Синтез и антибактериальная активность фосфониевых солей на основе производных пиридоксина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Пугачев, Михаил Владимирович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Казань
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2014
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
005554740
На правах рукописи
ПУГАЧЕВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ
СИНТЕЗ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ФОСФОНИЕВЫХ СОЛЕЙ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИДОКСИНА
02.00.03 - Органическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
6 НОЯ 2014
Казань-2014
005554740
Работа выполнена в Химическом институте им. A.M. Бутлерова и Научно-образовательном центре фармацевтики Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
Штырлин Юрий Григорьевич
кандидат химических наук, доцент
Бурилов Александр Романович
доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией
элементоорганического синтеза ФГБУН «Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН», г. Казань
Бардасов Иван Николаевич
кандидат химических наук, доцент кафедры общей, неорганической и аналитической химии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», г. Чебоксары
Ведущая организация:
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», г. Москва
Защита состоится «18» декабря 2014 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 212.081.30 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А.М. Бутлерова КФУ, Бутлеровская аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета, автореферат и диссертация размещены на сайте http://www.kpfu.ru
Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Научная часть.
Автореферат разослан « 2А » сцЭГ^Н-С^ Х 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук
Верещагина Яна Александровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Направленный синтез и установление взаимосвязи структуры органических соединений с их биологической активностью являются одними из приоритетных направлений развития современной медицинской и органической химии. Несмотря на достигнутый в этой области значительный прогресс, еще множество задач остаются нерешенными. В частности, в последние годы наблюдается заметный рост числа и распространенности инфекционных заболеваний, обусловленных появлением новых резистентных штаммов микроорганизмов. При разработке антибактериальных средств для лечения внутри- и внебольничных инфекций эффективным может стать подход, основанный на химической модификации биологически активных веществ природного происхождения. Одним из ярких представителей таких соединений является витамин В6, который вовлечен в метаболизм с более чем 100 ферментами и участвует в процессах биосинтеза аминокислот.
В течение последних 15 лет в отделе прикладной химии Химического института им. A.M. Бутлерова, а с 2011 года в отделе медицинской химии Научно-образовательного центра фармацевтики ведутся систематические исследования по изучению химических и биологических свойств производных пиридоксина. Разработан удобный способ синтеза 6-замещенных производных пиридоксина, установлены факторы, определяющие их реакционную способность, проведены исследования in vitro и in vivo антибактериальной, противовоспалительной, антихолинэстеразной и др. видов активности.
В настоящей работе представлялось целесообразным сконцентрировать свое внимание на синтезе, первичном скрининге и оптимизации структуры производных пиридоксина, содержащих фосфониевые фрагменты. Привлекательность такой модификации обусловлена тем, что, как известно из литературных данных, некоторые фосфониевые соли могут выступать в качестве антибактериальных фармакофорных групп.
Целью настоящей работы является синтез широкого ряда фосфониевых солей на основе производных пиридоксина и исследование их антибактериальной активности.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие основные задачи:
1. Разработка подходов к синтезу ряда шестичленных ацеталей 6-метил-2,3,4-трис(гидроксиметил)пиридин-5-ола;
2. Разработка подходов к синтезу широкого ряда фосфониевых солей на основе пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина;
3. Исследование антибактериальной активности полученных соединений на штаммах условно-патогенных микроорганизмов. Выявление закономерностей «структура - антибактериальная активность»;
4. Оптимизация химической структуры выявленных соединений-лидеров и исследование их антибактериальной активности;
5. Разработка подходов к синтезу алкенилпроизводных по реакции Виттига фосфониевых солей пиридоксина с бензальдегидом.
Научная новизна полученных результатов состоит в следующем:
- разработаны подходы к синтезу шестичленных циклических ацеталей на основе 6-метил-2,3,4-трис(гидроксиметил)пиридин-5-ола;
- подобраны условия проведения реакций галогенирования (хлорирования, бромирования) новых гидроксиметилпроизводных пиридоксина;
- впервые синтезирован ряд четвертичных фосфониевых солей на основе производных пиридоксина и исследована их антибактериальная активность;
- проведена оптимизация химической структуры выявленных соединений-лидеров;
- впервые синтезированы алкенилпроизводные пиридоксина по реакции Виттига четвертичных фосфониевых солей с бензальдегидом.
Практическая значимость работы. Разработан синтетический подход, позволяющий селективно модифицировать гидроксиметильные группы во втором, пятом и шестом положениях пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина, что открывает широкие перспективы для введения различных функциональных групп.
Некоторые четвертичные фосфониевые соли на основе производных пиридоксина in vitro показали высокую антибактериальную активность по отношению к грамположительным бактериям Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, сопоставимую с препаратом сравнения - ванкомицином.
Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых высокоэффективных и безопасных антибактериальных лекарственных средств.
На защиту выносятся:
1. Методики синтеза шестичленных ацеталей 6-метил-2,3,4-трис(гидроксиметил)пиридин-5-ола, их галогенпроизводных и четвертичных фосфониевых солей.
2. Данные по региоспецифичности реакции бромирования 5,6-бис(гидроксиметил)-2,2,8-триметил-4Н-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридина и кислотного гидролиза 5,6-бис(хлорметил)-2,2,8-триметил-4Н-[ 1,3]диоксино[4,5-с]пиридина.
3. Результаты исследования антибактериальной активности и цитотоксичности четвертичных фосфониевых солей на основе производных пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина. Установленные закономерности взаимосвязи структуры фосфониевых солей с их биологической активностью.
4. Методики синтеза алкенилпроизводных по реакции Виттига моно- и бисфосфониевых солей пиридоксина с бензальдегидом.
Степень достоверности и апробация работы.
Достоверность полученных результатов обеспечена использованием современных физико-химических методов масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 'Н, l3C, 3|Р, 19F, элементного анализа и РСА.
Основные результаты диссертационной работы докладывались на VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, 2012), XI научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2012), Всероссийской конференции "Современные проблемы химической науки и образования" (Чебоксары, 2012), XIX, XX, XXI Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011, 2012, 2014), VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013» (Санкт-Петербург, 2013), I Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013), I Всероссийской конференции по медицинской химии
(MedChemRussia-2013) (Москва, 2013), VIII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2014» (Санкт-Петербург, 2014), итоговой научной конференции Казанского федерального университета (Казань, 2014).
Личный вклад автора. Автор принимал участие в постановке цели и задач исследования, анализе литературных данных, выполнении экспериментальной работы, обсуждении результатов и формулировке выводов, подготовке статей и тезисов докладов. Все соединения, представленные в диссертационной работе, синтезированы соискателем лично.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 10 тезисов докладов и получен 1 патент РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 86 схем, 7 таблиц, 15 рисунков и состоит из введения, трех основных глав, выводов и списка цитируемой литературы, насчитывающего 196 источников.
В первой главе приведен обзор литературы по синтезу и свойствам производных пиридоксина и четвертичных фосфониевых солей. Во второй главе приведены результаты собственных исследований по синтезу и антибактериальной активности производных пиридоксина. В третьей главе представлена экспериментальная часть.
Методы исследования. Соединения получены с использованием различных методов органического синтеза. Состав и структура соединений доказаны с использованием физико-химических методов масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР 'Н, 13С, 3|Р, F, элементного анализа и РСА. Антибактериальную активность и цитотоксичность определяли с использованием методов работы с клеточными культурами и микроорганизмами.
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» и является частью исследования по основному научному направлению Химического института им. A.M. Бутлерова КФУ «Синтез, строение, реакционная способность и практически полезные свойства органических, элементоорганических и координационных соединений».
Диссертационная работа выполнялась в рамках государственного задания Минобрнауки РФ на выполнение работ «Фундаментальные и прикладные основы создания и применения инновационных лекарственных средств» (2012-2013 гг.), проектной части государственного задания в сфере научной деятельности (по заданию № 12.67.2014/К) «Синтез и оптимизация структуры соединений-лидеров -кандидатов в противоопухолевые, ноотропные, антихолинэстеразные, противомикробные и сердечно-сосудистые лекарственные средства» (2014 — 2016 гг.), стипендии Президента Российской Федерации для молодых ученых и аспирантов, осуществляющих перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (2013-2015 г.), при финансовой поддержке РФФИ (Грант № 14-03-31064 мол_а).
Автор выражает благодарность и признательность научному руководителю к.х.н. Штырлину Ю.Г. и к.х.н. Штырлину Н.В. за постоянную поддержку, всестороннюю помощь и понимание, а также за активное участие при обсуждении работы, к.б.н. Никитиной Е.В. за определение антибактериальной активности, к.б.н. Иксановой А.Г. за определение безопасности соединений, к.ф-м.н. Гнездилову О.И. и
инженеру Хаярову Х.Р. за съемку ЯМР-спектров, д.х.н. Бердникову Е.А. за помощь в интерпретации ЯМР-спектров, к.х.н. Лодочниковой O.A. за проведение рентгеноструктурного анализа, к.х.н. Мусину Р.З. за съемку масс-спектров, а также к.х.н. Сысоевой Л.П., лаб. Кашаповой И.Г., к.х.н. Стрельнику А.Д., аспиранту Гарипову М.Р., студенту Сапожникову C.B. и всем сотрудникам отдела медицинской химии Научно-образовательного центра фармацевтики за помощь в проведении работы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез и антибактериальная активность фосфониевых солей на основе пиридоксина и б-гидроксиметилпиридоксина
1.1. Синтез фосфониевых солей на основе пиридоксина и б-гидроксиметилпиридоксина
Фосфониевые соли получали реакцией нуклеофильного замещения хлорпроизводных (бромпроизводных) пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина с фосфинами.
Для синтеза широкого ряда хлорпроизводных пиридоксина использовали разнообразные синтетические подходы: введение ацетальной (кетальной) защиты гидроксильных групп для селективной функционализации пиридоксина и его производных, введение дополнительной гидроксиметильной группы в шестое положение пиридинового кольца семичленных ацеталей (кеталей) пиридоксина (нумерация для указания положения заместителей проведена в соответствии с заместительной номенклатурой пиридоксина) реакцией гидроксиметилирования в щелочной среде, проведение перегруппировки N-окисей пиридоксиновых производных для модификации ароматической метальной группы и, наконец, галогенирование гидроксиметильных групп шести- и семичленных ацеталей (кеталей) пиридоксина.
Фосфониевая соль 3 была синтезирована из пиридоксина в две стадии (схема
1).
Схема 1
На первой стадии было получено дихлорпроизводное пиридоксина 2 в виде гидрохлорида. На второй стадии для синтеза конечного продукта - четвертичной фосфониевой соли, была проведена реакция соединения 2 с четырехкратным мольным избытком трифенилфосфина. Реакцию проводили в ДМФА при температуре 90 °С в течение 7 часов. Однако вместо ожидаемого биспроизводного была получена монофосфониевая соль по пятому положению пиридинового кольца. По-видимому, на этапе разработки реакционной смеси при экстракции фосфониевой соли в воду происходит селективный гидролиз фосфониевого фрагмента по четвертому положению пиридинового кольца с образованием метальной группы. При использовании 5%-водного ацетонитрила в реакции дихлорпроизводного 2 с трифенилфосфином наблюдается селективный гидролиз хлорметильной группы в четвертом положении пиридинового кольца с образованием монофосфониевой соли 4. Для однозначного доказательства структуры соединения 3 был проведен встречный синтез в четыре стадии. Монохлорид 7 был получен восстановлением гидроксиметильной группы в четвертом положении пиридинового кольца до метальной с использованием цинка в уксусной кислоте с последующим снятием ацетатных групп в кислой среде и хлорированием гидроксиметильной группы соединения 6 хлористым тионилом. На последней стадии из хлорпроизводного 7 была получена фосфониевая соль 3.
Еще один способ получения монофосфониевой соли 4 представлен на схеме 2. Фосфониевые соли пиридоксина 10а и 106, содержащие метиленфосфониевую группу в пятом положении пиридинового кольца, получены в три стадии. На первой стадии осуществлялась защита гидроксильных групп в третьем и четвертом положениях пиридоксина с образованием шестичленного ацеталя 8а и кеталя 86. Далее производилось хлорирование гидроксиметильной группы с использованием хлористого тионила. На последней стадии были проведены реакции хлорпроизводных 9а и 96 с избытком трифенилфосфина с образованием соответствующих солей 10а и 106. Последующее снятие кетальной (ацетальной) защиты в кислой среде приводит к монофосфониевой соли 4.
|3и у
н 4
Схема 2
Монофосфониевая соль 16, содержащая метиленфосфониевый фрагмент в шестом положении пиридоксина, получена шестистадийным синтезом (схема 3). Соединение 13 было синтезировано путем первоначального введения кетальной защиты гидроксиметильных групп пиридоксина с последующим гидроксиметилированием соединения 11 и селективным ацилированием соединения 12. Далее последовательным взаимодействием с мезилхлоридом и
трифенилфосфином была получена фосфониевая соль 15. Попытки селективного снятия ацетатной и кетальной защитных групп при различных значениях рН водного раствора не увенчались успехом. Во всех случаях наблюдается одновременное снятие защитных групп с образованием соединения 16.
н3с II,с
^СНз
о
но.
НС1
¿V
о
сн.
но. ^ но^кУ „ ™ но ' Асо^ку
^^ Н2СО, ЫаОН
н,о
ДСНз
( о
ОН СН,С1,
•
Н,С N —
но
А'
СН3
Н20,НС1 АсО
13
МзС1, СНС13, Е13Ы
н!>сн=
РРЬ, АсО
НзС к- н3с н3с
15 и 14
Н 16
Схема 3
Аналогичная ситуация наблюдалась и при использовании метоксиметильной защиты ароматической гидроксильной группы (схема 4).
РсСНз
Н3С
но Ж У сн3осн2о
^ СН3ОСН,С1, Е13Ы
Н3С N
рГ
снст.
18
ch-.cn
НзС>СНз
он он 0-\
Н20,НС1 сн3осн2о^1у
н 16 19 с1-
Схема 4
Селективное снятие кетальной защиты с образованием монофосфониевой соли 22 удалось провести при введении мезилатной группы в соединение 12 (схема 5). Нз>сн3 Нз>сн3 "^СНз
Р\ Р\. Р\
ноуу «м.М!°уу рр-з, №0,,
1 м^он снс'з ^-Н3СЫ № 11
Н3С N
МзО
н2о, на ||
Р+РЬз
20
С1-
Н 22
Схема 5
Региоизомерная соединению 16 фосфониевая соль 25, содержащая метиленфосфониевую группу в пятом положении пиридоксина, была получена по схеме 6. Взаимодействием соединения 12 с хлористым тионилом получено дихлорпроизводное 23, которое образуется при изомеризации семичленного цикла в
термодинамически более стабильный шестичленный кеталь. Последующая обработка водным раствором кислоты приводит к снятию кетальной защиты и селективному гидролизу хлорметильной группы в шестом положении пиридоксина. Реакция протекает гладко и с количественным выходом. Структура соединения 24 по данным РСА приведена на рисунке 1. Взаимодействием монохлорида 24 с трифенилфосфином получена фосфониевая соль 25 (схема 6).
о
н,с
н3с н,с
^о. о.
ОН СН2С12
С1 НгО, НС1 С1
НО.
но.
С1
он
но но.
сн3ая
С1(1)
С1" 24
0(2)
Р+РЬз
он
25
Схема 6
°<4> Рисунок 1 - Структура соединения 24
по данным РСА
Для объяснения региоспецифичности реакции кислотного гидролиза соединения 23 были проведены квантово-химические расчеты относительной энергии образования двух возможных карбкатионов (таблица 1). Значительно более высокая стабильность карбкатиона I по сравнению с карбкатионом II (в рамках механизма мономолекулярного нуклеофильного замещения (8м1)) согласуется с экспериментальными данными.
Таблица 1 - Относительная энергия образования карбкатионов I и II по результатам квантово-химических расчетов методом Хартри-Фока с базисным
Структура карбкатиона но. ТГа Нзс'у сн2+ Н I но. "ОуСН/ Н II
АЕ", ккал/моль -5.8 0
Синтез монофосфониевой соли 32, содержащей метиленфосфониевую группу во втором положении пиридинового кольца, был осуществлен первоначальным превращением в кислой среде семичленного кеталя 12 в дикеталь 26 с последующим Ы-оксидированием ,и-хлорпербензойной кислотой (МСРВА). Далее проведена перегруппировка полученного Ы-оксида 27 в уксусном ангидриде, которая селективно проходит по метильной группе во втором положении пиридинового кольца. На следующей стадии синтеза осуществлено снятие ацетатной защиты метилатом натрия с образованием 2-гидроксиметилпроизводного 29. Взаимодействием с мезилхлоридом и далее с трифенилфосфином была получена фосфониевая соль 31, содержащая только один кетальный цикл. Следует отметить, что попытки выделения монофосфониевой соли, содержащей наряду с шестичленным
и семичленный кетальный цикл, оказались неудачными вследствие нестабильности последнего. Гидролиз фосфониевой соли 31 в кислой среде приводит к продукту 32 (схема 7).
н,с
СН3(Жа СН3ОН. СНС13
"зС 0 Н3С Н3С _
^ДХон^оДХо^н; ноДХоХс";
32 31 30 29
Схема 7
Монофосфониевые соли 3, 4, 10а,б, 15, 21, 22, 25, 31, 32 представляют собой бесцветные кристаллические вещества с температурой плавления выше 160 °С. Соединения 16 и 19 плавятся при температуре ниже 90 °С. Состав и структура всех полученных соединений доказаны методами ЯМР 'Н, 13С, 3|Р - спектроскопии и масс-спектрометр ии.
На следующем этапе были получены бис- и трисфосфониевые соли, содержащие метиленфосфониевые фрагменты в различных положениях пиридинового цикла.
Ацилированием гидроксиметильной группы, Ы-оксидированием м-хлорпербензойной кислотой, перегруппировкой в среде уксусного ангидрида, снятием ацетатной защиты метилатом натрия, хлорированием диола 36 мезилхлоридом и взаимодействием соединения 37 с трифенилфосфином получена бисфосфониевая соль 38. Снятием кетальной защиты в кислой среде получена соответствующая бисфосфониевая соль 39 (схема 8).
н,с 0 н3с н3с н3с
ОАс
0ч|] АСг°' °Тт ОАс мсрва ■ Ас;0 • 1
О- 34
35
СН3ОКа
сн3он, сна3
о Н'Ч о "зЧ п
но X 1 нзсЛ" н3с-у°>
рь,р "уу4^ , РР-, м^Е,3к о
за- рЬз'р-^Л^ 2С1- сн3сн а___сна3 но^Д^
Н 39 38 37 36
Схема 8
Установлено, что в реакции соединения 23 с трифенилфосфином замена неполярных растворителей (дихлорметан, хлороформ) на диполярные апротонные растворители (ацетонитрил, ацетон) приводит к значительному ускорению реакции и образованию целевого продукта с высоким выходом, что согласуется с механизмом реакции. Снятие кетальной защиты в кислой среде протекает мягко и с количественным выходом получается бисфосфониевая соль 41 (схема 9).
но но.
р-*рь3
н,с ^
н 41 ЗС1-
Схема 9
Трисфосфониевые соли 48 и 49 были получены последовательно в семь и
восемь стадий, соответственно (схема 10). Триол шестичленного кеталя 46 и его
продукт хлорирования 47 синтезированы из соединения 12 по методикам,
аналогичным для вышеописанных моно- и бисфосфониевых солей. Все реакции
протекают гладко и с высокими выходами. н,с
о-Л^1 н3с 0 щс Q
{ ° (СН3)2СО, ИС1, Н5С | "lC~T
— 2,2-диметоксипропан щ Ас2°-E13N г
Н3Д,А-0" С"2С1г ,IíCi-N^OAc СНСз HjC^^OAC
ОАс МСРВА
3 ч О
48 ЗСГ
Н3С
н
PPhj Ó
"■Но
N 47
"J4 О MsCl, EtjN О^^^л,
CHCI3 jl 1 "" едон
---OH AcD
»1С 0
»m
_C2I[;ONa ¿
ОАс OAc
H 49 4СГ
Схема 10
Бис- и трисфосфониевые соли 38, 39, 40, 48, 49 представляют собой бесцветные кристаллические вещества с температурой плавления выше 190°С. Состав и структура всех полученных соединений доказаны методами ЯМР 'Н, 13С, 31Р - спектроскопии и масс-спектрометрии.
На заключительном этапе была предпринята попытка синтеза трисфосфониевой соли 52, содержащей метиленфосфониевые фрагменты в четвертом, пятом и шестом положениях пиридоксина (схема 11). Гидролизом семичленного циклического кеталя в кислой среде и последующим хлорированием полученного соединения 50 мезилхлоридом в присутствии небольшого избытка триэтиламина был получен трихлорид 51. Взаимодействие соединения 51 с избытком трифенилфосфина приводит к образованию неразделимой смеси продуктов. По данным ЯМР 'Н и 3|Р - спектроскопии реакционной смеси наблюдается образование как целевого, так и региоизомерных моно- и бис- аддуктов. Попытки селективного замещения одного или двух атомов хлора при варьировании мольного соотношения соединения 51 и трифенилфосфина также оказались неудачными и разделить хроматографией индивидуальные продукты не представилось возможным.
Схема 11
Таким образом, на примере реакций нуклеофильного замещения с трифенилфосфином был разработан синтетический подход, позволяющий селективно модифицировать гидроксиметильные группы во втором, пятом и шестом положениях пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина 12, что открывает широкие перспективы для синтеза большого ряда соединений с различными функциональными группами.
1.2. Антибактериальная активность фосфониевых солей на основе пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина
Изучение антибактериальной активности соединений проводилось сотрудником научно-образовательного центра фармацевтики к.б.н. Е.В. Никитиной на ряде клинических бактериальных штаммов, полученных из Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканский Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Республики Татарстан», г. Казань.
В таблице 2 представлены значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) фосфониевых солей в сопоставлении с антибиотиком «последней надежды» - ванкомицином.
Все синтезированные соединения имеют узкий спектр действия и проявляют антибактериальную активность, также как и ванкомицин, только на штаммах грамположительных бактерий.
Монофосфониевые соли 10а и 106, содержащие шестичленные циклические кетали (ацетали), не проявляют антибактериальную активность (МИК > 1000 мкг/мл). Монофосфониевые соли 15, 19, 21, содержащие семичленные циклические кетали, бисфосфониевая соль 38 и трисфосфониевая соль 48 оказались более активными (значения МИК варьируются в пределах от 31 до 100 мкг/мл).
Максимальный антибактериальный эффект наблюдается для бисфосфониевой соли 40, содержащей метиленфосфониевые фрагменты в пятом и шестом положениях пиридоксина. Значение МИК на штаммах Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis составляет 5 мкг/мл и близко к МИК ванкомицина.
Таблица 2 - Результаты исследования антибактериальной активности in vitro moho-, бис- и трисфосфониевых солей_
МИК (мкг/мл)
Соединение Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии
Staphylococcus Staphylococcus Klebsiella Proteus spp.
aureus epidermidis pneumoniae
3 500 1000 > 1000 >1000
4 1000 1000 > 1000 > 1000
10а 1000 1000 > 1000 > 1000
106 1000 1000 > 1000 > 1000
15 100 100 > 1000 > 1000
16 1000 1000 > 1000 > 1000
19 100 100 > 1000 > 1000
21 31 50 > 1000 > 1000
22 100 100 > 1000 > 1000
25 1000 1000 > 1000 > 1000
31 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
32 > 1000 > 1000 >1000 > 1000
38 62.5 50 > 1000 > 1000
39 250 250 > 1000 > 1000
40 5 5 >1000 >1000
41 1000 1000 > 1000 > 1000
48 50 50 > 1000 > 1000
49 500 500 > 1000 > 1000
Ванкомицип 2.5 2.5 >1000 >1000
2. Оптимизация химической структуры 5,6-бис(метилентрифенилфосфоний)-2,2,8-триметил-4Н-[1,3]диоксино[4,5-
с]пиридин днхлорида
Путем варьирования заместителей у ацетального атома углерода шестичленного цикла, заместителей у атомов фосфора метиленфосфониевых групп и природы противоионов была проведена оптимизация химической структуры соединения 40 (рисунок 2).
2.1. Варьирование природы заместителей у ацетального атома углерода бисфосфопиевой соли пиридоксина
Синтез бисфосфониевых солей 56а-ж с различным гидрофильно-липофильным балансом представлен на схеме 12 и включает предварительное снятие семичленной кетальной защиты с гидроксиметильных групп в четвертом и пятом положениях пиридоксина, формирование шестичленного ацетального цикла, хлорирование диолов 54а-ж и взаимодействие дихлорпроизводных 55а-ж с трифенилфосфином. В качестве примера на рисунке 3 представлена структура соединения 56в по данным РСА.
ГОНон ОН н^^
ЮС., — „.IX- нзЛ^- снл „ЛЬ
С1(1|
"V
-он он
н3с'
54« Л-С^Н, 545 К=п-С3Н7 54в К=1-С3Н7 54ГК=Я-С4Н9 54д Я=(-С4Н9 54е К=л-С5Пм 54ж К=п-С,Н,3
Н3С
55а К-С2П, 556 Я=л-С3П7 55в 11=/-С3Н7 55г Я=л-С4Н9 55д Я=(-С4Н9 55е К=л-С5Н„ 55ж Я=/1-С71Г1; РРЬ3,
[ СН3СЫ
--- 3
2СГ
Н3С
Рисунок 3 -
56« Я-С^ 566 Я=л-С3Н7 56в Я=/-С3Н7 56г 11-л-С4Н9 55д 11-(-С4Н9 56еК=п-С5Нц 56ж К-л-С7М,,
■ Структура соединения 56в по данным РСА
Схема 12
Отметим, что вследствие сильного осмоления реакционной смеси попытка получения по вышеописанной методике соединения 55з с метальным заместителем у ацетального атома углерода оказалась неудачной уже на стадии взаимодействия тетрола 53 с ацетальдегидом. Соединение 55з было получено по аналогичным методикам синтеза, описанным для соединений 11, 12, 23 на схемах 3 и 6. Взаимодействием целевого продукта 55з с трифенилфосфином получена бисфосфониевая соль 56з (схема 13).
н
н3с
СН3С(0)Н, но
он на
н2со,
№ОН
Н
оА'СНз
Г О
н,о
■нохт
БОС!,
ОН СН2С1;
- 0чпРа
РРЬ3,
сн,сы
°УТр1рь>
2СГ
н3с
Схема 13
2.2. Варьирование природы заместителей у атомов фосфора в пятом и шестом положениях бисфосфониевой соли пиридоксина
В реакции соединения 23 с избытком триалкил- и триарилфосфинов получены с хорошими выходами бисфосфониевые соли 59а-д. Снятие кетальной защиты в кислой среде приводит к образованию бисфосфониевых солей бОа-д (схема 14).
23
59а II = л-Ви 596 Я = /?-То1у1 59в Я = т-То1у1 59гК = 2-ТЫепу1 59д Я = 4-Р-РЬ
I
Н
60аЯ = л-Ви 606 Я = р-То1у1 60в К = т-То1у1 60г Я = 2-ТЫепу1 60д Я = 4-Р-РЬ
Схема 14
Аналогичным способом получены бисфосфониевая соль 59е, а после снятия кетальной защиты - бисфосфониевая соль 60е (схема 15), структуры которых подтверждены методом масс-спектрометрии.
Схема 15
2.3. Варьирование природы противоионов бисфосфониевой соли пиридоксина
Фосфониевая соль 62а была получена в две стадии. Дибромпроизводное 61 синтезировано взаимодействием соединения 42 с Ы-бромсукцинимидом (N88). Было замечено, что при эквимольном соотношении соединения 42 и Ы-бромсукцинимида происходит селективное бромирование гидроксиметильной группы в шестом положении пиридоксина (схема 16). Структура соединения 63 по данным РСА представлена на рисунке 4.
42
МЗБ (1 экв.), РРЬ3 СНС13
Схема 16
чО(Ю)
a-
. .< J \
Br(1)
.0(1)
N(1)
Рисунок 4 - Структура соединения 63 по данным РСА
Важно отметить, что, как и в случае кислотного гидролиза соединения 23 (схема 6, таблица 1), бромирование соединения 42 N-бромсукцинимидом также протекает региоспецифично. Проведенные квантово-химические расчеты показали, что карбкатион III, образующийся по механизму SnI, также значительно более стабилен по сравнению с другим изомером IV (таблица 3).
Таблица 3 — Относительная энергия образования изомерных карбкатионов III и IV по результатам квантово-химических расчетов методом Хартри-Фока с
Структура карбкатиона "iVi он Н3С N'XH/ m НзС 0 НзсДгА-011 IV
Дккал/моль -4.7 0
Взаимодействием с иодистым калием получена нерастворимая в воде фосфониевая соль 626. Аналогичным способом, но уже с выведением из сферы реакции хлорида серебра синтезирована фосфониевая соль 62в (схема 17).
Схема 17
2.4. Антибактериальная активность и цитотоксичность бисфосфониевых солей
Исследование антибактериальной активности проведено в соответствии с разделом 1.2. Изучение цитотоксичности соединений проводилось на эмбриональных клетках почки человека НЕК 293 сотрудником Научно-образовательного центра фармацевтики к.б.н. А.Г. Иксановой. Значения LogP были вычислены с помощью программы Hyper Chem 8.0.8. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Результаты исследований in vitro антибактериальной активности и цитотоксичности бисфосфониевых солей___
№ соединения МИК (мкг/мл) CC50 (мкг /мл) LogP
Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии
Staphylococ cus aureus Staphylococ cus epidermidis Klebsiella pneumoniae Proteus spp.
56а 10 10 >1000 >1000 4.0 -0.33
566 1 1 >1000 >1000 3.0 0.30
56в 10 5 >1000 >1000 2.6 0.17
56г 5 10 1000 >1000 2.0 0.46
56е 5 5 1000 >1000 1.0 0.86
56ж 10 10 1000 >1000 0.5 1.65
56з 12.5 10 >1000 >1000 34.0 -0.90
59а 1.3 1.3 >1000 >1000 200.0 4.02
596 1 1 >1000 >1000 30.0 0.64
59в 1.3 1.3 1000 >1000 13.0 0.64
59г 100 100 >1000 >1000 0.99
59д 50 50 >1000 >1000 -3.88
59е 125 100 >1000 >1000 -1.21
60а 1000 1000 >1000 >1000 2.83
606 >1000 >1000 >1000 >1000 -0.54
60в 12.5 12.5 >1000 >1000 -0.54
60г 1000 >1000 >1000 >1000 -0.19
60д 1000 1000 >1000 >1000 -6.34
60е 500 500 >1000 >1000 -2.39
62а 1.3 2.5 >1000 >1000 27.5 0.33
626 100 100 1000 >1000 0.84
62в 10 10 >1000 >1000 0.32
40 5 5 >1000 >1000 72.0 -0.28
Ванкоми цин 2.5 2.5 >1000 >1000 >1000
Для всех синтезированных соединений, как и в предыдущем случае (см. таблицу 2), характерен узкий спектр действия в отношении грамположительных бактерий.
Зависимость антибактериальной активности соединений от природы заместителей у ацетального атома углерода является нелинейной и достигает экстремума для ацеталя 566, содержащего н-пропильную группу. Замена фенильных заместителей у атома фосфора в соединении 40 на биоизостерную 2-тиенильную группу приводит к понижению активности (соединение 59г). По сравнению с фенильными заместителями у атомов фосфора фосфониевые соли с более липофильными фрагментами (н-бутил, л/-толил и и-толил) показывают более высокую активность (соединения 59а-в). Замена противоионов в бисфосфониевых солях приводит к снижению антибактериальной активности в ряду Вг" > С1" >Г > N0/ (соединения 40,62а-в).
Исследования цитотоксичности синтезированных соединений показали, что они значительно более токсичны по сравнению с ванкомицином.
2.5. Оптимизация структуры бисфосфониевой соли пиридоксина
На заключительном этапе настоящей работы была предпринята попытка оптимизации химической структуры бисфосфониевых солей путем сочетания в молекуле фрагментов, проявивших наибольшую антибактериальную активность.
Фосфониевая соль 65, содержащая н-пропильный заместитель у ацетального атома углерода и и-толильные заместители у атома фосфора, получена с хорошим выходом (схема 18).
л-сзН7 п с3н7 _
Л А XI СН3СЫ Н3С N
556 65
Схема 18
н,с
P+(p-Tolyl)3 P+(p-Tolyl)3 2С1"
Все синтезированные в разделах 2.1-2.3 и 2.5 фосфониевые соли представляют собой бесцветные кристаллические вещества. Состав и структура полученных соединений доказаны методами ЯМР *Н, 13С, 31Р, 19F - спектроскопии, масс-спектрометрии, в некоторых случаях РСА.
2.6. Антибактериальная активность и цитотоксичность бисфосфониевой соли, содержащей н-пропильный заместитель у ацетального атома углерода и и-толильные заместители у атома фосфора.
Исследование антибактериальной активности и цитотоксичности in vitro соединения 65 проведено согласно разделам 1.2 и 2.4. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Результаты исследований in vitro антибактериальной активности и
№ соедине ния МИК (мкг/мл) CC50 (мкг /мл) LogP
Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Klebsiella pneumoniae Proteus spp.
65 2.5 2.5 1000 1000 1.0 0.99
Ванко мицин 2.5 2.5 >1000 >1000 >1000
Соединение 65, содержащее в своей структуре и-толильный заместитель у атомов фосфора и н-пропильный заместитель у ацетального атома углерода, обладает сопоставимой с ванкомицином антибактериальной активностью, но при этом, однако, уступает другим синтезированным в настоящей работе соединениям.
3. Получение алкенов по реакции Виттига
Фосфониевые соли широко используются в качестве субстратов при получении алкенов по реакции Виттига.
Попытки использования в качестве основания тяре/я-бутилата калия или н-бутиллития в ТГФ или диоксане оказались неудачными вследствие быстро протекающей реакции гидролиза метиленфосфониевой группы (схема 19).
НзЧ С, НзСП ^
Н3С N 1,1
106
BuLi ши í-BuOK
ТГФ или диоксан
Схема 19
При использовании в качестве основания триэтиламина реакция Виттига фосфониевой соли 10а с бензальдегидом протекает гладко и с выходом 89% приводит к образованию смеси Е- и 2- изомеров 67 и 68 в соотношении 4:3 (схема 20).
тТ4^
10a
Схема 20
Использование этой же методики для реакции Виттига бензальдегида с бисфосфониевой солью 40 не приводит к целевому продукту. Более продуктивной оказалась методика с использованием в качестве основания гидрида натрия. При кипячении в хлороформе в течение 60 часов образуется смесь алкенилпроизводных пиридоксина с общим выходом 52%. Методом колоночной хроматографии удалось разделить полученную смесь на моно- и бисалкенилпроизводные пиридоксина. Продукт 71 находится в форме /яранс-изомера, в то время как бисалкенильные продукты представляют смесь Z.E- и Е,Е- изомеров в соотношении 4:3 (схема 21).
°rSr
40
Схема 21
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Синтезировано 72 новых соединения на основе производных пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина, структура которых доказана методами ЯМР *Н, |3С, 31Р, ''Б, масс-спектрометрии и РСА.
2. Предложены подходы к синтезу ряда шестичленных ацеталей 6-метил-2,3,4-трис(гидроксиметил)пиридин-5-ола и подобраны условия проведения реакции галогенирования (хлорирования, бромирования) для гидроксипроизводных пиридоксина.
3. Реакции бромирования 5,6-бис(гидроксиметил)-2,2,8-триметил-4Н-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридина и кислотного гидролиза 5,6-бис(хлорметил)-2,2,8-триметил-4Н-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридина протекают региоспецифично по шестому положению пиридоксина. Экспериментальные данные согласуются с результатами квантово-химических расчетов стабильности региоизомерных карбкатионов в рамках механизма мономолекулярного нуклеофильного замещения (SnI).
4. Разработан удобный способ получения широкого ряда четвертичных фосфониевых солей на основе производных пиридоксина и 6-гидроксиметилпиридоксина.
5. Некоторые четвертичные фосфониевые соли на основе производных 6-гидроксиметилпиридоксина проявляют высокую антибактериальную активность на штаммах грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, сопоставимую с антибиотиком «последней надежды» -ванкомицином. Установлена взаимосвязь структуры фосфониевых солей на основе производных пиридоксина с их антибактериальной активностью.
6. Разработаны подходы к синтезу алкенилпроизводных по реакции Виттига моно- и бисфосфониевых солей пиридоксина с бензальдегидом.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Shtyrlin, N.V. Synthesis of novel 6-substituted sulfur-containing derivatives of pyridoxine / N.V. Shtyrlin, R.S. Pavelyev, M.V. Pugachev, L.P. Sysoeva, R.Z. Musin, Yu.G. Shtyrlin // Tetrahedron Letters - 2012. - V.53, Iss. 31. - P. 3967-3970.
2. Pugachev, M.V. Synthesis and antibacterial activity of novel phosphonium salts on the basis of pyridoxine / M.V. Pugachev, N.V. Shtyrlin, E.V. Nikitina, L.P. Sysoeva, T.I. Abdullin, A.G. Iksanova, A.A. Ilaeva, E.A. Berdnikov, R.Z. Musin, Yu.G. Shtyrlin // Bioorg. Med. Chem. -2013. - V. 21, Iss. 14. - P. 4388-4395.
3. Pugachev, M.V. Bis-phosphonium salts of pyridoxine: the relationship between structure and antibacterial activity / M.V. Pugachev, N.V. Shtyrlin, S.V. Sapozhnikov, L.P. Sysoeva, A.G. Iksanova, E.V. Nikitina, R.Z. Musin, O.A. Lodochnikova, E.A. Berdnikov, Yu.G. Shtyrlin // Bioorg. Med. Chem. - 2013. - V. 21, Iss. 23. - P. 7329-7341.
4. Пат. 2466728 РФ, МПК C07D213/67, C07F9/54, A61P31/00. Фосфониевые соли на основе производных пиридоксина / Ю.Г. Штырлин, М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин; ФГАОУ ВПО КФУ. - Опубл. - 20.11.2012.
5. Пугачев, М.В. Синтез фосфониевых солей на основе производных пиридоксина / М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин // VI Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012». Тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 90-91.
6. Пугачев, М.В. Синтез четвертичных фосфониевых солей на основе производных пиридоксина / М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин // XIX Международная
научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Тезисы докладов. - Москва, 2012. - С. 373.
7. Штырлин, Н.В. Синтез и антибактериальная активность фосфониевых солей на основе ацеталей пиридоксина / Н.В. Штырлин, М.В. Пугачев, Ю.Г. Штырлин // Всероссийская конференция «Современные проблемы химической науки и образования». Тезисы докладов. - Чебоксары, 2012. - Т.2, С. 204-205.
8. Пугачев, М.В. Синтез моно- и бисфосфониевых солей на основе производных пиридоксина / М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин // XI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского федерального университета «Материалы и технологии XXI века». Тезисы докладов. -Казань, 2012.-С. 56.
9. Пугачев, М.В. Синтез новых антибактериальных препаратов на основе фосфорсодержащих производных пиридоксина / М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин, C.B. Сапожников // VII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013». Тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2013. - С. 47-48.
10. Штырлин, Н.В. Синтез аммонийных и фосфониевых солей на основе пиридоксина / Н.В. Штырлин, М.В. Пугачев, C.B. Сапожников // Первая всероссийская конференция молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств». Тезисы докладов. - Москва, 2013. - С. 135.
П.Пугачев, М.В. Селективный синтез фосфониевых солей на основе 6-гидроксиметилпиридоксина / М.В. Пугачев // XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Тезисы докладов. — Москва, 2013. - С. 1.
12.Штырлин, Н.В. Синтез и антибактериальная активность фосфониевых солей на основе пиридоксина / Н.В. Штырлин, М.В. Пугачев, Ю.Г. Штырлин // Первая российская конференция по медицинской химии (MedChemRussia-2013). Тезисы докладов. - Москва, 2013. - С. 275.
13. Пугачев, М.В. Синтез монофосфониевой соли на основе 4-дезоксипиридоксина / М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин // XXI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Тезисы докладов. - Москва, 2014.-С. 52.
14. Сапожников, C.B. Синтез и антибактериальная активность фосфониевых и аммонийных солей на основе пиридоксина / C.B. Сапожников, М.В. Пугачев, Н.В. Штырлин // VIII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2014». Тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2014. - С. 86-87.
Подписано в печать 15.10.2014. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1, Уч.-изд. л. 1,11. Тираж 100 экз. Заказ 131/10
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета
420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59, 233-73-28
