Синтез фрагментов О-цепей гликопротеинов и их использование в качестве антигенов и зондов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ-НАУК ССС1^

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

ЗЕМЛЯНУХИНА Татьяна Викторовна

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ О-ЦЕПЕЙ ГЛИКОПРОТЕИНОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИГЕНОВ И ЗОНДОВ

02.00.10 -- Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Научный руководитель — кандидат химических наук, старший научный сотрудник Н. В. БОВИН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор С. Э. ЗУРАБЯН, доктор химических наук Л. В. БАКИНОВСКИЙ

Ведущая организация: Симферопольский государственный университет им. М. В. ФРУНЗЕ

Защита состоится 4 декабря 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан « ^f » ноября 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

/

А. НЕСМЕЯНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

^ктуадьндстьпроблемы. Углеводные цепи гликоконъюгатов поверхности клетки, а также углеводсвязывэкш»е белки являются наиболее чувствительными к онкотрансформэмии структурными элементами клетки. В последнее время накоплено больное количество данных об ' углеводных антигенах как диагностически .значимых маркерах онкотрансформации. Такие структуры наедены и среди О-пепей гликопротсипов - это антиген Томсена-Фридепрейха (TF-антиген, игаунодоминантная группе - дисахарид Gaipi-3GalNAc, связанный а-гликозидной связью с Ser/Thr полипептидной цепи), ert предшественник в биосинтетичес!:ом . пути - Тп~аятигея (GalNAcal-Ser/Thr), а также несколько других структурно близких tar антигенов.

В настоящее время' jpw выявления опухолевых маркеров углеводной природы широкое применение нашли лектаны и моноклеяальные антитела; другой подход заключается в определении ауто-антител к опухолевссоциированным антигенам. Проведение такого рода исследов шй, также как и многих других работ, связанных с изучением гликоконыш атов, трудно представить без соответствующих углевод-содержящих соединений --■ синтетических олигосахаридов и неогликоконъюгвтов, Поэтому их синтез и применение в качестве инструментов для изучения природных гликоконъюгатов во многих лэненно вами процессах функционирования клетки представляется актуальной задачей.

Цельюработа были

1) синтез фрагментов 0-цепеЙ гликопротеинов: Тп- и ГР-структур; структурно близких дисахаридов Gat@1-3GalNAc8- (Т^ Gala1-3GalNAca- (Тд д) и GalNAcal--3GalNAc р . а твкже ' -группоспецифичЕских олигосахаридов А..В.Н типа 3, для Которых TF-дисахарид является коровым фрагментом и бкосинтотическим предшественником; .

2) получение неоглпкоконъюгатов различных типов - неогликопроте-инов, чеогликолипидоп, псевдопо.лисахаридов и их использование в качестве антигенов и зондов.

-г -

Научнаяновизна ^ипрактическаяц Синтезированы

фрагменты О-цепей гликопротеинов: Тп- и ТР-структуры; Са1р1-ЗСаШср- , Са1а1-ЗСаШАса- и. Са1ДАса1 -ЗСа111Ас(3- дасахвриды, группоспецифические олигосахариды А, В и Н тша 3, причем последние Б олигосахаридов синтезироваш впервые,.

Получены и: хроматографически (ВЭЖХ) охарактеризованы флуоресцентно-меченые производные дисахаридов Са1р1 -ЗСа1МАс, Са1а1 -ЗСаШАс и СаШАса1 -ЗСаШс - соединения для структурного анализа О-цепей гликопротеинов.

' Реализован новый универсальный путь синтеза неогликоконъюга-тов* с полиакриламидной матрицей: конденсацией олигосахаридных гаптенов с полЕ(4-нитрофенилакрилатом) получены полимерные псевдополисахариды, неогликолшшда и биотин-содержащие зонды.

Синтезированные яеогликоконъюгаты были испытаны в нескольких областях иммунодиагностики: полимерные неогликолигшда проявили себя как.сильные иМмуногены, а псевдополисахариды - как удобные формы антигенов для изучения специфичности поли- ■ и моноклоналышх антител, в также лектиаов.

■ На основе искусственного ТР-антигена разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения естественных антител к антигену Томсена-Фриденрейха в сыворотке крсви. При помощи зонда с ЭТ-специфичностью нв поверхности лрмфоцитоз человека обнаружен специфический рецептор дисахарида Са1р1-ЗСа1НАса. •

_Апробация_по^ченщп_аанных;. Результаты настоящей работы были представлены на УШ Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987), на У Европейском симпозиуме по углеводем (Прага,. . Чехословакия,' 1989), на ХУ Международном симпозиуме по углеводам (Иокогама, Япония, 1990), на IX Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Торонто, Канада, 1991) и на XIII Международной конференции по лектинам (Берлин, ФРГ, 1991).

* Данный подход разработан коллективом авторов.

Структурами..объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ("Опухолеассоцинроватшнй антиген Томсеня-Фриденрейха"), обсуждения результатов (3 раздела), экспериментальной части, заключения и выводов. Обший объем диссертации 180 страниц; работа содержит Vii таблиц, 2 рисунка , список цитируемой литературы из' наименований и приложение из •f таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В настоявсй работе осуществлен синтез следующих гликозидов и олигосахаридов:

GalNAcal-OR (Tj,)

Galf?1 -3GalNAca1 -OR 4(TF) А(тип 3)-0R

Gaipi-3GalNAcpi-OR (T„ „) В(тип 3)4)R

Galal-3GalNAca1 -OR (Ta[a) НСгип 3)-0R GalNAcal -3GalNAcf31 -OR '

Олигосахариды были получены в виде 3-(трифторацетамидо)пропилгли

козидов, кь.орые далее превращали в разнообразные мякромо-

лекулярные. формы: неогликопротеИны,. неогликолипидр и псевдополисахариды.

. I.СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРЩИЫХ ГАПТЕНОВ. 1.1 •Спейсерировщ}ще_ааШАсд1:дВ_1Тп)_ и Са1р1 -Зйа1ИАса1 -Ой (ОТ) гвптены.

Ключевой стадией синтеза Тп- я 1Т-структур является создание «-гялвктозяминидной связи. В литературе описано несколько синтезов. Общепринята подход • для решения этой задачи использование в качестве глшеозилирующих. агентов производных 2-азидо-2-дезоксигалактозы - сахйроб с■ "несоучаствущей" азидной группой при С-2. Для создания а-галактозаминидной связи мы нашли новый более простой, чем описанные (если принять во внимание многостядийность синтеза 2-азидо-производных) подход, а Гликозид

(2) получали анпмеризапией соответствующего доступного р-гликозидн

(3) действием OF.-jSO.jII или непосредственным а-гликозидиротшшем пентаанетята I) гплактозпминп трифторопетамидопропанолом в

присутствии смеси катализаторов И^ОдН + ЕРд'Е^О. Дез-0-ацетилированием соединения (2) по Земплену был получен Тп-гаптен. Далее, для синтеза ТР-гвптена был использован следующий путь: из триола (5) реакцией с а,а- диметокситолуолом получили 4,6-0-бензилиденовое производное (6), которое гликозшшровшш ацеюбромгцлттозой. Реакция в присутствии ~ трифлата серебра привела к дисвхариду (7) с 50%-ным выходом. Применение классических условий Гельфериха позволило поднять выход до 73%. Интересно, что в качестве побочного продукта реакции в этом случае образуется с выходом 15% ацетат (7а), т.е. вместо гликозилирования частично происходит адетилирование ОН-производного (5).

CFgSOjH +

ОАО + R0H

ННАс

v°\ РЬ/чо/- °ч

САс

АсО А ° ,

с6н6/сн3шг

Hg(CH)2/HgBr2 АсО

► (1) TF-0R

ОАс ОАс (7)

Последовательным удалением бензилиденовой и ацетильных защитных групп стандартными методами с выходом 75% получен ет-гаптен (1).

1,2.Гапт;ены GalNAcal-Ser и (Gaipi-3GalNAca1-)Ser.

В природных антигенах TF-дисахаридное звено присоединено а-галактозаышшдной связью к остаткам серина или треонина полипептидной цепи. Воэточу параллельно с описанным выше синтезом

Тп~ и ОТ-гаптенов были синтезированы их серин-содержящие Аналога.

Производное серина (8) получено из хлоргидрата метилового эфира ь-серина (выход &2%). Для создания а-галактозвминидной связи в этом случае применили •подход с использованием в качестве гликозилирующего агента ацетилированного (З-хлорида (9), однако гликозилирование но Гельфериху проходило с низким выходом (14%) даже при использовании вакуумной техники подготовки реагентов. Использование в Качестве катализатора гликозилирования .трифлятя серебра повысило выход до 25%. Во всех случаях большую часть соединения (8) выделяли в неизменном виде.

со2ж * носнг4нш2- HCl

^-OR

r'O/A (он* \

\|____/ 0CHgCHNHCO(CH2)4CO2Et

CONHMe

Jhnhco (

COKM0

HOcigGfflfflCO(CHg) jGOg&t (8)

(9) R1*Ac

(10) R1=Bn

(11 ) R,=R2=Ac, R3=«3

(12) R1=R2=Bn, R3=N3

(13) Rf=:R^=Ac, R3=NHAc

(14) R1=If=H, R3=M)Ac R1 1

(15) R1R1=PhCH, R3-NHAc

CONHMe

iiCHgiHKHCO (CHg)4002Et

(16) R1R1=PhCH, R?=AC ;17) r'=R2=H (TF-OSer)

Такая низкая реакционная способность производного сериин (в) ок;мл(;сь неожиданной. Литературные данный снидетельотадыт, наоборот, о ионмшешнг, мктипности 0)1-группы серина. Положи.), в пишем случае ргтяшлум роль играют щк'странстпенпми уптруднема.

вызванные наличием спейсеркой группы. Существенно лучших результатов при гликозилироваяии удалось добиться только заменой вцетшшрованного р-хлорида на бензилированный (10), являющийся более мощным гликозилирующим агентом (выход а-гликозида (12) в условиях Гельфериха составил 85%). Восстановление азидной группы гликозида (11) (гидрогенолиз) , с последующим И-ацетилированием привело к соединению (13), из которого по уже описанной схеме через бензилиденовое производное и гликозилирование ацетобромгалактозой по Гельфериху, получили дисахарид (16). Удаление бензилиденовой и О-ацетильных защитных групп привело к целевому гликозилсерину, содержащему спейсерную грушу (17).

1.3.Спейсерироващше_гаптены_^а1@ЬЗСа1

ра!а1 -ЗСаШАса1 -Ой (Та<а-0Н), СаШАса!-зОаШАсзГчж.

' йейсерированный Т^ р-г§пте0_12?) (тершгаальный дисахарид глиКолипидов вН, и асиало-СМ,) синтезировали из р-гликсзида (3) по той же схеме, что и ТГ-гаптен (1).

Дез-О-ацетилированием соединения (3) был получен триол (18), • затем синтезировано 4,6-0-бензшшдеасвое производное (19), которое гликозилировали ацетобромгалактозой в присутствии трифлата серебра (выход дисахаридв (20) 50%). Деблокирование привело к целевому Тй й- дисахариду (£2).

ОИ АсО

(20) К1К1=РЬСН, й2=АС;

(21) И1=К2=Ас

(£2) =Й2=Н (Т.

Й-0Ю

Дисахарид __ Са1НАсд1:3(ЗаЩс§1-ОК_ (25), являющийся терминальным фрагментом антигена Форссмана, также получали из 3-ОН производного

(19). "В качестве гликозилдонооа для введения а-СаШАс-звена был

/

использован вцетилированный азидохлорид (9). Реакция в присутствии карбоната и перхлорате серебра с последующей модификацией азидной

группы в ацетамидаую_ и__ удалением.' спейсерированному дисахвриду (25).

OR АсО

.■ защитных;- груш—привела ~ к

(19)

(24) R'=NHAc (24) ——» -- GalNAcat -3GalNAc|31 -OR (25)

Для получения ^ атгаптена (фрагмент Galal -3GalNAca обнаружен в клетках линии человеческой тератокарциномы PAD был использован синтон (б), который гликозилировали тегра-О-бензил-а-ГЬгалакто-пиранозилбромидом (10а) в бензоле в присутствии цианида ртути. В литературе описано множество примеров эффективного а-глико-зилироввния в этих условиях, в том числе и 3-ОН группы галактозы. Однако в данном случае гликозшгарование шло с низким выходом и нестереоспециично. Существенно лучший результат был получен, когда в качестве гликозил-акцептора было использовано бенэилиденовое производное 2-эзидо-2-дезоксигал8ктозы (28). Суммарный выход a.a-и р.а-дисахвридов на стадии гликозилирования составил 90%, а соотношение а/р аномеров (29) и (29Ь) - 6:1. Смесь аномеров (29) и (29Ь) деблокировали без .разделения; дасахариды (30) и '(1) разделили с помощью препаративной ВЭЖХ.

са tw а $

^"Л Ph 0/~Л ВП0 /~Л Ph О

i

(б) R =NHAc (28) R1 =N3

R^(CH2)3NHCOCF3

(26) П =NHAc (29) R'=N3

(26b) R1=NHAc (29b) r'=N3

(26)--> -> Galal-3GalNAca1-OR (30)

(T*,* - Oft) •

1.4. ^тез^щщюспецифичесгах

4»__В_и_Н^шгосахаЕИдов__типа_3.

ТР-дисахарид является внутренним фрагментом многих более сложных цепей, в том числе группоспецифических (А, В, Н) и опухо-леассоциированных (к последним относят трисахарид Н типа 3). При получении олигосахаридов типа .3 (36), (40) и (43) применена традиционная стратегия синтеза структур АВН типов 1 и 2 -получение олигосадвридов А и В из их общего предшественника, олигосахарида Н. Исходным соединением для синтеза трисахарида Н (тип 3) был защищещщй Т?-дисахарид (7). Для введения фукозильного остатка получали лисах аридное производное (32) с одной свободной гидроксильной группой при С-2' : соединение (7) дезацетилировали по Земплену, затем получали бензилиденовое лроизводное (31), которое селективно вшдаровали хлорацетахлоридои по'З'-ОН. Хотя моно(хлорацетихшрование) диола (31) идет селективно в это положение, максимально достигнутый выход З'-ядорацетата (32) составлял лишь 53», из-за того, что даже при низкой конверсии исходного диола уже образовывался ди(хлорацетат) (33).

1с

((И2)3ШСОСР:

3 (32) В?=С1Ас, ЕЙ^РЬСН

(33) В1 =1^=0110, Н3К3=РЬСН

(7) В1-1(2=К3=АС (31) Н1=Иг=й. Й^^ЬСН (31а) ^В2^. Л^РЬСН

(34) ВГ=сис. А^РЬСН, й3=Вп

(35) й1*«. К2В2=РЬСН, й3=Вп

(36) В1=К?=Й3=Н

Фукозйлярование, хлорацетата (34) проводили в условиях галоид-ионного катализа три-О-бензвд-а-1-фукошранозилбромидом.

Выход трисахарида (34)- с — учетом ~ возвращенного дйсахарида (32) составил 63%. После удаления защитных групп обычным способом получен спейсерированный трисахарид Н (36).

Затащенный тетрасахарид В (37) синтезировали из производного трисахарида Н со свободной гидроксильной группой при С-3' (35), полученного удалением хлорацетильной группы по Земплепу из хлоренетата (34). а Галвктозное звено вводили, как и в случае синтеза Тд' -дисахврида, используя тетра-О-бензил-а-р-гадэктопира-нозилбромид в качестве гликозуишрувдего агента и цианид ртути как катализатор; (выход 80%). Снятием защитных групп получен спейсерированный тетрасахарид В типа 3 (40).

Защищенный тетрасахарид А (41) синтезировали также из З'-ОН трисахяридного производного (35). В качестве гликозил-донора_ был использован бензилированннй взидохлорид (10), гликозилирование проводили в присутствии карбоната и перхлората серебра. Тетрасахарид (41) не удалось выделить гомогеннйм, поэтому доочистку проводили на последующих стадиях - снятии защит и замене азидной группы на Н-ацетамиднуго. Общий выход спейсерированного тетрасахарида А типа 3 ни стадиях (35)—>(43) составил 43%.

^-ОН1

Иг0,'~0\ и1 о/—°\ в1о/~

V М; Л5й А

M___/ \|_/ _/ Ô(CH2)3NHCOCF,

Ir

3 ,0i b teAc

A \| (37) R1=R'=PhCH, R2=Bn, R3=OBn

R20 ) (40) R1=R2=H, R3=0H

R 0 >—J/ (41) R'=R1=PhCH, R2=Bn, R3=N3

OR2 (43) R1=R2=H, R3=HHAc

TK лисахаридлое звено Galpí ЗСаШАса обычно входит в corran более с,ложных испей как внутренний фраплент (антигены типе 3 гликопротештовой и гликолинидной природы). Недавно, однако, был выделен т.н. "галактозил-А" гликолипид. .в котором TF дипахнрил гшыетои т^] 1МИ71 лльним :

<¡HI.J.¡ i-,<iiriA.nl «ja 'itîalpl lf,]<f] H!«r

í"

Ри«ц1 рхиаттчл /I nuruirvn

В. данной работе мы сделали попытку синтеза галактозил-А твтрасахарг ■в (выделен курсивом). исходя из защищенного спейсерированного А-трисахорида (44).

Мы выбрали тот же путь синт за, что был использовал в случае №-дисахарида; получили бензилиденовое_ производное (46) со свободной, гидроксильной группой при С-3 терминального СаШ~остатка и использовали в качестве гликозилирукшшго реагента ацето-броыгалактозу. Однако,'ни в условиях Гельфериха, ни в присутствии трифлата серебра ГЛ1 > .озилирование не шло.

о(сн2)3шсосг3

(44) И1 =й2=Н3=Дс

(45) И1 =й2=йЭ=0Н

(46) К1,В2=РМ1, И3=Я

(47) Л1 =Вг, Иг=Н3=Н

Одной из возможных причин является жесткость бициклической конструкции гликозилируемого звена в соединении (46),поэтому мы получили другое производное - 3",4"-диол с бензоильной защитной группой в положении 6"- соединение (47). Тем не менее, производное (47) не удалось прогликозштроввть ни адетобромгалактозой (по Гельфериху), ни более мощным глккозшшрующим агентом 3,4, б-три-0-бензил-2-0-бензоил-а-1)-галактозилбромидом.

1 •5.Сщтез_свобд®ых_5исах8ридов Са1сс1-ЗСа№с и СаШса] -ЗОаШАс.

Свободные нейспейсерированные дисахариды и их флуоресцентно-меченые производные были синтезированы в качестве стандартов для структучого. анализа углеводных 0-цепей гликопротеинов.

Оба дисахарида были получены из одного предшественника -производного а-бен; ш-Н-ацетилгалактозамина со свободной гидроксильной группой при С-3 (48). В качестве гликозилдонора для введения а-галактозного звена был использован тетра-0-бензйл-а-1}-галактопиранозилброиид (10а). В ' отличие от аналогичного

-------спейсерированного—производного (6)7 производное а-бензил-

К-ацетилгалактозаминв (48) реагировало стереоспецифично, и с хорошм выходом (85%) дало а.а-гликозид (49). Далее соединение (49) деблокировали по обычной схеме, получая дисахврид Са1а1-ЗСаШс (52).

(49) _♦ — Са1а1-ЗСаШс (52)

Дисахарид Са1.ЧАса1-ЗСаШс (55) синтезирован .нелогичным образом: соединение (48) гликозилировали ац илированным азидохлоридом (9); выделенный основной продукт реакции а-гликозид (53) (выход 56%) - содержал в качестве примеси р-иэомер (53Ъ) (соотношение а/0=12:1).

Синтезированные свободные дисахариды Са1а1-ЗСаШс, СаШссП-ЗваШс, а также Са1р1-ЗСаШАс-дисахарид и СаШс были превращены во флуоресцентно-меченые 7-8Мино-4-метилкумаринрвыв (АМК) производные - по реакции восстановительного шинирования 7-амино -4-метилкумарином. Полученные АНК-дисахариды (56), (58) и СаШс АМК (59) были выделены в индивидуальном состоянии обрашенно-фазовой ВЭЖХ и охарактеризованы • хроматографически.

(56) Galal -3GalNAC-AMK (58) GalNAcal -3GalNAc-AMK

(57) Galpi-3GalNAc-AAK (59) GalNAc-AMK

Показано, что синтезированные дисахвридные производные' хорошо отделяются друг от друга; их также .легко, отделить от АМК-производных N-цепей и других моно- и дисахаридов, в том числе глюкозы, лактозы и N-ацетилгалактозамина. Это делает возможным прямое химическое Еыявление 0-цепей гликопротеинов, в том числе цепей, специфичных для опухолевых тканей.

г.МОДИФИКАЦИЯ одигосахаридных гаптенов И ПОЛУЧЕНИЕ НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ.

Целью синтетической части работы был как синтез низкомолекулярных олигосахаридов, так и получение их поливалентных макром9лекулярных форм - неогликопротеинов, неогликолипидов, псевдополисахаридов. З-Аминопропильная группа в качестве "преслейсера" предоставляет широкие возможности для иммобилизации.

Гаптены со свободной аминогруппой легко получаются с количественным выходом из соответствующих N-трифторацетильных производных действием анионита в 0Н~- форме. Т.о. были получены следующие 3-аминопропилглякозида (G-sp-HHg):

QaiNAcabO(CH2)3Ka2 (60)

Gñipi -3GalKAca1 OtCHg)^ (61) А (тип 3)-0(CH2)3NH2 (65)

Gaipi-3GalNAcpi-0(СНг (62) В (тип 3)-0(CH2)3NH2 (66)

Galal -3GalNAca1 -0(CH2 )3Шг (63) Н(тип 3)-0(СН2)3Ш2 (67).

GalNAcal -3GalNAca1-0(CH2)3HH2 (64)

2.1.Неогликопротеины.

Неогликопротеины получали конъюгацией углеводных гаптенов с БСА. или цитохромом с азидным методом.

Серинсодержащие Тд- и ТР-гаптены (14) и (17). имеющие в составе спенсере сложноэфирнум группу, превращали в ацилазидные производные (68) и (69) по следующей схеме:

------------------------------- СОИНСНз ~

<и!сНгСйШ0О(СН2)4СО2Ег (14), (17)

I МрНд- НзО

сошснз

О-ОСН^СШНСО (СН2)2С0 (СН2)4С0Ш-Ш2

1 ^ВиОГЮ

аюсНз

о-оа^йшоосш^^соса^^ссИз (68). (69)

Аминоялкилгликозиды . (60)-(63) модифицировали, ацплируя по аминогруппе М-оксисукцинимидным или пентафторфениловым эфиром моноэтилового эфира адипиновой кислоты (при этом одновременно с удлинением спейсера в его состав вводится сложноэфирнвя группа) и превращая далее в азиды (70)-(73):

гоансн^со^

С-вр-Ш^-=-> С-вр-ННС0(С1^)4С02Ег —. ^вр-ШаНСН^дССМз

(60Ы63) (70)-(73)

Выходы конъюгатов и процент включения углеводной компоненты были,

как правило, значительно ниже ожидаемых, рсобенно когда

приходилось работать с микроколичествами (единицы мг) азидоироизводных.

2.2. Полиакриламидные (ПАА) конъюгаты.

Полученные неогликопротеины, описанные в разделе 2.1. были использованы как искусственные антигены для иммунизации и иммуноанализа. Однако, методическая сложность их получения, низкие и нестабильные выходы, я также ряд ограничения в применении заставили искать новые подходы к неогликоконъюгатам. Псевдополисахариды.

Для синтеза водорастворимых ПАА-производных углеводов (псевдополисахаридов) в настоящее время широко используется подход, основанный на введении в углевод олефиповой группы (аллильной или акрилоильной) и последующей сополимеризапии с акрил амидом. Этот путь был реализован в данной работе только для получения ТР-конъюгата: ПАА производное получали реакцией

радикальной (»полимеризации акрилоильного производного (74) с акриламидом (схема 1).

(СН2=СНС0)20

С-вр-Ш2 -» С-вр-Ш-ООСН=СН2

(61) (74)

СОШ

Схема 1

+ + яву

н2 сош согйр^

с_е|) . / сош2 сош сош2

. / С-вр(й)

.... « - у'" . / • б - остаток с ах ьр а

у^ у' 1) С-8р(Ю-Ш1) Я - неуглеводный лиганд

¿00 ¿00 ¿00 ¿)

и и О

Н0г К02 Я0г

Нами разработан методически более простой, и в то же время универсальный подход. Он. основан на конденсации аминоалкил-гликозидов с полностью активированной полиакриловой кислотой -поли (4-нитрофенилакри летом) (схема 2). Наличие в полимере активированных карбоксильных групп дает.' широкие возможности его дальнейшей модификации амйносоединенияМи различных классов. Введение других (неуглеводных) амияолигандов позволяет придавать полимерной молекуле необходимые дополнительные (функциональные и физические) свойства. Практически количественный выход в реакции присоединения позволяет вводить в конъюгот заранее оаданное количество лиганда. Таким образом, по одной и той же схеме можно получать неогликоконъюгаты различных типов. В данной работе кроме псевдополисахвридов (С-зр)п-ПАА были получены также неогликолипиды (0-зр)п-ПАА-РЕ|п, (производные фосфатидилатаноламинв (РЕ)) и биотшшлированные производные (0-мр)п-ПАА-В1о11п.

ПАА-конъюгаты аминоалкилгликозидов (60)-(67) получали, смешивая растворы олигосахарида и полимера в ДМФА. В пределах 15-20 мол.Ж замещение нитрофенильных групп происходит количественно при комнатной температуре и в отсутствие катализатора. Для достижения более высоких степеней замещения реакцию проводили ,при повышенной температуре (40-5Г°С) в присутствии триэтиламина или диизопропклэтиламина. После присоединения к полимеру лигандов О-ЖЬ,, избыточные активированные группы превращали в амидшм действием 2-ашшоэтаиола или аммиака. Очистка конъюгата сводилась к отделению его от нитрофенола и избытка Ш3 (зтаноламина) и проводилась при помощи гель-фильтрации. В ряде случаев, например когда конъюгат -использовался для активации планшетов, вообще не требовалось никакой очистки, конъюгат только разбавлялся подходящим буферным раствором.

Этим методом с количественным выходом были получены ПАА-производные всех синтезированных олигосахаридов с различной

степенью замещения - от 5 до 30%

Неогликолиш1ды_ (0гзр]п;11АА;РЕпьи биотипилированные_зонды_(С^ад)п1ПАА-В1о

Синтез неогликолипидов. также как и биотинилированных произ водных, включал дополнительную стадию - присоединение к акриловому кору К-Ш^, где И - это дополнительный (нзуглеводный) лиган; Неогяжолкшда синтезировали, присоединяя к полимеру вслед за углеводным лигандом (или одновременно с ним) фосфатидилэтаполамин. Обычно молярное соотношение исходных реагентов было следующее: • шиноалкилгликозид/РЕ/мононерное звено = 1:1:6.

Синтезированные неогликолшгады обладали способностью встраиваться в биологические мембраны, в частности, в убитые ' бактерии Э. тШезоЬа. Таким образом были получены сильные иммуногены.

Зощы. Для получения углеводных зондов - реагентов для выявления углеводсвязывзющих белков (лектинов, гликозилтрансфераз, и возможно, глнкозидаз), в полимерную молекулу кроме сахарида вводили биотиновую метку с помошыо аминогексил-произнодного (¡-биотина (В1о1МН2). Соотношение СОС^СН^С^^/В^ШЬ, н синтезе

зондов было выбрано равным 4:1; как оказалось, относительно низкое содержание биотиновых групп заметно не вЛяяет на растворимость зонда в воде, и в то же время оно является вполне достаточным для его обнаружения.

3. ПРИМЕНЕНИЕ НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ.

3.1. Использование неогликопротеинов и неогликолипидов для • получения антител к углеводным антигенам.

Лемье (Л.и.Ьет1еш) первым предложил и успешно применил методологию получения антител к искусственным автогенам олигосахаридной природы, основанную на использовании неогликопротеинов. Синтезированные в данной работе ТП-,ТР- и Та а-активные неогликопротеины также были использованы для иммунизации и иммуноанализа.

Другим типом иммуногена для получения углевод-специфйческих антител явл отся гликолигшды, сорбированные на БаХкопеНа МттезоЫ. Этот подход с использованием природных гликолипидов был предложен Хакомори (З.Накотог1). Мы показали, что макромо-лекулярные неогликолипиды (С-зр)п-РАА-РЕт также легко встраиваются в бактериальные мембраны. Такого типа иммуногены были получены на основе неогликолипидов с ТР-, а~, Т^ и Н (тип 3)-специфичностью. Предварительные результаты по получению моноклон альных антител (МА) к зтим антигенам показали наличие специфического иммунного ответа у мышей на вводимый антиген.

3.2. Использование ПАА-гликоконъюгатов (псевдополисахаридов)

для выявления и характеристики специфичности антител.

В литературе описано использование водорастворимых ПАА-псевдополисахаридов, полученных методом сополимеризации оле--финовых гликозидов или акрилоильных производных с вкриламидом, для выявления антител к бактериальным антигенам углеводной природы. Такие полимерные, не содержащие белка антигены, оказались очень удачными реагентами дм сенсибилизации но.пистирольных планшетов в ИФА. 0то относится и к ПАА-конъюгатвм, полученным методом конденсации а ноли(4--нчтрофенилакрилятом). С помощью ПАА-коит.югятов специфичности ТР-, Т„ Т -, Н (тин 3) проводилось

_________ Vi •____________________________-_______•_________

тестирование сывороток мышей, иммунизированных соответствующими неогликолипидами. Эти же конъюгаты были использованы и для выявления ауто-антител в человеческой сыворотке.

3.2.1 .Определение ^уровня __анта:ТР-8нтател__в__сывдротее_ крови здоровых донорови опухоленосителей.

Естественные антитела к TF-антигену присутствуют в сыворотке крови каждого взрослого человека и представляют гетерогенную популяцию антител с широким спектром специфичности. Уровень внти-ТР-антитсл у здоровых доноров' практически не изменяется, в то время как у карциномных больных наблюдается его снижение. Поэтому разработка методов количественного определения анти-ТР-антител Представляет интерес для практической онкодиагностики ' с перспективой ранней и дифференциальной диагностики злокачественных новообразований. Для количественного определения анти-ТР-антител Шпрингером (G.F.Sprliiger) был предложен твердофазный иммуно-флуоресцентный иммуноанализ с использованием выделенного из эритроцитов ИТ-антигена. Нашей целью была разработка аналогичного метода с использованием штяшеских ТР-антигенов (неоглико-протеин TF-БСА и псевдополисахарид ТГ-ПАА).

На основе TF-БСА была разработана тест-система (ИФА-вариант) для определения суммарных анти-ТР-иммуноглобулинов в человеческой сыворотке. Результаты тестирования сывороток здоровых доноров л пациентов с опухолями молочной железы показали, что:

1) искусственный TF-антиген может быть использован для количественного определения естественных антител к TF-антигену в ИФА-тесте;

2) отсутствие достоверных отличий в. содержании анти-ТР-антител у больных доброкачественными опухолями молочной железы и здоровых лиц, а 18кже между доброкачественными и злокачественными опухолями той же локализации, не позволяет считать данный конкретный тест пригодным для диагностики. Поэтому мы разработали другую тест-систему с применением синтетического ТР-антигена, которая позволяла определять уровень специфических анти-ТР-антител класса М и одновременно общее значение IgM в исследуемой сыворотке, то есть фиксировать показатель (в литературе описано использование

- Ш -

индекса 0^)*.

Для,' определения'' специфических ййти-ТР-1£й был использован антиген ТР-ПАА. Па сравнению с ТР-БСА он давал существенно лучшие результаты: низкие фоновые значения, меньшую неспецифическую сорбцию, большую чувствительность. Общий уровень определяли в той же системе (постановка обеих реакций проводилась на одном планшете), используя для сенсибилизации планшетов анти'гела к р-цепи 1£М человека.

Получение результаты свидетельствуют об удовлетворительном качестве предложенной тест-системы. Определяемые значения сопоставимы с приводимыми в литературе, однако количество исследованных образцов сывороток здоровых доноров и онкологических больных пока недостаточно для статистической обработки, чтобы сделать определенный вывод о диагностических возможностях предложенного теста.

3.2,2.Изучение питопной_спещфичности_ мономональных_анти=А;1_анти:В:а^

Группоспецифические антигены А, В и Н типа 3, а также Тп-антиген, наряду с другими группоспецифическими антигенами и их фрагментами были использованы для характеристики эттопной специфичности трех гемагглютинирующих моноклональных ' анти-А-антител: ЗГО, 44Г9, 1Н10, а тдкже десяти анти-В МА.

При исследовании анти-А НА было установлено, что МА 1Н10, полученные к рецептору эгшдермального фактора роста карциномной линии клеток А431, проявили высокую специфичность по отношению к тетрасахэриду А типа 3. Возможно, антиген А (тип 3) входит в состав самого рецептора.

Из десяти изученных анти-В МА три интенсивно взаимодействовали с терасахаридом В типа 3. Эти антитела, как

» • концентрация анти-ТР-1кМ

0 =--х100

м концентрация общего

(концентрация анти-ТР-1кМ)2

0= -х100

V концентрация общего ТдМ

Данная часть, работы выполнена совместно с к.б.н. А.А.Молодык (ВОНЦ АМН СССР).

оказалось, отличаются от остальных способностью агглютинировать любые эритроциты В, в том числе и "слабых" подгрупп.

С помощью синтезированных олиго- и псевдополисахаридов била изучена тонкая углеводная специфичность трех лектинов: из butea jronúosa (BFA I и BFá II, Gal-специфические) и из икры вьюна (со специфичностью к a-Gal). Из полученных результатов следует выделить следующий; лектин из икры выоно проявил бысоку специфичность по отношению к дисахариду тератокарциномы (Та а). Этот факт открывает • ззезшягекк, лиимьиаишт ьтыю л«ктин» «

ОНКОЛИРГЯОСТККЯ.

3.5. Использование биотинилированного №-зонда для исследования углеводсвязывающих структур поверхности лимфоцитов.

Зонд с TF-дисахаридом Galpl -3GalNAca, использовали для изучения углеводсвязывающих белков клеточной поверхности лектинов и гликозилтрансфераз - в последнее время они привлекают внимание как возможные опухолевые маркеры.

Для выявления связывающихся с TF-зондом белков был применен иммуиоферментиий цитохимический метод с применением стрептавидин-пероксидазного копъвгата. Выли исследованы лимфоцита и другие лимфоидные клетки (моноцита) персфорическсй крови, лимфатических узлов, и клетки, обнаруживаемые в экссудатах плевральной полости у больных с метастазами.

В нескольких случаях зонд реагировал с лимфоидными клетками, гистиоцитами, связываясь с 50-70% лимфоцитов крови и экссудативной жидкости. При этом низкодифференцировашше клетки, относящиеся к ранним предшественникам В-лимфоцитов,- а также тимоциты с зондом не взаимодействовал:!. Не связывались с зондрм и опухолевые клетки эпителиальной природы, сами в большем количестве экспрессирукшше TF-auTSii'OH. • •

Как было показано на примере суммарной фракции Т и В-лимфоци-тов и др. клеток разной степени дифференцировки, выделенных из аденоид, связывание зонда специфически ппгпбпров.тлось только TF-дисахаридом и его «-гликозидвми.

Работа по выявлению рецептора к ТР-дисахиду выполнена к.м.н. И.В.Лбраменко Институт проблем онкологии АН УССР, г. Киев).

При' изучении клеточных лйнйй эсцйтных1 опухолей мышей лимфоидрого происхождения (Р-388 и ЕЬ-4) было обнаружено, что связывание зонда с клетками зависит от фазы митотического цикла: была выявлена тенденция к усилению экспрессии рецептора ТР-дисахарида в период синтеза ДНК.

Т.о. полученные результаты свидетельствуют о наличии на поверхности Т-лимфоцитов рецептора, специфически связывающего ТТ-дисяхарид. Вопрос о природе этого рецепторе остается открытым, в дальнейшем предстоит выяснить, с какой природы белком на поверхности клетки связывается зонд - с лектином или сиалилтрансферазой.

ВЫВОДЫ.

1. Синтезированы иммунодоминайтные углеводные фрагменты антигенов Томсена-Фриденрейха и Тд в виде спейсерированных гликозидов, а также в виде серин-содержащих производных.

2. Синт( ированы спейсерированные дисахариды Са1р1-ЗааШАс(3, Са]а1 -ЗСаШса и СаШссП-ЗСаШАср.

3. Синтезированы группоспецифические олигосахариды А, В и Н типа 3.

4. Предложен удобйМ! способ синтеза спейсерированного а галактозаминида.

5. Получены и хроматографически (ВЭЖХ) охарактеризованы флуоресцентно-меченые производные дисахаридов Са101 -ЗСаШс, Са1а1 -ЗСаШАс и Са1НАса1 -ЗСаШАс.

6. . Реализован новый универсальный путь получения не.о-гликоконъюгатов: псевдополисахариды, неогликолипиды и биотин-содержащие зонды на полиакриламидной основе получены конденсацией гаитенов с поли(4-нитрофенилакрилотом).

7. Показано, что полимерные неогликолипиды являются сильными иммуногенами. а псевдополисах8риды - удобными формами антигенов для изучения специфичности поли- и моноклинальных внтитрл.

8.На основе искусственного ТР--антигенэ разработана иммуно-ферментлая тест система для количественного определения г,стен твенпых антител к антигену Томсена Фрнденрейха в сыворотке крови.

9. При помогай зонда с ТР-специфичностью на поверхности лимфоцитов человека обнаружен специфический рецептор дпсахарида (1а1р| ЗСаШса.

- 21 - __ _ Основные_рез1льтатн _мссещацтонндй_рабцта__изложены__в

1. Бовин Н.В., Землянухина Т.В., Хорлин А.Я. Синтез неогликопротеинов, несущих гаптенч (Gaipi-3GalNA«i1-)Ser. Gaipi - 3GalMAca1. Gaipi-3GalNAcfi 1, (GalNAcal-)Ser.- Биоорган, химия, 1Э85. т.11, с.1256-1264.

2. Бовин Н.В., Землянухина Т.В., Хорлин А.Я. Изомеризация трифторацетамидонропил-2-ацетамидо-2-дезокси-р-1)-галактопиранозида

в д-аномер. Удобпнй метод синтеза искусственного Т-антигенв.-Биоорген, химия, 1986, т.12, с.533-538.

3. Землянухина Т.В., Байрамова Н.Э., Бовин Н.В. Антиген тератокарциномы РА1.- Тезисы VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов, Тбилиси, 1987, "Пущино", с. 216,

4. Землянухина Т.В.,' Бовин Н.В., Байрамова Н.Э. Синтез неогликопротеинов со специфическими цепями тератокарциномы,- Докл. АН СССР, 1988, т.299, с,129-131,

5. N.V.Bovln, N.E.Byramoya, T.V.Zeinlyanukhlna, E.Yu.Kor-chaglna. An aproach to carbohydrate antigen engineering. Abstracts of 5th European Symposium on Carbohydrates, Ргидае, Chechoslovakia, 1989. C-72.

G. T.V.Zemlyanukhlna, E.Yu.Korchagina, N.E.Byramova, N.V.Bovln. Synthesis ol A, B, -1 (type 3) ollgosaccarlde3 and their fragments. - Abstracts ol 5ttl European Symposium on Carbohydrates, Prague, Chechoslovakia, 1989, A-47.

7. N.V.Bovln, N.E.Byramoya, T.V.Zemlyanukhlna, E.Yu.Kor-chagina. Synthesis and properties of polymeric neoglyeoconjugates.

Abstracts of XVth International Carbohydrate Symposium, Yokohama. 1990, B110, p.287.

8. O.E.Galantna, T.V.Zemlyanukhlna, E.Yu.Korchaglna, N.V.Bovln. Epitope specificity of hemagglutlnaolng monoclonal antibodies. - Abstracts ol XVth International Carbohydrate Symposium, Yokohama, 1990, B040, p.216.

9. T.B.Землянухина, Н.В.Бовин. Синтез олигосахаридов с групповой специфичностью крови А, В, и Н (тип 3). - Биоорган.химия, 1990, т.16, с,1096-1104.

10. Бовин Н.В., Байрамова Н.Э., Землянухина Т.В., Корчагина Е.Ю., Андрианова Л.М., Мягкова М.А., Иванов А.Е., Земляков А.Е.,

Сухенко ■ Л.Т., Ющенко A.A., Зубов В.П. Способ получения искусственных антигенов. - Авторское свидетельство N 1614202, 1990.

11. О.Е.Галанина, Е.И.Дерюгина. М.И.Лапенков, А.Е.Носырев, Е.В.Корчагина, Т.В.Землянухина, Н.В.Бовин. Эпитопная специфичность гемагглютинирующих моноклональных анти-А-антител. Биоорган.химия, 1991, т.17, с.343-352.

12. О.Е.Галанина, Е.И.Дерюгина, Н.И.Оловникова, А.Е.Носырев, М.И.Лапенков, Н.Б.Чекнева, Т.В.Землянухина. E.D.Корчагина, Н.В.Бовин. ЭпиТопная специфичность гемагглютинирующих моноклональных анти-В антител. - Биоорган.химия, 1991, т.17.