Синтез и анальгетическая активность новых димерных аналогов бета-казоморфина-3 и бета-казоморфина-5 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

СКИСТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНМЫШ УНИВЕРСИТЕТ

СИНТЕЗ И АНАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ЛИМЕРШ АНАЛОГОВ ^КА30М0РША-3 П ^КА30М0РЖА-5

(02.00.03- -» Органическая химия)

АВЭОРЗ'ЗВРД" дассэртоют на соискатшо ученой сгепэнп кендпдота тшчвскта наук

и '»

/

На правах рукописи

САИНОВ САШТР ОАНГИКЙТОДОВИЧ

ДУШАНБЕ -- 19Э7

Работа выполнена на кафедре органической химии Тадкикрно-го государственного национального университета' 1 .

Научный руководитель: доктор химически* наук,

профессор ХАЛЙКОВ Ш.Х.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, 4 ■ . профессор Бавдаев С.Г.

кандидат химических наук, доцент Бадаев Р.В.

Ведущая организация: Таджикский медицинский университет

Защита состоится " // " сентября 1997 г. в час, на васе-

дании диссертационного совета Д 013.02.01. при Институте химии им. В.И. Никитина АН РТ, по адресу: 734063, г. Душанбе ул. Ай-ни 299/г.

Автореферат разослан " /<£" августа 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пулатов М.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проОлеш. В последние года большое количео-'во научных исследований в области органической хшш? посвякено шданив пептидных лекарственних препаратов, в частности -'безблжьяхжих. Зто связано с том, что прцмзняэше до нсетоя-;его времени для згой цели наркотические алкалоида ряда морщила блодают иежелатолышш -побочными эффектами такими, как подав-:ение дыхательного центра и эффект привыкания, вызывающий таксе аболевание как наркомания. После открытия описидкых пептидов и становления того, что по характеру действия па организм сии хеш с наркотически«! .алкалоидами началась штвасшшыэ иссла-оввния с целью применения этих пептидов в качестве сбезболава-здх препаратов. Поэтому проведение струкгурпо-^щдаснзлькнх сслвдоваяий в ряду опиокзвнх пептидов к норотичоеких аххался-ов является весьма актуальны!,-<.

Как наркотические алкалоида, так и опиойдт:е пептиды блия-т на фязнолагнчесш-ю процессы организма чороз опиоиднуэ роцэп-эрц. Несмотря на уке достишутнэ результат« по изучению опио-яшх рецепторов, та структура до иастоядаго зремэии ещо ко вменена. Изучение структуры и механизма действия опиовдных пеп-вдов с ошюндш-'мн рецепторами является одам из путей раскрыли пептпдно-рецепторкаго взаимодействия на уровне клетки. С гей точки зрения важной является оценка взаимного располокешхя энтров связывания (1,0 -отгаидних рецепторов на поверхности * пазматичвеких. квмбрав клеток, которая осудзсталйотся с помощь» кнтетнческих дамэрных дагандов, образованна: спиоидпшш пепти-эми, соединеннюш алшдааминовшга "шотикймя", сшодекя опрв-зденную длину.

Определение структуры опиоидных рзцепторог. и ьзашного

кяголокегаи их центров связывания монет откры?ъ путь к познано механизма лиганд~рецет "орного взаимодействия к 1ккдо.гат >нять суть многих проблем, связанных с ят-я&чп тяжадих зпбо-1ваний, поразсещих центральную «ррвчу» атстему, г?ких к«; 5*зр-А'ЩШЯ, ШЯЗОфреИЙЯ, ЭтШЗНОНЯ и друга«.

Цо.р.ь и; зодато «селелойпадЭ. рсио; не? /тгютекп.ой гл-

уп; н 'куГсч1:-.1 > (ол^!^. V! 11)

активности новых доаорных аналогов ^-специфических опиоидчых лигевдов р-казоморфина-э (н-Туг-Рго-РИе-он) и р-казоморфина-5 (н-5.'ур-Рго-йге-Рго-а1у-он), соединенных диаминоалкамовыми мостиками различной длины и шеищи, структуру Н-Туг-Рго-РИе-Ш-(СН^-Ш-РЬе-Рго-Туг-Н (1) И Н-Туг-Рго-РЬе-Рго- ГЛу-ШМСН^-ШЧЦу-Рго-РПе-Рго.-Туг-Н, <2) где 11=?, 4,6,8,. ... "

Для достижения отой цели было необходимо реаит:. следуицио задачи; . ■ ,

- синтезировать защищекшо пептида, соетвотстсуадце последовательности р-казоморфина-З и р-казоморфшт-5 и свободный пептид, соответствую®!! р-казоморфину-5;

- разработать оптимальные методики синтеза аминокислотных производных диаминоалканов с н-заадеаенными фашигалаямном и ГЛИЦИНОМ; •. .

- разработать оптимальные - .схемы синтеза и синтезировать новые димернаэ аналоги р-кааоморфина-3 й р-казоыорфшза-5 с диа-кишоалг.аиами; '

- разработать режим очистки синтезированных дамарных аналогов с помощью обращенно-фазовой. высокоэффективной жвдкостной хроматографии;

- изучить физико-химические свойства полученных соединений;

- определить анаяьгетическую активность синтезированных соединений по откоаошю к р-казоморфину-5 и дарфшу.

Научная новизпа. Впервые синтезированы аминокислотные прокзюдние диаминоалканов с м,Н'-защищенными <$енилаланкном и глицином и на их основе получены ноеыэ дамернне, аналога р-казоморфша-З (1) и р-казомор$шт-5 (г) и изучена их анальге-таческая активность'. Определено, что анальгетичоская активность дамернах аналогов р-казоморфина-з ниже или приблизительно равна ектввности морфина', но выше активности р-казоморбина-З. Аналь-гетическаи акПЙНость всех димерных аналогов р-казаморЯина-5 ваше активности Исходного р-казоморфина-5 и "природного морфина.

Практическая значимость. Разработанные методики, синтеза димерных аналогов р-казоморфина-З и Й-казоморфина-ь, включающих разные по длине цепочки диаминоалканов,и условия очистки подобных соединений 'с''помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии-•• могут быть использованы при синтезе подобных дилеров друих-чзйологически активных пептидов. Синте-

зировапяие димерние аналоги могут найтл щняленениз в ¡¡сслодовз-ниях по изучению структуры опиоидгак рецепторов и созданию новых обезболиващих препаратов на основе огооидннх пептидов.

Оспсзтше пслогешт ианосшше на зпцяту

1. Разработанные способы синтеза:

- пептидов, соответствующих последовательности р-казскорфяна-З и р-казокорфииа-5;

- аминокислотных производных диаминоажаноз с н.н'-зеадщешш-га фенилалашшом и глткгном.

- димерннх аналогов в-казоморфана-з и (М:гэо»эрфз:ч-5 г Н-Т^т-Рго-РЬе-Ш-(СЕ>> -Ш-РЯе-?го-1уг-11 (1) -и ИМСуг-Рго-РЬв-Рго-С1у-!>Н-<СЧ0)-КЕ-С1у-Рго-РИя-Гго-Туг-П (2) ТТЛ П«г,4,6.0,

с а .

2. Определенные /,рс;';атогра:р1чес:-;.;».о пзрл*.!£. гра очг.екп гаченных Д'.и'орш.ж шююгоз р-казс.'орфзй-э п рг

3. Данные ко шнйлыетичвекоа якгакк'сш синтезированных соединений.

¿вро$!И15тд работа. Результат диссертаций били доловены и обсуадош! на тучтдге конфзренцхяж '"Георэтачост и прикладные проблема жят" (Дуаак<7е,1995), "1>0~т?:1ч Инсгкт -та хюяот им. В.И. Никктдаа АН Республики Тпдяакяетгн'' (Дусш5е,199б), и кед-дународаоЯ кок£юинцик, посвк»зш'.ой зо-лотэт академика Порошка К.Т. (ДуаапС-9,1997), я таяге на евггода« яаучкэ теоретических конференциях профэссорско-щ»подайстедьс?<зго состава Тадоткско-го Государственного Национального утгаорептс'п (1990-1997гг.)

Публикация. По материалам дассертгцяз оъ,/й.п:хсь?.по 6 печатных работ.

Объем и структура дгссертздал. Диссертация ику япа на но страницах машинописного текста, состоит кз введнгаш, оозора ди-терлтурн, обсуждения рэпультвтов, эксперкмэптаиьной тая я» выводов и списка литературы, вклшоздпго 92 ятюиовашш.

Я. МАТЕРИАЛ! И !,<?,ТОДО

2.1. Пк-птпли. !!.-:гп:ли ' -в':;!!.1 м.-< ¡'о;г:к.л ">■

ГГ!|Г<'|!.'И ГЧСТ:?! Кр.''.. •(.'».; ( Г.- ЧИ7Т1','' "¡Г.;"!'.: '•'}' Г

качестве конденсируадего реагента был использован дациклогек-сшлкарбодшшнд. При конденсации блоков карбодинмидннм методом < целью .предотвращения рацемизации в качестве нуклеоф&льной добавки был использован 1-гидроксибензотрказол.

Б качестве временных ^-защитных функций были использоваш карбобвнзокси-(2-) и трет-бутилоксикарбогакл^ная \4oe-) группы. Гидроксилънзя груша тирозина была защищена бензильной (Вг! грушюй. Карбобензокси- и бвнзильную группы удаляли каталитическим тарированием над ю$-шм ра/о и обработкой бромистш водородом в ледяной уксусной кислоте. Вое-грушу удаляли обработкой трифторуксусной кислотой или бромистым водородом в' ледяной уксусной кислоте.

2.2. Очистка свободных пептидов. Свободные пептида бшв очищены с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке £50x46 ш 8р11ег1ъогЬ-0БЗ при ис-пользоваши в качзстве буфера о,1й-ной трифторуксусной кислот1 и в качестве органического модификатора - метанола при скорост] потока 0,5 Ш1/ыин и детектировании при длине волш 220 им.

2.3. Определение анаяьгвтйческой активности. Анальгетичес кую активность определяли по теоту "прижатия хвоста". Групп; белых мнаей предварительно обучали действию рвздракителя нало нением артериального заяша на основание хвоста. Реакцию мше; определяли по издаванию писке или грызанию закима. Отбирал группы по 5 мышей и вводили дозы пептидов в физиолтичесш растворе интрацистерально (в желудочек головного мозга). Реак ци» животных альтернативно определяли наложением артериальиог залила на основание хвоста через ь, 15, 30 и далее через кавды 30 минут до исчезновения действия препарата. Эффективную доз пептидных препаратов определяли методом Личфилда-Уилкоксона,'

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЭЛ. Синтез новых димернык аналогов р-казоморфина-З и (З-казоиорфина-5

Первоначально была сделана попытка присоединить р-казомор фин-з и {Мсбзоморфив-5 к диаминоешкенам.

Для этой цели; с исг.ольпоьанием харбодиглаишего ь

вкглшроаакшх эфиров бня1 сштезироввш зеаввюшшо пектега, соотватствущив р-казоморфшу-Э и р-казоморфн5у-5.

р-Квзоморфян-Э первоначально бил получен годом шгашро-ванннх вффов путем ступенчатого наращивания пзптидаоа цепа но-ганая с й-коаца в соответствии .со схемой 1.

Защищенный дилептид г-Туг(Ва1 )-?го-он О) Оыл подучен кои-

туг

■ОНр

Ба1

\

\-

Вя1

X-

Вз1

Вз1

Рго

РЬэ

-ОН

-ОН(3)

-05и(4) И-

-он

-ОН(5)

Схема 1. Синтез р-казоморфина-3.

;енсецией 2-Туг(Вг15-окр с натриевой солью пролила. Реакция :ондеисвцки ,з) била гроведена в зэтдетагсЗ^рьдаздном растворе, аделиваийся п-нитрофенол бнл удален экстракцией эфиром из вод-01о раствора реакционной смеси. Основной продукт выделяла окс-ракцией этилецетатом из подкисленного водного раствора. Вслед-ТВЯ0- схожей растворимости получаемого далэптвда и трет - бути- ■ оксикарбонил -О-бензилтирозина з органичосних растворителях редварительная очистка путем перекристаллизация из эфира ив ривела к полному удалению производного г-хроггат. Поэтому окон-ательную очистку полученного дкпептада проводила колоночной роматогрвфаей на силккагвлз ьиоолво. Элдарозаниви смесьо энзол-ацетон-уксусная кислота (100:50:2) бнл удален азпрорза- , ировавщий карбобензоксл-0-бенэилтирсзин. Основной продукт (3) лвировали метанолом. После упаривания элм;;тз и вдсумиэАНИч статка под вакуумом продукт бил получен с в:ш>дск 72,13.

Конечный запущенный трипептвд г-а'уг (Вз 1) - V го -рь^-юн (5) ял получен конденсацией ?.-Туг(Вз1)-Рго-05и (л) с фокзшзланписм выходом 62,1%. н-ОксисукшшимндныЯ эфир дипептвда (4) был порчен карбодиимидним методом в см? т? диоксан-зтнлацбтат и,сразу

после отфальтрования выпвваей дициклогексшилочевгшы.бал прибавлен в щелочной раствор натриевой соли фвшшалаккиа в' даматвл-формэдце. За счет того, что у синтезированного трлшшвда (5) растворимость в органических растворителях гораздо шао.-'чсы у исходного дипептида, то защищенный трипептид был получен с достаточной степень» чистоты путем экстракции огилацотатом из подкис данного водного раствора и последуюдаго дара о здений из

Туг

Рго

ГФ.е

Воо-

Еоо-

Воо-

Вос-

^-Шр Ва1

-Шр

-ОН

-ОН(б)

-ОН(7)

-ОНО)

Схеиа 2. Синтез р-казоцорфиш-З

вталацетата гексенон. Поатому в проведении дополнительной очистки, как в прэдздудеы случае, не было необходимости,

С целью поиска болов оптимального пути синтеза р-казоморфана-3 он бил синт зирован также штодоа. активированных ефйров путем ступенчатого наращивания пептидной цепа, го только начиная с С-конца согласно схеме 2.

На первой стадии синтеза, конденсацией Вос-Рго-Шр с натриевой солью фенилалашша в водао-ддаетилфорлавдном растворе, был получен защищенный дипетид Воо-Рго-РЬе-оа(б) с выходом 8458, который был очищен переосаадешем сначала из эфира гексаном, е затем из этилацетата эфиром. После'удаления трет •- бутилокси-карбонильной группы обработкой трифторуксусной кислотой, сразу. после удал8Ш1.ч растворителя свободный дипептид(7) вводился в реакцию конденсации с Вос-ТутчВ-аьояр. а-Карбоксильнал груша ьмкнэкомпонента в этом случае была защищена путем солеобразова-ния с помощью И-метилморфолша. Завдщешй трипептид(в) был получай с выходом 87,5Й посла очистки путем двукратного переосак-

дэппя из этшгацэтата эфиром.

Ттсвм обрезом, тактика ступенчатого паредаваяия пептадаоЯ цепа начиная с С-конца методом актшфонеиншс рфароз является наиболее опткмалышм путем синтеза р-казейорфйна-э (схека 2). В этом случае узветчисгется выход закташах пептидов и значительно упрощается процесс их очистки.

|3-Казоморф;:и-5 бил получен комбинаций ступенчатого наращивания пептидной ц-зпя и бло'шой кенд'лгсизш согласно схзке з.

Заззнценшй дтагатид Воо-?уг(Ва1 )-г-го-сн(9) сил получен конденсацией Воо~?уг(13з1 )-Шр и натриевой сог:л продинз в сг-есп даоксан-вода. Очпзтаа завдаяеююго ягпептядч от прамэси . п-иитрофзнола и Воо-?уг-(Ва1 )-0Н вслвдстЕМ сводкой раствори-

Туг

Рго

Воо- -Бос-Вос— Воо—

н-

Vе"1"' г.-л

(?)

(14)

Вз1

Ез1

ъ——СЯр

Рго

*'——01!

С1у

Л91.

—Ой 3-

—ой г~

—СЗи н-

(п)

-са

-ОБи н-(12)

—ОН

(15)

(16)

-он

-он

Сх<ма з. Сш!тез р-«азомор;,:г;;а-5

моста в органических растворителях бала осу^зсгшгсна колоночной хроматографией на силикогеле Ь-100/160. Присутствуя«» ярэгоси вначале удаляли элшроБЭнием смесью бекзол-апотон-уксуспвя

к".лс.т^-хд'.роЗЧ'Пм (10:0,^, .о',2:100). Основной продукт ОВЛ ЕЦДО-.V»! п;;и глетлиу/ом. уппеглпгпл олгеята п

■''/••■У-

"Л!Н

г^г'-'лг.".' -■■у-хл^ ('.)) г.тт.-;1!' . 1 г ■ , : \ } го-СИ ( 1

использована тактика ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с К-конца. Конденсацией г-рье-о^р с натриевой солью принта в водно-дашетилформамидном растворе с вагодом 82% был полу чел запущенный дишптзд г-РЪе-Рго-оЖЮ) который был очищен переосаггдэнием из зфира гексаном,затем из' этил ацетата эфиром.

Н-Оксисукцикимвдный эфир защищенного дишптида (11) был получен карбодиишднш методой в эгилацетатном растворе и вводился з реакцию конденсации с натриевой солью глицина сразу после удаления выпаЕией дициклогексилмочевины и упаривания этилене тата, Реакция конденсации в этом случав была проведена в смеси диоксан-вода. После прскышда кислым раствором и перекристаллизации из смеси этилацетат - эфир защищенный трипептия %-РЬа-РгоЧЛу-ОН (12) был подучен с выходом 84,ЗЯ.

Конденсация ди- и трипептидного блоков была осуществлена методом' акх-ивировакных эфиров. После удаления карбобензокси-группы с защищенного трипетвде путем каталитического гидрирования над ю$6-ным Рй/С свободный тргаентид Н-РЬе-Рго-01у-0Н (13) вводился в реакцию конденсгции с н-оксисукцишшидным эфиром Боо-й1уг(Вг1 )-Рто-0зи, (14). который был подучен карбодаимидным штодом» Реакция конденсации соединений (13) и (Н) была проведена в далэтилфорйа&ыде. Окончательное деблокирование пентапеп-тида (15) было осуществлено обработкой бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте в присутствии анизола. После осаадания йфиром из реакционной смеси свободный пентапептид (16) был очи-аен с пошаью обращенно-фазовоЯ высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Необходимо отметать, что для очистки этого пентапептида методом ВЭЗКХ потребовался особый экспериментальный подход, которой отличался от обычного. В результате многократных экспериментов были выбраны в качестве буфера 0,1%-ная трифторуксуснная кислота и в качестве органического модификатора - метанол. Особенность подхода заключалась б разной скорости подачи органического модификатора: от 50 до 1Ъ% время подачи метанола составляло 15 минут и с 75 до 90% - 5 минут. После лиофмлизации фракций, содержащих основной продукт, окончательный выход свободного пеятш ептида составил 58,3$.

Для получения дамерннх .аналогов конденсация пептидных блоков была осуществлена кэрбодиимидным методом.

'" Первоначально била сделана попытка получить димерккй ана- . лог. р-каяоморФета-З о окташтилендиашшом путем взаимодействия 2-х эквивалентов защищенного трипэптвда (8) с 1 эквивалентом октшетилендаемк^ч карбо;лдаым методом в присутствии • . 1-гидроксибонзотриазола в ;к ?тилформемидаом растворе по следующей схема: .

2 Boo-TyHD.~.1 )-Pro-Phs-OH + 2H0I • HgN(CIL,i» -i—5>Вос-Туг(Вз1 }-Pro-Phe-wH (CHg )gWl-Phij-Pro-Tyr(Bzl )-Bco Нуклеофяльная добавка 1 -гп^ :жсу.бг:нзотркезол была нетто пъяотяа с целью умэкьаэшш рацемизации. Посла обычной обработки, т.е. промывания киелнмя к щелочными растворами прагукт не бил получен с с достаточной степенью чистота. Поэтому вознкг-ла необходимость в дополнительной очистко, которая бала осуцоствлона колоночной хроштогргфггей на колонка с силлкагэ-шм L-100/RD0. При элкстроЕящш хлороформом С:и:: удалены прщ'.зеи, основной продукт эяшровеп кэтсиодэн. Поело упарявапия Фрекщй, содвряагоя основное продукт, он бил получен с выходом 165$. С. нтез дамерного сналога р-казошрй'лт:а-5 бил осуществлен вналогичным путем. Выход дпморз при этом составил 26*.

О первого взгляда когат иокззоться, ".то при конденсации тр-шептсшгаго блока с октап-зттондиеюшом енход лояучогопго ди-морного производного долгой быть вшэ, чек при конденсации пон-тапвптидного. Однако, в назем случае наблюдается обратная картина. Это, вероятно, можно объяснить тем, что наличие у С-концевого остатка р-казомор!ша-з (фешигрдэишя) присутствие фзнольного кольца затрудняет активацию его а-карбоксильной группы за счет стеричвеких факторов. У С-концевого остатка р-казоморфина-5 (глицина) отсутствует бокошя группа, которая создавала бы сторическио затруднения, Поэтому активация а-карбоксильной группы глицина проходит логчо, чем у фзнилолсшиа и, как следствие этого выход дамерного производного р-казомор-фгае-5 выше, чем производного р-казоморфина-3.

Такие результата для пептидной химии считается неудовлетворительными, поэтому возникла необходимость з поиске других /V путей синтеза пептидных щшзеодных такого типа.-Алт-тзркетивпым путем получения таких соединений является синтез чероо гг«щда получения окиноки&лотннх проазводшых аладдаакииоа.

Ш8ТСИУ в Д'эЛЪГК'пЖМ ДИМОрКК1.' йЧйЯСТВ p-K83fW>f.»J.-P'f!-3t1 ) " •

р-казоморфкна-5(2) были получены именно о помощью аминокислотных производных аякандиаминов.

■ Для синтеза димерных аналогов р-казоморфина-3 были полу- -чены следущие производные:

■ 2-Йю-Ш (СН2)п-Ш-РКе-г, п - 2, 4 Воо-РЬ.е-Ш(СНг)п-Ш-РЬе-Воо, п = 2, 4, 6, 8 Эти соединения были получены методом активированных эфиров. ковденсецией соответствующего алханматта с 2 эквивалентами п-нитрофекилового эфира н-защищешого фенилаланина.

Использование для- защита а-аминогруппы фенилаланина двух различных занятных груш обусловлено плохой растворимостью получаемых карбсбензокоилроизводаых. При их синтезе обнаружилось, что они легко синтезируются и легко очищаются вследствие своей плохой растворимости в органических растворителях. Даке карбо-б8нзоксипрризводное г-РЬе-1Ш(он2)2-кн-РЬе-2; растворимо только в .горячем диметилформамяде. Ято их свойство значительно облегчает процесс очистки путем перекристаллизации из диметилформа-мида.что дает возмокность получить их с достаточно высокой степенью чистоты и достаточно высоким выходом. Однако, их плохая растворимость.создает значительные трудности при удалении кар-бобензоксигруппы путем каталитического гидрирования, которое . необходимо проводить в горячем днметилформашдэ, что является нежелательным в пептидной химии *с точки зрения проведения эксперимента. Кроме того, чем большую длину имеет углеводородная цепь диаминоалкана, тем меньше растворимость получаемых димар-ных аминокислотных производных в органических растворителях.

Поэтому с целью повышения растворимости в органических растворителях аминокислотных производных дааминоалканов, также были получены конденсацией соответствующего диаминоалкана с п-штрофениловым эфиром трет-бутлоксикарбскилфенилаланина Вос-производные, которые обладают, гораздо лучшей растворимостью в. органических растворителях. Все они, за исключением соединения с п=8, растворимы в этилацетате и были очищены промыванием их этилацетатных растворов кислыми и щелочными реагентами с последующей перекристэлизацией из атилацетата. (п=2, 4) или из смеси этилацетат-диоксан (.6:1).. Только производное-с п=а было.очищено пврвосавдешем из .'диметилформамзда. водой.' Выход .данных аминокислотных производных, достигал-74-6**. •■'■". '■' , •' •' .

Удаление с этих производных трот- <5утлоксикарбонилыюй группы перед дальнейшей реакцией конденсации проходит легко и за короткое время при обработке трифторуксуской кислотой.

О целью разработки оптимальной схокы сштеза димераых производных. (З-казсморфина-эО) они были синтезировали двумя путями: ступенчатым наращиванием пептидной цепи методом активированных (п-нитрофезилоЕых) эфиров.и карбодгопящшм мотодом путем блочной конденсации ааинокисяотных производных алкаядиемша и дипептида (9) в ирисутствии 1-гвдроксибеизотриазола.

, На схеме 4 показан синтез ¿¡мерного производного р-казоморфжа-З с етилвндиашпюм путем ступенчатого наращивания • пептидной цепи.

При этом синтезе п-нитрофэкилотай ефар.кариобензокскпролн-на был взят без избыта, то есть на 1 эквивалент соедишюш

(17) било взято 2 еквивалэита ектнвнровшшого эфира. Очистка полученного соодинония бзлз осуществлена обычным методом с последующей перекристаллизацией нз этилацетата. Выход соединения

(18) составил 52,258. После удаления карбобензокси группы каталитическим гадрировашем полученное свободное производное (19) вводилось в реакцию конденсации с Я-а'уг )-ОНр, который был взят с избытком 25$. Выход конечного продукта (20) при г том. составил 545.

При использовании блочной копдексаця корбодшгмидным методом (схема 5) дгаштвдО) был взят без избытка,а дициклог ксил-кврбодимвд - с избытком 5% с целью увеличения выхода конечного продукта. После очистки обычным методом а последующего переосая-дения из этилацетата гексаном выход продукта составил 78,1258..

• Поскольку общий -выход конечного продукта при блочной конденсации оказался.более высоким, чем при использования ступенчатого нэрэадеания пептидной цепи, то дамэ^аэ аналога (з-каэоморфина-з с п = 4, б, 8 г>ит получены по стой. схеме.

При синтезе дилера с п=м дапеитид был использоъан с избытком 20%, с таким ге избытком в качества нуклоофцлъкой добавки был использован н-океисукциккмид, деосжлогексалкербодоизд бал использован с двухкратным избытком. Поело обычной обработки рэ-акидоннсй смеси, переосаддения из ефара гекезнем и перекристаллизации из этилацетата выход конечного продукта состегал

При получении дютрюв с п=б и п=-Э с избытком ю 203, со-

£

о fi

О ¡3 л

É*

ta

5

I

-4 r-l

я TjS ^

I -ч

о см

ta m ta

œ1

ы м со

N ta и

Os

h

ь-i (А ¡я

о, ^ S N

V4

M ы и

è

о о

о <-* О >-t M

(3 г) Ú H В N я

Vя

еч

о й

а

В

О ъ>

S S s

S p.

w и

0

1

.ft

a

s

04

a

S â

t.

e-i

M

и

a

« a

6 о

e

«

W

ответственно, были использованы аминокислотные производные диа-миноалканов. Полученные димеры после обычной обработки реакцон-ной смеси, переооаадэния из вфира гексаном, из этилацетата эфиром и из метенола ацетоном были получены с выходом 92 и 63.7Ä. соответственно.

Для синтеза димерных аналогов р-казоморфина-5(12) были получены следующие глициновые производные диаминоалкшов:

Boo-Phe-NH(OHg)n~NH-OIy-Boo , п - 8, 4 Z-Phe-NH(CH2)n-NH-GIy-Z, n;S, 4, 6, 8

Синтез бал проведен методом активированных зфиров конденсацией соответствующего диаминоалкеза с п-нитрофениловым эфиром N,N'- защищенного глицина в диметшформамиде.

Трет-бутияоксикарбонильные глициновые производные этилен-диамина и тетраметилендиаминв после промывания кислыми и щелочными реагентами и двукратной перекристаллизации из этилацетата были получены с выходом 58,7 и 83,335®. соответственно.

Растворимость в органических растворителях получаемых кар-бобензоксипроизводных была гораздо нш», чем у Боо-производных. Кврбобензоксигфоизводные диаминоалкшов с п = г и 4 ужа выпадали в осадок из диметалформамида в ходе реакции. После прошвания выпавшего осадка 1 н. раствором HCl для.удаления кепрорза-гироваввдх этилен- и тетраметилендиаминов и двукратного кипячения с этилацетатом для удаления п-нитрофеиола и карбобзнзокси-глицина они были получены о выходом 59.8 и 77,1 Sä соответствен-: но. Карбобензоксипроизводное с л = 8 первоначально было выделено осаждением при подкислении реакционной смеси 1 н. раствором H0I и после шрекристаллиза^ш из дкметллформамвда было получено с выходом 89.04%. Неожиданной-оказалась растворимость в .эти-лвцетате карбобензоксипроизводного с п = 6. Полученное карбобензоксипроизводное было очищено промыванием его этилацетатного раствора 0,5 н. раствором NaHCQ3 и 255-ной серной кислотой. После двукратно'* перекристаллизации из этилацетата его, выход составил 90,9«.

Мокно отметить, что температура плавления получаемых кар-бобензоксипроизводных уменьшалась с увеличением длины углеводородной цени ди&лноалкана. У производных с п=2, 4, б и 8 она №ла раьна 210, 184, 15."-161 и 172-17-4'°С, соответственно. В пг-с-тикчгллсжность »тому, температуры йл0*пения получаемых Вое -

производных с увеличением длины углеводородной цепи диаминоал-кана увеличивалась. У производного с п=2 она равнялась 76-78°С, а у производного с П=4 98-1оо°С.

Аналогично получё!шю димерных аналогов р-казоморфина-з ди-шрные аналоги р-казоморфина-5 с целью разработки оптимальных путей синтеза также были синтезированы как ступенчатым наращиванием пептидной цепи методом активированных зфиров, так и блочной конденсацией карбодинмидным методом. Для примера' на схеме 6 приведен синтез дккеркого аналога- р-казоморфина-5 с этилендиамином путем ступенчатого наращивания пептидной цепи.

Карбобензоксигруппу на промежуточных стадиях синтеза перед реакцией конденсации удаляли каталитическим гидрированием над {озИшм Рй/с в диметалформамиде и полученные производные со свободным:! аминогруппами вводили в реакцию конденсации с соот-ветствущим активированным (п-нитрофениловым) эфдром и-защи-щешшх аминокислот сразу после отфильтрования катализатора по окончании гидрирования. Активированные эфиры на каждой стадии синтеза были испольооввт без избытка. Полученные промежуточные и конечные защищенные демарше пептида были очищены промыванием их этилацетатннх ратворов 0,5 к. раствором ИаНСО-, 2^-ной серной кислотой с последующим переосаздением из эфира гексэном и затем из этилацетата эфиром. Выхода синтезированиях димеров соединений (п = 2) да-, три-, тетра- и пентапептвдов составляли 63, 67,8, 57,6 и 65,7 % соответственно.

На схеме 7 приведен синтез димерного производного р-казоморфина-5 с этилендиамином путем блоч.юй конденсации карбодинмидным методом. Разбивка аминокислотной последовательности р-казоморфиаа-5 на указанные блоки была продиктована требованием снижения степени рацемизации.

При синтезе димерного аналога р-казоморфинз-5 с этилендиамином для синтеза было использовано его Бос-глицштовсе производное. После удаления Вос-гругаш обработкой трифтор.укоусной кислотой полученное соединение (21) вводили в реакцию ; лденса-ции с дипептидом 00), которую осуществляли карбодатадгым методом в присутствии яентахлорфенола. После отфильтроЕьшпнля вы паваей дицишюгбксилкюче^.ины, проведения обычной сбрзботгсг реакционной смеси.парекристаллиаашгл из эфирп далуч?к потктд <22) о достаточна!" столс-нь» чистоты с вуходом 62, Эй. Посла уд&иивя

Бое-

Вое

Н-

Рго РЬе- Рго С1у ОТСС^^КН 01у Рго РЬе Рго

-^ОМр к-

ВаХ'

£21

ЭМр Е-

г—окр я-

25-

;р н—|—и рио

-н ОВД

-2" -г

-в о»

-а окр

Туг

-Н СЗН]

-Боо ¿21 ^Всо Вг1

Схема 6. Синтез верного ггялога (3-кагомор$нна-5 с этилендвачшом ступенчатым наращавгшаем поюшшэг цепи.

о.

г

Туг Ргс РЬе Рго 01у НЩСН^НН б1у Рго РЬе Рго

(0)

\

Бз1

\Ы1

Н-Л-

7.~

-ОН Н-

(10)

Воо-

Воо--ОН Н-

ОПр И-

ОИр

лт.

(22)

(24)

-Вое

-Вое

-н но-

(10)

~н но-

Схемз 7. Синтез димерного аналога р-казомор£ин-5 с этндендиамином блочной конденсацией

(9)

•Воо

V

В21

¿21 ^

карбобензоксигрупш с полученного димерного трипептида обработкой НБг в ледяной уксусной кислоте свободный дамерный трипептщ (£., ) был выделен из реакционной смеси сразу осаздением эфиром ] вводился в реакцию конденсации с (9) в диметилформа\оде карбо-диимвдным методом. После проведения обычной обработки и кристаллизации эфиром дамерный аналог р-казсморфина-5 с этилендиа-мином (24) был получен с выходом 53,52%.

Поскольку и в этом случае при блочной конденсации обида выход конечного продукта оказался выше, чем при использования ступенчатого наращивания пептидной цепи, то дююрные аналоп р-казоморфина-5 с п=4, 6 и а были получены путем блочной кон денсации по аналогичным схемам.

Для синтеза димэра с п=4 Всс-глициновое производное тетра-метилендиамина обрабатывали трифторуксусной кислотой для удаления Вос-групш и затем полученное соединение со свободными аминогруппами вводили в реакцию конденсации с дипептздом г-Р)1е-Рго-он в присутствии дициклогек'силкарбодиимида в диметилформа-миде. Поояе обычной обработки реакционной смеси и кристаллизации из этилацетата промежуточный дамерный трипептид был получе] с выходом 67,7%. Карбобензоксигрупш с полученного димэра бши удалена обработкой ;.Вг в ледяной уксусной кислоте. Затем конденсацией подученного дамера со свободными аминогруппами и да-пептида Воо-Туг(Вг1)-Рго-он карбодиимкдннм методом в присутствии 1 -гидроксибензотриазола был получен конечный защищашаи 'дамерный аналог р-казоморфина-5 с тетраметшюндивмшкхл. Поел« обработки реакционной смеси обычным методом и последующего пе-реосавдения из этилацетата эфиром его выход составил 54$.

В случае синтеза димерного аналога р-казоморфика- з с гек-саметилендитошом было использовано карбобензоксигдициново» производное. Перед реакцией конденсации с дшгептидом З-РЬе-Рго он карбобензоксигруппу с этого производного удаляли каталитическим гидрированием над 10?5-гам р&'с. Реакцию конденсаций полученного ПРОИЗВОДНОГО СО СВОбОДНКМИ ШПЮГруГШаМИ С ДШ1М1ТИД01 &-Р1ге-Рго-ОН осуществляли девдасяокарбодашшом в пр-дсутстш 1 -гидроксибен зотриазода в диче та^лрмалиьс'М растворе. Вследствие схожей рв! гаоримооти поа/ч*ш!*>го дтазрнсто трчтатк»* и д:-.-пептида 2-Р!:е-и органичен:»'}. рй1/п.'0зк?»'вях о'ичн-:.- о-Зрэ боткой роакцио-иоЛ сч, ^ '.

шей декер защищенного трипептида не удалось подучить с доста-•очной степенью чистота. Поэтому для его очистки была применена юлоночнея хроматография на силикагеле 1г-100/1б0. При елюирова-пш системой бензол-ацетон-уксусная кислота (100:50:2) удаляясь принеси. Основной продукт-элюировали метанолом. После упа-швания метанола и внсушквачия под вакуумом выход димера защищенного трипептида составил 71,42$. Карбобензоксигруппу с полу-юнного димера защищенного трипептида удаляли обработкой НВг в ¡едяной уксусной кислоте. После, выделения из реакционной смеси «фиром димер со свободными аминогруппами вводился в реакцию индексации с дипептидом (9)'-карбодиимидным методом в присутст-яш 1-гадроксибензотриазола в даметилформамидном растворе. Как [ при синтезе днмерного трипептида очистка димера защищенного ¡ентапептида обычной обработкой не удалась. Поэтому для его »чистки была использована колоночная хроматография на силикаге-¡е, которую проводили аналогично очистке димера защищенного ■рипептида. После упаривания элюента и переосаядения из метано-1а эфиром выход конечного продукта составил 67,5$.

Дилер Воо-Туг(Вз1) -Рго-РЬе-Рго-01у-НН- (0Н2 )д-ШМ31у-Рго-'Це-Рго-Тут(Вг1)-Воо был'получен аналогично димеру с п=6. После »чистки таии! ко катетами, как и димеры с п=6 защищенных три-[ пентапептида дамери с п=8 три- и пентапептидов были получены ! выходом 57.3 и 81,63$, соответственно.

.Полное деблокирование всех 'димеров р-казоморфина-3 и |-казсморфина-5 с доаминоалканамн осуществляли обработкой НВг в ¡эдяной уксусной кислоте в присутствии анизола с целью предот-¡рваения" побочных реакций, которые могли бы произойти на фе-юлышх кольцах тирозина и фенилалашшв.

Первоначальную очистку свободных докеров осуществляли юаздением ефлром из реакционной смеси после деблокирования, »кончательная очистка была проведена с помощью обращенно- фазо-юй высокоэффективной жидкостной хроматографией.

3.2. Очистка свободных дилеров с помощью ВЭХХ

Одним из наиболее широко применяемых методов разделения пептидных смесей и очистки пептидов в последниб годы является !бращенно-4|ЗЗоьая Еысокоэффектив! :Я кидкостнал хроматография. В

качестве подвижной фазы для создания буферных смесей используют дигидрофосфат калия, ацетат аммония, трифторуксусную кислоту и органические модификаторы - метанол, этвнол, ацетояитрил, изо-пропанол.

Поскольку деблокирование полученных димеров (3-казоморфи-на-з(1) и р-казоморфйна-5(г) осуществляли обработкой НВг в ледяной уксусной кислоте, то в этих условиях проходили побочные реакции из-за наличия бензольного кольца у остатков тирозина и фенилвланина. При »том образовались примеси, которые были очень близки по хроматографической подвикности к основному веществу. Вследствие их одинаковой растворимости в органических растворителях удалить их полностью путем перекристаллизации или перео-савдения не удалось. Поэтому окончательная очистка синтезированных димеров была проведена с помощь» обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Так как в состав димеров входят углеводородная и пептидная части, для очистки которых по отдельности необходимы различные системы буферных ратворов и органических модификаторов, поэтому очистка каждого синтезированного соединения представляло сложную задачу и требовала индивидуального похода.

После многочисленных экспериментов по подбору элюента в качестве буферного раствора была выбрана 0,1Я-ная трнфторуксус-ная кислота и в качестве органического модификатора - метанол.

В таблице 1 приведены время выхода и условия очистки свободных димеров р-казоморфина- ^ и р-казоморфшт-5. Как можно видеть из таблицы I наиболее легко очищались -дилеры р-квзоморЗмна-З. В большистве случаев было достаточно проведения однократной очистки в каком-то одном выбранном рекиме. Сложнее всего было очистить димер р-казоморфша-э с п=8. Для его очистки было необходимо изменять скорость подачи органического модификатора. При дробном изменении градиена метанола от 90 до 70% за 12 минут, 1 минуту - при 70$ и от 70 до юо% за 6 кинут время выхода этого димера составляло 16,12 минут и он выходил при 100% органического модификатора.

Для очистки димеров р-казоморфина-5 было необходимо использовать несколько режимов подачи органического модификатора.Только димер с п=2 был очищен с первого раза. Время выхода составило 13.12 минут при изменении концентрации метанола равной 5055.

Таблица 1. Условия очистки свободных динаров р-казоморфана-З и Э-каэоморфЗНа-5 при ВЗЖХ»

СОЕДИНЕНИЕ Время выхода, (мин) Изменение концентрации метанола, >3 Время изменения концентрации метанола, (мин) Концентрация метанола при которой выходит пептид, %

1 2 3 4 5

5,93

Н-Фут^-Рго-РЬе-КН- (СН2) 4-Ш-РКе-Рго-(Руг-Н 8,43 Н-Гуг-Рго-РЬ.е—КН—(СЙ£ )^-Ш-РЬе-Рг6-Ту1^Н 4,34 к-а'ут-рго-рьвча1-(сн2)8-ш-рьв-?ро-!гу1^н ю,62

Н-Туг^Рго-РЬв-Рго-СХу-Ш- (СНр )Р-Ш-<31у-Рго-Рйе-Рго-гуг-Н й с

НЧГуз^Рго-РЬв-Ртх>-«1у-Ш-(СЯо) д-Ш-<51у-Рго-РКа-Рго-фуг-й *

18,12

13,12 5 10

от 50 до

90

ОТ 50 до 90

от 50 до 87

от 100 до

90

ОТ 70 до 95

от 90 до 70

при 70 от 70 до 100

ОТ 50 ДО 90

от юо до 70

от 50 до

90

12

9

17 6 19

12

1 6

12 19 12

85 82 72

90 87

100 90

79

ю

Продолжение таблицы 1.

1 2

4,06

4.37

Ii-^yv-Prc-Phe-Pro-01y-!ffi4CK> Ь-ЙН-Gly- 5,31 Pro-I'he-Pro-Tyr-H ¿ D

2

4,69 5

4,69

ь-1\ут^р vo-Phe-Pro-Gly-NH- ( CH„ - -î®-Cly- 5,6

pr.:-í-ne-pro-tyr-h ^ 11

10,75

3 . 4 5

от 50 до 6

вО

от 80 до 1 69

90

от 100 ДО 6 73

70

ОТ 50 ДО ь

90

от 90 до 1 98

100

ОТ 100 до 6 73

70

от 100 19 78

70

от 100 до 12 70

50

ОТ 100 до 19 88

70

ОТ 95 до 12 73

70

поп 70 Э

от 70 до 1

100

Для очистки димера р-казоморфяна-5(п=8) такае било необходимо применять различную скорость подачи органического модификатора. Как и в случае очистки димера (З-казоморфша-з с п=8 было использовано снижение концентрации органического модификатора от 95 до 70 % в течение 12 кинут, при 70$ - з минуты, от 70 до 100 - в точение одной минуты и затем при 100Я до полной очистки колонки. Дкмер выходил при 732 органического модификатора, время выхода составляло to,75 минут.

Посла очистки степень чистоты синтезированных димеров составляла 99%.

3.3. Анальгетпческая активность синтезированных динаров

Одной из важнейших задач'; решаемых при синтезе опиоидных пептидов является создание эффективного пептидного препарата.

Таблица 2. Анальгетпческая активность димерных аналогов р-казоморф..на-з и р-казоморфина-5

Ä СОЕДИНЕНИЕ . %> нМолъ/мышь

1. Н-Гуг-Рго-Phe-tJH- (Cllg )?-NH-Phe-Pro-Tyi--H : I 4,10

2. H-Tyr-Pro-Phe-tm- (СН2 ^-NH-Phe-Pro-Tyi^H 11 3,50

3. H-Tyr-Pro-Phe-NH- (CI^) g-KH-Phe-Pro-Ty^-H H 3,1.0

4. H-^yr-Pro-Phe-MH- (CHg)g-NH-Phe-Pro-Tyr-H l! 1 до

5. H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-HH-iCIL, )?-Ш -Gly-Pro-Phe-Pro-Tyr-H з.оо .

6. H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-HH-(CH-,) .-HH-Gly-Pro-Phe-Pro-Tyr-R d 4 2,80

7. H-Tyr-Pro-Phe-Pro-G ly-HH- ( CHp )fi-NH-Gly~ Pro-Phe~Pro-Tyr~H c 1,56

8. n-Tyi^Pro-Phe-Pro-Gly-NH-COHp )„-MH-Gly-Pro-Phe-Pro-Tyr-H 0,15

9. Р-казоморфш-5 24,64

10. морфин 3,2

обладающего аналы'етической активностью, которая дает возможность заменить широко используемые наркотические анальгетики группы морфина.

О втой целью была определена анальгетическая активность синтезированных соединений.

Для етого был иопользовн тест НаИе рзлоЬ" (прижатие хвоста). Анальгетическая активность определялась на мышах введением доз пептида интрацистбрально (в келудочок головного мозга) с помощью 1-образной иглы. Реакцию животных определяли наложением артериального зажима на основание хвоста через 5, 15., 30 и далее через каждые 30 минут до исчесновения действия препарата. -Эффективную дозу пептидных препаратов определяли методом Личфилда-Уилкоксона. Полученные результаты приведены в таблице г.

Полученные результаты показывают, что анальгетическая активность димэров р-казоморфина-з киае или приблизительно равна анальгетичоской активности морфина и вшзе таковой природного р-казоморфина-5. Только у димэра с п=а актишость приблизительно в. 1,9 раза выше активности морфина. У всех днмерных производных (З-квзоморфяиа-5 анальгетическая активность выше актаа-кости морфина к самого (Э-казоморфина-5. У димэров с п=6 и 8 активность выше активности морфина в 2,05 И21.3 раза, соответственно.

Эти результаты еще раз потверздают тот факт, что димери-аация опиоидных пептидов приводит к увеличению енальгетической активности дамеров По сравнению с исходными мономерными соединениями.

Выводы

1. Разработаны способы синтеза дамерных аналогов (З-казо-дарфина-з к р-казоморфша-5 на основе -аминокислотных производных алкандиаминов, вклтающих углеводородные радикалы разной длины.

2. Найден оптимальный способ очистки сшйезировшшнх димерных методом ?ысо-коаффектиьвой чвожоста^й £ромот.Ьграфии.' ."..■•'- . ' ".

">. Шкяз^'Ь что даЧ^ге^йч^ока^ /а'й'адностг-, СЕН"%зирова!ягах

новых дилеров увеличивается с удлинением углеводородной цеш ал-кандиамина. '

4. Определено, что анальгетическая активность димерного аналога р-казоморфина-5 с п=а в значительной степени превосходит аналогичный показатель р-казоморфина-5 и морфина.

Основные результаты работа иэлоаены в следувдих публикациях:

1. Савдов О.С., Халиков Ш.Х. Синтез и идентификация нового фрагмента димерного аналога р-казоморфгаа-5. //Тезисы апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава ТГУ.-Душанбе, 1994.-С. 46.

2. Саидов O.G., Халиков Ш.Х. Синтез нового димерного аналога р-казоморфина-5. //Теоретические и прикладные проблемы химии:'Тез. докл.-Душан'э, 1995.-0. 56.

3. Саидов С.С., Халиков Ш.Х. Димеризация новых трипептид-ных фрагментов энкефалина р-казоморфина-5. //Материалы науч. конф. поев 50-летию Института' химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан: Тез. докл.-Душанбе, 1996.-С.8Э.

4. Саидов С.О.,, Халиков Ш.Х. Синтез новых аналогов р-казоморфина-5. //Материалы научн. конф. поев."50-летию Института химии им. В.Й. . Никитина АН Республики Такикнстан: Тез. докл.-Душанбе, 1996.-0. 84.

5. Савдов. С.С., Халиков Ш.Х. Синтез аминокислотных производных алкандиаминов //Вестник педагогического унивэрсите-та.-Душанбе, 197.-кё!-^; 49-51.

6. Саидов С.О., Халиков Ш.Х. Синтез димерных аналогов р-кезоморфина-5. //Вестник педагогического университета.-Душанбе, 1997.-N8.-C. 52-56. " ' ' , •

j' :.