Стабилизация бактериальной формиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы методом направленного мутагенеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РОЖКОВА Александра Михайловна

СТАБИЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ГИДРОФОБИЗАЦИЕЙ БЕЛКОВОЙ ГЛОБУЛЫ МЕТОДОМ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

02.00.15-ХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА И КАТАЛИЗ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: проф., д.х.н. Тишков В.И.

Москва-1999

СОДЕРЖАНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................5

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЫАЕ)+-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ..............................................7

1.1 Физико-химические свойства КАЕ)+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных источников................................................................................................7

1.2 Сравнение аминокислотных последовательностей КА1)+-зависимых формиатдегидрогеназ................................................................................................10

1.3 Третичная структура КАГ)+-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101...................................................................................................13

1.4 Практическое применение КАЕ)+-зависимой формиатдегидрогеназы..........17

1.5 Механизмы инактивации ФДГ при различных температурах........................23

ГЛАВА 2. СТАБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

2.1 Различные подходы к увеличению стабильности белков...............................24

2.2 Анализ подходов к повышению стабильности белков с использованием методов белковой инженерии..................................................................................28

2.3 Повышение гидрофобности белковой глобулы...............................................37

2.4 Создание стабильных белков введением нескольких мутаций...................... 45

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................................48

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................48

3.1 Материалы...........................................................................................................48

3.2 Методы исследования.........................................................................................49

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................60

ГЛАВА 4. ГИДРОФОБИЗАЦИЯ а-СПИРАЛЕЙ......................................................63

4.1 Направленный мутагенез остатков Serl31, Serl60, Serl68, Serl84 и Ser228.63

4.2 Двойные замены Serl31/160Ala и Serl84/228Ala............................................72

4.3 Точечные замены Tyr62Phe и Tyrl65Phe..........................................................73

4.4 Точечные замены Serl47Ala, Ser 147Val, Serl47Thr........................................76

ГЛАВА 5. ВЫТЕСНЕНИЕ МОЛЕКУЛ ВОДЫ ИЗ ОБЛАСТЕЙ ГИДРОФОБНЫХ КОНТАКТОВ................................................................................................................83

5.1 Точечная замена Ala294Val................................................................................84

5.2 Замена Alai72Val................................................................................................87

5.3 Двойная замена Alai72/294Val..........................................................................89

ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА МНОГОТОЧЕЧНЫХ МУТАНТОВ..... 93

6.1 Кинетические свойства мутантов ФДГ: Т4, Т5, Т6 и Ala294Val....................95

6.2 Исследование термоинактивации нативной ФДГ и мутантов Т4, Т5, Т6, Ala294Val в диапазоне температур Т = 60-70°С.................................................... 97

6.3 Количественный анализ степени аддитивности мутантов............................ 104

6.4 Температурная зависимость активности нативной ФДГ и ее мутантов Т4, Т5, Т6 и Ala294Val в диапазоне температур Т=25-45°С............................................107

6.5 Применение стабилизирующих мутаций для очистки

формиатдегидрогеназы........................................................................................... 111

V. ВЫВОДЫ.................................................................................................................. 112

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................... 113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ЫАО+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный

ЫАЕ)Н - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

ЫАЕ)Р+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

МАБРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ФДГ - формиатдегидрогеназа

АДГ - алкогольдегидрогеназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогеназа

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ИПМДГ - 3-изопропилмалатдегидрогеназа

__5

АТФ - аденозин-5 -трифосфат сМГР - дезоксирибонуклеозид -5 -трифосфат ИПТГ - изопропилтио-(З-Б-галактозид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ДТТ - дитиотреитол

I. ВВЕДЕНИЕ

КАО+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ; КФ 1.2.1.2) метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH:

NAD+ + НСОО" NADH + С02

Этот фермент широко изучается с начала 70-ых годов. Реакция, катализируемая ФДГ, представляет собой самую простую реакцию среди NAD+-зависимых дегидрогеназ и является очень удобной моделью для выяснения основных закономерностей катализа переноса гидрид-иона в активном центре ферментов этого класса. Практическая ценность ФДГ связана с тем, что этот фермент - наилучший биокатализатор для системы регенерации NADH in situ [1, 2]. NADH используется в качестве кофермента более чем 700 дегидрогеназами. С помощью дегидрогеназ можно получать большое количество физиологически активных соединений (аминокислоты, стероиды и т.д.). Вследствие дороговизны самого кофермента для практической реализации этих процессов необходимо использовать систему регенерации NADH. Необратимость катализируемой реакции, широкий pH-оптимум активности, доступность фермента в больших количествах и его высокая стабильность делают ФДГ оптимальным ферментом для создания подобных систем. Несколько лет назад в нашей лаборатории был получен мутант ФДГ, специфичный к NADP+ [2], в результате чего стала возможной разработка на основе ФДГ системы регенерации NADPH.

Клонирование в нашей лаборатории гена ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 [3] и создание векторных конструкций, обеспечивающих эффективную экспрессию этого гена в клетках бактерий E.coli [4], позволили начать систематические направленные исследования по белковой инженерии фермента. В настоящее время в нашем распоряжении также имеются модели трехмерной структуры ФДГ для свободного фермента и тройного комплекса ФДГ-1ЧА1)+-азид (разрешение 1,8 и 2,0 Ä, соотвественно), полученные с помощью

рентгеноструктурного анализа [5], что позволяет проводить моделирование и анализ аминокислотных замен в белковой глобуле.

Одним из важных направлений работы по изучению ФДГ из Pseudomonas sp. 101 является исследование взаимосвязи структуры и стабильности фермента. Это направление представляет большой интерес как с практической, так и с научной точек зрения. Получение высокостабильного мутанта ФДГ, сохраняющего каталитические свойства нативного фермента, позволит использовать ФДГ в системах, сопряженных с NAD+- и МА1)Р+-зависимыми ферментами из термофилов. Кроме того, увеличение термостабильности ФДГ может сильно упростить процедуру ее очистки.

Цель данной работы заключается в повышении термостабильности ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101. Отличительной особенностью данного фермента является то, что он превосходит по своей стабильности все известные на сегодняшний день КАБ+-зависимые формиатдегидрогеназы из различных источников: бактерий [6-8], дрожжей [9-14], грибов [15, 16] и высших растений [17-21]. Поэтому широко распространенный метод стабилизации белков, основанный на сравнении аминокислотных последовательностей данного фермента и его гомологов из термофилов, в нашем случае не подходит. В связи с этим мы были вынуждены опираться исключительно на общие подходы стабилизации белков, которые только начинают формироваться благодаря накопленным в последние 10-15 лет экспериментальным данным. Подтверждение или опровержение этих принципов на примере ФДГ, безусловно, сделает вклад в дальнейшее становление теоретических основ стабилизации белков.

В представленной работе для повышения термостабильности ФДГ из Pseudomonas 101 используется один из общих методов стабилизации белков, основанный на оптимизации гидрофобных взаимодействий в белковой глобуле. Этот метод включает два подхода: 1) гидрофобизация а-спиралей белка, 2) вытеснение молекул воды из полостей белковой глобулы и заполнение этих полостей боковыми группами гидрофобных аминокислотных остатков.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ NAD+ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

1.1 Физико-химические свойства NAD+-3aBHCHMbix формиатдегидрогеназ из различных источников.

Ферменты, способные окислять формиат-ион, обнаружены в микроорганизмах и высших растениях [22]. Они могут быть классифицированы на два основных семейства. Первое включает различные белки, содержащие в активном центре железосерные кластеры и ионы селена и молибдена [23, 24]. Эти ферменты отличаются высокой молекулярной массой, сложной четвертичной структурой, наличием различных простетических групп, физиологической ролью и чувствительностью к кислороду.

Второе семейство включает КАБ+-зависимые ФДГ (КФ 1.2.1.2.), не имеющие в активном центре ни простетических групп, ни ионов металлов.

В гомогенном состоянии выделены ФДГ из дрожжей Kloeckera ¿£>.2201 [9], Candida boidinii [10], Candida methylica [11, 12], Pichia pastoris NRRL Y-7556 [13], Pichiapastoris IFP [20], Candida methanolica [14], бактерий Pseudomonas ¿7?. 101 [25], Pseudomonas methylica [26], Moraxella sp. C-l [6], Paracoccus sp. 12-A [8], Mycobacterium vaccae N10 [7] и гороха Pisum sativum [19] и ячменя [21].

Следует отметить, что на ранних этапах изучения ФДГ (начало 70-х-середина-80-х годов) основное внимание уделялось ферментам из дрожжей. Однако, низкая стабильность и не очень высокие значения удельной активности у дрожжевых ФДГ привели к тому, что, начиная с середины 80-х годов, более активно стали исследоваться ферменты из бактерий. В настоящее время наиболее изученным ферментом среди формиатдегидрогеназ второго семейства является ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas ^.101 (предыдущие названия Bacterium sp.l

и Achromobacter parvulus Tl) [25], гомогенный препарат которой был получен в нашей лаборатории еще в 1974 г.

Основные физико-химические свойства ФДГ из различных источников приведены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что все формиатдегидрогеназы состоят из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 35-49 кДа каждая. Каждая из двух субъединиц имеет по одному активному центру.

Все формиатдегидрогеназы имеют близкие значения констант Михаэлиса по NAD+ (60-110 мкМ) и формиату (2-15 мМ), однако, удельная активность ФДГ из бактерий в 3-4 раза выше, чем у ферментов из других источников. ФДГ, выделенные из высших растений, отличаются большим сродством к формиату и NAD+.

У. всех ФДГ широкий рН-оптимум каталитической активности. Максимальная скорость ферментативной реакции остается постоянной в диапазоне стабильности фермента (рН 5-10,5). Константы Михаэлиса по NAD+ и формиату постоянны в диапазоне рН 6,0-9,0. При более кислых и более щелочных значениях рН наблюдается увеличение Км как по NAD+, так и по формиату [27].

Для бактериальных ФДГ характерен неупорядоченный Bi-Bi механизм, тогда как остальные ферменты окисляют формиат-ион согласно упорядоченной двухсубстратной кинетической схеме [22]. Лимитирующей стадией является перенос гидрид-иона в тройном комплексе ФДГ-формиат-NAD"1".

ФДГ играют ключевую роль в метаболизме метилотрофов, катализируя финальный шаг катаболизма С1-соединений и обеспечивая метилотрофные микроорганизмы энергией в виде восстановленной формы кофермента NADH. Прокариоты и эукариоты используют различные биохимические системы для утилизации метанола. Метилотрофные бактерии окисляют метанол до С02 либо посредством циклических механизмов, либо через линейные цепи дегидрогеназ, в то время, как метилотрофные дрожжи, такие как Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Pichiapinus, окисляют метанол до СОг через формальдегид [28].

Таблица 1

Физико-химические свойства некоторых МАБ+-зависимых формиатдегидрогеназ.

Источник Мол. Масса, кДа рН-оптимум Удельная активность, U/mg j^NAD Км мкМ А м мМ Ингибиторы Ссылки

бактерии

Pseudomonas sp. 101 2x44 6,0-9,0 16,0 (37°С) 110 15 N3', CN", NCV, Hg2+, ДТНБ [30]

Moraxella sp.C 1 2x48 6,5-9,0 6,0 (25°С) 68 13 N3', CN", Ag+, Hg2+, ДТНБ [6]

Mycobacterium vaccae N10 2x44 6,0-9,0 6,0 (37°С) 200 20 N3", SCN", N03', Hg2+, Cu2+, ДТНБ [2]

Paracoccus sp. 12-A 2x49 6,5-7,5 11,6 36 5 N3', CN", Ag+, Hg2+ [8]

дрожжи

Hansenula polymorpha 2x40 7,0 2,8 (37°С) 70 40 N3', CN', NO3", Hg2+, Cu2+ [29,35]

Candida boidini 2x36 6,5-8,5 2,4 (30°С) 90 13 N3", CN", NO3-, Hg2+ [9,10]

Candida methylica 2x46 6,0-9,0 10,0 (37°С) 100 13 N3\ CN", NO3-, Hg2+, Ni2+ [11,12]

Pichia pastoris NRRL-Y-7556 2x47 6,5-7,5 8,2 140 16 CN', Hg2+, Cu2+, ДТНБ [13]

растения

Pisum sativum 2x42 6,0-8,0 3,7 43 1,7 ДТНБ [18]

Phasoleus aureus 2x46 - - 7,2 1,6 ДТНБ [19]

Solanum tuberosum 2x42 - - - - ДТНБ [17]

Следует отметить, что в качестве субстрата ФДГ может использовать не только формиат, но и 8-формилглутатион [22]. Это показано для дрожжей [29],

гороха [19] и Pseudomonas ¿р. 101 [30]. Митохондриальная ФДГ, выделенная из клубней картофеля, участвует в кислород-зависимом синтезе АТФ [31].

Физиологическая роль ФДГ в других высших растениях, животных и человеке остается пока невыясненной.

Все формиатдегидрогеназы характеризуются высоким содержанием в клетках. Например, при культивировании на метаноле в качестве единственного источника углерода содержание ФДГ в клетках бактерий и дрожжей составляет до 18-20% от общего количества растворимых белков [2]. Кроме того, было обнаружено, что в нефотосинтезирующих тканях картофеля Solanum tuberosum содержание ФДГ в митохондриях равно 9% от всех белков [17].

1.2 Сравнение аминокислотных последовательностей NAD+-3aBHCHMbix формиатдегидрогеназ.

На сегодняшний день известно 14 полных последовательностей ФДГ из различных источников (Рис. 1): из бактерий- Pseudomonas spAOl [32], Moraxella С-1 [EMBL Accession 008375], Mycobacterium vaccae N10 [7], из дрожжей- Candida methylica [33], Candida boidinii [34], Hansenula polymorpha [35], Sacchromathys cerevisiae [EMBL Accession Z75296], из высших растений- Arabidopsis thaliana [GeneBank Accession Z30777, Z30880], картофеля Solanum tuberosum [17], риса [GeneBank Accesion D15743, D23989] и ячменя [21], из низших грибов- Neurospora crassa [16], Aspergillus nidulans [15], Magnoporpha grisia [GeneBank Accession АА415108]. Неполные последовательности известны для ФДГ из арбуза [GeneBank Accession АА660126], мыши [GeneBank Accession АА681620] и человека [GeneBank Accesion N75707]. Последовательности ФДГ из Arabidopsis thaliana, риса, арбуза, мыши, человека и грибов Magnoporpha grisia были получены при анализе последовательностей кДНК из базы данных Gene Bank.

.ßl

3/10-lA , .<-> 59

PseFDH MorFDH MmuFDH MisFDH AraFDH BarFDH RicFDH SceFDH CmeFDH HanFDH MagFDH NeuFDH AspFDH

................................AKVLCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDFTPGQLLGSVSGELGL

................................AKVVCVLYDDPINGYPTSYARDDLPRIDKYPDGQTLPTPKAIDFTPGALLGSVSGELGL

AKILCVLYPDPVDGYPPVYARDSIPYIGGYPDGQSLATPSAIDFTPGELLGCVSGELGL

SRVASTAARAITSPSSLVFTRELQASPGPKKIVGVFYKAN------EYAEMN-----------------------PNFLGCAENALGI

RQAAKATIRAC P S S S S G Y FARRQ FN AS PG D S KKIVGV F YKAN------EYATKN-----------------------PNFLGCVENALGI

.....AAMWRAAARQLVDRAVGSRAAHTSAGSKKIVGVFYQAG------EYADKN-----------------------PNFVGCVEGALGI

WRAAAGHLS GRALGSRAAHT SAGS KKI VGVFYKGG------EYATxN-----------------------PNFVGCVEGALGI

SKGKVLLVLYEGG------KHAEEQ-----------------------EKLLGCIENELGI

.................................KIVLVLYDAG------KHAADE-----------------------EKLYGCTENKLGI

.................................KVVLVLYDAG------KHAQDE-----------------------ERLYGCTENALGI

LTTQREKVKVLLVLYDGG------QHAKDV-----------------------PELLGTTENELGI

................................VKVLAVLYDGG------KHGEEV-----------------------PELLGTIQNELGL

.....................................VLYDGG------SHAKDQ-----------------------PGLLGTTENELGI

<-

al

ß4

->. <-—>.

oc2

ß5 .<-—>.

oc3

ß7 .<—->'

<-

a4

ß8

.<-147

PseFDH RKYLESNGHTLVVTSDKDG-PDSVFERELVDADVVISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQSAID—RNVTVAEVTYCNS

MorFDH RKYLESQGHELVVTSSKDG-PDSELEKHLHDAEVIISQPFWPAYLTAERIAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAID—NNITVAEVTYCNS

MmuFDH RxYLEAQGHELVVTSDKDG-PDSVFEKELHDADVVISQPF

MisFDH REWLESKGHQYIVTPDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAYVTAERIKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAA—AGLTVAEVTGSNT

AraFDH RDWLESQGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAYVTAERIKKAKNLKLLLTAGIGSDHIDLQAAAA—LGLTVAEVTGSNV

BarFDH RDWLESKGHHYIVTDDKEG-FNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAYVTAEKIKKAKTPELLLTAGIGSDHIDLPAAAA—AGLTVARVTGSNT

RicFDH REWLESKGHHYIVTDDKEG-LNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAYVSAERIKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLKAAAA—AGLTVAEVTGSNT

SceFDH RNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANE—RKITVTEVTGSNV

CmeFDH ANWLKDQGHELITTSDKEGE-TSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKSVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNV

HanFDH RDWLEKQGHDVVVTSDKEGQ-NSVLEKNISDADVIISTPFHPAYITKERIDKAKKLKLLVVAGVGSDHIDLDYINQSGREISVLEVTGSNV

MagFDH RKWLEDQGHTLVTTSDKDGE-NSTFDKELEDAEIIITTPFHPGYLSAERLARAKKLKLAVTAGIGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGSNV

NeuFDH RKWLEDQGHTLVTTCDKDGE-NSTFDKELEDAEIIITTPFHPGYLTAERLARAKKLKLAVTAGIGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGSNV

AspFDH RKWIEEQGHTLVTTSDKDGE-NSTFDKELVDAEVIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKLAVTAGIGSDHVDLDAANKTNGGITVAEVTGSNV

XX

* * * * * *

(XA

oc5

->. . <-

a6

ßA

ав

ßB.

PseFDH MorFDH HumFDH MisFDH AraFDH BarFDH RicFDH SceFDH CmeFDH HanFDH MagFDH NeuFDH AspFDH

aC

234

ISVAEHVVMMILSLVRNYLPSHEWARKGGWNIADCVSHAYDLEAMHVGTVAAGRIGLAVLRRLAPFDV-HLHYTDRHRLPESVEKELN---

NSVAEHVVMMVLGLVRNYIPSHDWARNGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLLAPFDM-HLHYTDRHRLPEAVEKELN---

YGLTQSTVGIIGLGRIGQAIARRLKPFGVQRFLYTGRHSAPEEAAE

VSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVINGEWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDSELENQIG---

VSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQVVKGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMAPELEKETG---

VSVAEDELMRILILLRNFLPGYQQVVKGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRYGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLQINPELEKEIG---

VSVAEDELMRILILLRNFLPGYQQVVHGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRVKIDPELEKEIG---

VSVAEHVMATILVLIRNYNGGHQQAINGEWDIAGVAKNEYDLEDKIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYDYQELPAEAINRLNEAS

VSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVG---

VSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIISGGWNVAEIAKDSFDIEGKVIATIGAGRIGYRVLERLVAFNPKELLYYDYQSLSKEAEEKVG---

VSVAEHVLMTILVLVRNFVPAHEMIQAGEWDVAGAAKNEYDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLAPEVEKEIG---

VSVAEHVLMTILVLVRNFVPAHEQIQEGRWDVAEAAKNEFDLEGKVVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSAEKEAEIG---

VSVAEHVVMTILLLVRNFVPAHDQIRNGDWNVAAVAKNEFDLENKVVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLRPEVEKEIG---

**** * * * ** * * * * * * X XXXX * * * * * X

ßC а 7 ßD aD aE

<—> . . <-X—-> . . . <-> . . . <-

ßE 3/10EA . <—> . . <-X-

aF

-299

PseFDH MorFDH MisFDH AraFDH BarFDH RicFDH WmeFDH SceFDH CmeFDH HanFDH MagFDH NeuFDH AspFDH

---------LTWHATREDMYPVCDVVTLNCPLHPETEHMINDETLKLFK-

---------LTWHATREDMYGACDVVTLNCPLHPETEHMINDETLKLFK-

---------AKFEEDLDKMLSKCDIVVINTPLTEKTKGMFDKERIAKLK-

---------AKFVEDLNEMLPKCDVIVINMPLTEKTRGMFNKELIGKLK-

---------AKFEEDLDAMLPKCDVVVINTPLTEKTRGMFNKEKIAKMK-

---------AKYEEDLDAMLPKCDVIVINTPLTEKTRGMFNKERIAKMK-

---------------TRTRGLFNKERIAKCK-

KLFNGRGDIVQRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMK-

---------ARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFK-

---------ARRVHDIKELVAQADIVTINCPLHAGSKGLVNAELLKHFK-

---------CRRVDNLEEMLAQWEVVTINC PLHEKTRGLFNKDLISKMK-

---------CRRVADLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTQGLFNKELISKMK-

-RGAYIVNTARGKLCDRDAVARALES

- RGAYLVNTARGKLC DRDAIVRALE S -KGVLIVNNARGAIMDTQAVVDACNS

- KGVLIVNNARGAIMERQAVVDAVE S -KGVIIVNNARGAIMDTQAVADACS S -KGVIIVNNARGAIMDTQAVADACSS -KGVLIVNNARGAIMDTQAVVDACNS

- DGAYLVNTARGAICVAE DVAEAVKS -KGAWLVNTARGAICVAEDVAAALES -KGAWLVNTARGAICVAE DVAAAVKS

- KGSWLVNTARGAIVVKE DVAEALKT -KGSWLVNTARGAIVVKEDVAEALKS

-ARRVDSLEEMVSQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKELISKMKPGKSALLYLIIPMLMYHKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEALKS

* * *y*

PseFDH MorFDH MisFDH AraFDH BarFDH RicFDH WrneFDH SceFDH CmeFDH HanFDH MagFDH NeuFDH AspFDH

ßF

<—>.

aG

. . . <->. <-

ßG

->.....1 <-

a8

->

3/10-9A (39 RIO a9

. . . . <-><->. . <-><—-

->. 384

GRLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMPY-GRLAGYAGDVWFPQPAPNDHPWRTMPH-GHIAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRYMPN-GHIGGYS