Синтез и исследование противоопухолевой активности новых C(2)-функционализированных производных тритерпеноидов лупанового ряда

Недопёкина, Дарья Александровна

Синтез и исследование противоопухолевой активности новых C(2)-функционализированных производных тритерпеноидов лупанового ряда тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Недопёкина, Дарья Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Уфа МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и исследование противоопухолевой активности новых C(2)-функционализированных производных тритерпеноидов лупанового ряда»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и исследование противоопухолевой активности новых C(2)-функционализированных производных тритерпеноидов лупанового ряда"

На правах рукописи

Недопёкипа Дарья Александровна

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ С(2)-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ ЛУПАНОВОГО РЯДА

02.00.03 — Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата химических наук

2 9 АВГ 2013

Уфа-2013

005532384

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Спивак Анна Юльевяа

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

член-корреспондент РАН Миронов Владимир Федорович заведующий лабораторией ФГБУН Институт органической и физической химии

им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН (г. Казань)

кандидат химических наук, доцент Комиссарова Наталия Григорьевна старший научный сотрудник ФГБУН Институт органической химии УНЦ РАН (г. Уфа)

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Новосибирский институт оргаиической химии имени H.H. Ворожцова СО РАН

Защита диссертации состоится «17» сентября 2013 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.062.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук по адресу: 450075, Уфа, проспект Октября, 141. Тел/факс: (347)2842750. E-mail: mk@,anrb.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук и с авторефератом на сайте ВАК Министерства образования и науки РФ.

Автореферат разослан «!Чу> августа 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор химических наук

Шарипов Г.Л.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Нативные пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда (бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты) составляют важный класс биологически активных соединений с широким спектром биологического и фармакологического действия. Особый интерес к этим соединениям вызван их противоопухолевыми и противовирусными свойствами. В 1995 году было обнаружено, что бетулиновая кислота проявляет цитотоксичность по отношению к мелапоме человека путем индукции апоптоза раковых клеток (ЕБ5о 1.1-4.8 мкг/мл). Впоследствии появились сообщения о протсгаоопухолевой активности этого природного соединения по отношению к другим типам злокачественных клеток. На сегодняшний день бетулиновая кислота находится в стадиях 1/11 клинического исследования в качестве препарата для лечения синдрома диспластического невуса.

Бетулиновая кислота и ее некоторые синтетические производные относятся к группе противораковых веществ - «митоканов», биологической мишенью которых являются митохондрии. Митоканы дестабилизируют митохондрии и индуцируют апоптоз раковых клеток (не затрагивая нормальные клетки) независимо от их р53-статуса. В работах, посвященных изучению механизма противоопухолевого действия бетулиновой кислоты, убедительно показано, что она способствует накоплению в митохондриях активных кислородсодержащих частиц. Продуцирование в больших концентрациях свободных радикалов ведет к увеличению проницаемости или к разрыву мембран митохондрий с последующим высвобождением в цитозоль проапоптозного медиатора - цитохрома С, активацией каспаз и фрагментацией ДНК.

Нативные лупановые тритерпеноиды проявляют низкую токсичность по отношению к животным даже при высоких концентрациях, однако относительно небольшой потенциал их биологического действия, низкая растворимость в воде и неблагоприятные параметры по абсорбции и метаболизму являются серьезным препятствием для использования этих веществ в клинической практике. В связи с этим в последние несколько десятилетий проводятся интенсивные исследования по синтезу производных бетулина и бетулиновой кислоты путем модификации функциональных групп при атомах углерода С(3) и С(17). Исследования привели к получению новых лекарственных агентов, которые по своей противоопухолевой и противовирусной активности превзошли бетулиновую кислоту. Не менее перспективными представляются трансформации, направленные на структурную модификацию кольца А в лупановых тритерпеноидах. В литературе описаны методы получения и биологические свойства диосфенолов, А-секопроизводных бетулиновой кислоты ii их ангидридов, а также группы соединений с 1,3-еноновым фрагментом в кольце

А, в которых атом углерода С(2) связан со стерически небольшими электроно-акцепторными группами (CN, CI, СНО). Эти С(2)-функционализированные производные бетулиновой кислоты проявили более сильную цитотоксическую активность по сравнению с бетулиновой кислотой и действовали как эффективные ингибиторы продуцирования оксида азота в

активированных макрофагах.

Работа выполнена в соответствии с планами НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии наук по теме «Направленные трансформации природных и синтетических токоферолов, тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов» № Госрегистрации 01201168019 в 20112013 гг., атакже при поддержке грантов РФФИ № 10-03-00105 (2010-2012) «Дизайн и синтез гетеродимерных и (поли)амидамин (РАМАМ) дендримерных конъюгатов токоферолов и тритерпеноидов в качестве новых современных лекарственных средств»; № 12-03-97005-а (2012) «Новые митохондриально-направленные производные токоферолов и пентациклических тритерпеноидов: синтез и изучение in vitro их противовоспалительных и противоопухолевых свойств»; программ фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах РАН: «Медицинская и биомолекулярная химия», проект «Синтез и исследование цитотоксическнх и противовоспалительных свойств новых производных лупановыхтерпеноидов с модифицированным кольцом А и их конъюгатов с токоферолами»

(2011) и «Медицинская химия: молекулярный дизайн физиологически активных соединений и лекарственных преператов», проект «Синтез митохондриально-направленных ионных производных бетулиновой и урсоловой кислот как новых противоопухолевых агентов»

(2012).

Пель и задами исследования. Цель исследования заключалась в получении новых С-2 функционализированных производных лупановых тритерпеноидов как потенциальных

противоопухолевых агентов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• синтезировать ранее неизвестные C-2-аллилзамещенные производные лупановых тритерпеноидов на основе реакции аллильного а-алкилирования енолятов или енокситриэтилборатов калия, генерированных из бетулоновой, дигидробетулоновой кислот и 3-оксомодифицированного бетулина;

• изучить реакцию спироциклизации 1,6-гексадиенового фрагмента кольца А с целью синтеза новых потенциально биоактивных спироциклических систем;

• разработать эффективные способы введения в молекулы лупановых тритерпеноидов трифенилфосфониевого фрагмента, способствующего усилению их цитотоксических свойств и избирательности действия на митохондрии раковых клеток;

• изучить in vitro цитотоксическое действие лупановых тритерпеноидов с фрагментом трифенилфосфоний-катиона.

Научная новизна. Впервые осуществлено селективное а-алкилирование енолятов и енокситриэтилборатов калия, генерированных из З-кетолупанов (бетулоновая, дигидробетулоновая кислоты, 3-оксомодифицированный бетулин) под действием Ви'ОК или KN(SiMe3)2-Et3B и бромистого аллила. В результате, с высоким выходом получены новые С(2)-моноаллил- и С(2)-диаллилзамещенные производные лупановых тритерпеноидов, доступные в качестве ключевых строительных блоков для дальнейших трансформаций.

Впервые радикальной циклизацией 1,6-гексадиенового фрагмента в 2,2-диаллилзамещенных метил- или бензилбетулонатах, инициируемой Fe(N03)3-9H20, синтезированы спироциклические соединения, в которых кольцо А лупанового тритерпеноида в C-2-положении спиросочленено с вицинально замещённым 4-нитрометил-З-хлорметалцнклопентаком. На основе результатов квантово-химической оценки энергетических характеристик реакции определена наиболее вероятная 4'R, 3'S, l'R -конфигурация хиральных атомов спироциклопентанового фрагмента в 4'-(нитрометил)-3'-(хлорметил)спиро[лупан-2(1')-циклопентане] - основном диастереомере, выделенном в индивидуальном виде для каждого из эфиров (метилового и бензилового).

бетулиновую кислоту.

Практическая ценность. Разработаны селективные препаративные методы синтеза лупановых тритерпеноидов с легко функционализируемыми С(2)-аллильными фрагментами. Полученные новые соединения могут быть использованы как ключевые полупродукты для направленного синтеза различных биологически активных веществ в ряду пентацихлических тритерпенов. Ионные производные лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами, проявившие при первичном скрининге высокую цитотоксическую активность по сранению с бетулиновой кислотой, представляют интерес в качестве потенциальных

митохондриально-направленных противоопухолевых агентов и рекомендованы для углубленных фармакологических исследований.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика» (Уфа, 2010), XIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург,2011), Международной конференции «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, 2011), XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Органическая химия: химия и технология» (Екатеринбург, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и тезисы 5 докладов на конференциях, получен один патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора на тему «Синтез и изучение противоопухолевых свойств бетулина, бетулиновой кислоты и ее производных», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 164 наименования. Материал диссертации изложен на 128 страницах компьютерного набора (формат А4) и включает 30 схем, 2 рисунка и 2 таблицы.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Одинокову Виктору Николаевичу за постоянное внимание, консультации и неоцемшую помощь на всех этапах выполнения данной работы.

Основное содержание работы

1. Синтез новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными

заместителями в кольце А.

В ряду многочисленных полусинтетических аналогов лупановых тритерпеноидов С-2 функционализированные производные бетулина и бетулиновой кислоты составляют относительно небольшую группу веществ. К этим соединениям относятся диосфенолы, 2-алкилиден разветвленные производные бетулоновой кислоты и лупановые тритерпеноиды с 1,3-еноновым фрагментом в кольце А, в которых С(2) атом углерода связан с электронно-акцепторными группами. Большинство из соединений этой группы проявили более высокую цитотоксическую активность в отношении различных линий опухолевых клеток по сравнению с бетулиновой кислотой. В связи с этим представляло интерес получение новых С-2 функционализированных производных тритерпеноидов лупанового типа с использованием в качестве полифункциональных строительных блоков С(2)-моноаллил и

С(2)-диаллил замещенных производных 3-кетолупанов. О синтезе этих соединений в ряду лупановых тритерленоидов в литературе не сообщалась.

В данной работе в синтезе новых лупановых тритерпеноидов использовались реакции аллильного а-алкилирования енолятов или енокситриэтилборатов калия, генерированных из эфиров бетулоновой, 20,29-дигадробетулоновой кислот и 3-оксомодифицированного бетулина.

Как известно из литературы, эффективными интермедиатами в реакциях а-алкилироваиия кетонов являются енокситриэтилбораты калия, которые получают т ¿Ни взаимодействием циклических или ациклических кетонов с реагентами КН—Е^В, КХ^МезЬ—Е(3В или Ви'ОК—Е^В в эфирных растворителях. Использование таких енолят-анионов в большинстве случаев позволяет контролировать регио- и стереохимию реакций и исключает образование побочных продуктов О-алкилирования, ди- и полиалкилирования. Нами показано, что взаимодействие аллилбромида с енолят-анионами А, полученными взаимодействием метил- бетулоната 1, метил- 2 или бензил- 3 дигидробетулонатов или 28-ТВ8-защищенного 3-оксомодифицированного бетулина 4 с КИ^МезЬ в 1,2-диметоксиэтане (ОМЕ), с последующим добавлением в реакционную среду Е1чВ (мольное соотношение 1-4 : КТЧ^МезЬ : Е(3В : С3Н5Вг = 1 : 1.3 : 1.3 : 2) привело за короткий период времени (4 ч) с выходами 42-71% и с высокой стериоселективностью (2|В:2а = 98:2) к 2р-аллилзамещенным гритерпеноидам 5-8 (схема 1). На примере метилбетулоната 1 было исследовано влияние природы депротонирующих агентов, растворителя и времени реакции на стереоселективность аллильного а-алкилирования исследуемых кетонов. Так, при увеличении продолжительности реакции до 24 ч наблюдалось незначительное повышение образования 2а-пропенил эпимера 9 (2(5:2а = 96:4, данные спектров 'Н и 13С). При замене растворителя ОМЕ на ТГФ селективность реакции за 4 ч изменялась также незначительно (2р:2а = 96:4), однако при увеличении продолжительности реакции до 24 ч кинетически контролируемый 2р-эпимер 5 претерпевал частичную изомеризацию, по-видимому, в термодинамически более стабильный 2а-эпимер 9, что привело к смеси эпимеров 5 и 9 (2р:2а = 60:40).

Превращение 2р-эпимера 5 в условиях термодинамического равновесия в 2а-эпимер 9 было подтверждено нами дополнительным экспериментом. При выдерживании 2р-эпимера 5 в ТГФ в присутствии КМ^Мез);—ЕЛзВ в течение 48 ч наблюдалось образование смеси (60:40) 2Р- и 2а-эпимеров. Смесь (70:30) эпимеров 5 и 9 была получена также при а-аллилировании енолята А, полученного енолизацией метилового эфира бетулоновой кислоты 1 под действием КН—ЕЦВ в ТГФ (конверсия через 24 ч составила 21%). При

енолизации терпеноида 1 под действием Ви'ОК—Е13В в Г)МЕ состав продуктов аллильного а-алкилирования енолят-аниона А существенно изменялся в зависимости от того, как проводилась реакция.

Схема 1

Реагенты и условия: а. 1) ЮМ^Меэ);, ВЕЪ, 2) С,Н5Вг, ОМЕ пли ТГФ, 20"С, 4ч; Ь. 1) КЛфМеэЬ, ВЕ1,, 2) СзВДг, ТГФ, 20°С, 24 часа; с. 1) Ви'ОК., Е13В, 2) С3Н5Вг, БМЕ, 20°С, 12 ч; А. 1) КН, Е1,В, 2) с3н5вг, ТГФ, 24ч; с. 1) Ви'ОК, Е1,В, 2) С3Н5Вг, ОМЕ, 20"С, 1ч, затем Ви'ОК, 12ч;/ КЛ(31Ме,)2, ВЕ13, ТГФ, 20°С, 48ч.

Взаимодействие эфира бетулоновой кислоты 1 с Ви'ОК—ЕЬВ в БМЕ (мольное соотношение 1: Ви'ОК : Е13В : С3Н5Вг = 1 : 1.1 : 1.3 : 1.3) в течение 12 ч дало смесь 2(3- и 2а-эпимеров 5 и 9 (20 : 2а = 70 : 30). Общий выход продуктов 5 и 9 из-за низкой конверсии процесса не превышал 20%. При проведении реакции с повторным добавлением в реакционную среду 1.1 эквивалента Ви'ОК и последующим выдерживанием реагентов при избытке основания в течение 12 ч (в условиях термодинамического равновесия) был получен индивидуальный 2а-эпимер 9. Высокая стереоселективность реакции аллильного а-алкилирования терпеноидов 1-4 и образование в качестве кинетически контролируемых продуктов 2р-эпимеров 5-8, по-видимому, обусловлены тем, что енолизация эфира бетулоновой и дигидробетулоновой кислот 1-3 и кето-производного бетулина 4 под действием стерически объемного основания КМ^МезЬ в ОМЕ приводит к хелатированному енокситриэтилборату калия. Благодаря наличию метальной ангулярной группы (Ме-25) хелатные комплексы енолятов А с растворителем ориентируются со стерически более доступной а-стороны, в связи с чем последующая стадия алкилирования енолят-анионов аллильным электрофилом происходит с р-стороны. При проведении реакщш аллильного алкилирования эфира бетулоновой кислоты 1 в ТГФ стереоселективность процесса существенно снижалась, поскольку ТГФ по сравнению с ОМЕ менее склонен к образованию хелатных комплексов с металлами.

Аллштьные геминально замещённые производные бетулоновой кислоты и 3-оксо-производных бетулина представляют интерес в качестве полифункциональных блок-синтонов для новых производных лупановых трнтерпеноидов. Например, лупановые терпеноиды с 1,6-гексадиеновым фрагментом в кольце А могут быть трансформированы в структуры, содержащие спироциклопентановые и спироциклогексановые кольца, в которых в качестве спироатома будет выступать C-2-углеродный атом. Нами было показано, что реакция аллилбромида с енолятами калия (В), генерированными при действии на терпеноиды 1, 2, 3 или 4 избытка Ви'ОК в DME (мольное соотношение X, 2, 3 или 4: Ви*ОК : C3H5Br = 1 : 2.5 : 2.2), с высокой селективностью и выходом 52-69% привела к продуктам 2,2-бис-аллилирования - тсрпеноидам 10-13 соответственно (схема 2). Деблокированием карбоксильной функции в соединении 10 галогенолизом под действием LiBr в ДМФА была получена 2,2-бисаллил-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овая кислота 14.

Структуры полученных соединений подтверждены данными одномерных (*Н, ПС, APT), двумерных гомо- (COSY, NOESY) и гетероэкспериментов (HSQC, НМВС). Определение химических сдвигов атомов водорода СН2-, и СН-групп колец тритерпенового остова проведено с использованием метода двумерной гетероядерной корреляции (HSQC).

Схема 2

П к=со1Ме,к|-сн,снсн,(1,10);

ЛХ^. И = С01Ме, Я' = (СН^СН (2,11);

% А Т»В к - СО,Вп, 1!'-(СН,),СН (3,12);

и = С11,ОТВЯ, И1 = СН3СН=СН,(4,13); И = СО,11, Я1 - СН,СН-СН, (14);

"В "

Реагенты и условия: а. 1) Ви'ОК, 2) С3Н5Вг, ОМЕ, 20°С, 2ч; Ь. ЫВг, ДМФА, кипячение.

Так, о р-ориентации аллильного заместителя в соединении 5 (2р-эпимер) свидетельствуют 1,3-стерические взаимодействия этого заместителя с метальными группами С(24) и С(25), которые обусловливают экранирование и сдвиг сигналов углеродных атомов метальных групп в сторону более сильных полей (на -3.9 м.д. и -2.5 м.д. соответственно) по сравнению с сигналами соответствующих метильных групп в 2а-эпимере 9. В соединении 9 в результате 1,3-стерического взаимодействия а-ориентированного аллильного фрагмента с углеродным атомом метальной группы С(23), последний резонирует в более сильном поле (5 19.43 м.д.) по сравнению с атомом С(23) в 2в-эпимере (6 21.72 м.д.). При определении

конфигурации аллильных заместителей в 2а- или 2р-эпимерах использовали также диагностические протоны в спектрах ЯМР 'Н - метановые протоны при атомах С(2) и метиленовые протоны при атомах С(1). Так, в эксперименте NOESY для соединения 9 сигнал метилового протона при атоме С(2) (S 2.77 м.д., м) имеет интенсивный кросс-пик с сигналом метальной группы С(24) (5 1.06 м.д., с), что свидетельствует об их пространственной близости и, следовательно, о ß-ориентацин метанового протона Н(2). Найденная КССВ (3Jh(d,hc2) = Ю Гц) аксиального протона Н(1) (5 1.21 м.д., т, 2J = 3J = 10 Гц), интенсивный кросс-пик с ангулярной метальной группой С(25) в NOESY однозначно указывает на аксиальное положение протона Н(2). Следовательно, аллнльная группа в соединении 9 находится в экваториальном положении и имеет а-ориентацию. В эпимере 5 вицинальная КССВ (3Jh(d.ii(2) =13 Гц) аксиального протона Н(1) (5 2.08 м.д., д.д, 2J = 6 Гц, 3J = 13 Гц) свидетельствует об аксиальном расположении протона 11(2). Следовательно, в эпимере 5 аллильная группа также находится в экваториальном положении, но имеет ß-ориентацию. Спектральные и стереохимические особенности эфиров 2а- и 2р-аллил-3-оксо-лупанов, по-видимому, объясняются кардинальными различиями в конформации кольца А.

Таким образом, нами впервые осуществлено аллильное алкилирование еноксшриэтилборатов калия 3-кетолупанов, позволившее в условиях кинетического контроля получить с высоким выходом 2р-аллилзамещенные тритерпеноиды. Разработан простой и эффективный метод синтеза новых производных лупановых тритерпеноидов с геминальными аллильными заместителями у атома углерода С(2), доступных для дальнейших трансформаций.

2. Синтез спироциклопеитильных производных лупановых тритерпеноидов радикальной нитроциклизацией C-2-диаллильных эфиров бетулоновой кислоты.

Известно, что наличие спиро- группы в молекулах различных природных и синтетических биологически активных веществ оказывает существенное влияние на их биологическую активность. При конструировании в молекуле спнрогруппы часто используют субстраты с геминальными диаллильнымн заместителями, которые легко вступают в реакцию радикальной циклоизомеризации или циклоизомеризации под действием комплексов переходных металлов.

Представлялось интересным изучить реакцию радикальной циклизации 2,2-диаллилзамещенных метил- и бензил- бетулонатов 11 и 12, инициируемую Fe(N03)3'9H20 (в условиях его термического разложения) в присутствии FcCb или LiCl как ловушек

радикалов по разработанному ранее методу1. Реакция при кратковременном кипячении реагентов в ТГФ привела с хорошим выходом к смеси диастереомерных спиросоединений 15 и 16 соответственно (схема 3).

Схема 3

11,15 R=Me; 12, 16 R=Bn

Реагепты и условия: a. FcfN0-,), 9H-0, FcCl, или LiCI, ТГФ, 65°С.

В масс-спектрах MALDI TOF смеси соединений 15 и 16 присутствовали молекулярные ионы, соответствующие их брутто формулам (для 15, m/z 654.98 [M+Na] , 670.96 [M+Kf; для 16, 730.40 [M+Naf, 746.37 [M+Kf). В спектрах ЯМР *Н продуктов циклизации 15 и 16 сигналы групп CH2N02 и СН2С1 проявлялись в виде широких мультштлетов, резонирующих при S 4.30-4.75 и 3.45-3.65 м.д., соответственно, в спектрах ЯМР 13С этим группам соответствовали характерные триплетные сигналы: для соединений 15 5 75.81 и 44.45 м.д., для соединений 16 5 75.83 и 44.46 м.д.

Анализ спектров ЯМР этих соединений не позволил определить их стереоизомерный состав. Методом колоночной хроматографии на силикагеле из трудноразделимых диастереоизомерных смесей 15 и 16 удалось выделить в индивидуальном виде основные изомеры 15а и 16а соответственно. Строение соединений 15а и 16а было частично подтверждено анализом данных одномерных спектров ЯМР 'Н и 13С, двумерных гомо-

Спектры ЯМР 'Н и 13С с небольшими отличиями для соединений 15а и 16а полностью соответствовали их структуре и содержали по единичному набору характеристических сигналов лупанового, циклопентанового фрагментов и соответствующих заместителей. В их спектрах ЯМР 13С наблюдалось сильнопольное смещение синглетного сигнала

*Т. Taniguchi, Н. Ishibashi. Org. Lett. 2010,12, № 1, 124.

четвертичного углеродного атома С-2 в кольце А (Д 5 5.7 м.д.) по сравнению с его расположением в спектрах исходных эфиров 11 и 12. Выявленная в спектрах ЯМР 'Н КССВ вицинальных протонов НС-3' (2.7 м.д.) и НС-4' (3.0 м.д.), равная 8 Гц, свидетельствовала об их взаимной цис-ориентации и, следовательно, цис-расположении групп CH2N02 и СН2С1 в спироциклопентановом фрагменте. Взаимная цис-ориентация заместителей подтверждалась интенсивными кросс-пиками в спектре NOESY между протонами группы СН2С1 (3.5 м.д.) и CH2N02 (4.4 м.д.). Однако спектроскопия ЯМР не позволяла сделать исчерпывающее заключение о стереохимическом строении спиросоединений. Для получения информации об абсолютной конфигурации хиральных атомов углерода циклопентанового кольца был проведен теоретический анализ стереохимических особенностей исследуемой реакции2.

На примере модельного 2,2-диаллилзамещенного циклогексанона 11', конформационное строение которого соответствует строению цикла А исходных лупановых терпеноидов (11, 12) методами DFT и ab initio исследован механизм реакции радикальной циклизации, протекающей согласно схеме 3.

Экваториальное /(-ориентация положение

« Л

Л "¿"V f ?д®'

\ Аксиальное \ 11

а-ориентаиия ^ положение ^^

Фрагмент 2,2-диаллилзамещенного 2,2-диаллилциклогексанон

Метилбетулоната 11 (модельное соединение) 11'

При экзо-циклизации 1,6-гексадиенового фрагмента метилбетулоната 11 (или модельного соединения 11') в циклопентан возможно образование восьми диастереомеров: по четыре пары молекул с цис- и транс-расположением вицинальных групп СН2>102 и СН2С1, различающихся расположением последних относительно плоскости кольца А лупанового остова (изображены диастереомеры модельных соединений 15а'-с1' с Я-конфигурацией спироатома).

! Автор благодарит д.х.н., проф. С.Л. Хурсана и М.Ю. Овчинникова за выполнение теоретического анализа стереохимических особенностей реакции и консультации при обсуждении результатов (Институт органической химии УНЦ РАН).

NO,

Cl О 15»'

Результаты расчетов полных энергий оптимизированных структур всех изомеров модельных соединений 15а'-(Г в приближении ВЗЬУР/6-ЗЮ(<1) однозначно свидетельствовали об энергетической предпочтительности транс-изомеров: разница в энергии между наименее стабильным транс-изомером 15Ь' и наиболее стабильным цис-изомером 15а' (или продуктов реакции 15Ь и 15а) составила 9 кДж/моль, разница в энергии наиболее устойчивого транс-изомера 15с' с изомером 15а' (или продуктов реакции 15с и 15а) возрастает до 15 кДж/моль.

Однако из полученных нами экспериментальных данных следовало, что термодинамически менее устойчивые цис-изомеры образуются в мажорных количествах. Так, выход цис-изомера 15а составил 37% в расчёте на смесь диастереомеров 15. Для объяснения данного кажущегося противоречия выдвинуто предположение, что кинетика и механизм исследуемой реакции обусловливают избирательное образование термодинамически менее стабильного цис-изомера. В пользу выдвинутой гипотезы свидетельствовали известные факты о преимущественном образовании цис-замещенных циклопентанов в реакции радикальной циклизации 1,6-гексадиенов3.

В соответствии с гипотетическим механизмом, предложенным для радикальной нитроциклизации 1,6-диенов в работе1, реакция С-2-диаллилзамещённых эфиров бетулоновой кислоты, например, метилбетулоната 11 начинается с радикального присоединения двуокиси азота к одной из двух двойных связей 1,6-диенового фрагмента с последующей 5-экзо-циклизацией интермедиата 17 в интермедиат 18, содержащий циклопентилметильный радикал, спиросочленённый с кольцом А лупанового тритерпеноида. Радикальный интермедиат 18 улавливается атомом хлора, давая продукт реакции 15 (схема 4).

3 J. С. Tripp, С. H. Schiesser, D. P. Curran. J. Ат. Chem. Soc. 2005, 127, 5518.

Схема 4

Расчёты относительной энергии Гиббса переходных состояний Р-ТБ* и а-ТБ* двух направлений первой стадии процесса циклизации модельного соединения 11' показали предпочтительность взаимодействия двуокиси азота с аллильным заместителем в соединении 11', имеющим экваториальную конфигурацию (р-ориентация аллильного фрагмента в 11), что приводит к интермедиату 17' (схема 5).

Схема 5

Следовательно, на основании данных, полученных для модельного соединения 11', можно предположить, что в ряду изомерных соединений 15 предпочтительно образование четырёх диастереомеров 15а-<1 с К-конфигурацией С-2-спироатома. При расчёте относительной энергии Гиббса переходных состояний 18а'7-11"!, ведущих к модельным соединениям 15а'-<Г, переходное состояние 18а'*, ведущее к изомеру 15а', отличалось самым

низким энергетическим барьером. Найденное значение АДС*с., составляет 8.1 кДж/моль. Вычисленное из этой величины отношение констант скорости ка/кс = 15 (Т = 338 К), то есть константа скорости стадии циклизации, протекающей в направлении образования модельного соединения 15а' или продукта реакции 15а на порядок выше констант скорости конкурирующих каналов. Следовательно, экспериментально наблюдаемое образование цис-изомеров 15а и 16а спироциклопентановых производных эфиров бетулоновой кислоты находит свое разумное объяснение при анализе данных, полученных в рамках теоретических исследований, снимающих отмеченное выше кажущееся противоречие между термодинамикой изомерии и данными ЯМР-исследований диастереоизомерной смеси соединений 15 или 16.

Таким образом, радикальной циклизацией 1,6-гексадиенового фрагмента в 2,2-диаллилзамещенных метил- или бензилбетулонатах, инициируемой Ре(МОз)з-9НгО в присутствии ИеСЬ или 1ЛС1, синтезированы ранее неизвестные спироциклические соединения, в которых кольцо А лупанового тритерпеноида в С-2-положении спиросочленено с вицинально замещённым (нитрометил)-(хлорметил)циклопентаном. На основе результатов квантово-химической оценки энергетических характеристик реакции с помощью теоретического анализа механизма реакции установлены наиболее вероятные структуры выделенных в индивидуальной форме из смеси диастереоизомеров мажорных продуктов 15а и 16а как метил-3-оксо-3'8-(хлорметил)-4'К-(ш1трометил)-спиро[лупан-2(1')К-циклопентан]-дигидробетулоната и бензил 3-оксо-3'8-(хлорметил)-4'11-(нитрометил)-спиро[лупан-2(Г)К-циклопентан]-дигидробетулопата соответственно.

3. Синтез лупановых тритерпенондов с трпфенилфосфониевыми фрагментами как потенциальных противоопухолевых агентов.

Бетулиновая кислота и ее некоторые синтетические производные относятся к группе противоопухолевых веществ - «митоканов», биологической мишенью которых являются митохондрии. Это соединение избирательно дестабилизирует митохондрии и индуцирует алоптоз опухолевых клеток независимо от транскрипционного фактора р53. Бетулиновая кислота способствует накоплению в митохондриях активных кислородсодержащих частиц. Продуцирование в больших концентрациях свободных радикалов ведет к увеличению проницаемости или к разрыву мембран митохондрий с последующим высвобождением в цитозоль проапоптозного медиатора - цитохрома С, активацией каспаз и фрагментацией ДНК. В настоящее время в области медицинской химии активно развиваются исследования, посвященные дизайну и синтезу митохондриально-нацеленных противоопухолевых агентов, поскольку митохондрии играют ключевую роль в энергетических процессах клетки, в

генерировании активных кислород-содержащих радикалов и регулировании путей клеточной смерти. При создании новых лекарственных средств учитываются физико-химические и морфологические особенности митохондрий, в частности уникально большой по сравнению с другими органеллами и клетками трансмембранный потенциал митохондрий. Кроме того, митохондриальный мембранный потенциал клеток солидных опухолей существенно превышает потенциал нормальных клеток, что позволяет надеяться на избирательную аккумуляцию положительно заряженных молекул в митохондриях трансформированных клеток. Известно, что некоторые липофильные катионы, такие как родамин-123 и тетрафенилфосфоний проходят через гидрофобные барьеры плазмы митохондриальных мембран и накапливаются в митохондриях. Это свойство липофильных катионов можно использовать для доставки цитотоксического соединения в митохондрию опухолевых клеток с высокой селективностью. Мы предположили, что ковалентное связывание бетулиновой кислоты и ее производных с мембранопроникающим трифенилфосфониевым катионом приведет к облегченному транс-мембранному переносу тритерпеноидов и, как следствие, к усилению их противоопухолевой активности.

Нами синтезированы новые производные лупановых тритерпеноидов — трифенилфосфониевые соли 20,29-дигидробетулиновой и 3-эпи-20,29-дигидробетулиновой кислот, которые значительно превзошли бетулиновую кислоту по своей противоопухолевой активности. В синтезе целевых фосфониевых солей 33-35, 42, 43, 45 в качестве ключевых интермедиатов использовали 2|3-аллилзамещенные метил- и бензил-дигидробетулонаты 6 и 7, которые получали по разработанному нами методу (схема 1, стр. 8).

Восстановление кетогруппы соединений 6, 7 с помощью КаВ Н4 или с помощью Ь-селектрида дает их 2-гидроксипроизводньге 19-21, необходимые для последующих трансформаций в трифенилфосфониевые соли (схема 6).

Изучение этой реакции позволило выявить существенное влияние С-2-аллильного фрагмента на стереохимию процесса восстановления 3-кето-группы в кольце А. Так, в отличие от высоко стереоселективной трансформации бетулоновой кислоты в бетулиновую кислоту (Зр-ОН:За-ОН = 94:6) взаимодействие соединений 6 и 7 с КаВЩ в системе растворителей МеОН-СНС1з или МеОН-ТГФ привело к смеси эпимеров 19 и 21 с незначительным преобладанием ЗР-эпимера (3|3-ОН:За-ОН = 68:32). Найденная в спектрах

'СОК

33. К1 «ОН; И1=Н; Г)' =ОМе; Х=Г

34. ГС =11; ГС-ОП; К= -ОМе; Х=[

35. Я1 =ОАс: Я2=Н; Я!=ОВп; Х=1

42. Я1 =ОАс; И1 -Н; И3 -ОМе; Х=Вг

43. К' 'Н; И1 =ОАс; К1 =ОМг; Х-Вг 45. Н1 =ОАс; I!1 -Н; I)' =ОН; Х=Вг

ЯМР 'Н соединений 19 и 20 КССВ (Зін(2), Н(3) = ЮГц) протона Н(3) с аксиальным протоном Н(2) (см. выше, стр. 10) свидетельствовала об аксиальном а-расположении протона Н(3) и, следовательно, о р-ориентации З-ОН-группы. В За-эпимере 21 КССВ 3.Гн(2),н(3) = 1.5-2Гц.

Схема 6

Я« И, И'-ОАс, Н: 44, 45

Реагенты и условия: а. КаВН4, СеСЬ7Н20, МеОН-ТГФ, -30°С-20"С, Аг; Ъ. Ь-селекгрид, ТГФ, -78°С-20°С, Аг; с. Ас,0. Ру, ОМАР, 20"С; ВН, ТГФ, ТГФ, 20"С, Аг; е. 12, РРЬ5, нмидазол, ТГФ, 0°С;/ МбО, Ру, СН2С12, ОМАР, 20°С; g. 1лВг, (СН3)2СО, кипячепие, Аг; к. [М/С, НЬО; /. РРЬ,, СН,С6Н5, кипячение, Аг.

Стереоселекгивность реакции удалось существенно повысить при использовании ЫаВН4, модифицированного СеС1у7Н20. В этом случае Зр-эпимеры 19, 20 получены с селективностью 95-96%. Авторы работ4 объясняют стереоспецифичность реакций восстановления кетонов реагентом КаВН^СсСЬ ^НгО образованием комплекса иона церия с карбонильным атомом кислорода, что приводит к увеличению вероятности «аксиальной» атаки гидрид-анионом на кетон с последующим получением экваториального Зр-спирта. Влияние аллильного заместителя в соединениях б и 7 проявлялось также при использовании объемного восстанавливающего агента три(е/иор-бутил)боргидрида лития (Ь-селектрида). Взаимодействие дигидробетулоната 6 с Ь-селектридом привело с высокой селективностью

4 ХІ,. ІдісЬе, 1. Аш. СИеш. Бос., 1978, 100, 2226; Е. БГэдЬга, І.Сегпу, V. Роигаг, Н. С!их!оипзка, Бю-ойя, 2010, 75, 721.

(За-ОН:Зр-ОН = 96:4) к За-спирту 21, что существенно отличается от результатов восстановления L-селектридом бетулоновой кислоты (3a-OH:3(3-OH = 62:38). Полученные спирты 19, 21 и их ацетаты 22-24 были превращены с хорошим выходом в фосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45 (схема 6). С этой целью двойную связь в соединениях 19, 21-24 гидроборпровали, первичные спирты 25, 26, 29 превратили в йодиды 30-32 действием йода в присутствии имидазола и трифенилфосфина, а спирты 27-29 - в бромиды 39-41 через стадию соответствующих мезилатов 36-38. Взаимодействие галогенидов 30-32, 39,40,44 с избытком трифенилфосфина в кипящем толуоле дало целевые трифенилфосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45. Структуры всех полученных соединений подтверждены данными одномерных ('Н, 13С, APT, 31Р), двумерных tomo-(COSY, NOESY) и гетеро экспериментов (HSQC, НМВС). В спектрах ЯМР 31Р солей 33-35,42,43,45 сигналы атома фосфора наблюдались в характерной для фосфониевых солей области 23.37 - 24.34 м.д.

Таким образом, нами разработан эффективный подход к синтезу ранее не описанных фосфониевых солей лупановых тритерпеноидов. Доступность исходных растительных метаболитов (бетулин, бетулоновая, бетулиновая кислоты) и высокие выходы промежуточных веществ делают данный подход перспективным для получения большой группы конъюгатов пентациклических тритерпенов с трифенилфосфониевыми катионами как потенциальных противоопухолевых агентов.

4. Исследование пптотокспчсской активности синтезированных соединений5.

Цитотоксическое действие соединений 6, 11, 15, 33-35, 42, 43, 45 исследовали in vitro на раковых клеточных линиях карциномы Эрлиха и мастоцитомьг Р-815. Препаратом сравнения служила бетулиновая кислота. У исследуемых соединений 6, 11 и 15 противоопухолевая активность проявилась, как и у бетулиновой кислоты, в концентрации 10 мкгмл"1 и далее дозозависимо увеличивалась. При этом в концентрациях 10, 25 и 50 мкг-мл"1 действие соединений не превосходило действие бетулиновой кислоты. Все исследуемые трифенилфосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45 по противоопухолевой активности значительно (40-50 раз) превзошли бетулиновую кислоту. Их цитотоксическое действие проявлялось, начиная с концентрации 1 мкг мл"1, а в концентрации 10 мкг мл"' эти соединения вызывали 100%-ную гибель опухолевых клеток. Бетулиновая кислота в концентрации 10 мкг/мл только начинала проявлять цитотоксическое действие, которое дозозависимо возрастало при концентрациях 25 мкг мл-' и 50 мкг-млч. Однако даже в этих высоких концентрациях

5 Автор выражает благодарность д.м.н., проф. Ю.П. Вельскому и д.м.н., проф. В.А. Хазанову за выполнение экспериментов по определению цитотоксической активности полученных соединений и активное участие при обсуждении результатов. (ООО ^Инновационные фармакологические разработки», ООО «Ифар», г. Томск).

оставались жизнеспособные клетки опухоли Р-815 (34.3% и 30.5% соответственно) и опухоли Эрлиха (50.4% и 40.5%) (Таблица 1).

Таблица 1.

Цитотоксичеекое действие фосфониевых солей 33-35, 42, 43. 45 и бетулиновой кислоты (БК) на клетки опухоли Р-815 (в числителе) и Эрлиха (в знаменателе) (% жизнеспособных клеток) (Х±$Е)"

Концентрация /МКГМЛ-1 33 34 35 42 43 45 БК

ь 100.0 12.2

100.012.4

0.1 93.7+1.7 86.1+3.2 97.612.3 98.6+4.2 96.113.8 97.514.5 89.314.1

91.5+2.0 93.8+3.5 98.113.8 95,5+1.2 95.114.9 98.612.6 93.314.4

1 38.811.7"° 5.3+2.0"° 89.116.1 59.7+3.7°'" 53.8+5.0°'" 60.014.5"' 102.8+6.0

66.213.0°" 60.514.6°" 99.814.8 73.4+5.02°'" 71.713.6°-" 73.412.3°-" 96.813.1

10 о.о+і.з"° -1.8+1.6"° 13.4+4.4°'" -6.812.9°'" -3.511.6°'" -11.213.7°-" 62.811.1°

-0.310.7°" -2.310.4е" 10.811.1°'" -3.9+4.6°-" -1.312.02е'" 16.012.2°-" 57.3+4.2°

25 0.9+1.0"° -0.1 + 1.1"° 2.2±4.2°'" 7.8+6.6°-'' 3.8+1.0°-" -2.в+з.2°-" 34.315.0°

0.8+0.8а1 0.0+0.4°" 1.212.3е-" 7.214.8е-'' -3.812.2'-" 5.412.6°-" 50.412.4°

50 -0.7+1.0"° 0.411.0"° 4.6+2.2°,а 8.3±2.8°'" 5.011.6°-" 7.213.7°-" 30.5+2.9°

3.512.5е" -1.310.3°" 0.1+4.0°'" -2.117.9°-" 0.2+1.9°" -5.215.0°-" 40.5+2.6°

1С» 1.01 0.65 4.79 1.20 1.15 1.10 41.00

/мкмоль'л 1 1.27 1.21 4.70 1.37 1.35 2.30 54.00

"X - среднее значение экспериментальных данных, БЕ - стандартная ошибка. Контроль; г

Различия с контролем достоверны, р < 0.05; ^ Различия с соответствующей концентрацией

бетулиновой кислоты достоверны, р < 0.05; ІС50 - концентрация, вызывающая

полумаксимальную ингибицию жизнеспособных клеток.

Цнтотоксическое действие бетулиновой кислоты (БК) и солей 33-35.42,43,45 на опухолевые клетки мастопиточы-Р 815 и карциномы Эрлиха

60 f

}

50 Г

33 34 35 42 43 45 БК

□ мястоцитомз Р-815 Вкарцинома Эрлиха

Из литературы известно, что трансформация 28-карбоксильной группы бетулиновой кислоты в алкоксикарбонильную, как правило, приводит к полной потере цитотоксических свойств. Противоопухолевая активность бетулиновой кислоты в отношении клеток

меланомы человека выше активности ее За-эпимера. Вместе с тем, исследованные нами трифенилфоефониевые соли 33-35, 42,43,45, несмотря на различия в химической структуре, проявили сравнимые цитотоксические свойства. Полученные факты, по-видимому, свидетельствуют о существенном влиянии трифенилфосфониевого катиона, как новой фармакофорной группы, на биологическую активность тритерпеноидов лупанового ряда. Высокая цитотоксичность фосфониевых солей лупановых тритерпеноидов по сравнению с бетулиновой кислотой может быть связана с их облегченным трансмембранным переносом в митохондрии раковых клеток.

Выводы

1. Разработан эффективный подход к синтезу лупановых тритерпеноидов с легко функционапизируемыми С(2)-аллильными заместителями. Новые тритерпеноиды использованы в качестве ключевых сингонов в направленном синтезе потенциальных таргетных противоопухолевых лекарственных средств.

2. Разработаны селективные методы синтеза С(2)-моноаллил и С(2)-диаллилзамещенных производных лупановых тритерпеноидов на основе взаимодействия с аллильными галогенидами енолятов или енокситриэтилборатов калия, генерированных in situ из 3-кетолупанов под действием Ви'ОК или KN(SiMe3)2—Et3B.

3. Установлено, что генерация енолят-анионов с помощью KN(SiMe3)2—Et3B в 1,2-диметоксиэтане с последующим взаимодействием с аллилбромидом протекает в условиях кинетического контроля и с высокой стереоселективностью приводит к 2р-аллилироизводным.

3. Осуществлен первый синтез спироциклопентильных производных лупановых тритерпеноидов радикальной нитроциклизацией С(2)-диаллилзамещенных эфиров бетулоновой кислоты, инициируемой Fe(N03)3' 9Н20. С помощью теоретического анализа механизма реакции установлена наиболее вероятная структура мажорного продукта реакции, выделенного в индивидуальной форме из смеси диастереоизомеров и установлена наиболее вероятная 4'R, 3'S, l'R - конфигурация хиральных атомов спироциклопентанового фрагмента - метил- или бензил- 3-оксо-3'-(хлорметил)-4'-(нитрометил)спиро[лупан-2(Г)-циклопентан]дигидробетулоната.

5. Выявлено существенное влияние С(2)-аллильного заместителя на стереохимию восстановления 3-кетогруппы 2-аллилзамещенных 3-оксолупанов. Найдены селективные восстанавливающие реагенты (NaBH4-CeCl3' 7Н20 и L-селектрид), позволившие с высокой

селективностью (94-96%) получить 3ß-OH и За-ОН эпимеры 2-аллилзамсщенной бетулиновой кислоты.

6. На основе доступных растительных метаболитов (бетулин, бетулиновая кислота) впервые синтезированы ионные производные лупановых тритерпеноидов с липофильным мембранопроникающим трифенилфосфониевым фрагментом. В испытаниях in vitro фосфониевые соли по противоопухолевой активности значительно превзошли бетулиновую кислоту и рекомендованы для углубленных фармакологических исследований в качестве противоопухолевых лекарственных средств.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, JIM. Халилов, В.Н. Одиноков. Синтез новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными заместителями в кольце А и изучение in vitro их противовоспалительных и цитоксических свойств. И Известия Академии наук, Серия химическая. 2011. - Т. 60 - №4. - С. 694-701.

2. A.Y. Spivak, E.R. Shakurova, D.A. Nedopekina, S.L. Khursan, M.Y. Ovchinnikov, L.M. Khalilov, V.N. Odinokov. The first synthesis of spirocyclopentyl derivatives of lupane triterpenoids by radical nitrocyclization of C-2-diallyl substituted betulonates. // Tetrahedron Letters. 2012. - T. 53 - № 2. - C. 217-221.

3. А.Ю. Спивак, Д.А. Недопекина, Э.Р. Шакурова, P.P. Халитова, P.P. Губайдуллин, В.Н. Одинаков, У.М. Джемилев, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, С.А. Станкевич, Е.В. Короткая, В.А. Хазанов. Синтез лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами и изучение их противоопухолевой активности. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2013.-№1.-С. 189-200.

4. А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, В.Н. Одиноков. Способ получения метилового эфира 3-оксо-3'-(нитрометил)-4'(хлорметил)-спиро[лупан-2,Г-циклопентан]-28-овой кислоты. // Патент РФ № 2448975. - Б.И. - 2012. - № 12.

5. А.Ю. Спивак, P.P. Халитова, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, P.P. Губайдуллин, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, С.А. Станкевич, В.А. Хазанов. Трифенилфосфониевые соли лупановых тритерпеноидов, способ получения и применение в качестве противоопухолевых веществ. // Заявка № 2012144231 (положительное решение от 18.03.2013).

6. Д.А. Недопекина, Э.Р. Шакурова, А.Ю. Спивак, В.Н. Одиноков. Синтез новых аналогов бетулоновой кислоты содержащих гемм-диаллильный и спироциклопентановый фрагменты в кольце А. // Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы химии. Теория и практика». - Уфа. - 2010. С. 83.

7. ДА. Недопекина, А.Ю. Спивак, P.P. Халитова, Э.Р. Шакурова. Синтез новых производных бетулоновой кислоты с аллильными заместителями в кольце А. // XIV Молодежная конференция по органической химии. - Екатеринбург. - 2011. - С. 435.

8. E.R. Shakurova, A.Y. Spivak, D.A. Nedopekina, A.N. Ivanova, N.V. Belska, V.P. Belsky. Synthesis and avaluation in vitro of antiinflammatori and cytotoxicity activity of new derivatives lupane triterpenoids with allyl substituents in the A-ring. // International Conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine». - Sant-Petersburg -

2011.-P. 189.

9. Д.А. Недопекина, А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, P.P. Халитова. Первый синтез фосфониевых солей лупановых тритерпеноидов как потенциальных противоопухолевых агентов // XVМолодежная школа-конференция по органической химии. - Уфа. - 2012. -С. 61.

10. Д.А. Недопекина, А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, P.P. Халитова. Синтез новых митохондриально-направленных производных бетулиновой кислоты // Всероссийская научная конференция «Органическая химия: химия и технология». - Екатеринбург. -

2012. - С. 68.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Недопёкнна Дарья Александровна СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ С(2)-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ ЛУПАНОВОГО РЯДА

02.00.03 - Органическая химия

Отпечатано в типографии ГОУ ВПО «Бащгосмедуниверситет РОСЗДРАВА» 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3 Лицензия №0177 от 10.06.96 г.

Подписано в печать 18.06.2013 г. Отпечатано на ризографе. Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-изд.л.1,5. Тираж 140 экз. Заказ №232.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Недопёкина, Дарья Александровна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИИ И КАТАЛИЗА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201361185 На правах рукописи

НЕДОПЁКИНА ДАРЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

02.00.03 - Органическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник Спивак Анна Юльевна

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список принятых сокращений.............................................................4

Введение.........................................................................................6

Глава 1. Литературный обзор. Синтез и изучение противоопухолевых свойств бетулина, бетулиновой кислоты и их производных.................И

1.1.Синтез и противоопухолевая активность бетулиновой кислоты........................................................................13

1.2.Синтез и противоопухолевая активность С(3)- и С(28)-производных бетулина и бетулиновой кислоты ....................................................................................17

1.3.Синтез и противоопухолевая активность тритерпеноидов лупанового ряда с модифицированной структурой кольца А..................................................................................35

1.4.Синтез и противоопухолевая активность тритерпеноидов лупанового ряда с модифицированным изопропенильным фрагментом...................................................................46

1.5.Синтез и противоопухолевая активность тритерпеноидов лупанового ряда с модифицированной структурой кольца Е..................................................................................49

Глава 2. Обсуждение результатов......................................................54

2.1.Синтез новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными заместителями в кольце А................................54

2.2.Синтез спироциклопентильных производных лупановых тритерпеноидов радикальной нитроциклизацией С-2-диаллильных эфиров бетулоновой кислоты............................59

2.3.Синтез лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами как потенциальных противоопухолевых агентов...........................................................................66

2.4.Исследование цитотоксической активности синтезированных

соединений....................................................................70

Глава 3. Экспериментальная часть.................................................73

ЗЛ.Синтез новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными заместителями в кольце А.............................74

3.2.Синтез спироциклопентильных производных лупановых тритерпеноидов..............................................................83

3.3.Синтез лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами.................................................................85

Выводы....................................................................................106

Литература................................................................................108

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АС2О - уксусный ангидрид Bu' - mpem-бутил CDI —1,1 '-карбонилдиимидазол CDT -1,1 '-карбонил-ди( 1,2,4-триазол) DBU - 1,5-диазабицикло[4,3,0]нон-5-ен DCC - дициклогексилкарбодиимид DDQ - 2,3-дихлор-5,6-дицианобензохинон DMAP - 4-диметиламинопиридин DME — диметоксиэтан HOBt - N-гидроксибензотриазол (iPr)2NH - диизопропиламин LDA - диизопропиламид лития ш-СРВА — метахлорнадбензойная кислота MsCl - метансульфонилхлорид NBS - N-бромсукцинимид PPTS - пиридиний-4-толуолсульфонат TEMPO — (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил ТНР - тетрагидропиран TRIS - трисгидроксиметиламинометан

АПОПТОЗ — генетически запрограммированная гибель клетки CD95/Fas - рецептор клеточной гибели (рецептор «смерти»), экспрессирующий на поверхности мембраны клетки

TNF - фактор некроза опухоли, многофункциональный противовоспалительный цитокин, активирующий ядерный

транскрипционный фактор NF-kB

NF-kB - ядерный транскрипционный фактор, модулирующий продукцию белков иммунного ответа на физические и химические раздражители (радиация, окислительный стресс), инфекционные агенты (бактерии, вирусы, паразиты), сигнальные молекулы (гормоны, цитокины)

FADD - молекула-адаптор, Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (Fas-associated protein with death domain)

BcI-2 - семейство белков, регулирующих проницаемость мембран митохондрий: антиапоптотическая группа белков - Bcl-2, Bcl-X, Мс1-1, проапоптотическая группа белков - Bax/Bak, ВНЗ

р53 (белок р53) - транскрипционный фактор, выполняющий функцию супрессора образования злокачественных опухолей (антионкоген). При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется. Результатом активации является остановка клеточного цикла и репликации ДНК; при сильном стрессовом сигнале - запуск апоптоза

Цитохром С, AIF - апоптогенные факторы, которые при определенной проницаемости мембран митохондрий дислоцируются из митохондрий- в цитозоль и активируют сигнальные молекулы апоптоза, в частности каспазу-9

Топоизомеразы (ДНК-топоизомеразы) - ферменты, катализирующие превращение топологических изомеров ДНК друг в друга, контролирующие уровень суперскрученности ДНК

МТТ-тест - основан на восстановлении бесцветной соли тетразолия (бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, МТТ-реагент) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана в ДМСО, количество которого измеряется спектрометрически. Снижение показателя оптической плотности в пробах по сравнению с контрольным опытом свидетельствует о цитотоксическом действии вещества.

ВВЕДЕНИЕ

Нативные пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда (бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты) составляют важный класс биологически активных соединений с широким спектром биологического и фармакологического действия. Особый интерес к этим соединениям вызван их противоопухолевыми и противовирусными свойствами [1-6]. В 1995 году было обнаружено, что бетулиновая кислота проявляет цитотоксичность по отношению к меланоме человека путем индукции апоптоза раковых клеток (ЕБ5о 1.1-4.8 мкг/мл) [7, 8]. Впоследствии появились сообщения о противоопухолевой активности этого природного соединения по отношению к другим типам злокачественных клеток. На сегодняшний день бетулиновая кислота находится в стадиях 1/11 клинического исследования в качестве препарата для лечения синдрома диспластического невуса.

Бетулиновая кислота и ее некоторые синтетические производные относятся к группе противораковых веществ - «митоканов», биологической мишенью которых являются митохондрии [9, 10]. Митоканы дестабилизируют митохондрии и индуцируют апоптоз раковых клеток (не затрагивая нормальные клетки) независимо от их р53-статуса. В работах, посвященных изучению механизма противоопухолевого действия бетулиновой кислоты, убедительно показано, что она способствует накоплению в митохондриях активных кислородсодержащих частиц. Продуцирование в больших концентрациях свободных радикалов ведет к увеличению проницаемости или к разрыву мембран митохондрий с последующим высвобождением в цитозоль проапоптозного медиатора -цитохрома С, активацией каспаз и фрагментацией ДНК [8, 11, 12].

веществ в клинической практике. В связи с этим в последние несколько десятилетий проводятся интенсивные исследования по синтезу производных бетулина и бетулиновой кислоты путем модификации функциональных групп при атомах углерода С(3) и С(17). Исследования привели к получению новых лекарственных агентов, которые по своей противоопухолевой и противовирусной активности превзошли бетулиновую кислоту [3, 5, 6]. Не менее перспективными представляются трансформации, направленные на структурную модификацию кольца А в лупановых тритерпеноидах. В литературе описаны методы получения и биологические свойства диосфенолов, А-секопроизводных бетулиновой кислоты и их ангидридов [1, 13], а также группы соединений с 1,3-еноновым фрагментом в кольце А, в которых атом углерода С(2) связан со стерически небольшими электроно-акцепторными группами (CN, Cl, СНО) [14-16]. Эти С(2)-функционализированные производные бетулиновой кислоты проявили более сильную цитотоксическую активность по сравнению с бетулиновой кислотой и действовали как эффективные ингибиторы продуцирования оксида азота в активированных макрофагах.

В связи с этим, разработка эффективных методов синтеза новых производных тритерпеноидов лупанового ряда и изучение их противоопухолевой активности является актуальной и практически важной задачей.

Цель исследования заключалась в получении новых С-2 функционализированных производных лупановых тритерпеноидов как потенциальных противоопухолевых агентов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

генерированных из бетулоновой, дигидробетулоновой кислот и 3-оксомодифицированного бетулина;

• изучить in vitro цитотоксическое действие лупановых тритерпеноидов с фрагментом трифенилфосфоний-катиона.

Работа выполнена в соответствии с планами НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии наук по теме «Направленные трансформации природных и синтетических токоферолов, тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов», № Госрегистрации 01201168019 в 2011-2013 гг., а также при поддержке грантов РФФИ № 10-03-00105 (2010-2012) «Дизайн и синтез гетеродимерных и (поли)амидамин (РАМАМ) дендримерных конъюгатов токоферолов и тритерпеноидов в качестве новых современных лекарственных средств»; № 12-03-97005-а (2012) «Новые митохондриально-направленные производные токоферолов и пентациклических тритерпеноидов: синтез и изучение in vitro их противовоспалительных и противоопухолевых свойств»; программ фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах РАН: «Медицинская и биомолекулярная химия», проект «Синтез и исследование цитотоксических и противовоспалительных свойств новых производных лупановых терпеноидов с модифицированным кольцом А и их конъюгатов с токоферолами» (2011) и «Медицинская химия: молекулярный дизайн физиологически активных соединений и лекарственных преператов», проект «Синтез митохондриально-

направленных ионных производных бетулиновой и урсоловой кислот как новых противоопухолевых агентов» (2012).

В представленной работе впервые осуществлено селективное аллильное а-алкилирование енолятов и енокситриэтилборатов калия, генерированных из 3-кетолупанов (бетулоновая, дигидробетулоновая кислоты, 3-оксомодифицированный бетулин) под действием Ви'ОК или KN(SiMe3)2-Et3B и бромистого аллила. В результате, с высоким выходом получены новые С(2)-моноаллил- и С(2)-диаллилзамещенные производные лупановых тритерпеноидов, доступные в качестве ключевых строительных блоков для дальнейших трансформаций.

Впервые радикальной циклизацией 1,6-гексадиенового фрагмента в 2,2-диаллилзамещенных метил- или бензилбетулонатах, инициируемой Ре(Ы0з)з"9Н20, синтезированы спироциклические соединения, в которых кольцо А лупанового тритерпеноида в C-2-положении спиросочленено с вицинально замещённым 4-нитрометил-З-хлорметилциклопентаном. На основе результатов квантово-химической оценки энергетических характеристик реакции определена наиболее вероятная 4'R, 3'S, l'R -конфигурация хиральных атомов спироциклопентанового фрагмента в 4'-(нитрометил)-3'-(хлорметил)спиро[лупан-2( 1 ')-циклопентане] - основном диастереомере, выделенном в индивидуальном виде для каждого из эфиров (метилового и бензилового).

Разработаны эффективные способы синтеза и впервые синтезированы ионные производные лупановых тритерпеноидов, содержащие в качестве заместителя липофильный мембранопроникающий трифенилфосфониевый катион. В испытаниях in vitro на двух видах опухолевых клеток (мастоцитома Р-815 и Карцинома Эрлиха) все синтезированные фосфониевые соли по противоопухолевой активности значительно (40-50 раз) превзошли бетулиновую кислоту. Ионные производные лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами, проявившие при первичном скрининге высокую цитотоксическую активность по сранению с

бетулиновой кислотой, представляют интерес в качестве потенциальных митохондриально-направленных противоопухолевых агентов и рекомендованы для углубленных фармакологических исследований.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Одинокову Виктору Николаевичу за постоянное внимание, консультации и неоценимую помощь на всех этапах выполнения данной работы.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ БЕТУЛИНА, БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ.

Исторически, природные продукты остаются богатейшим источником соединений, которые находят применение в разных областях медицины, фармацевтики и биологии. В противораковой терапии доминирующая роль природных веществ следует из того факта, что 74% современных противоопухолевых лекарственных препаратов были выделены из природных источников, получены структурной модификацией природных соединений, или природные вещества использовались в качестве моделей в дизайне и полном синтезе новых противоопухолевых агентов [17-19]. Природные продукты, выделенные из растительного сырья, морской флоры или микроорганизмов, отличаются огромным структурным разнообразием и высоким биологическим потенциалом. Благодаря этим качествам исследователи традиционно выбирают природные молекулы в качестве структур-лидеров, которые оптимизируют в терапевтически пригодные вещества с высоким фармакологическим потенциалом и незначительными побочными эффектами. Синтетические трансформации соединений-лидеров в комплексе с исследованиями по высоко-производительному скринингу, комбинаторной химии, компьютерной химии и молекулярной биологии ускоряют процесс открытия современных противораковых лекарственных средств.

В ряду эффективных противоопухолевых средств растительного происхождения, активно используемых в настоящее время в клинической практике, следует отметить следующие группы соединений: алкалоиды барвинка розового (винкаалкалоиды — винбластин, винкристин и их полусинтетические производные, такие как виндезин и винорелбин); дитерпены (терпеноиды), выделенные из коры тисового дерева (таксаны -паклитаксел и доцетаксел); полусинтетические производные

подофиллотоксина, выделенного из кустарника подофилла щитовидного (этопозид и тенипозид); камптотецины - полусинтетические производные алкалоида камптотецина, выделенного из стеблей кустарника Camptotheca acuminata. Противоопухолевое действие винкаалкалоидов и таксанов обусловлено их антимитотической активностью, направленной на микротрубочки клеток. Этопозид и тенипозид относятся к ингибиторам топоизомераз, в частности топоизомеразы И, камптотецины также являются ингибиторами топоизомераз, но в отличие от подофиллотоксинов ингибируют топоизомеразу I [18].

Многие другие природные вещества активно исследуются в качестве потенциальных цитотоксических агентов, среди которых пентациклические тритерпеноиды вызывают большой интерес, как соединения, показавшие обнадеживающие результаты в доклиническом исследовании. Пентациклические тритерпеноиды содержатся в природных источниках в изобилии. Они проявляют различные биологические свойства, из которых наиболее интересны противовирусные, противовоспалительные, противомикробные и самое главное - противоопухолевые свойства. Бетулиновая кислота и другие нативные тритерпеноиды лупанового типа известны более века, однако только в 1995 году в работе Pisha с сотрудниками впервые была обнаружена селективная цитотоксичность бетулиновой кислоты против меланомы человека MEL-1. К настоящему времени для бетулиновой кислоты и ее многочисленных производных выявлена in vitro противоопухолевая активность в отношении различных линий опухолевых клеток.

В данном обзоре освещаются только те работы, в которых структурные модификации бетулина и бетулиновой кислоты, используемых в качестве соеди