Структурно-функциональная характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus Thuringiensis подвида Galleriae на основе методов молекулярного клонирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Л10СК0ВСКМИ ОРДЕНА ЛС1И1МЛ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Л\. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КАРАСИ Н Александр Ильич

СГ Р У КТУ Р Н О Ф У Н К Ц И О Н А Л Ь И АЯ X А PA KT Е Р И CT И К А «-ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINGIENSIS ПОДВИДА GALLERIAE НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ

Специальность — 02.00.10 . , . Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте' генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: - — доктор химических наук,

профессор В. М. Степанов.

Официальные оппоненты: — доктор химических наук

Ю. Ф. Дрыгин; доктор биологических наук Л\. Ф. Шемякин.

Ведущая организация: — кафедра органической и биологической химии Московского ордена Ленина к ордена Трудового Красного Знамени Педагогического Университета им. В. И. Ленина.

Защита состоится 16 июня 1992 г. в 15 час. на заседании специализированного совета Д-053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова, по адресу: 119899 ГСП, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » .. . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

I. Г. Смирнова.

общая характеристика работы Актуальность проблемны. В настоящей арекя j в большей примононкв находит биологические средства тщмш растений «л основа Eacillus thuringiensis ( ВТ 1. гоночные для яэтчином балвь чер 300 зидов насекомых отрядов l.epldoptcrs, Diptam и Colc.optcra. Энтомоцадный эффект ВТ определяется, глазным образом, белковыми 5-эндотоксинами, образующими кристаллы и хода спорулнцпй Эндотоксины . продуцируемый различными подвидами ВТ отличаются по перзичной структуре н специфичности энтокоцадного эффпкта. В последние годы, d смзи с рлэвюком методов генной и белковой иняннврни. достигнуты значительные успехи э чзучеии!; бвлков этого ласса. D то жп время молекулярный оснсвы :>нтомослопифичностя я механизма доИстввя д--зн-дотоксянсв йэу jhu до сих пор достаточно слабо. Поэтому .'«тонирование н сравнительная структурная характеристикd новых генов 6-эндзтокснноб, в особенности токсинов с уникальной специфичностью, является весьма актуальной задачей.

Иельв данной работы являлось ьлониршыияа п структурная характеристика генов 6-эндотоксинов ИТ подазда gaileribe, в ток число - й-эндотоксина отввтетыонного за прояппоиче уникальной сиецхфячкости крястаялоа зтого подвида по атношошт к личинкам GJlleria aellonella. С этой иельл, а также длч обеспечения работ по созданию представитсшьной коллекции генов б-эндотоксинов была поставлонна методическая задача -разработать универсальную иотсдячоскув схему клонирования генов i-эндотоксинов различных подвидов. ВТ

Научная новизна я практическая ценность работы. Ii лр.;мо5 работ» к до i7* (Га в лниё~Гвнов~2 otTj некие п ВГ апериыо проводилось с использованием фйзиидных геномных бябпнптек, дающих рад преимуществ по сравнению с использованными ранее подходами. Впервые клонировании я охарактеризовать! гены евy:t 5-ан-дотоксинов подвида qallerlae.. а тон числе В-эндотоксина СгуIG* • гначвтельно отличаи'Имгос* от известных ранне яо пергнчкой структуре и специфичности антококицного действия Клонированная в работе гоны Ь-эндотоксинов C'rylA'a) из

Иизплния е-эндотоксинов и соответствующих геном привв дьчк в соответствия г. гшинигок на сет одни струг.турно-функ-циональний ипассификацией (Табл. II. чпэрвыв предложенной Hofte к wiii.filf*/ в ;яазг.

полиьдл Ыь-;»г rffcj I! Cj.illi Iis подвида tenebrionis переданы D p,m ллбори . оьйй wi: создании альтерга! ившк продуцентоа к ■ i5KiH^runH.av. растении, устойчивы? к насекомым-вредителям. ИрвнарйТ, полученный на основа рвкомбинантного штамма E.coli ■ сицирлашиго клонированный ген crylG, прошил первый этап исп1.| i лил it » h<t4c<:7ju высоко специфично) о инсектицида против вредители улоеь - личинок большой вощаной моли iGelieria inei-lonelia).

Публикации л апробация работы. Материалы исследования по jene диссцг. дм.)* опубликованы в 2 статьях, а. также были üuö^ct-ijjiuhvm ь ьиив стинлсв'.дх couoiushinß на Всесоюзных ион-фсфомийх а гг. Пущина, ЕЮлигож. Тбилиси » 1988, I9S9, lyaO гг. , л ¡'а ¡¡а.ь^унгц.-одьом ииохимичог.ком Конгрессе в Иерусалиме в ii^ilr.

осин и cipvwvypa работы. Диссертация состоит из введении. oC'jiipa л п ерк-уры, посвнценного генно- инженерным подходам к изучении к практическому применении Л- андото.чсинзв Я'-. оос.уждони,! рскуль г а гоЕ, экспериментальной части, выиодоь и списко имтир^омом литературы.

Лис-иртацил содержит 2-S рисунков и S таблиц.

Полный ой'.еи psV.iu ш страниц.

содержание работы

I. Рч:;рабигкй методической схемы клонирования генов эндотоксинов ВТ.

Описанные ь гигературе схемы хлониропания генов а-зн.цо-токсинов основаны главным образен на получении клоногпк нла.1МИД1ых или обогащенных тек или иным способом препаратов тотальной ДНК. В?. Использование их подходов сопряжено с рядом существенных ограничений. Гены Ь-энд. омсинов имеют как правило глааmvдную локализацию, однако есть ланкыо. свидетельствующие о хромосомной локализации некоторых тонсичо-иых генои. В:,'.целгпие высокомолекулярных ппазнкд ВТ - -_>то ьесьма трудоомкли процесс, связанный к тому же с риском потер* чести гзье:ичгского материала. С использованием альтернативного гюдхоаа. оснояашюго на обогащении тотальной ЛИ*. Лгагченгдн* опоодэлешюго размера, практически невозможно ктсмуров.пь riüB.,ie. значительно огличаюииеск по структура Г'.'ны тгксннпв, аминокислотная послединательность которых

не установлена. Использованная о данной' работе стратьгяя, основанная па кэнструлроэз.чяи библиотек тогвльичх ЛИК не. фззмкдном вектора, позволяет преодолеть большинство отпх ограничений и продстввлязт собой достаточно ^нипзрсалькур п эффективную схону клонирования генов г-энпотсксииоп. I. X. Конструирование а анализ фазиадиьк бкбляотэк.

Для создания илонотэк использовала суинарнуо тотальную ДНК различных подвидов ЯГ. В качество векторной састакы использовала фадм-иду-Ap5L5. сконструированную! з лаб^ра»орки нолекулярной ген&таки БШШгенетика (Гиг.. I), и газогную куль-гуру В. coll ОТ-14 (sup£. supf, TonB J. Фазккяный эокгор содержит a состааа^ одной молекулы полнсразкорну» плагкцду pUC19 и фрагмент фвгал, достаточный ляп поддержана« лягичееког.) развития фага. Таким образо., отот доктор сочвткот в соЗе прокмудэстпа фаговых а' плазиядцьк dsktopod, нспользозавшклея ранее для клонирования гонов 5-эндотоксинов ОТ. Гаэкчр кп-, лекулы ApSLS 1.33т. п. к.) такоп, что вектор бэз ЕставочиоЗ

• последовательности ноаат подперяяваться в клатка только s плазмидной форна. Благодаря зтону ужа на стадия получения клонотеки, при /паковке in vitro происходят пряной отбор рокомбннантных клонов. Па Psc. X приведена тагшчкая сиона эксперимента. По этой схеме, d данной рлботэ были получены фазквдшэ библиотеки тотальных ДНК ряда подвидов ВТ ! Табл. Z), образуюиях а-эндотоксины с различиой энтоноспецвфгчлостьв.

Била разработана методика анализа фазннднъвс библиотек с использованием афянно очшпаикых антител к пскокону токсину. • Такой катод скрининга наиболее удобен для клонирования поя-норазморных а функциональных гоков i-эияотоксниоэ. Прики-нявшался с.чака выявления кннунеположительных клопов с использованием иетодн двух антител универсальна - потаолявт использовать один и тот же коньогат в сочотанви п р&зявч5М:<а ■ преларатани специфических антител, а также дает значнтельро* усиление первичного сигнала

Полиая ехэиа характеристики флзкидкых кланов, отобрлншк »з библиотек* после повторного скрининга (Рис.1) включает» I. Идентификацию белхового продукта в клеточном экстракте!' а) Вестэрн-блот - SDS-электрофорез с последующим электро-,' переносом белков на нитроцеллюлознуп кембрану й- пнн^чс-, логический проянлечидн по той же схвив. что я пра йклу- .

КОСКрИНИНГЧ.

С') Определение биологичвеной активности на личинках чуст-енгольмых к данному 6-эндо жеину насекомых. Установление егшктра токсичности в биопробах на ряде типичных тост- обь«1 ктоь.

2. ОтрутУрнуи характеристику вставочной последовательности

ai Pbctp4kussü;ih).iü анализ - олрэдельиив размера клонирэ-о&ниого фрг.гхекта и в замкппго расположения участков узчапанья нескольких крупнокепящих рветриктаз.

б) Локалвзаимч искомого гена -

-при клонировании известного гена - по рестрнктазной карге;

-1.рм ньличжк олкгонуклоотидного или двунятезого ДНК-зенца - с покощьш Саузьрн-блот гибридизации;

-при иълкчкк антител к ¿-андотоксину - на основе ичмунстестяровани« долециокных вариантов, получэннъ:* на базе экспрассионного ваьтора.

в) Онр&деланкв нукяеотияной последовательности (частичное или полное) клонировакых фоагментов из предпо'логв.акой области локализации гака. Сраамнтелькь'.Е структурный анализ - устаиэьлонне точной локализации, ориентации и классификационная кдэнтификацяя roiva 6-ондотонсияа.

1.2 Клонирование н идентификации генов crylA(a) к cryIIIA.

С использованием иилуноскринпнга был клонирован описанный и литературе гея crylA(s) из подвида kurstaKi (Рис. 2а). При Ввстерн-бпот анализе экстракта клоток Е. col i, несущих зтибранную рекенбииантиую фазмчду >.рОС2, на реплико вы.чвлн-ется инмунополо.кительнмй белковый компонент, совпадаюший по подвижности с искомым токсином (Иг " 133 kDa). При биотести-(¡овакчя этого экстракта ка личинках Lymantr* л dispar наблюдалась их ЮСК V ибсль.

Характеристику клоихоовамных фрагментов ДНК, и сочввт-ствующих белковых продуктов удобно проводить с испопьзовани-ем плазкидной фср*ы отобрзиных рекоибккантных фазмид. Перегон э плазмлдную форму осуществляется с помощью транедукция в Е. coli при 50°С, благодаря наличию в векторе ,4pSL5 гена -Its, пла-.'иидного orí и маркера Лрг (ген Ыа) (Рис.1!. Пслу-■енная рветриктазнач карта АрОС2, полностью согласуется с данными S'.'hnppf et ai, 1985, впервые осуществивших клониро-

=ание и определенно нунлоотидной послодопитальносчи гена

5-эндотоксина из подвида fturstdhi. В отдельных ггаммпх вонзила Uurstaki может содержаться до трех близких по структур«» генов - crylA(a), crylA(b) и crylA(c). Оцноэкачнгк ндяят*-5>икация клонированного нами гока, кзк crylA(a), была осу-дествлена на основе частичного определения нуклествднсй последовательности двух ЕсоЯ1 фрагментов (0,7 и 0,6 т. п. и. J

из кодирующей области гена.

В последующей работе гач сгуХЛ(а), субклонхрован^ый в юставе экспрессионного вектора, использовался в качестве эбьекта сравнения и зонда для гйбридизационних экспорнмян-гов. С использованием этого гэу в даной лаборатории в настоящее время проводится работа по создание мэлок> ляриых гибридов с дру ння ö-эндотоксин-кодирукздвмм гьнамх.

Альтернативным методическим подходок к выявлонп» пасхо экспрессмруьэдхся в Е, coli гоноо в-эндотоксинов в флзннд-ных библиотеках является скрининг с использованием начатых Ш1К-э0нс0в. В данной работе с поиощьгп гибрадизационйого скрининга с олнгонукявотядкым зондом проводилось клокирова-ние гена crylXIA из подвида tenebrlonls. Этот ген являете« весьма валким компонентом создаваемой коллекции, ввиду tiyp-спектив ого практического использования для создания трансгенного картофеля, устойчивого к личинкам колорадского жука. Кроме того, СгуШЛ - это единственный на сегоднгшнив донь

6-эндотоксин с установленной пространственной структурой.

Схема клонирования геиа crylIJA из .библиотеки ВТ подв.члв

tcnebrlonie представлена на Рис. 26. Явпду неблагоприятного для клонирования 'расположения сайтов EcoRX в гонона see выделенные при первичном и повторном анализе библиотеки клоны содержали только неполноразмерныйган CrylTIA (лишенный последних 210 п. н. кодирующей последовательности со стороны 3'конца).

Это отражает определенные ограничения данной векторной системы, связанные с необходимостью использования нрупиощи-пяийй рестрикгазя EcoRl. Тем не менее, йыделанныа кланы содержали фрагмент гена (1700 к. н. ), достаточный для использования в проводимых в лаборатории работах по коиеттруиеавекы» гибридных токсинов

2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ Cl.-УКТУРНО-фУККЦИОНАЛЬИАЯ ХАРАКТЕРИСТИК* ó-DíUiOTOKClIHOB ПОДБИЛА GALLERIAS.

Разработаны«? ¡¡атомические псдаоды были использованы при клонировании и анализе гонов S-эндотоксинов подвида ija.lle-rioe (Рис. 3).

Кристаллы данного подвида ВТ обладают достаточно сложный белковым составон. Множественные .ены 6-ондотокснноа подвида gallerías к началу данно!5 работы практически но были ил учены.

К лаборатории химии белка при изучении белкового состава кристаллов таима II-B7 поввнде. gal!eriee удалось выделить и охаракторвзояать белков'1Й компонент ответственный sa их уникальную антоноспеифичность по отношониэ к личинкам Gallería ncllonrlla. Эгог болок был назван "положительным компонентом'' но необычной для других 6-яндотохсинов электрофорвти- ' чйской подвижности истинного токскка (Mr ПО kDa). образующегося при активации трипсином соответствующего протоксина (Иг 130 IíDü). Значнгилыааа отличия атсго белка от других ¿-эндотоксинов были вымвлэиы и при его имкукохиничфском анализе и определении N-концевой последовательности методом Эдмана.

!! кристаллах ряда штаммов подвида дalleriae присустпует 5-ондотокскп. Енкунологьчэски родственный балкам подкласса Crylí.. Кристаллы исследуемого нами штамма 11-67 практически на реагируют с антителами к балкам подкласса. Cry.IA.

Молекулярное клонирование, структурный анализ и гетеро-лог^чнаа экспрессия дают возможность проанализировать причины наблидаеной кринтичностя cryíА-подобного гона а шт. 11-67. Поэтому при анализе тотальной геномной библиотеки ВТ подвкда galJnrije шт. 11-Б7 были использовании два типа антител - к уникальному 5-эндотоксину - "полсл'ихельному компоненту" - подвид«, galieriae (ABGal) и 6-эндотоксину СгуХА(е) подвида Hurstaki (/\sKur).

Были получен«., две группы клонов с непересекаю'синисч км-мунологическини и гибридизациокныкк характеристикам!;. Последующий анализ показал, что первая группа - представляла собой клоны содержащие ген 4-эндотоксина, соотвегствующкй вы-сшупочянотоку "положительному компоненту", названный нами r:yIG. вторая группа - ген í-эндотоксина. по бисспецифичнус-tv и икмунологическим свойствам родственного токсинам под-

класса CrylA н нал ванны* нами crylA(g). г. I. ,5-Эндотоксин О у IG.

с'хзнл клонэрова1<*я"гвна сгу/с предетавлекна на Рис. 1а

*

При Вестерн-бит анализа отобранных иа библиотека кланов первой группы было показано,что в них экспрессируягся бялок нмиунологкчаскв родственней в совпадающий по размеру (Мг 130 kDa) с основным белковым компонентом кристаллов шт. И-67 подвида де.11ег1ле. Прв рестряктаз^ом картирования и гябрядв-зацконном анализе с использованием t:rylA(a)- зонда не выявляется никакого сходства клонированного сегмента (« II т. п. И. ) с «звестиынн генами а-эндотоксинов. Поэтому для прэдвари-тельной локализация искомого rs во встаакв был гшлучои ряц делвцаонных вариантов первоначально ото£ранного фг.змпдио.'о клона АрОСЮ в якмунологячоски проаналяз«рояанкы ах белковые продукты.

Иснокий ген был првдварятольио локализован в ранках фрагмента Kpr.I-Xbal (Зт. п. н. ). Установление точного расположен» я ориентации гена было проаедэнс на основа чаегачкого определения нуклаотадноЙ последовательности. В ранках саквв-няроавнкого фрагкэнта KpnI-Eco47.3 ( I. I т. П. к. J бкяя обка-руяены SD-последовлтольноегь, нннцяаторный кодой и открытая рамка считывания, фрагмент которое, начиная с 24-ой аиаио-наслоты соответствовал установленной ранен n-kokuoboS последовательности белка "полояятельного компонента" (Рис.4). Это позволяет' однозначно адеитифЕцврояать клонированный гон, в также определять ы-кониевоВ участок, отдеплявмый тряпепнон ' (по связ* L:'e23-Туг24) при пратоолвткччекой актвваиип со-oTsöi стсуюпого п^отоксика. Для больиинства токе в нов Cryl-класса (Табл.1) N-концевое расшепленяэ происходят по связи Arg23-Ilfc29 В этой облает* наблюдаются наиболее су-шаствечныч структурный отлячия болка CrylG от других язвосТ" них токсянов Cryl-класса (Рис S) Интересно, что на протяжения боппа чем 5по л. н. в направления 3' от жнициаторного кодона но обнаруживается каких-либо структур сходных с аз-вчепшии бацкллчркьмя промоторами, в ток чясло с промогорамт тяпа nti и Btri локалкзованныкя на расстояния - 100-130 п. н. от начала любого *з описанных в литоратура cryl-гянор. Это обстоятельство служит указанием на возможность опвроиаой t организации генов 4-эндотоксинов подпила gsllc~iae. В Поль-

зу -акого продпололе жн говорят последние данша, полученные з лаборатории, которые свидетельствует о локализации на расстоянии около I т. п. н. в направ. 5нни 51 от crylG еще одного гена i-эндотоксина.

Сопоставление нуклеотидчой послацовательности crylG в сзк^йнмров^нт.'В области не позволяет обнаружить существенной токологии г. каким-либо иа изчесгных i.iKob <5-эндотоксинов, определенный уровень сходства удается выявить лишь при сопоставлении loo iвегствующих аминокислотных последовательностей (Рис.3). Уровень совпадений в последовательности CrylG с другим* токсинами класса СгуТ в средней не превышает I9X. в то ьремя как. большинство из них (за исключением CryIB) на том участке согпагдаит на DOX. Интерпретации наблюдаемых стручтуркых отличий помогает сопоставление с расположением элементов вторично! структуры CryIIIA,' единственного пока ¿-эндотоксина с полностью установленной пространственной структурой.

Несмотря на заська существенные отличия ь аминокислотных последовательностях, такое сопоставление позреляет отметить,

ЧТО:

- Количество инваризнтных аминокислот выше на участках соответствующих а-спиралям белка CryIIIA, в особенности аЗ и as, чем между нами. В ранках самих а-спиральных участков количество совпадений возрастает по мере приближения к а-З-спирали, которая, как считается, выполняет основную роль о поддержании общей .пространственной, структуры перво-, го а-спирального домена. Этот домен предположительно непосредственно участвует в формировании ионного канала при связывания с клеткой - мишенью. Такой процесс, вероятно является общим для всех 6-эндотоксинов, , лежит в основе механизма их токсического действия. - Чередование инвариантно гидрофобных и гидрофильные анино-кнелот (отмечены отдельной строкой на' Рис.5), наиболее существенное для формирования характерной структуры "пучка* из семи.а-спиралей о токсине CryIIIA, сказывается устойчивой характеристикой сравниваемых участков асах токсинов. Наблюдаемые аминокислотные замены в ранках спирали-зованных участков (a2b-a5) практически не изменяют профиля гндрг.фобноств Это позволяет предположить, что все токсины

класса Cryl, включая и структурно отдаленный CryIG, характеризуются сходной пространственной структуре4 пергого домена, котсрыв вероятно играет основную роль в проявлении собственно токсического эффекта ecsx 6-эндотоксинов ВТ. 2 Проведенный сравнительный структурный анализ с учетом данных по мг белка и токсичности (дли Gallería mellonclla. которая являегся представителем отряда Lepidoptera) позволял классифицировать клонированный нами ген как сгуЮ (Табл. 1). 2.2. а-Эндотокскн CrylA(rj).

Вестерч-блот анализ клонов второй группы отобранных из библиотеки galierlae (Рис.36) показал наличие белкового продукта имнунологи^ески и по моле улярному весу (Кг ■•> 133 kDa) сходного с e-эндотоксином СгуШа) из подвида kurrtakl.

Предварите ьная л о кал аз ац я я геча во вставка размером 7 т. п. н. проводилась на основа рестриктазного и ¿"абрядязацн-онного картирования. Сходство рвстриктазных карт клонированного гэна и crylA(a) позволило локализовать его ль участке размером в.З т. п. н. (Ркс.Зб). Гкбрндизацвонкоо картирование., в котором и качестве зонда использовался полноразхерный ген crylA(a) зыяввло значительное ролсгво этих гонов. Л-Зндо-тсксян из подвида galleriae содержит я участка с отнооятэль-но низким уровнем сходства втом число а области, соответствующая « второй чатйёртя гена, которая считается ответственной за специфичность энтомоцидного действия. Сравнение рост-риктазных карт выявляет определенные отличая клонированного гена от других известных представителей гтого поышасса -crylA(a), crylA(b) и crylA(c).

Окончательная«локализация и идентификация проводилась на основе частичного определения нуклаотидной последовательности клонированного гена, соответствующей N-концевому участку белка. В сякяонхрованной области 250 п н. ) была обнаружена SD-последояательность и открытая рамка считывания. Срас-нение этой последовательности с аналогичными участками генов подкласса crylA показало наличие 21 нуклеотияноЕ и в амиио- '

Сравнительный анализ устаноялеквой в последнее время в , лаборатории полней последовательности Ссу1в позволил га<ого яыявьть существенные структурный отличия от других токсинов на участках, предположительно отвечающих за специфическое • узнавание рецепторов клетки-мишени.' Эти отличия, вероятно Определяют уникальную энтомоспецифвчность токсина СгуХС.

in

кислотных :и<наи (Рис 6!. Характерно, ню последовательности других про д. .-таи атьг.эй огою подкласса на данной участке практически ияонтачны (только 3 нуклоотидная в I аминокислотная закона) i Рис 6).

Наличии Rur.,i<oh степени гомологии и в тоже ерами значи-тельни» струкгурныи oí личин в этой высоко консервативной для балков г.овкласс-i CrylA облает, позволили нам классафиииро-1<(1ТЬ кл...ни}ювиг1пый ген. как нового представителя данного подкласса - (ГаОл. 1). Использованный нами индекс

группы ! с! гюдчйркиьает относительно болыау» структурную отдаленность- or других групп (а,Ь и с) подкласса CrylA и в то же ьромя аилнэтея к.' емонкческим указателем подвида gallerías.

Сан факт клонирования и нормальной экспрессии гена сгу1А(д) ъ rt-i upojuji 1йчно9 снстони Е. coJj показывает. что илблюд-лемая "крам ичнос-i t" этого гена в исходном шт. II-67 (jdilrririe не ськзанп ни с потерей гена ( пак это происходи:! чрк эллнминнроьлн*« соогает станцией плаз икры ). ни с повреждениями в кодируиыпИ области. Причины этого явльнвя, которое эероятиэ cbh3B4j с особенностями регуляции экспрессии мно-и-.есч венных гэиов о эь-дотоксиноэ ь данном штамме, в настоите о врпмя кг. г л сдухлсь.

Результаты провяленного бкетестировани.ч белковых продуктов клонированных гонов (качественны? анализ или так назц-маамые бкопробы) ни выявил* эначхтельных различий в спектре токсичности i--..идотоксинов CrylA(g) и CrylA(a) ( Табл. 3). Дл> установления возможных количественных рьзличкЁ в удельной чктивностк этих токсинов проводится разработка системы гетч-рологичнои экспрессии к очистки белковых продуктов соот-иэтетвуюших rqi-.ua

Биопробы тдк*.е подтвердили значительное отличие спектра токсичности Ciylí". от представителе)! подкласса CrylA,' ь :ом числе и его уникальную специфичность по отношению к личинка Gullet id mclloncll<j.

ишоды

l. Разработана схема эффективного клонирования генов 6-эндотоксинов mclllus t Jiuringiensis, основанная на кокстру ронэниа тотальных геномных библиотек с использованием фазмкчного вектора ApSL5. Сконструированы тотальные ге-

номные библиотеки подвидов kurataki. дя] leriar:, Lenebrio-ni.i. iaraeJ ensJ i>, InncctuJ, cien<irol inuis, tolvorthi. j lr.s~ ti образуюа*х 4-эндотоксины с различной rneyифичногть» энтомецидниго действия.

2 В рамках отработки мвтодячэскях приемов вмкуИОЛ(Л В 1ЧСКОГО в г8брвдяЗ(Щиопного скрининга фьямидных библиотек клонированы описанные в ллвратуре гены:

- cryJ.l(n) i подвид kumtuki шт. 1Ю-? Oipel) - полнораэ-мерный ген, ксдируыавй 6-эндотоксин, токсичный для рада нлсекОМЫУ.-врадигелей отряда Lepidoptera.

- crylllA (лодчяд teneiir-iortis) - Ь'-кокцезпй фрагмент, гнна. coo i ветсг вуиглий пергым 565 аминокислотам 5-эн-дс.'оксина токсичного для личинок отряда. Coieoptera.

3 Ппоркые клонирован ген л-эндотоксина СсуЮ из подвида gaj Leriae, с, г au i с i венного за укнкалы:ь:й тип Ькоспецафич-ности кристаллов этого подвида к личинкам большой воииной koj:h (öJiJeria ,-ne J i and l а ) •. Сравнительной анализ первич■ ной структуры и сопостьвлэнкв с данными по пространсгзен-нси cipvKTypa токсина Cryllln позволяло предположить, что, несмотря на бь.'ивлэнныи существенные отличня, 5-эн-дотсксин CiylC-, как и пев токсины класса Cryl, характьри-гу нт с;я формированием аналогичного по прсстранстзэчной структуре и-спирального N-концевого домена. Этот домен bepohihü Ki'pi-зт кл.очеЕую роль в механизме токсического деиовиг. ьс(-.< А-эндотоксинов. "

4. Ent-рьыз клон-ipoBdii ген 4-эндотоксина CrylA(g) из подвида gaJ.l-5r.ibe. Р^счриктазноо и гибридизационное картирования, частмчноа ог.'ре целенио первичной структуры в N-концевой области, анализ иммунологических своАста и биослецифич-hocix белкового продукта этого гена быябклн значительное сходство с представителями подкласса CrylA. В то же время вычвленные структурные отличия позволили классифицировать клонированный гон как представитзля ноной группы А(д) внутри данного подкласса.

Результаты работы отражены в следующих публикациях:

i. и. а. Залунчн, д.И.карасик, П. и. Костина, о. п. Загнитько, i. л. ост&рман. г. г. Честухина "структурно-фунхизональная характеристика 6-эндотоксина BacilJus thurinqieusiз var.

galleriae, избирательно токсичного для личинок вощиной моли" в кн Тезисы докладов на Всес. конференции "Новыо направления биотехнологии", (г. Пущино), окт. IS88, с. 36.

2. к. Л. Осторкан, А. И. Карасин, О. П. Загнитл>ко, С. В. Калугер,

Г. Г. Честухина. М. Ю. "юнштэйн, Н.К.Янковский В. К. Степанов "Клонирование и сравнительная характеристика двух структурно отдалонкых 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis подакдов galleriae и kurstaki" Молекулярная биология, 1380, Т. 23, 463-472.

3. С,. В. Смулевжч А.. И. Карасин, О. П. Загнхтько, 0. В. Мосолова,

С. В. Калугер, Л. Л. Остерман, Г. Г. Честухкна "Анали. первичной структуры г-эндотоксина В. thuringier.sis ssp. galleriae в сопоставлении с а-эндотоксинами других подвидов" в кн. : Тизхсы Всес конференции по проблемам создания в применения микробиологических средств зашиты растений С г. Белигож), 1989, с. 5С

4. Снулевич С. В , Карас ин А. И., Мосолова О. В. , ЗагкитькО О. П. , Остерман А. К. , Честухкна Г.Т. "Анвпвз первичной структуры'6-.шдотоксяна Sacillua thuringiensis Sep. galle— viae" в кн. : Тезисы докладов на Вссс. симпозиуме по химик белков I. г. Тбилиси), . май 1Э90, с. ИЗ.

5. S.V.SiT.ulevitch, A.L.Osterman, А.В.Shevelev.. S.V.Kaluyor, А.Т -Kcrasir., R.M.Kadyrov, O.P.Zagnitk.o, G.G.Cbestdkhina, V.H.Stepanov *Nucleoti_e Sequence of a Novel delt-.n-Endotoxin Gone crylG of Eaaillu9_ thuringieiisie e&p. galleriae" i i991;, FEB3 Letts, V.\2P3, 'p. 25-26.

6. A.I.Kdraeiri, A.L.Osterjnan, R.H.Kariyrov, S.V.Smulevitch, G.G..Chentuknina, V.M.Stepanov "Structure and host range diversity of entomocidal proteins of Bacillus thurlngiensls ssp. galleries" (1991) in: the ABSTRACTS of the 15th International Congress of Biochemistry, Jerusalem, Israel, Auguet 4-6 1991, p.59

Рис Л. Обцап e^o.-ia конструирования и анализа фазмидньве библиотек В. thuringiensis.

1.Вектор в плззмидной форма Рестрикция EcoRI.

3.Цитирование.

1.Упаковка в капсид in vitro. Прямой отбор рекочбикантных фаэмид ( 43 -5">к.Ь ) .

М

>10-20кЬ

2. Тотальная ДНК В. 1:ЬУг:!.пд1эпз1з. Неполная рестрикция КсоШ.

Фазмидная библиотека

А г.

представительность »10 клонов

5.Инфекция

газонной

культуры.

6.Иммуяоскрининг в фаговой форме на нитроциллюлоз-ных фильтрах.

7.Поыторный скрининг (иммунологический и/или гиб-ридияационный): отбор фазмидных клонов несущих искомый ген.

в.Трансдукция eE.coli: отборно Ар1 при 3 0°С.

9.Выделения и анализ ДКК

10.Термоиндукция ; анализ С-алкоыых продуктов

Рис.г.

Схема клонирования генев СгуХй(а) и СгуШй.

I— Зегерк-баат - Еяотгсгарояакгп

а.

¡Хноеы из

Подробгог картараванпс

Зогщ дла тебрадязав^я 1

1)

>

— У* и-р и

Атятгаи (А^ит) /

Частечяие секЕеяаромаве; ндезш$й18дна гена (5у1А1'а/

подвида /гйМ'

[Кповн мэ оибивотеки; подяяда 1еп?Ы?'ош'я I

0;1ихиукпгагтитш!г*

аия И „

К

б.

Гояяртороаапвг

габркдниг ггявя

Соэдваве аодсгртвеызмх продуциттез

Погпргезае трзжтсивкг ¡»»тений

уП.'.*

I рТО<16 }

кЬ /

/

ДНК-зонд

____________/...

! Ппеторннй анализ |

>!ЭкЬ

Секмтяронаниаи обпзг»в

Частичное анкнартвакае; едгвтяфгпсацяй гева ГгуН?

,— Ífa.-Yf*j>:¡- С/от I—-Биидачицанпии!"

IIccw¡>!!-SMT

Зоад для гсбйядмчлдйл i *

а.

Asííal + кsïur -¿грЯ-эйац — i

Кйотсстарасашг

Дспрциоиике париапги ríoj4{)oGuue хиртиронание

-.О

Phi

¿Ves»'

1

Частичной сехсеакровавао; погапизацая а здрия1фикация\ гена Cr/JG

f œ >

[Клони <í3 библкотехи! i подвида gjt'/cjhc !

ъО"*

'--s

AsCai-AsXur + иу-Я-эаад

имауяотесигрсвание, п^сдцярйтельнаа покалнгацмя ram

Ж )

'шюрр-.рои&пие гйбряцБЫХ газов Создание ольтераатаЕи« прадудснтоа'

Вестерн -блот

j—■ Бкотестаровааке--1

ciylA(g) R К Я

• подробное Еартроаакие

£атШ

„//POKJO:U

\i?J -

¡'ибридазацишшое картирование — cr-^T—Qj'íAfaf-WA'O.

Частичное ce<ti¡e;¡;spossraie; легализация и йдеатифбшация гена Orj'tífgJ

Рьс.4. Рестрикизиая карта вставичной области в плаэм^де' рКР7, содержащей грн сгу! иухлеотквная последовательность секвенированного фрагмента (на карт» помечен стрелк <-->) и сооп лствуюцая М-копцввая аминокислотная г.оследовагел' ю< ь тохсина Сгу1 Двойным подчеркиванием виделен участок аминокислотной последовательности, определенный концеьым секвенированием но Эдману "положительного компонента".

I 1 Г---:--1----!----~Т--

а ' 2 3 4 !

" л

' ^ ^ я, — »4 Г!

С к * " «а и

£. >-. 8 С 8 | 8 « 0 г -8 .3

и -кних и , Я .2 и и м

&Сгу] О

з® б©

<¡511'ГЛ п САС7й7 АтеПТСЖТТССАТСЯИЛТОШТТвАААЛАСТАААТвТТСТКеАТбТААВСТАТЛ АПТАТСАСО

АйАТАМ7вТМ.л'' •'ССТАПС^АТТйАТС.«ТСТ%АТААССАЕШТСМС1ТА?М0ТАПЛ£6САТ1ТССССа ЛССДССС^1

ТтАТАС.\АААСТАДТАТЛСТЗССЛ16ЦЕ}^Г|АТНТТССТС7АТТТССТТААЙТТТТТ^^АТСС^1 АТАТАТАСАТСАТАТ'ГТ1^Л^]

АГЛоСС! ТСАТС ТЛСТА1 ДТТАГСТААТТОЛСбСТААТСАТАТТС ААДТССбТ^ЛТТТЛС AA/ЛCAAATT/1ATG/W'^Í^V^C А1

Я? Т"ЛСС АТСТСТТТП ТАТТ^ А^иАСТЛА.ЧААССЦААГ,Г.ТГГГЛаа/ЛГ.СТ^1;7СТАЛГЗДА£С1ААГСйСС.МСАТА|^

АСА ГГ. ГСШАТААААААШ ГАЛСССШТАЛТСТТТТААААТП ГШДАТАЛТСТАааГ.аСША/,ТТАТЬййТСДЛА^ТА/ДГ.^(

ДТТСйСССТ ГССЛА1ТСТй1з7 ГСТ§САТСТ«/.Т6ЛТ6ТТГ1ССЛААТАТССТТ11^ССЛАСААГСГ.АТА1ТСЛ1СТ6С ГТТАА^' а : I Г. А Б N С а С 4 3 п у V А К - У Р А Н N Р V 5 5 А I к

ТАМТТСТТСТСААМТАОТАСГАТТС^^ХлСТСбАТТААСДТААТАСЕССАТССГ^^ААСААССАОТАТСТАТТйССАСААССА^ 1Н5С()Н Я 511МИ1Н11Е0ААКЕА 7 516771

?С?СТС1ТАТСДС.«САСГ.ГКТСГГАс1ЕйАТ[.ШТТСШАСТАТАТ0АССТТА^СТАААСТАС;ТАЗСАСйТЛаТ/«;ТСаАС^ V Г, I. I Т А Р 5 I 7 Й I I $ I V У О I I Б К v I. в £ 5 $ £ С,

,77?'

V С# I 31 5Г I Ь1Р. \ijQSVlNDGI АОР

гес П С ТС7АС7С71Л1ЛСАЗС ААС ГА^ 7Т.ЛаАаССТС^ГС0Л7АСЛССАА7ААСА?.^С7АА77С7Г.С77С7СС7(,ААСААС71хЕ' ь 5 Б V I. I У К N V 1. ГАСОЗЫИКИР.«5-А8А£ С I К

г ^'йадтссс^ситслрм^'г^гал^ш |ТГ№ССс:АаСС7СТТТА1^^АТСГ.ТГ6СТСаТ7АССТ;'-АСДЛАА|^(

Л Г'О IАТГАСС1ГГ Г ГИССсЙЩ12сА7ПТ7ССАПТАПАСТЛСТАМЙАТССТАСТАеАТАГСОСАСТААТТбиЙ1

. I 1.1 :. р 5 г а Т" а и р г н I II I а о а т я V а . н я с

рзвимвзниэ N-концевых последовательностей S-эндотоксинов класса г.г/1; посгавлониа с зпвконтлки вторично* структуры эндотоксина СгуША. кочень- остатки, совпадающие п большинстве последовательностей, ¡pam ч'] - инвариантно гидрофобные [j»¡¡ и галрофилы<ый {%} остатки)

у1д -------------------------------MÜ«NPWIMEC\rVNCLSNFEVEVI,GGEn-" 23

VII) ---------..----------------------KKIKNQMQCV?YMCr.SNf KEIILGEEH— - 2 7

y IE -----------------------------MEIVMNÜHQCVPYNCLNXPENEII.DIER--------20

yXC ----------------------------—MEEHHQNQCIFYHCI'.5NPEEVr.LDGES:--------2"

yIF -------------------------------KENMlQHQQVíWCI.NNS'EVEIUIEEi;—- 27

yJB ----------MTSURKHEHEIIH/.tfSNHSAQHDLLPDARIKDELqiAEGmíIDPFVSA--------4 f¡

ylC ---MHQHKHGIICASKUGCASDDVAKYPLANNPYCSALÍJI.NSCQHSSILSWtNIIGD--------5 4

-------------------Ш i

ylll A MNFNNHSEHDTIKlTENHEVPTNHVQyrLAETPÍÍPTLEDLNXKEFLRKTADNNTEAI.ESS 60

у.ТД —IET3YtPIDISLSLXQytX»SEíVrGAGFVÍ.ür.VaiI»GIFGPSQMJJ.\FPVQíE2HNd 6a

VID --LETGNTVADJ£t,GI,IHFLYSllFVr'>JGGFIVGLLELXHGVlG?SQVtni>TiAl}IEQLISQ 3b

ylF -----:;NSi:VAT!JIALKISHI.LA5ATHlGG]LLGLFCAtWG:.IGPS0WDt,FLEQIEI.LID0 8",

■ylC — IS'ÍGNSSIDISI.Sr.VQFLVSMKVPGGGrLVGLIDF'VWGIVGPSCHaM'LVOIEQLIJJE Sí)

•ylF ---StQRLPI.DlSLSLTPFLLSbTVPQVSVAFSi.FDLIKGriTi'SDWSL'rí.LOIEQLIF.q 84

■yTP ---g'ÍVQXGXKJACRILGVLGVPKAGQLA.SFYSFI.VGELHI-RGPjyj.WEIFlEHVglil-INil 105

■y 1С AAKEAVSIGTTIVSLIXAPSbTGLISIVYDtIGKVLGGSí;- -gQSISaESICnLLSI.tDL 112

I В H 1~1Г~ИПШ ГЖИ1ГЖ1

yl II Л TTKDVIQKGÍSVVGDrLGVVGFPFCGAI,V5FYTNFUITIWP-SEDPHKAF.HE'tíV5AbHDÍl 119

"al" ' a 2 я "a ~2h

-y JA HIEEFATtlIQAISRLEGI.SNLVOrYAESFllEWEACPT----NPALRFEinaQFTOrfHSALT^ 14 3

■yin 41EEFAPJ!iAISRl.EG/.3KI.yKvVySAFr>DHEKDPT-----HPALXEE4aiQFHDMnSAI.IT 142

"/IE KI FEFAENQ M KCL EG 15 31, YG X YT EAFREWEADFT---HPALiCEf.MRT QFitDKHS IL VI 141

-y1С ÜIAEFARHAAlANI.EGLGNNFuIY VSAFKEHEEDFN---HVETJrrKVlURFRILDGLLER 142

-ylF S/.írrLERHRAXTTLRGLADSYEijriEÁLEEWEWiPN---H AQLHED VXIRFANTDDA£IX 141

■y IB QITE'l APJITM-ARiCüLGDSFRAYQQSI.L'rHLENRD---DAUTESVLYTÜYIALELDFUÍ 16/.

-ylG HVSQSVLNDGiADFNGSVLLYEHYLEAi.DSHKOp-----HSASAEEL8rRK«IADS,EFDK 168

Cfi щшгштё " -щ-Twwm-b---s—rr ~д-ипяп .

•ylIIÁ Kt/U)YAKSKAU>>EJ-QGi;Qilb^-EDYySAtSS^Ktif^'3SK!^HSQGRlRELFSQA£SlIFPJi 179

" o¡ 3 ~ a 4"

"У1Л AXP¿LA--------VaNYOYPLtSVYVgAAHLHLíVLESVSVFGÜRft'S 133

-yID 4XPLFR--------V0W*BVAU.S»*VaXAK<JÍLSUUU)VSVFU2RHe 182

ry IE AIÍ'LFS---------V2NYQVFFLSVYV0AÁNLHtSVLÍDVEVFGQAWS 181

i-ylC DIPr.FP.--------I SCFL'VPU. SVYAQAANLHLAIJ.RDSVIFGLEWR 102 :

rylF hlVff?, T---------I.TGKEIPLL^VYVQAAHUaSLI.RDAVSFGQGHG 181

ryin. bMítKA--------TrN0EVI'Ll.K"Y>0.\AMLflLLLLRIiA3I.FGSEFG 2П2

ryxa ILTKC:iLTHGGSl.ARQHAQILLI.PSFAt:AAFFHU.tX,I¿3ATRY,GTí!b'a 21S

ryl IIA SM^SFA---------V£GYEVl.FX,TTYA«A>,íiTHt-FI;XJfCS'31 YÍÍEEHi; 2 '.9

;'ис.£ Petip>iMa:iiii.a кгры вставочной области в плазмиде ^OXICZ, содеркав>гм ген cry нуклоощдлая последовательность саквенироаанного фрагмента (на .карте помечен стрелкой и соо1ветствуга )н М-иищчвая аминокислотная поспедооательность тс'сина СгуГА( сопоставлении с другими представителями Crylft-подхпасса показаны тслыю отличия от Crj { Звездочкой (*) отмечена единственная нуклеотндная и аминокислотная замена, стли токсин СгуЩа) от Сг>ХА(Ь) и CrylA(c),'.

о а>

Члс

*

е

su

Ж

8 S ы -

—h /--

• ui в*

CryiAg

-.-SO—

с rv 1Ц с,) GATTGG f AmTMTAAAACAGATGGAAfiT AACnATGGATAACAATCCGAAMTTMlGAMGC АТТСС П tryIA(Q> " И. D К N Р К I Н Е С i Р

сгу!А(а,Ь,с) С ' С С

Сгу!А(а,Ь,с) !«

crylAJa) TuTT ГАЛС TAACCCTGAAGTAGAAGTATT'^GTGEAGAAA&MTA'iAAACTSUnACACCCCAATAGAT ATI

Cr/Щд) CLSIJPEVEVLGGERIETGYTPIOI

cryIA{>.,b,c) С

Cr>IA(a,b,cJ

crviA(q) "iCICTAACnCAAT'ncTCTTGAGTGAATTTGTCCCASGTGCTGGGnTSTATTACGlTTAATTGATTTAAI/ SLTQFLLSEF"PG/ifiFVL6LIDLI cryIA(e,b.cJ G T, Г С AG AC G A

Cr/If,(»,b,c) ; VI

\ • * <--(fcr

crytA(g) rrTGIAGGTCCTTCTCAATGGGATGCATnCTTGTGCAAATTGAACAGTTAATTAGf.CAAAGAATAGAGgAj

CrvfA(g) .f'VCPSQUBAFLVQ I EQL I SQP. 1 E E tryl.Ai'a.h.r.) A T T С CCA A A

r.tyIA(»,b.c) IF P* fl

1. i классификация i-эндотоксинов bacjllus thiiiiimgijïhsiï-.

OWC , Mr '»OPM4 специфично-: гь «первый клонированы

H CFilHI-H!IPOft»HV

;д1ипсс, белка КРИСТАЛ- DHTOHOUlir.llOI 0 __________________ ________.

•руппи) ( l:Da > ЛОВ действия HA: из подвила год

1АСС СгуХ бипкр. lepidoptera

:у1Л(а)-* 133 kur ;>•! aki lia:;

:уХЛ(Ь) 131 ba l iner 19 36

:у1Л(с) 133 kunsCskl : 985

Î 13 3 gail vi 1уч1

L-via 138 t hurinj i eiinl n 1933

.vie 135 cntorr.oc i dus 1Q68

ryJL) 13? aizat'ii i п90

ryXE 133 henjae , 1*j90

cyl? 133 i i ¿nva } 1s 9 1

-y ilL1. U1 (GaUarin ijcil 1er ije 1935

■ melonelia)

Г1ЛСС Cryï r l'y бои Л н. lemdoptdr/.

l'y I TA -Il -»dipteri k'jrst dkl 1989

rylIB 7 1 ( Lrtpidoptfird ) kurr,t эki J 93 3

iTACf CrylII ромбэиль. coleoptera

irylIIA*' 7 3 tembrioris 1987

>-yîIIB 73 tolwnrth.i 1990

ry.'IIC 130 oa 11¿riae 1991

Г.ЛСС CrylV oec л an. 1 ГЛР'ГЕкА

L-ylVA 13-t ! isi nej ensi s 1987

ry 1VB 128 I i<7t aelcnb is 1908

rylVC 7 3 | - i ae ' snsi s 19U6

l'y î VD 7 2 i s't di* l ensj s . _____ _ 1sb8 L

Епепвыа клонированы к частично соквеиироианы в лашюй работа клонированы и кцвш и|>ииирозакы a данной работе.

габл. 2

КОНСТРУИРОВАНИЕ К АНАЛИЗ фАЗ!Ш£НЫХ БИБЛИОТЕК BACILLUS TKUP.INGIEHSIS

КИКЛИОг£КА ÜOilBKiU

KVRS7MKV ■JALLCFIAE

TENEi IF ¡ON IS Al.hSTI

гоыор.ти*

IHPAVl EltSIS Ornvr-ÜUHUS tNXECTUS

) МЕТОДЫ ВЫЯБЛСНК'"

j положительных I КЛОПОВ

j Рмнунофериентный

j Имнунофсрнонткый;

I С-уХА-зонл

j И ккунофкрнентный

ОлигонуклеотиднЫв 5 0нд

Клку нифернентниЯ Ii миуноф <рмещ мый

на тзегнооваиы

__I—

ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ

размер

З.С КЬ 3.5 1;Ь

З.Б 1;Ь.

1.7 кь

класск<£й-КаЦИЯ

CrylA(a)

CrylAig! *

CrylC Cry!IIA

1ОКСЙЧНУСТЪ

для-

Lepldopteia Lepitfoptera

LepivJopt era (yi <«лен для Gal.»ei .lone lis Coleoptira

спорные клонн^спакы я данной работы

1<|бл. Я ТЕСТИРОВАНИИ &НТОНОПАТОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ (ЕИОПРОШ) ТЕСТ ОБЪЕКТ

Lyniantrj3 dispir Шолкупряд непарный

Calleria mellonslla Ноль нош.иная

Hellet his armiqera СоЕка хлопковая

Carpoc^psa pomonel1 а Г'Лоду ерка яблоневая

I Тгп*->1а bisse! Holla Коль платяная

HcJ lot/iis viriplaha Совка люцерновая

| iieJ i'-'thii! marjtlma j "oBKä донниковая

j MumcFti-a brassicae 1 СойКг капустная

____КЛОНИРОВАННЫЕ fEliLl

CrylC

CiylA(g) CL-ylA(b)

I

+

± +

+

_ -j •r 4

± +