Синтез и свойства анионных полиэлектролитов, содержащих фрагменты аминокислот и наноструктурирующих белков капсида ВИЧ

Карасева, Екатерина Николаевна

Синтез и свойства анионных полиэлектролитов, содержащих фрагменты аминокислот и наноструктурирующих белков капсида ВИЧ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Карасева, Екатерина Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и свойства анионных полиэлектролитов, содержащих фрагменты аминокислот и наноструктурирующих белков капсида ВИЧ»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и свойства анионных полиэлектролитов, содержащих фрагменты аминокислот и наноструктурирующих белков капсида ВИЧ"

'Яа правах_пуъописи

Уг

КАРАСЕВА Екатерина Николаевна

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА АНИОННЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТЫ АМИНОКИСЛОТ И НАНОСТРУКТУРИРУЮЩИХ БЕЛКОВ КАПСИДА ВИЧ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-2 ДЕК 2010

Москва - 2010

004614553

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза им. А. В. Топчиева РАН и Исследовательском центре биомодуляторов и лекарственных соединений Научно-инновационного фонда Здоровья

Научные руководители: доктор химических наук

Сербии Александр Владимирович кандидат химических наук Черникова Елена Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Щтильман Михаил Исаакович доктор химических наук, профессор Маковецкий Кирилл Львович

Ведущая организация: Московская государственная академия

тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 16 » декабря 2010 г. в \ Ц часов на заседании диссертационного совета Д 002.234.01 в ИНХС РАН по адресу 119991, ГСП-1. Москва, Ленинский проспект, 29, конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИНХС РАН.

Автореферат разослан « 16 » ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия особое внимание исследователей привлекают физиологически активные синтетические полиэлектролиты, имитирующие структуры природных биополимеров. С одной стороны, они представляют собой удобные экспериментальные модели для изучения макромолекулярных объектов «живой» природы и познания основ биологических форм жизни; с другой - являются ориентиром развития химии полимеров в направлении создания новых гибридных макромолекулярных систем, сочетающих структурные и функциональные возможности природных и синтетических полимеров. Это открывает новые перспективы в актуальных областях биотехнологии и медицины.

К полимерам такого рода относят чередующийся циклосополимер малеинового ангидрида (МАН) с дивиниловым эфиром (ДВЭ) состава 2:1 (ДВМА) и его производные:

Кислотно-анионные гидролизаты (2=0Н) ДВМА являются имитаторами чередующейся организации остова нуклеиновых кислот (без имитации генетического кода боковых нуклео-тидных групп) и обладают свойством активировать реакции противовирусного иммунитета. Модификация боковых групп 2 ДВМА вирус-распознающими «векторами», включая полипептидные фрагменты рецепторов клеток человека, позволила создать физиологически активные полимеры, уникальность которых заключается в сочетании свойств иммуностимуляторов с функциями прямого узнавания-блокады вирусных нанообъектов.

В развитие этих исследований данная работа акцентирована на актуальной проблеме синтеза новых потенциальных ингибиторов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на основе макромолекул ДВМА, содержащих сульфокислотные имитаторы активных центров рецепторов клеток и фрагменты структурообразующих белков самого вируса.

Следует отметить, что высокомолекулярный ДВМА (при ММ > 2x104) и его производные токсичны. В этой связи, другой актуальной задачей явилась разработка эффективных методов синтеза узкодисперсных сополимеров ДВМА с невысокой ММ.

Цель работы - разработка методов контролируемого синтеза циклосополимера дивинилового эфира и малеинового ангидрида заданной ММ и его направленная модификация аминосульфокислотными имитаторами активных центров клеточных рецепторов и фрагментами наноструктурирующих вирусных белков (на примере

ДВМА

матриксиого белка капсида1 ВИЧ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать закономерности радикальной чередующейся сополимеризации МАН и ДВЭ в присутствии агентов обратимой передачи цепи (ОПЦ) - бензилдитиобензоата и дибензилтритиокарбоната: изучить влияние агента ОПЦ на структуру сополимера и возможность контроля молекулярно-массовых характеристик сополимеров. Найти условия синтеза и выделения полимерных продуктов, при которых полностью сохраняются ангидридные группы для прививки аминореагентов.

2. Синтезировать пептидные фрагменты матриксного белка ВИЧ (ответственные за наносборку вирусного капсида) с регулируемым положением вдоль пептидной цепи одной незащищенной аминогруппы, предназначенной для прививки к ангидридным звеньям сополимера.

3. Осуществить синтез гибридных макромолекул на основе ДВМА, пептидных фрагментов матриксного белка ВИЧ и аминосульфокислотных имитаторов активных центров ВИЧ-восприимчивых рецепторов клеток человека.

4. Провести модификацию всех продуктов в кислотно-солевые растворимые формы, бносовместимые с клеточными культурами и пригодные для биологических испытаний на противовирусную активность.

Кроме того, по мере готовности результатов биологических испытаний (выполнение которых не входило в компетенцию диссертанта) предполагалось провести анализ соотношений «химическая структура - биологическая активность» для полученных продуктов.

Научная новизна. Новизна исследований радикальной сополимеризации МАН и ДВЭ заключается в том, что впервые с использованием метода ОПЦ удалось синтезировать узкодисперсные сополимеры ДВМА заданной ММ в интервале 103 - 104, сохраняющие реакционные центры псевдоживой полимеризации. Полученные продукты охарактеризованы методами спектрометрического анализа (ЯМР, ИК, УФ), ГПХ и вискозиметрии.

Выполнен синтез ранее не описанных полипептидов (и их флуоресцентно-меченных производных) протяженностью 15-33 аминокислотных остатков, имитирующих регион от 2-й до 4-й спирали матриксного белка капсида ВИЧ. Молекулярный дизайн полипептидов в форме мопоаминореагентов, удобных для прививки к ангидридным группам, позволил осуществить синтез новой генерации производных ДВМА полианион-полипептидной структуры. В результате пептидной и аминосульфокислотной модификации ДВМА получено и подготовлено для биологических исследований более 30 новых полимерных субстанций.

1 Капснд (от латинского «сарБа» - вместилище) - белковая оболочка вируса, предохраняющая его нуклеиновую кислоту от внешних воздействий.

Практическая значимость. В ряду синтезированных продуктов выявлены соединения с уникально высокой комбинированной активностью против ВИЧ и цитомегаловирусной инфекции (фактора и ко-фактора СПИД), которые представляют прямой практический интерес в качестве основы для разработки препаратов противовирусной защиты от ВИЧ/СПИД.

Полученные макрореагенты: ангидриды ДВМА с реакционными центрами псевдоживой полимеризации и полипептиды могут быть использованы для комбинаторно-направленного синтеза новых макромолекул регулируемой структуры (блок-, градиентых и привитых сополимеров), а также самоорганизующихся супрамолекулярных систем.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях молодых ученых: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010), «Современные проблемы полимерной науки» (Санкт-Петербург, 2009); научной конференции ИНХС РАН (Москва, 2009), международной конференции по противовирусным исследованиям (Майями Бич, США, 2009), европейском полимерном конгрессе (Грац, Австрия, 2009), международной конференции по передовым материалам (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2009), Всероссийской Каргинской конференции (Москва, 2010), международной конференции по иерархически структурированным полимерам (Гаргнано Лаго ди Гарда, Италия, 2010).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 печатных работах, из них 7 публикаций в рецензируемых журналах и 17 - в сборниках тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов и их обсуждения (глава 2), экспериментальной части (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы (^^наименований). Диссертация изложена на 435" страницах, содержит 10 таблиц и Я ?• рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава!. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 содержит анализ литературных данных о методах синтеза анионных полиэлектролитов на основе сополимеров МАН, их физиологической активности в зависимости от состава, структуры и ММ, методах регулирования ММ, и известных направлениях модификации данной группы сополимеров в целях разработки противовирусных препаратов. Сделаны выводы о перспективности ДВМА в качестве платформы для создания ингибиторов ВИЧ-инфекции, необходимости разработки методов эффективного контроля ММ, а также целесообразности модификации сополимера аминосульфокислотами и полипептидными фрагментами белков капсида ВИЧ.

Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ;ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Предмет и объекты исследования

В соответствии с поставленными задачами экспериментальная работа бьша разбита на

три этапа (рис. 1): 1) разработка методик синтеза ДВМА с использованием классической

передачи цепи (1), обратимой передачи цепи (2) и (3), а также синтеза блок-сополимера (4);

2) полипептидный синтез (5); 3) модификация ДВМА путем прививки аминореагентов

2г) к ангидридным группам сополимера с последующим гидролизом остаточных

ангидридных звеньев в кислотно-анионные и солевые производные (.?з) (6). В ходе реакций

(1) - (6) получено девять типов полимерных продуктов (ИХ).

Этап 1. Синтез полиангидридов с использованием радикальной циклосополимеризации МАН иДВЭ в присутствии агентов передачи цепи.

лю

0*0*0 млн

Длк (1) в XББ

(2) X БК

О^Ло 5

(3)

ДЛоЛ° ...

>|ДАК'Я0

ДЛоЛо 6 6 ^ХЛо

СН,Р1, IV

СоЗ-ои

"Ч

Этап 2. Синтез полипептидных моно-аминореагентов для прививки к ДВМА

Аминокислотные н,»—<сщ4

реагенты, -► . сн

флуоресцентные ®

метки т- - CHICO-H■JQNHCSNH(CH2)6CO—

Этап 3. Модификация ДВМА полипептидами и/или аминосульфокислотами (2У с последующим гидролизом в апионио-солевые формы (2з).

Н оАЛо оАА

с«)

У—(ноос со ноос со ^ нг,= V

нг2 = , н;м—

РК3 = НОМ, М-Н/N«/4

VI г=г3

VII г = г;+7, VIII г-г,«,

IX г=г,+г24

■БОзМ

Рис, 7. Этапы исследования.

Как следует из обзора литературы (глава 1), ранее был описан синтез сополимера I и его гидролизата VIt (Z = ОН); последний, имитируя линейно-полимерное чередование тетрагидрофурановых и кислотно-анионных структур остова нуклеиновых кислот, проявил биологическую активность имитатора (агониста) и некоторых свойств нуклеиновых кислот вирусов, искусственно стимулируя реакции противовирусного иммунитета (например, индукцию интерферона) [Merigan Т.С., Kapusla H.A., Кренцеяъ Б.А. и др.]. Известно также [Сербии A.B., Тимофеев И.В. и др.], что прививка к полимеру I пептидных фрагментов вирус-восприимчивых клеточных рецепторов (1-2 мол. %) перед завершающим гидролизом (2 = OH/Na, 98-99%) многократно усиливает противовирусную активность. Эти предпосылки послужили основанием для выбора ДВМА, в качестве основного объекта исследования, как «платформы» направленного синтеза потенциально физиологически активных полимеров, но с новым составом боковых групп. В данной работе вместо пептидных цепочек клеточных рецепторов к полимерному остову прививали сульфокислотные имитаторы активных центров этих рецепторов, а также полипептидные фрагменты матриксного белка самого вируса.

2.1. Радикальная цнклосополнмеризация малеипового ангидрида и дпвшшлового эфира в присутствии различных агентов передачи цяш

Мономеры и растворители очищали по стандартным методикам, инициатор - дшштрил азобисизомаслянной кислоты (ДАК) - перекристашшзовывали из метанола и сушили в вакууме до постоянного веса. ОПЦ-агенты - бензилдитиобензоат PliC(=S)SCH2Ph (ББ) и дибензилтритиокарбонат PhCH2S-C(=S)SCH2Ph (БК) - синтезировали и очищали по известным методикам, контролируя чистоту продуктов методами ПМР и хроматомасс-спектрометрии. Образцы для полимеризации готовили растворением рассчитанных количеств мономеров, инициатора и агента передачи цепи в выбранном растворителе. Растворы заливали в ампулы, и после дегазации ампулы отпаивали. Полимеризацию проводили при 60, 70 и 80°С. Полимеры выделяли осаждением в сухой диэтиловый эфир, промывали безводным бензолом, кипятили в эфире над СаНг в аппарате Сокслета и сушили в вакууме при 60°С до постоянного веса. Конверсию определяли гравиметрически. Типичные условия синтеза полимерных продуктов представлены в табл. 1. С учетом гидролитической лабильности МАН и его остатков в полимерной цепи все операции по очистке исходных реагентов, приготовлению реакционной смеси, выделению и очистке полимерных продуктов проводили в боксе в атмосфере сухого аргона или азота или в вакууме.

Элементный анализ выполняли на анализаторе CHNS-0 EAU08 (Carlo Erba

Instruments) с программным обеспечением «МультиХром-153»2. Спектры поглощения сополимеров записывали на спектрофотометре Сагу 50 Scan фирмы Varían и обрабатывали с помощью программного обеспечения Сагу Win UV Ver 3.0. ИК-спектры образцов в таблетках КВг в области 400-4000 см'1 регистрировали на вакуумном ИК-Фурье-спектрометре IFS-66-v/s фирмы Bruker2. ПМР спектры сополимеров в растворе (CDj^O (и их гидролизатов - в D2O) записывали на спектрометре MSL 300 фирмы Broker2. Молекулярно-массовые характеристики образцов в форме полунатриевых солей определяли методом ГПХ в 0.1 М водном растворе NaNCb по стандартам ПЭГ на жидкостном хроматографе "Waters", оборудованном колонкой Ultrahydrogel 1000 и рефрактометрическим детектором R1-4102. Характеристическую вязкость определяли при 30°С, используя вискозиметр типа Убеллоде, в растворе ДМФА для продуктов в ангидридной форме, и в водных растворах, содержащих 0.1 М ЫаЫОз, 1 М или 0.15 М NaCI или в боратном буфере (рН = 10.2), для продуктов в форме полунатриевых солей.

Таблица 1. Условия синтеза сополимеров ДВМЛ

Начальные концентрации (моль/л) Растворитель Температура (°С)

МАН ДВЭ ДАК БК ББ ТГФ

1.0 0.5 0.015 0 0 0.5 снсь 60

Ас20 60

2.0 1.0 0.003 0 0.03 0 ЦГН* 60 70 80

Ас20 60

МЭК'

2.0 1.0 0.003 0.03 0 0 ЦГН* 60 70 80

Ас20 60

МЭК'

2.0 1.0 0.003 0 0 0 ЦГН' 60 70 80

*ЦГН- цикяогексаноп, МЭК - метилэтилкетон.

2.1.1. Синтез сополимера ДВМА в присутствии ТГФ Ранее описанные в литературе примеры радикальной сополимеризации МАН с ДВЭ в различных растворителях в диапазоне температур 55-70°С без применения каких-либо специальных регуляторов ММ приводили к широко полидисперсным продуктам ДВМА М„/М„ = 3.1-9.0 [Butler G.B., Breslow D.S., Горшкова М.Ю. и др.]. Сообщалось о контроле ММ с помощью микродобавок воды в процессе сополимеризации в среде ацетона

2 Анализы выполнены на экспериментальной базе ИНХС РАН: элементный анализ выполнен н.с. Крутько Е.Б.; спектры ПМР сняты к.х.н., с.н.с. Филатовой М.П.; ИК-спектры получены в группе д.х.н., проф. Бондаренко Г. Н.; исследования методом ГТТХ проведены к.х.н., с.н.с. Талызенковым Ю. А..

[Волкова И.Ф. и др.]. Однако данный способ сопряжен с побочными реакциями гидролиза МАН, ангидридная активность которого ограничивает также использование традиционных агентов передачи цепи с подвижными атомами водорода, таких, как тиолы. В практике синтеза ДВМА медицинского назначения наибольшее распространение получило применение для передачи цепи добавок ТГФ. С учетом опыта предыдущих исследований первым шагом данной работы в поиске оптимальных условий синтеза ДВМА контролируемой ММ апробирована аналогичная методика использования ТГФ, как агента передачи цепи, но в среде хлороформа, а также при повышенных мерах защиты реакционной среды от примесей влаги.

Радикальная сополимеризация МАН и ДВЭ в присутствии ТГФ протекает с высокой скоростью (1-2 ч, 74-88%) и приводит к образованию сополимера с повторяющимся звеном МАН : ДВЭ = 2:1 (химической структуры 1). Показано, что добавление ТГФ приводит к снижению ММ и сужению ММР циклосополимера (М„/М„ = 1.40) по сравнению с продуктом сополимеризации (М^Мп = 5.42) в отсутствии ТГФ, что доказывает эффективность ТГФ как регулятора ММ.

2.1.2. Контролируемая радикальная сополимеризация малеиноеого ангидрида и дивинилового эфира в присутствии агентов обратимой передачи цепи При введении в свободно-радикальную (со)полимеризацию специального агента ОПЦ (АОПЦ) общей формулы 5=С(Х)-5У в реакционной системе наряду со стадиями инициирования и роста цепи появляются новые специфические реакции передачи цепи по механизму обратимого присоединения-фрагментации (рис. 2):

0 ¡'и +5=<р—3-У рост цени х ло,щ

рост цепи л

лши-ЛОГЩ

Рв-Э-С-в-У I

х Ы1

(У-Я-С-Б-Р,, X 1т 2

Ра-8—С=Б X

/ими-ЛОПЦ Р^-Я-С^Я X

лшш-АОГЩ

'•3

рост цепи + Рп 3 рост цели

(а)

(б)

Если -X = -Я-К, то

М + 5=С—З-Рц

рост цели

лши-АОПЦ

+ 5=С-5-Р„ : Я

рост цеп и |

Р»

тиш-ЛОПЦ2

Рп—3—С—Б—1'о ЯК 1м2

Ри—Я—С—8—Р« Я 1шЗ

Рп

Рй- Б—С—Э—Ри + К • М

тии-мнщ! к

люи-Аоацг

рост цепи + р"0

рост цени

(б')

(в)

Рис. 2. Схема обратимой передачи цепи по механизму присоединения-фрагментации.

Радикал роста Р„', возникающий при инициировании полимеризации за счет распада инициатора, обратимо присоединяется к ОПЦ-агенту с образованием радикального ннтермедиата Intl. Этот интермедиат может необратимо превращаться в полимерный ОПЦ: агент (поли-АОПЦ), отщепляя уходящую группу в виде радикала Y", реинициирующего полимеризацию мономера М (рис.2а). Полимерный ОПЦ-агент вступает в аналогичную реакцию взаимодействия с другим макрорадикалом, при этом образуется интермедиат /л<2, который может высвобождать один из полимерных заместителей в виде радикала, способного к полимеризации (рис. 26). Если в качестве ОПЦ-агента используется тритиокарбонат, то этот интермедиат распадается с отщеплением второй уходящей группы R' и в системе возникает новый полимерный ОПЦ-агент - поли-АОПЦ2 (рис.2б'). Последний также будет вовлекаться в последовательность реакций присоединения-фрагментации; независимо от пути распада возникающего при этом иктермедиата lnt3 в системе всегда регенерируется макрорадикал, способный к участию в реакции роста цепи (рис.2в). Конечным продуктом реакции является макромолекула, содержащая на конце (в случае ББ) пли в центре цепи (в случае БК) тиокарбонильную группу. Полимер, выделенный из реакции на любой стадии, и введенный в свежую порцию мономера и инициатора, сам будет выполнять функцию агента обратимой передачи цепи. За счет многократного повторения стадий обратимой передачи цепи макрорадикалы «оживают» и полимеризация приобретает черты «живого» процесса: наблюдается линейный рост среднечисловой молекулярной массы М„ с конверсией и сужение ММР продукта полимеризации

Влияние условий синтеза на скорость полимеризации и выход сополимера. В условиях классической радикальной циклосополимеризации скорость процесса понижалась в ряду растворителей: циклогексанон > МЭК > уксусный ангидрид (рис. За). Эта последовательность согласуется с увеличением полярности среды, препятствующей формированию между МАН и ДВЭ донорно-акцепторных комплексов, играющих существенную роль в реакции роста цепи [G. Butler]. При использовании циклогексанона реакционная смесь оставалась гомогенной вплоть до предельных конверсий мономеров, напротив, в растворе уксусного ангидрида наблюдалось выделение сополимера из раствора при конверсии выше 10%. Аналогичное явление, но менее выраженное, наблюдалось и в растворе МЭК.

При добавлении ББ к системе МАН-ДВЭ-ДАК наблюдается продолжительный индукционный период, который, вероятно, связан с образованием относительно стабильных радикальных интермедиатов Intl и Int2; он составляет 60 ч при проведении сополимеризации в уксусном ангидриде и 40 ч - в циклогексаноне. При увеличении температуры индукционный период уменьшается, что коррелирует с известным понижением

стабильности интермедиатов, а общая скорость процесса закономерно повышается (рис. 36). Однако предельные выходы сополимеров оставались низкими и не превышали ~Ю%.

При использовании в качестве ОПЦ-агента БК независимо от природы растворителя полимеризация протекает с высокой скоростью - не ниже, чем в классической радикальной сополимеризации в этих условиях (рис. Зв). Это коррелирует с меньшей стабильностью радикальных интермедиатов, образующихся с участием тритиокарбонатов.

(а) (6) (в)

Время, ч Время, ч Время, ч

Рис. 3. Зависимость конверсии от времени при сополимеризации МЛН и ДВЭ (а) [ДАЩ-ЗхКТ1 моль/л, 60РС в циклогексаноне (1), метилэтилкетоне (2) и уксусном ангидриде (3); (б) в присутствии ББ (3x10'2 моль/л) в ¡циклогексаноне при 60 (!), 70 (2) и 80°С (3); (в) в присутствии БК (Зх10>2 моль/л) при 6(РС в циклогексаноне (I), метилэтилкетоне (2) и уксусном ангидриде (3).

Как и в случае классической радикальной циклосополимеризации, реакционная смесь в растворе циклогексанона при ОПЦ-сополимеризации оставалась гомогенной вплоть до предельных конверсии мономеров. При сополимеризации в уксусном ангидриде в присутствии ББ расслаивания также не наблюдалось, что, вероятно, связано с низким выходом сополимера (5-10%). В аналогичных условиях в присутствии БК сополимер выделяется из раствора при конверсии выше 30%. Можно предположить, что увеличение конверсии, при которой происходит расслаивание реакционной смеси, по сравнению с классической радикальной сополимеризацией, обусловлено образованием продуктов с более низкой ММ.

Состав и структура сополимеров. По данным элементного анализа, ИК-, ПМР- и УФ-спекгроскопии состав сополимеров, полученных в классической и ОПЦ-сополимеризации соответствует соотношению остатков МАН и ДВЭ = 2:1 и структуре повторяющегося звена сополимеров 1-Ш, представленного на рис. I. В ПМР-спектрах (см., например, рис. 4) всех полученных образцов присутствуют пики, характерные для данного сомономерного звена и описанные ранее в литературе.

Рис. 4. 'НЯМР спектры сополимеров, полученных сополимеризацией АНН иДВЭ в растворе МЖ при 6СРС в присутствии БК и без пего.

ИК-спектры сополимеров, полученных классической и ОПЦ-сополимеризацией (рис.

5), также оказываются близкими.

Рис. 5. ИК-спектры сополимеров ДВМА, полученных в условиях: ¡о - классической и II, III -ОПЦ сополимеризации (в присутствии ББ и БК, соответственно), а таю/се спектр БК.

В частности, присутствие негидролизованных остатков МАН подтверждается дублетом наиболее интенсивных полос поглощения - при 1780 и 1860 см'1, относящихся к характеристическим полосам валентных колебаний С=0 в ангидридах карбоновых кислот.

На наличие в сополимере остатков МАН указывает также триплет интенсивных полос валентных колебаний ангидридной группировки -С(=0)-0-С(=0)- при 1240, 1080 и 940 см"'. Эти полосы перекрывают область ожидаемых, но существенно менее интенсивных, полос поглощения фуранового цикла, образуемого циклосочленением остатков ДВЭ с МАН (1180, 1060 и 900-910 см'1); к фурановому циклу может быть также отнесен мало интенсивный пик при 1450 см"1. Валентные колебания СНг и С-Н групп проявляются в области 2860-2980 см"1. Гидролиз ангидридных циклов сополимера в кислотные и кислотно-солевые производные регистрируется соответствующим смещением полос валентных колебаний С=0 в область 1720 см"1 (кислота) и 1580-1590 см*1 (соль), смещением валентных колебаний С-0 при 940 и 1240 см"1, соответственно, в область 1210-1230 и 1410-1440 см"1, а также снижением интенсивности поглощения С-О-С при 1080 см"1 и появлением интенсивного поглощения ОН (кислота) в области 2800-3700 см"1.

Полученные результаты доказывают, что введение ОПЦ-агента в сополимеризацию не влияет на состав и структуру повторяющихся звеньев циклосополимера по сравнению с классической радикальной сополимеризацией (см. рис. 1, соединения I - III).

Следует отметить, что сополимеры, синтезированные в присутствии ББ или БК и тщательно очищенные от исходных компонентов, по данным элементного анализа содержат серу. Кроме того, в спектрах ПМР (рис. 4) зарегистрированы сигналы протонов ароматических групп: 7.2 - 8.1 м.д. от стабилизирующей (фенильной в случае ББ) и уходящей (бензильной в случае ББ и БК) групп; в ИК-спектрах этих сополимеров удается наблюдать характеристические полосы, отвечающие ароматическим фрагментам исходных ОПЦ-агентов (рис. 5). Спектрофотометрический анализ полимеров в УФ-видимой области (200 - 600 нм) также позволяет идентифицировать фрагменты ОПЦ-агентов в структуре сополимеров: в спектрах продуктов, полученных в присутствии ББ, наблюдается полоса поглощения с максимумом при 495 нм, характерная для дитиоэфирных групп, а в случае БК - полоса с максимумом при 430 нм, типичная для тритиокарбокатов. Эти данные согласуются с общими представлениями о механизме ОПЦ (рис. 2) и подтверждают образование продуктов химической структуры II и III (рис. 1).

Молекулярно-массовые характеристики продуктов сополимеризации. Основным отличием псевдоживой радикальной полимеризации от классической является возможность контроля ММР полимеров, в частности получения узкодисперсных продуктов (Mw/M„ < 1.2). Как видно на рис. 6А, сополимер, полученный в присутствии БК, характеризуется существенно более узким ММР (М.А/М„ = 1.16), чем сополимер, полученный классической сополимеризацией (Mw/Mn = 1.56).

□ 0'

А-

•'X

о I о г

• з

• 4

• 5

о 6 О 7

Конверсия, X

Рис. б. Молекулярно-массовые характеристики сополимеров ДВМА:

А ■ Нормированные к единичной площади ГПХ-кривые сополимера, полученного в присутствии (I) ив отсутствие (2) БК при 60° С в растворе циклогексанона в течение 5 ч. Б - Зависимость среднечисленной степени полимеризации (Рг) от конверсии мономеров для сополимеров, полученных в присутствии БКв разных растворителях: уксусный ангидрид (1, 2), циклогексанон (3-5), метилэтилкетон (б, 7); методы определения Р„: элементный анализ на 5 (1, 3, 6), ЯМР (4, 7), УФ-спектрофотометрии (2, 5). Пунктиром обозначена теоретическая зависимость.

Однозначным доказательством псевдоживого механизма является линейный рост среднечисленной степени полимеризации Р„ с конверсией. На рис. 6Б приведены конверсионные зависимости Р„ сополимеров, полученных ОПЦ-полимеризацией в присутствии БК в разных растворителях. Видно, что независимо от способа определения Р„ и природы растворителя, использованного для синтеза, в широком интервале конверсии мономеров значения Р„ близки к теоретическим, рассчитанньм по уравнению: Р„ = Ч[М]о/[АОПЦ]о, где я - суммарная конверсия мономеров, [М]о - начальная концентрация мономеров, [АОПЦ]о - начальная концентрация ОПЦ-агента. Следовательно, введение БК в сополимеризацию МАН и ДВЭ действительно обеспечило «живой» характер процесса, что позволяет получать сополимеры с контролируемой ММ и узким ММР.

Псевдоживой характер процесса был независимо подтвержден в следующем эксперименте. Характеристическая вязкость продуктов ОПЦ-сополимеризации линейно возрастала с увеличением конверсии (рис. 7), что коррелирует с ростом Р„. Напротив, характеристическая вязкость сополимеров, полученных классической радикальной сополимеризацией, либо не изменялась, либо незначительно понижалась в ходе процесса.

Рис. 7.

Конверсионная зависимость характеристической вязкости сополимеров, полученных:

1-е присутствии БК,

2-е отсутствии БК, А- в растворе 1 МИаС1, Б-в боратном буфере

[Г|], дя/г

0,1

1 но

Конверсия, К

50 100

Конверсия, %

Аналогичные результаты были получены и в сополимеризации с участием ББ, однако в этом случае достичь высоких конверсий мономера не удалось.

Таким образом, в настоящей работе впервые предложен эффективный метод синтеза узкодисперсных (Mw/M„< 1.2) сополимеров ДВМА (II и III, рис. 1) с контролируемой ММ.

Возможности макромолекулярного дизайна на примере синтеза блок-сополимера. Наличие в полимерной цепи фрагментов ОПЦ-агента (-SC(=S)X), представляющих собой реакционные центры псевдоживой полимеризации, открывает новые возможности для макромолекулярного дизайна, в частности, для синтеза блок-сополимеров.

Полученный в присутствии БК сополимер оказался эффективным полимерным ОПЦ-агентом в гомополимеризации стирола. Полимерный ОПЦ-агент (3x10"2 моль/л) и ДАК (3x10'3 моль/л) растворяли в смеси стирола (1 моль/л) и циклогексанона, полимеризацию вели при 80°С в течение 3 суток, конверсия составила 30%. По окончании полимеризации реакционная смесь оставалась гомогенной. Отсутствие в составе полимерного продукта примесей гомополимера стирола доказано методом селективной экстракции: в отличие от полистирола (ПС) полученный сополимер полностью нерастворим в бензоле; этот результат однозначно доказывает отсутствие гомополимера ПС в продукте реакции. Включение звеньев стирола в полимерную цепь было подтверждено данными ЯМР- и ИК-спектроскопии. В спектре ПМР (рис. 8) отчетливо видны сигналы протонов ароматических групп: 7.2 - 8.1 м.д. В ИК-спектрах, наряду с характерными полосами поглощения ДВМА, проявляются четко разрешенные пики колебаний ароматических фрагментов ПС (700, 756, 1497 и группа пиков 3000-3100 см'1).

ДВМА ^пс^ ^ПС^ ДВМА

87654321 6, м.д. Рис. 8. 'Н ЯМР спектр синтезированного блок-сополимера.

Согласно механизму ОПЦ-полимеризации в присутствии симметричных тритиохарбонатов в конечном полимере активная тритиокарбонильная группа находится в центре цепи (рис. 2). При добавлении такого полимерного ОПЦ-агента к "чужому" мономеру образуется триблок-сополимер; при этом внедрение нового мономера происходит в середину цепи между атомом серы и концевым звеном полимерного заместителя.

В исследуемой системе образуется триблоксополимер следующего строения: ДВМА-ПС-ДВМА (IV, рис. I). По данным ЯМР мы оценили степень полимеризации полистирольного блока и суммарную степень полимеризации блоков ДВМА; они оказались близкими по значению и составляют 17+2.

Наличие в молекуле триблок-сополимера IV блоков ДВМА, содержащих ангидридные группы, позволяет использовать их, как и сополимеры ДВМА, для прививки новых функциональных групп или полимерных цепей и гидролиза в полианионные производные. В сочетании с гидрофобными блоками полистирола это означает образование амфифильных сополимеров, способных к самоорганизации, с новым потенциалом направленного формирования биологической активности.

Таким образом, важнейшим результатом первого этапа работы явилась разработка новых методов получения узкодисперсных сополимеров ДВМА с контролируемой ММ и их применение для создания новых гибридных полимеров в двух направлениях:

1) синтез амфифильных блок-сополимеров,

2) прививка боковых цепей по ангидридным группам с последующей конверсией неиспользованных ангидридных групп в кислотно-анионные производные,

2.2. Синтез полипсптндных фрагментов матриксного белка капсида ВИЧ в форме мопоаминореагеитов

На следующем этапе работы решалась задача направленного синтеза второй группы структурно-функциональных блоков (V, рис. 1) для построения целевых гибридных полимеров с повышенным потенциалом ингибирующей активности против ВИЧ.

Синтез осуществляли по принципу искусственной имитации полипептидной цепочки аминокислотной последовательности матриксного белка р17 капсида вируса. Имитировали последовательность аминокислот в том регионе биополимера (рис. 9А), который по литературным данным ответственен за взаимное узнавание и наноструктурирующую самосборку вирусных частиц. Пептидные цепи протяженностью от 15 до 33 аминокислотных остатков, воспроизводящие участки нативного белка в регионе от 2-й до 4-й спирали, были получены методом твердофазного синтеза с использованием Вое-стратегии. Синтез выполняли в проточном реакторе, снабженном системой свеллографического мониторинга

для непрерывной регистрации изменения объема пептидилполимера по методике, разработанной в Пущинском филиале ИБХ РАН [Родионов И.Л. и соавт.] на экспериментальной базе разработчиков.

1 мсаказуьзс СЕЬОКИЕКШ ьярссккои* ькштеАЭКЕ 41 ЬЕКРАУМРБЬ ЬЕТБЕССКе! ЬБдЬОРЗЬОТ БЗЕЕЬИЗЪУМ

81 Т1АУЬУСТН<2 ЯЮУКОТКЕА Ь0К1ЕЕЕ0ЫК ЗКККАООААА 121 БТСШЗОУЗО ЫУ

V6 V, V* V, V«

Рис. 9.

А - Схема полной аминокислотной последовательности3 природного белка рП капсида ВИЧ и участка, выбранного для имитации с помощью синтетических пептидов. Б - Структура синтезированных полипептидов

Синтез осуществляли таким образом, чтобы конечная пептидная макромолекула имела только одну незащищенную аминогруппу, предназначенную для присоединения к сополимерам ДВМА, полученным на первом этапе. Стерическую доступность этой группы усиливали тетраметиленовым мостиком (используя вместо аргинина остатки лизина). Расположение аминогруппы вдоль полипептидной цепи регулировали в процессе синтеза посредством заданных комбинаций защитных групп. Получали также и флуоресцентно меченные производные. Структура синтезированных полипептидов представлена на рис. 9Б;

3 Мономерные остатки аминокислот в полимерной цепи белка представлены принятым в биохимии однобуквенным кодом: А - аланин, С - цистеин, О - аспарагиновая кислота, Е -глутаминовая кислота, Р - фенилаланин, й - глицин, Н - гистидин, I - изолейцин, К - лизин, Ь - лейцин, М - метионин, N - аспарагин, Р - пролин, О - глутамин, в — серин, Т — треонин, К - аргинин, V - валин, \У - триптофан, V - тирозин.

Ас—К РАУЫРЗИЕТЗЕС С-ОН I

Ии'-Х-К р А V N Р Э Ь Ь Е Т Э Е й С-ОН

(СН2)„-МНг

где: -X-Пи*-

Ас—р АУМРОИ-ЕТБЕССКСП 1-ОН (СН2)4— 1ЧН2

Р1и«-Х-Р АУЫРСИЕТЗЕбСКО! [.-ОН (СН2)4-Ш2

Ас—К РАУ^ОИ-ЕТвЕвСКСП1-ОН (СН,)4— 1УН2 (СН2)4— ШАс

Р|и»-Х—К РА7ЫРС1-ЬЕТЗЕССКС11 1-ОН (СН2)4—1ЧН2 (СН2)4—ЫНАс

Ас—р AVNPGLLETSEGCKQILGQLQPSLQTGSEE I—ОН

(сн2и-1чн2

Ии«- X— Р А V N Р С I- I Е Т Э Е в С К О 11. е С! I- О Р Э 1- С! Т в Э Е Е 1-ОН (¿Н2)4—мн2

Ас—к РАУМРСИЕтзЕоскаасаюРЗьйтезЕЕ I,—он

(СН2)4—1«Н2 (СН2)4-ШАС

А<>-К РАУМРСИЕТбЕОСКОаСаЮРБЮТСЗЕЕ 1-ОН I I

(СН,)4— 1МН2 (Сн,)4— Ш-Пи«

ЫНС5ЫН(СН2)6СО—

шсв—

их чистоту доказывали методами хроматографического анализа и масс-спектрометрии (MALDI-TOF).

Таким образом, в результате второго этапа работы был выполнен направленный синтез серии ранее не описанных в литературе полипептидов (Vj-Vio) - имитаторов сайтов взаимного межмолекулярного узнавания и наноструктурирующей самосборки матриксного белка р17 капсида ВИЧ. Полипептиды получены в форме моноаминореагентов и их флуоресцентно-меченных аналогов с различным положением незащищенных аминогрупп, предназначенных для прививки к полиангидридам.

2.3. Синтез гнбрндных полиэлектролитов, содержащих сульфокислотные имитаторы рецепторов и (или) полипептидные фрагменты капсида ВИЧ

Третий этап работы (6, рис. 1) заключался в «химической сборке» гибридно-полимерных систем на основе полученных на предшествовавших этапах ангидридных (I-IV) и полипептидных (V = HZi) макрореагентов, а также аминосульфокислот (HZj). Синтезированные продукты подвергали гидролизу (HZ3) и очистке, при этом получали растворимые в водно-биологических средах гибридные анионные полиэлектролиты VI-IX (рис. 1).

Выбор аминокислот: HZ2 = иа^а-аминобензолсульфокислота или таурин (рис.1) обусловлен тем, что первая имитирует сульфатированные по тирозину центры связывания ВИЧ хемокиновыми рецепторами человека, а вторая - фрагменты гепарансульфатных рецепторов, восприимчивых к широкому спектру вирусов. Наряду с HZ2 в отдельных случаях использовали также 4-аминодиметилен-1,2-норборнен (HZ4) - синергнст противовирусной активности - из опыта предшествовавших работ [Сербии A.B. и др.] Прививка целевых аминореагентов к сополимерам малеинового ангидрида. Прививку к полимерным цепям ДВМА (I-IV) полипептидных V (HZi, рис. 9Б) и низкомолекулярных (HZ2, HZ4) аминореагентов осуществляли по реакции присоединения аминов к ангидридным группам (остатков МАН в сополимерах, рис.1). Соотношение прививаемых к сополимеру полипептидных ответвлений и боковых групп Z\ : Zi : Zi, а также суммарную степень модификации ангидридных групп регулировали соотношением соответствующих аминореагентов между собой и по отношению к числу ангидридных групп сополимера. Реакции проводили в безводной среде апротонных растворителей (ДМФА или ДМСО) при 50-55°С в течение 2-4 ч с последующей выдержкой реакционной смеси не менее суток при комнатной температуре (в условиях, предварительно отработанных на модельных соединениях). Продукты аминолиза выделяли осаждением в сухой диэтиловый эфир, примеси экстрагировали эфиром (или хлороформом), и предварительно очищенные образцы сушили в вакууме.

Гидролиз продуктов в кислотно-анионные формы и их солевые производные. Для получения растворимых в водных (физиологических) средах анионных форм синтезированные продукты подвергали исчерпывающему водному или водно-щелочному (в мягких условиях - в растворе бикарбоната натрия) гидролизу остаточных (неиспользованных для прививки аминореагентов) ангидридных групп в карбокси-кислотные и их солевые производные. Гидролиз проводили в инертной атмосфере, предотвращая риск побочных реакций окисления кислородом воздуха.

Очистка и получение полимерных субстанций для биологических испытаний. С учетом повышенных требований к чистоте тестируемых субстанций для биологических испытаний полученные гидролизаты подвергали тщательной очистке методом многоцикловой ультрафильтрации. Ультрафильтрацию выполняли в ячейках под избыточным давлением (2-3 атм.) азота, применяя мембраны с порогом проницаемости 1 kDa и 3 kDa, что позволяло удерживать целевые полимерные продукты над мембраной и удалять примеси, ковалентао не связанные с сополимером. Один цикл ультрафильтрации состоял из 10-кратного концентрирования < 0.2 мас.% раствора образца в бидистиллированной воде, что повышало степень очистки концентрата от примесей примерно на порядок. Для каждого полимерного образца проводили не менее 4-х циклов ультрафильтрации. Количество примесей контролировали спектрофотометрически. После заключительного цикла ультрафильтрации целевой продукт выделяли из водного концентрата лиофильной сушкой, получая быстрорастворимые в водных средах высокопористые порошки - «субстанции» - в наиболее удобной для биологических испытаний форме. Состав и чистоту конечных продуктов подтверждали данными элементного анализа, УФ-, ИК- и ПМР-спектрометрии.

Всего в рамках диссертационной работы подготовлено для биологических исследований более 30 опытных образцов (табл. 2).

2.4. Некоторые результаты биологических испытании и анализ соотношений «химическая структура - биологическая активность»

Из числа полученных к настоящему времени результатов биологического тестирования, наибольший интерес представляет уникально высокая комбинированная активность сульфокислотно-модифицированных образцов группы VII. Противовирусная активность была зарегистрирована как в отношении вируса иммунодефицита человека, так и цитомегаловируса (табл. 3).

В рамках поиска взаимосвязи «химическая структура - биологическая активность» важно отметить рост противовирусной эффективности полимерных продуктов VII по мере увеличения степени сульфокислотной модификации.

^сн о сн Таблица 2. Конечные продукты - образцы для биологических

^^ "у N—0 испытаний. 2 -регулируемые в процессе синтеза комбинации: \—(№ООС СО = -т- полипептид (ГгКя). = -Ш-Х-50,Ш, 2, = -ОД 24 = -Ш-

N¡,000 СО Ъ (СНз)2-корбориен, 2; = -№Н-(СН))гННС5КН-5-флуоресцеии

/ г

Код образца* Тип" Исходный Состав и соотношение боковых групп Z

конечного ДВМА Тип *** / мол. % от общего содержания Z

продукта Тип**/M„ Z, гг z3 Z, Z5

AS777h VI 1 / 8700 0 0 100 0 0

AS825 VI III / 4100 0 0 100 0 0

AS828 VI HI /6 200 0 0 100 0 0

AS831 VI III /8600 0 0 100 0 0

AS820 VII 1 / 8700 0 Т / 25.0 75 0 0

AS821 VII I / 8 700 0 Т / 50.0 50 0 0

AS822 VII I / 8 700 0 T / 75.0 25 0 0

AS823 VII 1 / 8 700 0 Т /100.0 0 0 0

AS824 VII 1 / 8700 0 Т / 98.5 0 0

AS677 VII 1 / 8 700 0 Т / 12.5 72 16 0

AS678 VII 1 / 8700 0 Т / 25.0 59 16 0

AS679 VII 1 / 8700 0 Т / 50.0 34 16 0

AS679-flu VII 1 / 3700 0 Т / 48.5 34 16

AS688 Vil 1 / 8 700 0 Б / 80.0 20 0 0

AS827 VII III /4100 0 Б /100.0 0 0 0

AS829 VII III /6 200 0 Б /100.0 0 0 0

AS830 VII III / 6 200 0 Б /100.0 0 0 0

AS832 VII Ш /8 600 0 Б / 50.0 50 0 0

AS833 VII III /8 600 0 Б /100.0 0 0 0

AS826 VII III /4100 0 Б / 50.0 so 0 0

AS800 VIH 1 / 8700 V, /1.5 0 98.5 0 0

AS800-flu VIII 1 / 8700 V2 /1.5 0 98.5 0 0

AS801 VIII 1 / 8 700 V, /1.5 0 98.5 0 0

AS801-flu VIII 1 / 8700 V, /1-5 0 98.5 0 0

AS803 VIII 1 / 8700 Vs /15 0 98.5 0 0

AS803-flu VIII 1 / 8700 V6 /1.5 0 98.5 0 0

AS802 VIII 1 / 8700 V, /1.5 0 98.5 0 0

AS802-flu VIH I / 8 700 V, /1.5 0 98,5 0 0

AS804 VIII 1 / 8 700 V, /1.5 0 98.5 0 0

AS804-flu VIII 1 / 8 700 V» /1-5 0 98.5 0 0

AS834 VIII III /8 600 V, /15 0 98.5 0 0

AS835 IX III /8 600 V, /1.5 Б / 48.5 50 0 0

AS836 IX III /8 600 V, /1.5 Б / 98.5 0 0 0

*Код регистрации субстанции в Исследовательском центре биомодуляторов и лекарственных соединений НИФ Здоровья в качестве «образца для биологических испытаний»,

**Тип сополимеров соответствует рис. 1; ***Тип привитого полипептида (¿¡) - см. рис.8, тип аминосульфокислоты (X<): Г - таурин (-Х- = -(СЩг), Б - парааминобеюолсулъфокислота (-Х- = -СеНг): тип Хз, Ха и - в заголовке к таблице.

С точки зрения биохимической мимикрии объяснением этому может служить повышение степени имитации синтетическими полимерами сульфокислотных центров вирус-распознающих хемокиновых и гепарансульфатных рецепторов клеток человека. С физико-химической точки зрения важно выделить: рост отрицательного заряда макромолекулы по мере сульфокислотной модификации, и, как следствие, разворачивание цепи полимера, т.е. увеличение эффективного радиуса макромолекулы и поверхности ее контакта с внешней средой.

Таблица 3. Противовирусная активность сульфокислотно-модифш\ированных сополимеров VII

Со< боко z2 )THomei зых груг мол.% z3 ние г 2*, Z4 Концентрация 50% цитотоксичности CCso, мкг/мл на клетках: Лимфобласты | Фибробласты = (конц. тс ВИЧ-1 Индекс селективности противовирусного действия ксичности) / {конц. противовир. эффективности) Цитомегэловирус человека

Лечебно-профил. Виру- Микро- Профи- Лечебно-цидно бицидно лэктически профил.

0 100 0 12 72 16 25 69 16 50 34 16 80 20 0 > 1 000 3 500 > 1 ООО 1 440 > 800 1 420 > 800 > 500 > 2 000 3 000 > 37 > 139 > 242 > 258 > 680 < 10 350 <10 <10 66 1 400 22 <10 355 1 400 189 < 10 >5000 >500 >91 <10 7 500 5 500 250 4 290

*Структура сополимера и химическая природа боковых групп 2 - в табл. 2 и на рис. 1.

Авторы, условия и результаты биологических испытаний подробно представлены в публикациях [1 -3]

Рост отрицательного заряда макромолекулы должен закономерно приводить к повышению эффективности электростатического связывания с противоионами, а поверхность вирусных частиц, как известно, характеризуется избытком положительного заряда. Конформационное разворачивание макромолекулы (экспериментально доказанное вискозиметрически в водных средах, близких к физиологическим, рис.10) также закономерно влечет за собой увеличение контактно-активной поверхности, что допускает повышение потенциала связывания (блокады) вирусных белков.

М г/дл

0,4

0,3

. ♦

0,2 ; а

■

ОД 1 1

▲ ■

о.з 0,2 0,1

0,4 0,3 0,2 0,1

о,з 0,2 ОД О

мол. % сулъфокислотпых групп среди боковых групп Z

Рис, 10. Зависимость характеристической вязкости сополимеров VII от степени модификации боковых групп 2 аминосулъфокислотой. Измерения выполнены при 37°С для трех физиологически значимых уровней рН: ♦ - рН = 5.5 (фосфатный буфер), ш - рН = 7.4 (изотопический раствор для инъекций% а - рН = 8.5 (боратный буфер), в ряду, различных по степени полимеризации групп полимерных образцов (табл. 2): А - Р„ = 33 (АЗ 777И, АЗ 820, АЗ 821, АЗ 822, АЗ 823, АЗ 824), Б - Л, = 32 (АЗ 831, АЗ 832, АБ 833), В -Р„ = 23 (АЗ 828, АЗ 829, АЗ 830) и Г - Р„ = 15 (АЗ 825, АЗ 826, АЗ 827).

Таким образом, анализ результатов испытаний на клеточных культурах in vitro в ряду аминосульфокислотно-модифицированных полимерных продуктов группы VII выявил высокоэффективные ингибиторы ВИЧ-инфекции (вирусного возбудителя СПИД), а также цитомегаловирусной инфекции человека (кофактора осложнений и летальных исходов при

иммунодефицитных состояниях). При этом обнаружена зависимость: «химическая структура - биологическая активность», проявляющаяся в росте противовирусной эффективности с увеличением сульфокислотной модификации.

Предварительные испытания в ряду впервые синтезированных полипептидов группы V также выявили соединения, активные против ВИЧ, подавляющие самосборку вирионов в ВИЧ-инфицированных клетках.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы направленного синтеза анионных полиэлектролитов в ряду производных сополимеров малеинового ангидрида с дивиниловым эфиром, содержащих аминосульфокислотные имитаторы активных центров вирус-распознающих рецепторов клеток человека и полипептидные фрагменты матриксного белка капсида ВИЧ. Исследованы степень полимеризации, спектральные характеристики, химический состав и строение новых полимерных продуктов, а также потенциал их противовирусной активности в зависимости от химической структуры и физико-химических свойств.

2. Впервые исследована радикальная чередующаяся циклосополимеризация малеинового ангидрида и дивинилового эфира в условиях обратимой передачи цепи. Показано, что строение повторяющегося звена циклосополимера, полученного в присутствии агента обратимой передачи цепи, не отличается от строения звена в цепи сополимера, синтезированного в условиях классической радикальной циклосополимеризации. Последовательное увеличение молекулярной массы сополимера с ростом конверсии, выход узкодисперсных продуктов, а также образование блок-сополимера при использовании полученного циклосополимера в качестве агента обратимой передачи цепи в полимеризации стирола однозначно доказывает протекание сополимеризации по псевдоживому радикальному механизму.

3. Впервые осуществлен синтез ряда полипептидных фрагментов матриксного белка р17 капсида ВИЧ в форме новых моноамино-макрореагентов, пригодных для прививки по ангидридным группам полученных циклосополимеров малеинового ангидрида и дивинилового эфира, а также их флуоресцентно-меченные производные.

4. Синтезированы новые водорастворимые гибридно-полимерные продукты на основе циклосополимера малеинового ангидрида и дивинилового эфира и регулируемых комбинаций аминосульфокислот и пептидных фрагментов матриксного белка ВИЧ.

5. В ряду синтезированных гибридных полимеров выявлены соединения, обладающие высокой комбинированной противовирусной активностью, как против ВИЧ, так и против цитомегаловирусной инфекции (фактора и ко-фактора СПИД).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ:

Публикации в реферируемых журналах:

1. Производные карбокси-миметиков полимерного остова нуклеиновых кислот, ингибирующие цитомегаловирус человека. 1. Микробицддный эффект in vitro / Сербии А. В., Карасева Е. Н., Федорова Н. Е., Павлова М. В., Климова Е. В., Леонтьева М. В., Кущ А. А. П Антибиотики и химиотерапия. - 2007. - Т. 52, № 11-12. -С. 8-13.

2. Противовирусная активность поликарбоксилатных соединений, модифицированных каркасно-углеводородными и сульфокислотными фармакофорами, при цитомегало-вирусной инфекции in vitro / Павлова М. В., Федорова Н. Е„ Сербии А. В., Егоров Ю. А., Карасева Е. Н., Климова Е. В., Кущ А. А. // там же - 2008. - Т. S3, № 7-8. - С. 8-14.

3. Влияние мембраноактивных полианионных соединений на различные стадии жизненного цикла цитомегаловируса человека в клетках in vitro / Павлова М. В., Федорова Н. Е., Сербии А. В., Климова Е. В., Карасева Е. Н., Голышев С. А., Поляков В. Ю., Кущ А. А. // тамже-2008.-Т. 53, К» 11-12.-С. 3-10.

4. HIV-1 Gag Matrix Protein Fragments and Polyacid Conjugates Designed for the HIV Inhibition/ Karaseva E., Serbin A., Rodionov I., Vasiliev A., Abramov V., Alikhanova О. H Antiviral Research. - 2009. - Vol. 82, № 2. - P. 59.

5. Macromolecular Basis for Microbicides Dual Protecting against HIV and Cytomegalovirus Infection / Serbin A., Karaseva E., Egorov Y., Dunaeva 1., Pavlova M., Kushch A. // Antiviral Research. -2009. - Vol. 82, № 2. - P. 66.

Доклады на конференциях:

1. Karaseva E. N., Dunaeva I. V., Neminuschaya Т. O. Free radical polymerization of maleic anhydride with vinylic monomers via reversible addition-fragmentation chain transfer process. I 5th Saint-Petersburg Young Scientists Conference «Modern Problems of Polymer Science», Saint-Petersburg, October 19-22, 2009, Abstract book. - P. 14.

2. Serbin A. V., Karaseva E. N., Tsvetkov V. В., Alikhanova O. L„ Rodionov I. L. Hybrid Polymeric Systems for Nano-Selective Counter Intervention in Virus Life Cycle // European Polymer Congress (EPF09): Abstr. (Graz, Austria, July 12-17, 2009). - P. 184.

3. Serbin A., Karaseva E., Chernikova E., Dunaeva I., Krutko E., Filatova M., Zezin A. Graft and RAFT Reactive Macro Reagents: 3. Bis-[copoly-(divinyl ether-alt-maleic anhydride)]-trithiocarbonate // ibid - P. 184.

4. Dunaeva I., Serbin A., Karaseva E., Chernikova E., Krutko E., Filatova M., Zezin A. Graft and RAFT Reactive Macro Reagents: 2. Copoly-(divinyl ether-alt-maleic anhydride)-dithiobenzoate //ibid-P. 258.

5. Карасева E. H., Дунаева И. В., Короткое С. Г. Чередующиеся сополимеры с ангидридными и тритиокарбонатными реакционными группами в основной цепи // «Ломоносов 2010» тезисы докл. XVII Междунар. науч. конф. студентов, аспираггтов и молодых ученых, секция «Химия», подсекция «Высокомолекулярные соединения» (Москва, 12-15 апреля 2010 г.). -Москва 2010. -№ 7628.

6. Дунаева И. В., Карасева Е. Н., Короткое С. Г., Крутько Е. Б., Талызенков Ю. А., Филатова М. П., Черникова Е. В., Сербии А. В. Обратимая передача цепи в синтезе сополимеров малеинового ангидрида и дивинилового эфира // «Полимеры-2010»: тезисы докл. V Всерос. Каргинской конф. (Москва, 21-25 июня 2010 г.). - Москва, 2010. -№ 284-1.

Подписано в печать:

09.11.2010

Заказ № 4469 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Карасева, Екатерина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Анионные полиэлектролиты на основе чередующихся 6 сополимеров малеинового ангидрида

1.1.1. Синтез, состав и строение.

1.1.2. Физиологическая активность

1.1.3. Молекулярная масса как фактор биофункционалъной активности и известные методы ее регулирования.

1.2. Направления модификации сополимеров малеинового ангидрида для усиления их противовирусной активности.

1.2.1. Мембранотропные производные.

1.2.2. Имитаторы вирус-распознающих клеточных рецепторов

1.2.3. Производные, содержащие фрагменты вирусных белков

1.3. Состояние проблемы конструирования ингибиторов ВИЧ-инфекции и постановка задач собственных исследований.

Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Радикальная циклосополимеризация малеинового ангидрида и дивинилового эфира в присутствии различных агентов передачи цепи.

2.1.1. Синтез сополимера в присутствии тетрагидрофурана

2.1.2. Контролируемая радикальная сополимеризация в присутствии агентов обратимой передачи цепи

2.2. Синтез полипептидных фрагментов матриксного белка капсида

2.2.1. Выбор региона искусственной имитации природного белка

2.2.2. Синтез полипептидныхмоноаминореагентов.

2.3. Синтез гибридных полиэлектролитов, содержащих аминосульфокислоты и (или) полипептидные фрагменты.

23Л. Прививка целевых аминореагентов к сополимерам малеинового ангидрида.

2.3.2. Гидролиз продуктов в кислотно-анионные формы.

2.3.2. Очистка и получение полимерных субстанций для биологическш испытаний.

2.4. Анализ результатов биологических испытаний и соотношений «химическая структура - биологическая активность»

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Радикальная сополимеризация

3.2. Полипептидный синтез

3.3. Синтез модифицированных сополимеров и подготовка субстанций для биологических испытаний

3.4. Методы анализа чистоты, состава и структуры продуктов

ВЫВОДЫ

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез и свойства анионных полиэлектролитов, содержащих фрагменты аминокислот и наноструктурирующих белков капсида ВИЧ"

В последние десятилетия особое внимание исследователей привлекают физиологически активные синтетические полиэлектролиты, имитирующие структуры природных биополимеров. С одной стороны, они представляют собой удобные экспериментальные модели для изучения макромолекулярных объектов «живой» природы и познания основ биологических форм жизни; с другой - являются ориентиром развития химии высокомолекулярных соединений в направлении создания новых гибридных макромолекулярных систем, сочетающих структурные и функциональные возможности природных и синтетических полимеров. Это открывает новые перспективы в актуальных областях биотехнологии и медицины [1-3].

Кислотно-анионные гидролизаты (£=ОН) ДВМА являются имитаторами чередующейся организации остова нуклеиновых кислот (без имитации генетического кода боковых нуклеотидных групп) и обладают свойством активировать реакции противовирусного иммунитета (см. главу 1, раздел 1.1.2).

Модификация боковых групп 2 ДВМА вирус-распознающими «векторами», включая полипептидные фрагменты рецепторов клеток человека, позволила создать физиологически активные полимеры, уникальность которых заключается в сочетании свойств иммуностимуляторов с функциями прямого узнавания-блокады вирусных нанообъектов (глава 1, раздел 1.2.2).

В развитие этих исследований данная работа акцентирована на актуальной проблеме синтеза новых потенциальных ингибиторов вируса

ДВМА иммунодефицита человека (ВИЧ) на основе макромолекул ДВМА, содержащих сульфокислотные имитаторы активных центров рецепторов клеток и фрагменты структурообразующих белков самого вируса.

Следует отметить, что высокомолекулярный ДВМА (при ММ > 2x104) и его производные токсичны (глава 1, раздел 1.1.3). В этой связи, другой актуальной задачей явилась разработка эффективных методов синтеза узкодисперсных сополимеров ДВМА с невысокой ММ.

Цель настоящего исследования - разработка методов контролируемого синтеза циклосополимера ДВМА заданной ММ и его направленная модификация аминосульфокислотными имитаторами активных центров клеточных рецепторов и фрагментами наноструктурирующих вирусных белков (на примере матриксного белка капсида1 ВИЧ).

1 Капсид (от латинского «саряа» - вместилище) - белковая оболочка вируса, предохраняющая его нуклеиновую кислоту от внешних воздействий.

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

выводы

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Карасева, Екатерина Николаевна, Москва

1. ' Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.:1. Химия, 1986.-296 с.

2. Кабанов В.А. От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам // Высокомолекулярные соединения Серия А. 2004. - Т. 46, № 5. - С. 759-782.

3. Штильман М.И. Полимеры в биологически активных системах // Соросовский образовательный журнал. 1998. - Т. 8, № 5. - С. 48-53.4/ Молдавский Б.Л., Кернос Ю.Д. Малеиновый ангидрид и малеиновая кислота. Л.: Химия, 1976. - 86 с.

4. Trivedy B.C., Culbertson В.М. Maleic anhydride. -NY-London: Plenum Press, 1982.

5. П.1 'Петрова Т.Л. Реакционная способность виниловых эфиров в реакциях чередующейся сополимеризации с малеиновым ангидридом //

6. Автореферат дисс. кхн: 02.00.06 Иркутск: ИИОХ АН СССР, 1988. -18 с.12. " Wagner-Jauregg Т. Über addierende Hetero-polymerisation // Berichte. 1930.

7. Vol. 63. № 11. P. 3213-3224.

8. Стоцкая Л.Л. Донорно-акцепторные комплексы в реакциях гомо- исополимеризации гетероатомных соединений. // Диссд.х.н.: 02.00.06-М., 1991 -319 с.

9. Dewar M .J.S., Pierini A.B. Mechanism of the Diels-Alder reaction. Studies of the addition of maleic anhydride to furan and methylfurans // Journal of American Chemical Society. 1984. Vol. 106. № 1. P. 203-208.

10. Sandner B. Die rolle von Diels-Alder-reaktionen beienigen radikalischen polymerisation // Acta Polymerica. 1984. Vol. 35. № 5. P. 359-363.

11. Vazzana I., Grandi F., Hyashi K., Munari S., Russo S. Radiation-induced copolymerization of furan and maleic anhydride // La Chimica e Г Industria. 1975. Vol. 57. P. 745.

12. Бийег G.B. Cyclopolymerization and cyclocopolymerization. -NY-Basel-Hong Kong: Marcel Dekker Inc., 1992. 557 p.35.' Breslow D.S. Biologically active synthetic polymers // Pure and Applied Chemistry. 1976. Vol. 46. № 2. P. 103-113.

13. Kunitake Т., Tsukino M. Radical cyclopolymerization of divinyl ether and11maleic anhydride. A C-NMR study of the polymer structure // Journal of polymer science. Part A, Polymer chemistry. 1979. Vol. 17. № 3. P. 877-888.

14. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Д., Стоцкая JI.JI., Слоним И.Я. Исследование структуры сополимера дивинилового эфира с малеиновым ангидридом спектральными методами. // Высокомолекулярные соединения Серия А. 1996. - Т. 38, № 10. - С. 1683-1686.

15. Букринская А.Г. Вирусология. M.: Медицина, 1986. - 336 с.

16. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 592 с.55.''Feltz Е.Т., Regelson W. Ethylene maleic anhydride copolymers as viral inhibitors. //Nature. 1962. Vol. 196. № 4855. P. 642-647.

17. Richmond J.Y. Mouse resistance against foot-and-mouth disease virus induced by injectios virus induced by injections of pyran // Infection and Immunity. 1971. Vol. 3. № 2. P. 249-253.

18. Budzynski W., Chirigos M., Gruys E. Augmentation of natural cell activity in tumor-bearing and normal mice by MVE-2 // Cancer Immunology, Immunotherapy. 1987. Vol. 24. № 3. P. 253-258.

19. E production by guinea-pigs. A comparative study with lipopolysaccharide // Immunology. 1975. Vol. 29. № 2. P. 319-326.

20. Берлин A.A., Вольфсон C.A., Ениколопян H.C. Кинетика полимеризационных процессов. -М.: Химия. 1978. — 319 с.

21. Triblock Copolymers by Radical Polymerization in Two Steps. // Macromolecules. 2000. Vol. 33. № 2. P. 243-245.

22. Moad G., Rizzardo E., Thang S.H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis // Polymer. 2008. Vol. 49. № 5. P. 1079-1131.

23. Handbook of RAFT Polymerization // ed. by C. Barner-Kowollik. -Weinheim: Wiley, 2008 556 p.

24. Han J., Silcock P., McQuillan J., Bremer P. Preparation and characterization of poly(styrene-alt-maleic acid)-b-polystyrene block copolymer self-assembled nanoparticles // Colloid and Polymer Science. 2008. Vol. 286. № 14-15. P. 1605-1612.

25. Kattenbeck В., Rohrhofer A., Niedrig M., Wolf H., Modrow S. Defined amino acids in the gag proteins of human immunodeficiency virus type 1 are functionally active during virus assembly // Intervirology. 1996. Vol. 39. № 1-2. P. 32-39.

26. Pavlova М., Serbin A., Fedorova N., Karaseva Е., Klimova Е., Kushch А. Anti-Cytomegalovirus Activity of Membranotropic Polyacidic Agents: Effects in vitro // Antiviral Research. 2009. Vol. 82. № 2. P. 50-51.

27. Воркунова Г. К., Калнина JI. Б., Бурштейн М. Е., Сербии А. В., Родионов И. Л., Павлова М. В., Букринская А. Г. Действие новых антивирусных препаратов на репликацию ВИЧ-1 // Вопросы вирусологии. 2009. - Т. 54, № 2. - С. 27-31.

28. Гитис С.С., Глаз А.И, Иванов А.В. Практикум по органической химии -М.: Высшая школа, 1991. 303 с.

29. Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Дж., Тупс Э. Органические растворители. Физические свойства и методы очистки. Пер. с англ. М.: Издательство иностранной лителатуры, 1958. - 520 с.

30. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Пер. с англ. М.: Мир, 1976. — 542 с.

31. Храмкина М.Н. Практикум по органической химии. Д.: Химия, 1977. -320 с.