

На рис.5 представлен частично релаксированный спектр ДТФХ-ё4 (15 Ь), который показывает, что при температуре 30°С самым быстро релаксирующии сигналом является сигнал с наименьшим квадрупольным расщеплением, а наиболее медленно релаксирующий сигнал соответствует а-С2Н2 и имеет величину ДУд меньшую, по сравнению с (3-С2Н2-группой. В

случае ДМФХ-(1- (15 а) квадрупольные расщепления а- и Р-С2Н2-групп практически совпадают при данной температуре (рис. 4)

У У

е-^пг-'ЬггтгГ-п—-^-"Д-—-Л—■"■-г $ Д

10000 0 -10000 HERTZ

Рис. 5. Частично релаксированньш 2Н-ЯМР спектр (30 МГц) ДТФХ-d, при 30 °С. Задержка между 180°- и 90°-и.\шульсами - 11 мсек.

Полученные нами данные указывают на то, что поверхность мембра! из диацштьного фосфатидилхолина заряжена более отрицательно m

сравнению с диалкильным аналогом, что является причиной изменения конформаиии фосфохолиновых групп (рис. 6).

Рис.6. Схематическое представление отличий в конформации фосфохолиновой группы фосфатидилхолинов диалкильного (а) и диацильного(Ь) типов.

Наличие карбонильных групп в молекуле диацильного фосфатидилхолина создает положительный дипольный потенциал внутри углеводородной области и отрицательный потенциал на поверхности мембраны. Это является причиной того, что положительно заряженный 1М-конец фосфохолинового диполя притягивается к поверхности бислоя (рис.6).

Представленная на рис.6 схема структурной организации бислоя из фосфатидилхолинов диалкильного и диацильного типов позволяет объяснить многие отличия в свойствах мембран, построенных из данных липидов. Отклонение фосфохолиновой группы в сторону водной фазы

О 5- О б

С 8+ С 8+

11

У

11

приводит к тому, что полярная группа диалкильного липида занимает несколько меньшую динамически усредненную площадь на поверхности мембраны по сравнению с диацильным липидом. В результате, углеводородные цепи фосфатидилхолина диалкильного типа оказываются упакованными более плотно, что должно приводить к повышению температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл, В то же время в соответствии с теорией Israelashvili (1980), уменьшение динамической площади полярных групп липидов и увеличение плотности упаковки углеводородных цепей способствует переходу бислоя в инвертированную гексагональную фазу. Данные выводы находятся в полном соответствии с многочисленными экспериментальными данными, полученными при сравнительном исследовании фазовых свойств липидов с простой и сложной эфирной связью. Конформационные различия фоефохолиновых групп в составе липидов диацильного и диалкильного типа обусловлены наличием или отсутствием их взаимодействия с электрическими диполями карбонильных групп. Согласно теории гидратационных сил, отсутствие электрических диполей карбонильных групп в составе фосфатидилхолинов диалкильного типа является главной причиной образования фазы со взаимным проникновением алкильных цепей (interdigitated phase).

Биологический эффект липидов с простой эфирной связью.

При проведении синтетических исследований по полученик дейтеромеченых фосфатидилхолинов экспериментальные методик! отрабатывали на немеченых соединениях. Полученные липиды алкильногс типа исследовали в качестве модуляторов воспалительных процессов Изучали влияние липосом, содержащих данные липиды, на развитие отек; тканей стопы крысы, который вызывали введением флогогенного агента -формалина. Отек тканей служил одним из проявлений местно!

воспалительной реакции. Результаты экспериментов показали, что 1)осфатидилхолины алкильного типа эффективно ингибируют процесс воспаления в мягких тканях. По-видимому, это обусловлено тем, что линиды г простой эфирной связью понижают активность фосфолипазы А? в очаге воспаления*.

Выводы.

1. Разработан метод синтеза р-дейтерэмеченого холина и синтезированы холины с дейтериевыми метками в различных положениях.

2. На основании предлагаемого удобного способа синтеза фосфатидилхолинов получен ряд липидов диацильного и диалкилыюго типов со структурно-эквивалентными дейтериевыми метками в гидрофильной части молекулы.

3. Предложен новый подход к синтезу полностью дейтерированных фосфатидилхолинов диацильного типа.

4. Методом 2Н-ЯМР проведено сравнительное изучение полученных фосфатидилхолинов диацильного и диалкильного типов в составе липидного бислоя. Показано, что триметиламмониевая группа в составе фосфохолинового фрагмента липидов диалкильного типа является более удаленной от поверхности мембраны по сравнению с диацильными аналогами.

5. В результате биологических испытаний показана возможность использования липидов алкильного типа в качестве ингибиторов воспалительных процессов.

♦эксперименты проводились в ПИТО, МЗ России, Москва, (зав. лаб. Шальиев А.Н.).

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1 .Чудинов М.В., Аникин М.В., Аникин A.B., Брагина H.A., Чупин В.В., Серебренникова Г.А. Синтез фосфатидилхолинов,селективно меченных дейтерием. // Биоорган, химия,- 1993 - Т. 19.- N 2,- С. 250 - 261.

2.Брагина H.A., Чупин В.В. Синтез дейтерированных липидов. (обзор) // Успехи химии. - 1997,- Т. 66. - N 11,- С. 1077 - 1090.

3. Брагина H.A., Чупин В.В. Синтез ß-дейтеромеченого холина. // Дешифрованная рукопись в ВИНИТИ. - 1997. - 3092 - В97.

4. Брагина H.A., Курочкина Е.Ю., Аникин A.B., Чупин В.В. Удобный способ синтеза фосфатидилхолинов. // Биоорган, химия,- 1998. - Т. 24. - N 2,- С. 146149.

5. Брагина H.A., Чупин В.В., Булгаков В.Г., Шальнев А.Н. Липидные ингибиторы фосфолипазы Аг. // Биоорган, химия.- 1998. (в печати).