Структурно-функциональный анализ ДНК-узнающих белков с помощью синтетических фрагментов ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И /1 /ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КУБАРЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДНК-УЗНАЮЩИХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК

ООЗ 17ЬУЬ*и

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2007

003175980

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им МВ Ломоносова и в научно-исследовательском институте физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ им М В Ломоносова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корреспондент РАН

профессор Цетлин Виктор Ионович

доктор химических наук, профессор Лаврик Ольга Ивановна

доктор биологических наук,

вед научн сотр Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им В А Энгельгардта РАН

Защита состоится 27 ноября 2007 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском государственном университете им M В Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии им АН Белозерского МГУ, аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им MB Ломоносова

Автореферат разослан 27 октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами (НК) является основополагающим фактором существования живой материи Анализ генома человека позволил предположить, что расположенные в нем нуклеотидные последовательности кодируют более 30000 белков По приблизительным оценкам 6% этих белков являются факторами транскрипции, 13,5% - способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами НК-связывающие белки играют ключевую роль в основных процессах жизнедеятельности клетки, таких как регуляция экспрессии генов, транскрипция, трансляция, репликация и репарация Исключительно важным для понимания этих процессов является изучение природы и механизмов образования комплексов белков с ДНК

Первый ДНК-связывающий белок был открыт в 1967 г {Gilbert et al, 1967) С тех пор методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА) было охарактеризовано более 400 комплексов белков с ДНК Анализ кристаллографических данных позволил не только выявить основные принципы ДНК-белковых взаимодействий, но и определить, каким образом белки узнают определенные последовательности в ДНК Однако даже современные возможности РСА и ЯМР не исключают применения других методов исследования НК-белковых взаимодействий Это связано с тем, что «взаимоотношения» между белками и нуклеиновыми кислотами носят динамический характер и могут сопровождаться значительными изменениями структуры биополимеров

В настоящее время наибольший вклад в понимание принципов НК-белкового узнавания вносит изучение сложных функционально зависимых мультибелковых комплексов, формирующихся при различных клеточных процессах В этих исследованиях незаменимыми оказываются методы направленного изменения структуры НК-лиганда, точечной замены определенной аминокислоты белка и ковалентного присоединения белка к НК, образующие группу так называемых биохимических подходов к исследованию механизмов функционирования НК-узнающих белков Указанные методы позволяют получать сведения об отдельных аспектах и деталях НК-белкового взаимодействия, например, установить белковый компонент, непосредственно связанный с определенным участком НК, выявить механизм передачи «сигналов», обеспечивающих согласованное функционирование биомолекул, зафиксировать контакты, существующие лишь короткое время в процессе ферментативного катализа или структурной перестройки объекта Таким образом, биохимические подходы сохраняют свою неизменную актуальность Их применение особенно эффективно в сочетании с анализом данных РСА, сравнением аминокислотных последовательностей белков, моделированием структуры белков и их комплексов с ДНК

Относительно короткие (10-30-звенные) синтетические фрагменты ДНК используются для изучения природных структур и процессов практически с того момента, как были разработаны эффективные методы их получения Развитие химии нуклеиновых кислот позволяет создавать новые типы модифицированных олигонуклеотидов, которые являются мощным инструментом в исследованиях различных аспектов взаимодействия ключевых ферментов и белков клетки с ДНК В

свою очередь, полученная с помощью синтетических ДНК информация может найти практическое применение для направленного воздействия на функционирование биологических систем

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в разработке комплексного подхода к исследованию ДНК-белковых взаимодействий в растворе Этот подход включает в себя детальный анализ взаимодействия ДНК-узнающего белка с синтетическими ДНК-лигандами различной первичной и вторичной структуры, зондирование групп атомов ДНК, вовлеченных в узнавание с белком, методами «отпечатков» и на основе данных по взаимодействию белка с модифицированными аналогами ДНК, выявление фрагментов белка, контактирующих с ДНК, методом ковалентного присоединения к лигандам, содержащим реакционноспособные группировки, и путем изучения свойств мутантных форм белков, моделирование ДНК-белковых взаимодействий

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи

1 Выбрать и охарактеризовать белки - объекты исследования, которые узнают в ДНК последовательности различной длины, относятся к разным классам и участвуют в процессах транскрипции, репарации, метилирования или гидролиза ДНК

2 Предложить оптимальный набор синтетических немодифицированных и модифицированных одно- и двуцепочечных фрагментов ДНК для изучения особенностей функционирования ДНК-узнающих белков

3 Сконструировать новые типы ДНК-лигандов с реакционноспособными группировками для региоселективного ковалентного присоединения к белкам с целью зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах и определения структурных особенностей последних

4 Разработать новые методики тестирования активности ферментов рестрикции, модификации и репарации, методы контроля за ходом ферментативных реакций Оптимизировать стратегию определения функциональных групп белка и ДНК, вовлеченных во взаимодействие

5 Предложить общую схему зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах на различных стадиях их образования

Научная новизна и практическая значимость работы. Предложена стратегия исследования ДНК-белковых взаимодействий в растворе, применимая к любому ДНК-узнающему белку независимо от размера и структуры узнаваемой им нуклеотидной последовательности Получены новые данные, позволяющие сделать выводы об особенностях функционирования р50 субъединицы фактора транскрипции МБ-кВ, урацил-ДНК-гликозилазы, ДНК-метилтрансферазы ЗвоП и эндонуклеаз рестрикции БвоИ, РврСТ, МЬо1, ЕсоЬШ и Муа1 Перспективность разработанного нами комплексного подхода к изучению ДНК-белковых взаимодействий подтверждена данными РСА

Впервые для 30 ферментов рестрикции П-го типа, не являющихся изошизомерами, выявлены консервативные ДНК-связывающие мотивы, сделано предположение об эволюционной взаимосвязи между различными эндонуклеазами Н-го типа, предложен дивергентный сценарий эволюции Выявленные закономерности позволяют на базе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей эндонуклеаз рестрикции предсказывать структурные и функциональные особенности отдельных

представителей этого класса ферментов

Идентифицированы группы атомов участка метилирования ДНК и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции-модификации SsoII, существенные для формирования комплексов с С5-цитозиновой метилтрансферазой SsoII Предложена модель функционирования метилтрансферазы SsoII как белка, сочетающего в себе свойства фермента модификации и фактора транскрипции

Расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой для исследования механизмов действия ферментов рестрикции, модификации и репарации Продемонстрирована перспективность применения олигодезокси-рибонуклеотидов, содержащих остатки 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 1-(3'-дезокси-Р-Т>-трео-пентафуранозил)урацила, для структурного анализа комплексов урацил-ДНК-гликозилазы с ДНК

Получили развитие химические подходы к исследованию белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации белка синтетическими аналогами ДНК Установлено, что ДНК-лиганды, содержащие единичные фосфорил-дисульфидные или 2'-йодацетамидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка ДНК с 2'-0-2-оксоэтильными группами в участке узнавания белка позволяют фиксировать остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда Предложена структура дуплексов с реакционноспособной группировкой в определенном положении кВ-участка для необратимого ингибирования фактора транскрипции NF-kB

Впервые показана возможность выявления АР-эндонуклеазной активности с помощью ДНК, содержащих 1,3-пропандиол Предложены новые методы анализа степени метилирования каждой из цепей субстрата ферментами модификации, определения специфичности действия цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, непрерывного контроля за расщеплением ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции, экспресс-детекции активности ферментов репарации, рестрикции и модификации с помощью лигандов, закрепленных на полимерном носителе Два последних метода могут быть использованы для тестирования примесей неспецифических нуклеаз в препаратах целевых белков

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 2-5-ом рабочих совещаниях фирмы «New England BioLabs» по биологической модификации ДНК (Берлин, Германия, 1990, Вильнюс, Литва, 1994, Инсбрук-Иглс, Австрия 1997) и «Рестрикция/Модификация» (Бристоль, Великобритания, 2004), на международном симпозиуме «Синтетические олигонуклеотиды прогресс и границы практического использования» (Москва, 1991), на конференциях FASEB «Эндонуклеазы рестрикции и модифицирующие метилтрансферазы структура и механизм» и «Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты» (Сакстон-Ривер, Вермонт, США, 1993, 1996), на XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 3-ей конференции IUBMB «Молекулярное узнавание» (Сингапур, 1995), на VII конгрессе FAOBMB «Достижения в биохимии и молекулярной биологии» (Сидней, Австралия, 1995), на международном симпозиуме «Биокатализ-2000» (Москва, 2000), на 5-ой международной конференции по

изучению узнавания в нуклеиновых кислотах (КАССЖ-У) (Шеффилд, Великобритания, 2001), на У-ом симпозиуме «Химия и биология нуклеиновых кислот» (Кембридж, Великобритания, 2003), на ежегодных рабочих встречах «Биохимия белково-нуклеиновых комплексов» и «Ферменты и мультиферментные комплексы, воздействующие на нуклеиновые кислоты» (Гиссен, Германия, 20022004, 2006, Москва, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 статей (5 обзоров) Объем и структура работы. Диссертация изложена на 479 страницах машинописного текста, содержит 192 рисунка, 64 таблицы, 27 схем Диссертация состоит из введения, главы «ДНК-узнающие белки - объекты исследования», обзора литературы на тему «Молекулярные аспекты взаимодействия белков с ДНК», обсуждения полученных результатов, заключения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (694 ссылки)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ДНК-узнающие белки - объекты исследования

Эндонуклеазы рестрикции <■ЭР) П-го типа 5,то// (Я БяоП). РхрО! (Я РярЫ). МуаI (Я МуаЛ. ЕсоШ! (Я ЕсоЯП). МЬо! (Я МЬоР узнают специфическую двутяжевую последовательность нуклеотидов и катализируют гидролиз фосфодиэфирных связей в ДНК ЯБвоН - 5' ¿СХЖЮ 3', Я Рэрв! и Я ЕсоШ! - 5' 4СС\У00 3', Л Муа1 -5' СС4-МЮО 3', ЯМЬо1 - 5' 4-ОАТС 3' (Ы = А, в, С, Т, V/ = Т, А, 4 - место гидролиза) Выбор ферментов обусловлен различиями в свойствах и субстратной специфичности, а также их возможным «родством» с эндонуклеазами, для которых имеются данные РСА и/или результаты, полученные биохимическими методами Особый интерес представляло сравнительное изучение особенностей функционирования Я Муа1, Я ЭвоП, Я РврИ, Я МЬо1 и Я ЕсоГШ, выявление гомологичных участков в их первичной структуре и поиск эволюционной взаимосвязи между ними

ДНК-метилтранс<Ьераза (МГаза) БьоЦ СМ Яяо 17) узнает в двутяжевой ДНК ту же последовательность, что и Я БвоП, и метилирует внутренний остаток (1С этого участка (5' ССИвв 3') с образованием 5-метил-2'-дезоксицитидина (Никольская и др, 1983) Уникальной особенностью М ЗвоП является наличие протяженной И-концевой области (1-71 аминокислотные остатки), предшествующей первому консервативному участку белка Показано, что 1Ч-концевая область определяет способность М ЗбоП выступать в роли фактора транскрипции стимулировать экспрессию собственного гена и ингибировать экспрессию гена, кодирующего Я БвоП {Karyaglna е/ а/, 1997) Таким образом, М ЗвоП представляет собой уникальный бифункциональный белок с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования Бифункциональные белки такого типа практически не изучены

В большинстве случаев химические механизмы действия ДНК-гликозилаз неизвестны или предложены на основании статических кристаллических структур Изучаемая нами ураиил-ДНК-гликозилаза СУПГ) из плаценты человека является простейшей монофункциональной гликозилазой, лишенной эндонуклеазной активности по отношению к апиримидиновому (АР) участку Фермент катализирует

гидролиз N-гликозидной связи между урацилом и углеводофосфатным остовом В ряде случаев в сравнительных экспериментах использовалась УДГ из Е coli

Ядерный фактор транскрипции NF-кВ является основным элементом в системе регуляции экспрессии большого числа генов Одним из аспектов, необходимых для понимания принципов функционирования NF-кВ и для создания новых подходов к направленному регулированию его активности, является изучение молекулярных основ взаимодействия этого белка с ДНК В качестве модели фактора транскрипции NF-кВ использовали р50 субъединицу NF-кВ человека, соединенную с глутатион-S-трансферазой (p50-GST) Известно, что такой белок в виде гомодимера эффективно взаимодействует с кВ-участком, представляющим собой двутяжевую 10-звенную последовательность нуклеотидов 5'-GGGRNNYYCC-3' (R = A, G, Y = Т, С, N = A, G, Т, С) {Kieran et al, 1990, Smith et al, 1988) '

2. Разработка новых методик анализа взаимодействия ферментов рестрикции, модификации и репарации с ДНК Оценка степени метилирования отдельных цепей дуплекса метилтрансферазами

Метод слежения за метилированием каждой из цепей ДНК основан на введении в лиганд двух радиоактивных меток 3Н и 32Р В качестве субстратов следует использовать ДНК-дуплексы с цепями разной длины для их эффективного разделения в полиакриламидном геле (ПААГ) Такой субстрат инкубируют с МТазой в присутствии Э-аденозил-Ь-метиошша (AdoMet), содержащего 3Н в составе метальной группы Затем в реакционную смесь добавляют 32Р-меченные олигонуклеотиды с точно измеренной радиоактивностью и с той же электрофоретической подвижностью, что и олигонуклеотиды, формирующие ДНК-субстрат 32Р-метка служит как маркер при авторадиографии и как внутренний стандарт для корректного определения счета по 3Н После электрофоретического разделения и извлечения олигонуклеотидных фракций из геля определяют значения 3Н- и 32Р-радиоактивности Полученные величины радиоактивности цепей дуплекса по тритиевой метке пересчитывают с учетом изменения 32Р-радиоактивности образцов

Спектрофотометрический метод контроля за ходом расщепления дуплексов

эндонуклеазами рестрикции Суть метода заключается в регистрации гиперхромного эффекта, обусловленного фрагментацией субстрата под действием ЭР и последующей его диссоциацией на одноцепочечные олигонуклеотиды Для того, чтобы в ходе кинетического эксперимента наблюдалось увеличение оптической плотности при 260 нм, необходимо выбрать субстрат такой длины и такую температуру реакции, чтобы обеспечить существование субстрата в двутяжевой форме в начальный период времени и частичную или полную диссоциацию продуктов расщепления На

* М SsoII, М SsoII(C142A), MNlaX с шестью остатками His на N-конце предоставлены Карягиной А С (НИИЭиМ РАМН), Лавровой Н В и Тихоновой Т В (ВНИИСБ РАСХН), УДГ из плаценты человека -Невинским Г А (ИХБиФМ СО РАН), УДГ из Е coli нативной или модифицированной структуры -Ворониной ОJI (ВНИИСБ РАСХН) и Гончаром ДА (ООО «СибЭнзим») Мутантные формы субъединицы р50 с глютатион-Э-трансферазой на N-конце получены Колесниковым И В , Молочковым HB и Тимченко М А (Институт белка РАН) Фрагменты ДНК, в том числе модифицированные, синтезированы сотрудниками химического факультета и НИИФХБ МГУ Романовой Е А, Метелевым В Г, Волковым Е М, Зацепиным Т С , Зубиным Е М под руководством проф Орецкой T С

спектрофотометре регистрируют зависимость прироста А260 (ААгбо) от времени, значение А260 в момент добавления фермента принимают за ноль (рис 1) Спектрофотометрический метод позволяет получить непрерывную кинетическую кривую гидролиза субстрата ферментом Он может быть рекомендован для тестирования препаратов на присутствие определенной ЭР или, напротив, неспецифических эндо- или экзонуклеаз, быстрого определения кинетических параметров реакции

Рис 1. Расщепление субстрата I 5' АССТАСС j TGGTGGT 3' 3' TGGATGGA t ССАССА 5' эндонуклеазой рестрикции Mval (участок узнавания выделен, i - места гидролиза фосфодиэфирных связей) Зависимость прироста оптической плотности реакционной смеси при 260 нм (ДА2бо) от времени в интегральной (1) и дифференциальной (2) формах

Экспресс-метод тестирования активности ферментов

Оригинальный подход, пригодный для быстрой проверки активности ферментов рестрикции, модификации и репарации, разработан с помощью ДНК-субстратов, иммобилизованных на полимерном носителе К олигонуклеотиду, закрепленному на полимере на основе силикагеля CPG-500 и содержащему на 5'-конце 32Р-метку, добавляют комплементарную матрицу, формируют дуплекс и инкубируют с ЭР При гидролизе фосфодиэфирной связи в участке узнавания фермента меченые продукты с полимерного носителя переходят в раствор, что позволяет судить об активности эндонуклеазы на качественном уровне

Для тестирования активности ДНК-метилтрансфераз иммобилизованный субстрат первоначально инкубируют с ферментом модификации Затем в реакционную смесь добавляют ЭР, действие которой блокируется в случае метилирования ДНК Об активности МТазы свидетельствует отсутствие 32Р-метки в растворе

Для оценки активности УДГ использовали dU-содержащий 5'-32Р-меченный олигодезоксирибонуклеотид, иммобилизованный на носителе Tenta Gel S-NH2 Для расщепления углеводофосфатного остова в AP-участке, образующемся после удаления урацила, применяли концентрированный раствор аммиака, что позволило значительно ускорить процедуру гидролиза В отличие от CPG-500 носитель Tenta Gel S-NH2 в этих условиях не подвергается деструкции, поэтому появление 32Р-метки в растворе обусловлено только расщеплением AP-участка в иммобилизованном субстрате

Метод универсален и может быть использован для тестирования активности широкого набора ферментов нуклеинового обмена при синтезе соответствующего субстрата, а также для выявления примесей неспецифических нуклеаз в препаратах белков Кроме радиоактивной метки на 5'-конец иммобилизованного ДНК-фрагмента можно вводить флуоресцентные маркеры

005 -

20 40 60 80

прсмя, мин

Определение неметилируемого (1С в участке узнавания цитозиновых МТаз

Предлагаемый подход основан на применении бисульфитной реакции в сочетании с УДГ При разработке метода была использована М БвоИ На схеме 1 рассмотрены два возможных варианта метилирования МТазой участка узнавания в ДНК (А, Б) На стадии 1 субстрат инкубируют с М БйоП в присутствии Ас1оМе1:, добиваясь исчерпывающего метилирования Затем реакционную смесь обрабатывают эндонуклеазой рестрикции БвоИ для удаления неметилированных молекул ДНК (стадия 2) Я ЗбоИ гидролизует участок узнавания, если внутренний или внешний остаток <1С неметилирован (Упорова и др, 1985, Громова и др, 1991) Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях разделяют цепи ДНК-дуплекса (стадия 3) Для удобства разделения одна цепь должна быть на несколько нуклеотидных звеньев длиннее другой Метилированные олигонуклеотиды выделяют из геля, обрабатывают бисульфитом натрия (стадия 4) и обессоливают Бисульфит натрия обратимо присоединяется по двойной связи С5-С6 цитозина Образующийся аддукт при обработке щелочью (стадия 5) быстро дезаминируется с последующим отщеплением бисульфита Полученный <Ш-содержащий олигонуклеотид инкубируют с УДГ (стадия 6) После расщепления ДНК по АР-участку реакционную смесь разделяют методом электрофореза в ПААГ, содержащем 7 М мочевину (стадия 7) По длине образовавшегося олигонуклеотида определяют, какой остаток <1С неметилирован Единственным ограничением этого подхода является необходимость конструирования субстратов, у которых отсутствуют остатки с!С в последовательности, примыкающей к участку узнавания МТазы с 5'-конца Разработанный метод был применен для определения специфичности действия МТазы Ы1аХ

3. Характеристика синтетических ДНК-лигандов

Исследование свойств ДНК-узнающих белков целесообразно начинать с изучения их взаимодействия с пемодийииированными ДНК-дуплексами Такие лиганды позволяют определить оптимальные условия функционирования ДНК-узнающих белков и охарактеризовать термодинамические и кинетические параметры ДНК-белкового взаимодействия, стехиометрию процесса комплексообразования

*р—сстсо-

А

/

♦р—т'сстсда—

I

*р-т'ССТСО-

I

*р-т'СХГТСЮ-

I

*р-ш'С + ТСО-

Стадии 1,2 ^

*р-Ст'СТСО-

Стадия 3 |

*р-Ст'СТСО-

Стадии 4,5 ^

*р-ит'СТСО-

Стадии 6,7 ^

*р- + т'СТ(50-

А Б

р*-32Р

т5С - 5-метил-2'-дезоксицитидин и - 2'-дезоксиуридин

Схема 1.

Немодифицированные ДНК-дуплексы с вариациями нуклеотидной последовательности, использованные для изучения свойств ДНК-узнающих белков -объектов исследования, представляют собой короткие 11-20-звенные субстраты с одним участком узнавания и более протяженные 30-47-звенные ДНК-дуплексы В отдельных экспериментах использовали субстраты конкатемерного типа и ПЦР-фрагменты, содержащие один или два участка узнавания изучаемых ЭР

Модифицированные ДНК-дуплексы дают возможность идентифицировать фрагменты ДНК, вовлеченные во взаимодействие с белком, прояснить детали механизма функционирования белка По способу введения модификации применяемые нами ДНК-лиганды могут быть разделены на две группы К первой группе относятся олигонуклеотиды, модификацию которых проводили после завершения химического синтеза (постсинтетическая модификация) Так, для получения ДНК-лигандов, содержащих апуриновые/апиримидиновые участки, N7-метил-2'-дезоксигуанозин или этоксифосфатную группу, немодифицированный дуплекс обрабатывали в условиях статистической модификации муравьиной кислотой, гидразином, диметилсульфатом или К-этил-1Ч-нитрозомочевиной соответственно Такой прием использовался нами в методе «отпечатков»

Во вторую группу входят модифицированные ДНК, полученные в процессе олигонуклеотидного синтеза В данной работе расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой В качестве аналогов субстратов ферментов рестрикции, модификации и УДГ предложено использовать олигонуклеотиды, в которых одно или несколько нуклеозидных звеньев заменено на остаток (211,28)-2-оксиметилтетрагидрофуранола-3 ((ИК) или на остаток 1,3-пропандиола (Ргф Для подтверждения участия оснований в дискриминационных взаимодействиях белка с ДНК использовали ациклический аналог нуклеозида - 9-[1'-гидрокси-2'-(гидроксиметил)этокси]метилгуанин ((ДО)

-о—, „ _о----Сиа

о о

(КШ 4 " РГЙ —О—(СН2)3—О— дЮ

I I

Введение таких модификаций в состав 14-звенного ДНК-дуплекса приводит к понижению его температуры плавления (Т„л) на 14-19°С, однако данные КД свидетельствуют об отсутствии существенных конформационных изменений двойной спирали

Сконструированы лиганды, которые содержат нуклеозид-ные остатки с модификацией в 2'-положении рибозного кольца, моделирующие структурную гетерогенность ДНК 2'-дезокси-2'-фторуридин (Ш), 2'-амино-2'-дезоксиуридин (пЦ), и нуклеозидные остатки с инвертированной гидроксильной группой при С2'- или СЗ'-атоме 1-(2'-дезокси-Р-Б-/й/>ео-пентафуранозил)урацил (тимин) хи (хТ), 1 -(З'-дезокси-Р-В-трео-пентафуранозил)урацил (Ш)

Замена атома Н в 2'-положении фуранозного кольца на атом Б не влияет на стабильность 14-звенного дуплекса, в то время как замена атома Н на ЛИг-группу или

инверсия ОН-групиы у С2'- или СЗ'-атомов понижает его Тпл на 5-8°С Спектры КД дуплексов, содержащих остатки хТ или Ш, существенно отличаются от спектра немодифицированного дуплекса положением точки нулевого перехода и максимума полосы положительного Коттон-эффекта, но при этом практически совпадают друг с другом Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии в хТ(хЦ)- и Ш-содержащих дуплексах структурно-модифицированного фрагмента с частично нарушенными «стэкингом» оснований и системой водородных связей В случае Ш-модификации в составе ДНК-дуплекса, кроме того, появляется неприродная 2'-5'-межнуклеотидная связь

Для идентификации роли отдельных атомов и групп атомов гетероциклических оснований ДНК во взаимодействии с белком незаменимой оказывается точечная модификация гетероциклов В табл 1 приведены аналоги гетероциклических оснований, использованные в настоящей работе Все они не оказывают существенного влияния на вторичную структуру двутяжевого ДНК-лиганда

Таблица 1 Аналоги гетероциклических оснований, используемые для конструирования ДНК-лигандов с точечными модификациями в участке узнавания белков

Гетероциклическое основание Аналог гетероциклического основания Условное обозначение нуклеозида Зондируемая группа атомов

тимин урацил 5-фторурацил 5-бромурацил 5-йодурацил аи я5аи Ьг5с1и 15аи 5-СНз, большая бороздка 5-СНз, большая бороздка 5-СНз, большая бороздка 5-СНз, большая бороздка

цитозин 5 -метилцитозин 4-метилцитозин птУС т4с1С 5-Н, большая бороздка 4-N112, большая бороздка

аденин 6-метиладенин тМА 6-ЫН2, большая бороздка

гуанин гипоксантин <п 2-КНг, малая бороздка

Уникальными инструментами исследования механизма действия ДНК-узнающих белков оказались дуплексы с неканонической вторичной структурой Мы использовали три типа таких структур, синтезированных в нашей лаборатории гантелеобразный ДНК-дуплекс (ДНК-«дамбл»), дуплекс, концы которого соединены остатком полимиксина М и дуплексы с химической «сшивкой» между цепями Подтверждением структуры всех «сшитых» дуплексов является повышение их термической стабильности по сравнению с исходными ДНК, а также устойчивость к нуклеазному гидролизу

/СССААССсЮОССТСТррСТ^

3 44 свст тев-Ассолсй—с А 3

5 ' СССТс№ЗАС<ЗССАСТТТСССАсМ:ССС 3 '

I I

3 ' СССАпОСТССССТСАААТССТпЦАССС 5 1

cN - ненуклеозидная вставка с карбоксильной группой

пи - 2'-амино-2'-дезоксиуридин

АСАСС(ЗСАСТТТСССАС -

С^Полимиксин М)

Г7

. о-р -ш о-

тстсссстсааассстссса-

Выделены участки узнавания Я БвоП, И Муа1, Я ЕсоЯП, Я РэрСТ, М БвоИ и фактора транскрипции ОТ-кВ

Основное внимание в данной работе было уделено развитию химических подходов

к исследованию белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации белка реакционноспособными аналогами ДНК Мы применяли три типа реагентов 1) фотоактивируемые ДНК-дуплексы, содержащие остатки 5-бром- или 5-йод-2'-дезоксиуридина, 2) ДНК-дуплексы с реакционноспособной межнуклеотидной группировкой (замещенной пирофосфатной, фосфорилдисульфидной), 3) ДНК-дуплексы, несущие активную группировку (альдегидную, йодацетамидную) в 2'-положении углеводного фрагмента Важной особенностью этих ДНК-лигандов является то, что предложенные модификации могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи Фотоактивируемые НК широко используются для зондирования аминокислотного окружения гетероциклических оснований ДНК в предварительно сформированных белково-нуклеиновых комплексах Остальные реагенты позволяют анализировать контакты белков с углеводофосфатным остовом ДНК Такие модификации не должны нарушать комплементационные взаимодействия и специфические контакты в белково-нуклеиновом комплексе Мы показали, что реагенты второго и третьего типа способны взаимодействовать с определенной аминокислотой белка с образованием устойчивого конъюгата без дополнительной активации при значениях рН 6,0-8,0 и сохранять стабильность в нейтральных водных растворах в течение длительного времени без потери реакционной способности

ДНК-лиганды с межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировкой

Для введения межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировки (ЗПГ) в заданную позицию цепи ДНК использовали метод химического лигирования олигонуклеотидов, содержащих моно- и дизамещенные концевые фосфатные группы, на комплементарной матрице под действием 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимида В зависимости от того, какой из концевых фосфатных остатков, 3'- или 5'-, в исходном олигонуклеотиде этерифицирован, возможно образование двух изомерных ЗПГ-содержащих дуплексов (схема 2) Соединения с ЗПГ 2>-типа получены впервые

Все модифицированные олигонуклеотиды расщеплялись под действием 0,5 М раствора пропилендиамина (ПДА) с рН 8,0 в течение 12 ч при 37°С с эффективностью около 95% Нуклеофильная атака и присоединение ПДА происходит по неэтерифицированной фосфатной группе в межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировке (схема 2), что согласуется с данными о свойствах ЗПГ-содержащих дуплексов Л-типа, описанных ранее (Кузнецова и др, 1990)

0

1

0= р—осн.

0

о=р-о-

1

о

®

о=р-осн, он

мн-<сн2)гмн2 о=р-о-I

0

1

о=р-о-

инг-(снг)3-ннг

0=р-осн,

о

®

0

1

о=р-о-

I

МН-(СНг)ГМН2

он

о=р-осн,

Схема 2

Для оценки реакционной способности ЗШ -содержащих ДНК-дуплексов по отношению к различным 1гуклеофилам использовали низкомодекулярные соединения, имитирующие функциональные группы боковых цепей ряда аминокислот: ПДА (Lys), имидазол (His), этилгуапидип (Arg), дитиотреит (Cys), n-крезол (Туг), этанол (Ser и Thr), ацетамид (Asn и Gin) и уксусную кислоту (Asp и: Glu). Эти сосдинснргя инкубировали с реак ц и о ш юспособным дуплексом при 20°С в 7,5 мМ HEPES-буфере (рН 8,0), содержащем 34 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,05 мМ ЭДТА. 0,5 мМ дитиотреит (условия формирования комплекса р50 субъединицы фактора NF-kR с лигандом) в течение 12 ч. Только ПДА и имидазол взаимолейстпугот с ЗПГ в модифицированном дуплексе (рис. 2). Можно полагать, что и ходе аффинной модификации с ЗПГ-содержащими фрагментами ДНК будут реагировать остатки Lys и His бачка.

; 2 j 4 ч б ? я «

ДНК-лигаиды, содержащие фосфорилдисульфидную группировку Межнуклсотидпую фосфорилдисульфидную группировку (ФДСГ) вводили в ДПК аутолнгиров ai ! и ем З'-тттоф ос формированного о л и го 11 у клеотида с 2-пириди.чди сульфидным аддуктом 5'-дсзокс11-5'-меркаптопрои'шодпого олитонуклеогида в 15 мМ натрий-нитратном буфере (рН 4,5), содержащем 150 мМ NaCl и 20 мМ MgCb, в отсутствие комплементарной матрицы (схема 3). При проведении реакции в течение 30 мид при 25"С выходы, продуктов составили 95-98%.

Олигопуклсотиды и ДНК-дуплексы с ФДСГ инкубировали с дитиотреитом (ДТТ), -ацетил-L-jj на и н ом, N" - ai 1сти л -L-ци стсин ом и глутатиопом (у-Ъ-глутами л - L-цистеинил глицином). ФДС1' в составе ДНК количественно расщеплялась под действием 50 мМ раствора ДТГ в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5, 1ч, 20°С) и 0,3 мМ раствора ^'"-ацетил-L-ци сте и и а (рП 7,5, 1-5 ч, 20°С), но практически ие реагировала с производным лизина (8 мМ, 5 ч). Весьма вероятно, что в ДНК-белковом комплексе эта реакнионнеспособная группировка будет преимущественно взаимодействовать с остатками Cys, в то время как амин01руппы остатков Lys останутся незатронутыми.

Ряс. 2. Авторадао!рамма электрофорстичеекого разделения в 20%-ном ПААГ с 7 М мочевиной реакционных смесей, содержащих дуплекс с ЗПГ ^-типа и одно из модельных соединений: дорожка 2 - зтанол. 3 - пропиле![диамин, 4 - имидазол, 5 - этилгуанидин, 6 - п-крезол, 7 - дитиотреит, й' - уксусная кислота, 9 - ацетамид. Дорожка I - исходный модифицированный дуплекс.

Схема 3.

Глутатион также эффективно взаимодействует с ФДСГ-содержащими ДНК В результате реакции тиол-дисульфидного обмена образуется конъюгат между пептидом и олигонуклеотидом Атака з' 5' з- |5'

тиольной группы Суэ глутатиона направлена на атом серы ФДСГ, связанный с 5'-метиленовой группой (схема 4) Структура образующегося олигонуклеотидо-пептида была подтверждена методом масс-спектрометрии и встречным синтезом

ДНК-лиганды, содержащие 2 '-йодацетамидную группировку Для синтеза 2'-йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов использовали олигонуклеотиды с единичными 2'-амино-2'-дезоксиуридиновыми звеньями (схема 5), которые ацилировали избытком ангидрида йодуксусной кислоты в среде ацетонитрил/1 М натрий-боратный буфер (рН 8,3) в темноте при 37°С в течение 2 ч Реакционные смеси анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте Выход продуктов ацилирования составил 70-95%

Схема 5

Совокупность данных, полученых с использованием модельных соединений (глутатиона, ДТТ, №-ацетил-Ь-лизина и гексаметилендиамина), позволяет предположить, что за короткий промежуток времени (15-30 мин) при рН 7,5-8,3 йодацетамидная группировка в составе ДНК-белкового комплекса будет преимущественно взаимодействовать с остатками Cys, в то же время аминогруппа Lys должна подвергаться алкилированию со значительно меньшей эффективностью Для подтверждения тиоэфирной природы связи между олигонуклеотидом с 2'-йодацетамидной группировкой и остатком Cys белка можно использовать реакцию селективного расщепления C-S-C-связи нитратом серебра (Sinha and Striepeke, 1991)

ДНК-лиганды, содержащие 2'-альдегидную группировку Добиться селективного связывания Е-аминогруппы боковой цепи остатка лизина можно, применяя для аффинной модификации белков НК-лиганды, содержащие в составе углеводного фрагмента альдегидные группы (Brevnov et al, 1997, Tumtskaya et

0

1

о=р-о-I

s I

s I

сн,

y —Glu—Cys—Gly I

s-

Схема 4

0

1

0=p-0-I

s-

Y —Glu—Cys—Gly

S

/

S' <k

а1, 1999) В развитие этого подхода мы предложили использовать ДНК, содержащие единичные 2'-0-(2-оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья (^Шйерш & а1, 2002)

Исходными соединениями для синтеза служили олигонуклеотиды с единичными 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридиновыми (цитидиновыми) звеньями, 1,2-диольную группировку которых окисляли периодатом натрия при комнатной температуре в ацетатном буфере (рН 4,5) и формировали ДНК-дуплексы (схема 6) После реакции е-аминогруппы боковой цепи остатка лизина белка с 2'-альдегидной группой в ДНК образующееся основание Шиффа восстанавливали до вторичного амина КаВН3СЫ

НА иг,™

>Чрн

?

о=р-о-

2 комплементарная ОН матрица

щ

ига(С^)

-а(°) г-1 о 0=1^»

NaBH.CN

Схема 6.

нгс ига(Су1)

О о I.ув

Я-4

4. Структурно-функциональный анализ ДНК-узнающих белков

4.1. Субъединица р50 фактора транскрипции NF-кB

Использование гомодимера р50 фактора транскрипции №-кВ, как объекта исследования, обусловлено возможностью сравнения результатов его взаимодействия с ДНК, полученных с помощью биохимических подходов, с данными РСА Нами проанализированы трехмерные структуры комплексов фактора МР-кВ с ДНК, определены консервативные и вариабельные ДНК-белковые контакты в зависимости от субъединичного состава белка и нуклеотидной последовательности участка узнавания, построены модели взаимодействия р50 субъединицы с «идеальным» палиндромным кВ-участком (Ы-кВ 5'-ССОААТТССС-3') и кВ-последовательностью из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (1§-кВ 5'-ОССАСТТТСС-3') Эти кВ-участки различаются нуклеотидной последовательностью и числом нуклеотидных пар между Св-корами (рис 3) В ходе работы были сконструированы наборы реакционноспособных ДНК-лигандов для аффинной модификации гомодимера р50-08Т В качестве базовых соединений использовали ДНК-дуплексы П-У Каждый модифицированный ДНК-дуплекс в одном из положений кВ-участка содержал межнуклеотидную замещенную шфофосфатную или фосфорилдисульфидную группировку, остаток 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридина, 2'-0-(2-оксоэтил)уридина или 2'-0-(2-оксоэтил)цитидина Места модификации выбраны в соответствии со схемами контактов димера субъединицы р50 ОТ-кВ с соответствующими участками узнавания (рис 3) и представлены в табл 2-4

а

Рис, 3, Схемы взаимодействия гомодимсра р50 субъединицы фактора транскрипции МР-кВ с: а - Ш-кВ-участком, б - 1ц-кВ-участком. Синими стрелками показаны вап-дер-ваальсовы взаимодействия между нсполярпыми атомами, черными стрйлкаыи - водородные связи, пунктирными фиолетовыми стрелками - контакты, допускающие образование водородной связи (3,5-4,0 Л); аминокислоты, относящиеся к одной субъедииице, выделены I'Н ко второй -СЦ2; СС-коры выделены П.

12345678 910 12345678 910

Л 5' ACCTCGGAAAGTCCCCTCT ш 5' ACCTCGGGAATTCCC СТСТ

3' GAGCCTTTCAGGGGAGA 3' GAGCCCTTAAGGGGAGA

Ig-кВ Id-кВ

IV

12345678 »10 12345678 910

5' ТС GGAAAGTCCCCTC у 5' TGGGAATTCCCCTC

3' AG CCTTTCAGGGGAG 3' A CCCTTAAGGGGAG

Ig-icB Id-кВ

Методом «торможения в геле» было установлено, что все модифицированные дуплексы связываются с гомодимером p50-GST так же эффективно, как и немодифицированные дуплексы II-V То есть введение единичной реакционноспособной группировки в различные положения кВ-участка не препятствовало образованию специфических ДНК-белковых комплексов

5'-Фосфатную группу 3-8-го нуклеотида Ig-кВ-участка (дуплекс II) и 4-, 5- или 8-го нуклеотида Id-кВ-участка (дуплекс III) заменяли на ЗПГ А- или .¿»-типа Дуплексы с ЗПГ, примыкающей с 5'-конца к нуклеозиду 9 обоих участков узнавания, использовались в качестве негативных контролей Выходы конъюгатов, образующихся при взаимодействии дуплексов, содержащих ЗПГ в различных положениях Ig-кВ- и Id-кВ-участков, с p50-GST приведены в табл 2

Таблица 2 Результаты аффинной модификации р50 субъединицы фактора ОТ-кВ ДНК-лигандами, содержащими межнуклеотидную замещенную пирофосфатную группировку

Дуплекс Нуклеозид-5'-фосфат, подвергнутый модификации Аминокислота, сближенная с кВ-участком по данным РСА Выход конъюгата*, %

(кВ-участок) ЗПГ Л-типа ЗПГ £-типа

A3 — 1 1

II A4 Lys272, Gln274, Gln306 1 5

(Ig-кВ) А5 Lysl44 50 1

G6 Tyr57, Lysl44 30 5

Т7 Cys59, Lys241 15 1

С8 Lysl45, Cys59 35 5

С9 — 2 10

A4 Arg30S 3 н/о

III А5 Gln274, Gln306 11 н/о

(Id-кВ) С8 Lysl4S, Cys59 10 н/о

С9 — 2 н/о

* Реакцию ковалентного связывания p50-GST с ДНК-лигандами, содержащими 32Р-метку в неэтерифицированной фосфатной группе ЗПГ, проводили в HEPES-буфере (рН 8,0) при 2(fC в течение 12 ч Далее реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПЛАТ, содержащем додецилсулъфат натрия (ДСН) Выход ДНК-белковых конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%, «н/о» - не определяли

Для дуплексов, содержащих ЗПГ А-типа, эффективность ковалентного связывания с белком зависит от положения реакционноспособной группы в углеводофосфатном остове ДНК Полученные нами данные иллюстрируют достаточно фиксированную локализацию ДНК-белковых контактов в центре связывания Так, выход ДНК-белковых конъюгатов различается в 50 раз для дуплексов с ЗПГ Л-типа в 4- и 5-ом положениях Ig-кВ-участка Выходы конъюгатов p50-GST с лигандами, содержащими ЗПГ Б-типа, не превышают 10% независимо от места введения модификации

Схемы распределения контактов между остатками лизинов и фосфатными группами Ig-кВ- и Id-кВ-участков различаются (рис 3) Этим может быть обусловлена низкая эффективность аффинной модификации p50-GST производными дуплекса III, содержащими ЗПГ Л-типа Остаток Lys 145 р50 субъединицы NF-kB сближен с 5'-фосфатом, примыкающим к остатку dC в 8-ом положении обоих кВ-участков Однако выход конъюгата в случае модифицированного в этой позиции дуплекса II в 3 раза выше по сравнению с модифицированным дуплексом III, что, возможно, связано с большим сродством гомодимера р50 к Ig-кВ-участку (Kunsch et al, 1992) Все полученные конъюгаты разрушаются под действием 5 M водного NH2OH (рН 5,0) Этот результат свидетельствует об образовании фосфоамидной связи и подтверждает предположение о том, что с ЗПГ в составе ДНК-дуплексов реагируют функциональные группы боковых цепей остатков Lys или His Соответствие результатов ковалентного связывания ДНК-белок для производных дуплекса II, содержащих ЗПГ Л-типа вместо 5'-фосфатной группы 3-, 5-, 6-, 8- или 9-го нуклеотидов Ig-кВ-участка, данным РСА позитивно характеризует возможности развиваемого нами метода аффинной модификации по определению контактов нуклеофильных групп аминокислотных остатков белка с межнуклеотидными фосфатными группами в ДНК

Для зондирования остатков цистеина р50 субъединицы NF-kB, сближенных с углеводофосфатным остовом в составе белково-нуклеинового комплекса, использовали ФДСГ- и 2'-йодацетамидсодержащие ДНК-лиганды ФДСГ вводили вместо 3'-фосфатной группы 6- или 7-го нуклеотидов Ig-кВ-участка Остатки 2'-амино-2'-йодацетамидоуридина находились в одной из цепей дуплексов IV и V в 5-, 6- или 7-ом положении кВ-участка Из табл 3 видно, что аффинная модификация p50-GST ДНК-лигандами с 2'-йодацетамидной или фосфорилдисульфидной группировкой в 7-ом положении кВ-участка, протекает с высокой эффективностью (выходы ДНК-белковых конъюгатов составляли 18-33%) При использовании дуплексов, содержащих модификацию в других положениях кВ-участка или без него, выходы ковалентно связанных комплексов с р50 субъединицей NF-kB не превышали 6% Для доказательства тиоэфирной (в случае 2'-йодацетамидсодержащих лигандов) или дисульфидной (в случае ФДСГ-содержащих лигандов) природы связи в ДНК-белковых конъюгатах использовали водный раствор AgNÛ3 или восстанавливающие агенты (ДТТ, трис(2-карбоксиэтил)фосфин) соответственно

Только Cys59 входит в состав ДНК-узнающего центра р50 субъединицы NF-kB (рис 3) Нами получена мутантная форма p50-GST, в которой остаток Cys59 заменен на Ala Белок p50(C59A)-GST образует специфические комплексы со всеми реакционноспособными ДНК-лигандами так же эффективно, как и с

немодифицированными дуплексами Замена остатка Cys59 на остаток Ala существенно не влияет на сродство р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ к ДНК Аффинная модификация p50(C59A)-GST модифицированными ДНК-лигандами не приводила к образованию ДНК-белковых конъюгатов Очевидно, именно остаток Cys59 белка ответственен за образование ковалентной связи с ДНК-лигандами обоих типов Полученные результаты согласуются с данными РСА и схемой ДНК-белковых контактов (рис 3), согласно которым остаток Cys59 р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ сближен с З'-фосфатной группой 7-го нуклеотида Id-кВ- и Ig-кВ-участка

Таблица 3. Результаты аффинной модификации р50 субъединицы фактора NF-кB ДНК-лигандами, содержащими фосфорилдисульфидную или 2'-йодацетамидную группировку

Дуплекс (кВ-участок) Нуклеозид-З'-фосфат, подвергнутый модификации Аминокислота, сближенная с кВ-участком по данным РСА Выход ДНК-белкового конъюгата*, %

2'-йодацетамид-содержащий дуплекс ФДСГ-содержащий дуплекс

II, IV (Ig-кВ) А5 — 1 н/о

G6 Cys59 4 4

Т7 33 18

V (Id-кВ) А5 — 4 н/о

Т6 — 6 н/о

Т7 Cys59 26 н/о

Модифицированный ДНК-дуплекс без кВ-участка 2 4

* Реакцию ковалентного связывания радиоактивно меченных ДНК-лигандов с р50-С5Т проводили в НЕРЕВ-буфере (рН 7,5), не содержащем ДТТ, в течение 30 мин при 25°С В случае 2'-йодацетамидсодержащих дуплексов 32Р-метка находилась на 5'-конце модифицированной цепи, в случае ФДСГ-содержащих - на 3'-конце Далее реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем ДСН Выход конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%, «н/о» - не определяли

Для выяснения особенностей комплексообразования и ковалентного связывания гомодимера р50 субъединицы ОТ-кВ с 2'-альдегидсодержащими ДНК-лигандами использовали ДНК-дуплексы IV и V Модифицированный остаток уридина или цитидина вводили в указанные в табл 4 положения одной из цепей ^-кВ- или И-кВ-участка Аффинную модификацию р50-08Т 5'-32Р-меченными ДНК-лигандами проводили в условиях специфического связывания в течение 30 мин в НЕРЕБ-буфере (рН 7,5) при 25°С Образующееся в результате реакции основание Шиффа восстанавливали до вторичного амина 25 мМ раствором №ВН3СК в течение 40 мин при 25°С (схема 6, с 15) и анализировали реакционные смеси методом электрофореза в 8%-ном ДСН-ПААГ

Из табл 4 видно, что ДНК-лиганды с 2'-0-2-оксоэтильной группировкой в 3-, 4- или 5-ом положениях ^-кВ-участка или в 5-ом положении Н-кВ-участка образуют

конъюгаты с p50-GST с более высокой эффективностью, чем другие модифицированные дуплексы Остатки Lysl44, Lysl45, Lys241, Lys272 или Lys275, предположительно сближенные с кВ-участками (рис 3), были заменены на остаток Ala Значения констант диссоциации комплексов мутантных белков и исходного р50-GST с дуплексами IV или V лежат в пределах одного порядка

Таблица 4. Результаты аффинной модификации исходной и мутантных форм р50 субъединицы фактора ОТ-кВ ДНК-лигандами, содержащими 2'-альдегиднук> группу

ДНК-дуплекс (кВ-участок) Нуклеозидное звено, подвергнутое модификации Аминокислота, сближенная с кВ- участком по данным РСА Выход ДНК-белкового конъюгата*, %

р50-GST Мутантные формы p50-GST

Kl 44А K14SA К241А К272А К275А

IV (Ig-кВ) A3 Lys2 72 25 23 20 21 13 11

A4 Lysl44 22 24 24 19 19 24

А5 23 18 22 18 20 18

G6 — 7 9 10 8 11 8

Т7 Lysl45 9 6 7 5 8 10

С8 — 4 4 5 3 5 5

С9 — 4 4 4 3 3 5

V (Id-кВ) А5 Lysl44 14 10 12 12 11 13

Тб — 8 8 7 8 8 6

Т7 Lysl4S 6 6 5 5 6 7

Модифицированный ДНК-дуплекс без кВ-участка 6 5 6 5 5 б

* Указанные значения выходов конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%

Все мутантные формы р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ ковалентно связывались с 2'-альдегидсодержащими дуплексами практически с той же эффективностью, что и исходный белок Исключение составляли белки с заменами К272А и К275А, для которых наблюдалось примерно двукратное падение эффективности образования ковалентно связанного комплекса с модифицированным по 3-му положению дуплексом IV (табл 4) Подобные результаты, однако, не являются доказательством участия каждого из этих остатков лизина в образовании конъюгата с реакционноспособным олигонуклеотидом, входящим в состав этого дуплекса

Для определения остатков Lys р50 субъединицы NF-кВ, образующих ковалентные связи с ДНК-лигандами, модифицированными по 3-, 4- или 5-му положениям Ig-кВ-участка или по 5-му положению Id-кВ-участка, было проведено протеолитическое расщепление соответствующих ДНК-белковых конъюгатов трипсином и последующий анализ полученных олигонуклеотидопептидов методом масс-спектрометрии в варианте MALDI-TOF Установлено, что в образовании ковалентных связей со всеми рассматриваемыми лигандами принимает участие остаток Lys360 белка Дуплексы, модифицированные по 3-му или 4- и 5-му положениям Ig-кВ-участка, также взаимодействуют с остатками Lys275 или Lys77 соответственно Выявленные остатки

входят в состав С-концевых участков Rel-гомологичной области (Lys275, Lys360) и в состав основной ДНК-узнающей петли L1 (Lys77) р50 субъединицы NF-kB Полученные результаты свидетельствуют о том, что 2'-альдегидсодержащие ДНК могут быть использованы только для зондирования остатков Lys белка, сближенных с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда

Основываясь на накопленных данных, можно предложить оптимальную на настоящий момент конструкцию ДНК-дуплекса для эффективного ингибирования фактора транскрипции NF-kB Такой дуплекс должен содержать реакционноспособную группировку (2'-йодацетамидную или замещенную пирофосфатную) в определенном положении углеводофосфатного остова кВ-участка, обеспечивающую эффективное необратимое связывание белка Для повышения термической стабильности и устойчивости к нуклеазному гидролизу комплементарные цепи в дуплексе должны быть соединены ненуклеотидными фрагментами Желательно введение в состав ДНК-лиганда соединений, способных улучшить его транспорт через клеточную мембрану и внутриклеточное распределение

4.2. Урацил-ДНК-гликозилаза

С помощью синтетических аналогов ДНК были изучены особенности связывания УДГ с нуклеиновой кислотой, узнавания урацила и его удаления, катализируемого ферментом Элиминирование урацила или его модифицированных аналогов тестировали по расщеплению углеводофосфатного остова в образующемся апиримидиновом участке Сродство олигонуклеотидов к УДГ оценивали как концентрацию лигандов, при которой достигается ингибирование реакции элиминирования урацила из ДНК, содержащей остатки [3H]dU, на 50% (150) (Василенко и др, 1994) В условиях этого эксперимента выщеплением урацила из синтетических dU-содержащих олигонуклеотидов можно пренебречь

Для выяснения роли фосфатных групп и гетероциклических оснований неспецифической ДНК в связывании с УДГ был синтезирован олигомер (TpEt)14T, в котором все межнуклеотидные фосфатные группы этилированы, олигомер (pddR)9pT с ненуклеозидными вставками, имитирующими апиримидиновые участки, и гомоолигодезоксирибонуклеотиды d(pA)10, (рТ)ю, d(pC)i0 Обнаружено, что сродство УДГ к олигомеру (pddRbpT (150 = 930 ±186 мкМ) сопоставимо со сродством УДГ к d(pC)io (I50 = 560 ±112 мкМ), характеризующимся наименьшей гидрофобностью по сравнению с другими гомоолигонуклеотидами Сродство УДГ к roMod(pN)10 возрастает в том же порядке, что и относительная гидрофобность оснований Cyt<Thy<Ade Возможно, УДГ вовлечена в слабые гидрофобные взаимодействия с гетероциклическими основаниями ДНК, но они не вносят существенного вклада в стабилизацию комплекса фермента с нуклеиновой кислотой По-видимому, важную роль в обеспечении сродства УДГ к неспецифической ДНК играют контакты фермента с углеводофосфатным остовом олигонуклеотида Действительно, олигомер (TpEt)i4T, в котором все межнуклеотидные фосфатные группы этилированы, в 4 раза менее эффективно связывается с УДГ по сравнению с немодифицированным олигомером (pT)is Обнаружено также низкое сродство фермента к 21-звенному олигонуклеотидопептиду, содержащему остатки урацила

Определяющим фактором связывания УДГ с субстратом является конформация углеводного фрагмента 2'-Фторсодержащий олигонуклеотид 14Ш связывается с УДГ в 100-200 раз хуже, чем субстрат 14Ш, а удаления урацила не происходит (табл 5) Следовательно, 3'-э//Эо-конформация рибозы не узнается ферментом Таким образом, «отбор» субстратов УДГ происходит уже на стадии комплексообразования

Таблица 5. Взаимодействие УДГ из плаценты человека с модифицированными олигонуклеотидами

Условное обозначение соединения Олигодезоксирибонуклеотид (5' -> 3') Отн сродство УДГ к ДНК-лигандуа Отн начальная скорость удаления урацила (vo)6

14U1 GCCAACCdUGGCTCT 1,00 100

14ÍU GCCAACCfUGGCTCT 0,01 0

14xU GCCAACCxUGGCTCT 1,67 7

14tU GCCAACCtUGGCTCT 0,83 1

14nU GCCAACCnUGGCTCT 2,50 0

14ddR GCCAACCddRGGCTCT 5,00 -

14U2 ACCTACCdUGGTGGT 1,00 100

14fl5U ACCTACCflsdUGGTGGT 2,00 14

14br5U ACCTACCbr'dUGGTGGT 0,40 0

14T1 ACCTACCTGGTGGT 1,14 0

а Относительное сродство УДГ к ДНК-лиганду оценивалось как отношение Iso для соединения 14U1 или 14U2 к Iso соответствующего модифицированного аналога субстрата Все измерения проводили не менее 3 раз Ошибка в определении значений Iso не превышала 20%

б Отношение vo ДНК-лигандов к v<¡ олигонуклеотида 14U1 или 14U2, умноженное на 100 Все измерения проводили не менее 3 раз Ошибка измерений не превышала 20%

Можно полагать, что начальной стадией функционирования УДГ является локальное расплетание ДНК УДГ в два раза быстрее элиминирует урацил из одноцепочечного олигонуклеотида, по сравнению с дуплексом, и примерно в 2 раза быстрее из дуплекса, чем из «шпилечной» структуры, температура плавления которой на 30°С выше Удаления урацила из наиболее стабильной гантелеобразной ДНК практически не происходит То есть функционирование УДГ тем более эффективно, чем менее стабильна двойная спираль ДНК По-видимому, «плавление» двутяжевой ДНК под действием фермента облегчает последующее выведение остатка урацила из двойной спирали, зафиксированное методом РСА (Parikh et al, 2000, Werner et al, 2000)

Изучение взаимодействия модифицированных олигонуклеотидов с УДГ позволило установить, что стадия катализа является существенно более «чувствительной» к структуре ДНК, чем стадия комплексообразования Модификация основания или

углеводного фрагмента dU в составе олигонуклеотидов приводит к значительному замедлению скорости удаления урацила из ДНК или даже к отсутствию гидролиза При этом сродство модифицированных лигандов сопоставимо со сродством контрольных олигонуклеотидов (табл 5) Следовательно, специфичность действия УДГ проявляется не на стадии комплексообразования, а на последующих стадиях -адаптации структуры лиганда до оптимальной и непосредственно на стадии катализа

Способность УДГ выщеплять аналоги урацила резко падает в следующем порядке H»F>Bp=CH3 Эти результаты коррелируют с размером и гидрофобностью заместителя и свидетельствуют о том, что атом водорода в С5-положении урацила вовлечен во взаимодействие с УДГ на стадии катализа

Освобождение ДНК, содержащей AP-участок, из фермент-субстратного комплекса, по-видимому, является лимитирующей стадией реакции, катализируемой УДГ Установлено, что олигонуклеотид 14ddR, содержащий единственный остаток (2R, 38)-2-оксометилтетрагидрофуранола-3 и представляющий собой, по существу, стабильный аналог продукта реакции, связывается с УДГ в 5 раз эффективнее, чем немодифицированный субстрат 14U1 (табл 5)

Полученные нами результаты в целом коррелируют с данными РСА, а в ряде случаев дополняют и конкретизируют их

4.3. Эндонуклеазы рестрикции

R SsoII, R.PspGI и R Mbol: определение каталитического и ДНК-связывающих мотивов

Отличительной особенностью ЭР 11-го типа от других групп ферментов является практически полное отсутствие гомологии в их первичной структуре В результате систематического анализа доступных аминокислотных последовательностей ЭР 11-го типа нами было выявлено 30 ферментов, в первичной структуре которых был найден консервативный блок из ~ 70 аминокислотных остатков (рис 4) Наиболее вероятная организация найденного блока соответствует обнаруженному ранее структурному модулю a(ß)ßß(+a) (Bujnicki, 2001) В этом участке можно выделить 3 мотива Один из них гомологичен встречающемуся во многих эндонуклеазах рестрикции мотиву (PD) (D/E)XK и отвечает за катализ (мотив К) (Stahl et al, 1998) Два других выделенных нами гомологичных мотива С1 и С2 не были ранее охарактеризованы Мы предположили, что они вовлечены в узнавание ДНК-субстрата

В табл 6 перечислены достаточно консервативные аминокислотные остатки ЭР подтипа IIP SsoII, PspGI и Mbol, входящие в состав мотивов К, С1 и С2 Нами изучена роль ряда из них (подчеркнуты) в функционировании перечисленных ферментов Как правило, консервативный аминокислотный остаток заменяли на остаток Ala Анализировали способность мутантных форм белков связывать и гидролизовать 32Р-меченные субстраты

Проведенные эксперименты подтверждают выдвинутую нами гипотезу о том, что в состав каталитического центра R SsoII/R PspGI входят аминокислотные остатки Е125/Е105, D160/D138, К182/К160, Е195/Е173 Остаток Е191/Е169, возможно, также участвует в катализе, играя вспомогательную роль Каталитический центр RMbol, по-видимому, формируют остатки D186, El99, N201 и Е212

мотив К

мотив С1

-рь

РзрЙ!

ЕеоКН

№еАо1500Р

СЪеТо2122Р

ВруАо2йЗР

Кг>п2Г Асе!II ЗдгАТ СЕП01 Взэ6341

МдоМХУ Х£аЛоС348Р МЬо1 арум 11 ЗзиОАТНА Ирп11 МдаШ Ы а11

Звисдтив

5ти1Р

зььзьви?

Нд1С1 Вап1

ГпиБ!

НдоРЫ

ссшс

••-.с

тсссда Т5£55А сгДСЗЗГС яИЯЖг ейССЗ* исстег сЗССЙЙс

.ЗИЛХЛШОАЦ! ИЕНЫ,

.ЕЕ: Т.ЙЕЕ [ннтаоуютмст иж^ 1 в'г'еА'/ЙЕАьЩк НЕ ььько "С 1 КА; Й мтюнягитт: тис «ж :л.кз .. мет в Р1

в

^шрцклЗА«—

даТС дате вктс

ОАТС

дате дате дате

йотясс эзтасс а^сс сксс скзсс

тесн гшиг/е-лМ

УС ¡{ШАКАКУАЖ 15

иъг. ?нкс; аж! : 3 л? ыткс раваар мтка и:-узеиьг от в лг

I ТЛГА ОТ С Е ШТНй

ы)ВЫ мот

М01ЫЙ ЫЭВНА

моня моая

1тида нее

£1|

Йуззаушнсаа

1С.1ЙЛ1ЕРГЬ

Ш". ГО: 1ЛОI

гаЬЗОЫГМАЙ!. .УЕНУИЭНАОЬ 'У

НИ/ККПЕИЪСК ТЬЕКЖШАС а1ьЕ1гт1ЕУСк ^ЬЕ'ГАГ.ККХЙК .КЬЕТУХЖИАС

¿В'ЛОГШЖГ' ■ 1 ГЙУГЬКОА^С^'ГГО

ы^кмЕ-ба-иькс ытнжщзцда Р. я

г:: нг ГЕ ЙТОИЕМЬТК

Рис. 4. Сравнительный анализ фрагментов аминокислотных последовательностей 30 ЭР П-го типа. Слева указаны названия эндонуклеаз и приведена одна цепь их участков узнавания в ДНК (5' 3'). Элементы вторичной структуры изображены над аминокислотными последовательностями ЭР. а-Спирали обозначены в виде цилиндров, [З-тяжм - в виде стрелок. Наиболее консервативные аминокислотные остатки К.ЗзоП и К.РьрИ, входящие в состав мотивов К, С1 и" С2, приведены над «выравниванием». Фоновым окрашиванием отмечены аминокислотные остатки, степень консервативности которых более 50%.

Таблица 6 Параметры взаимодействия исходной и мутантных форм эндонуклеаз рестрикции БвоИ, РэрСГ и МЬо! с ДНК-субстратамиа

Мотив К Мотив С1 Мотив С2

R Ssoll wt Е125А 6 D160A S180 К182А F191A Е195А R116A R117A SU8 RU9A К122А R186A Е187А R188A Q190

Kj, нМ 80 140 300 В 60 90 60 г И С НС - НС 160 800 400 500 -

отн акт,% 100 0 0 - 0 100 2 0 0 - 0 10 0 0 0 -

R PspGI wt El 05 А D138A Т158 К160А Е169А Е173А R96A F97 S98 R99A К102А R164A Е165 R166A R168

Kj, нМ 90 40 230 - 130 20 45 НС - - НС 25 >1000 - >1000 -

отн акт, % 100 40 0 - 8 44 12 <0,1 - - 0 70 <0,1 - 0 -

R.Mbol wt S149E D186A Е199А N201A E212Q А216 R140A К141 N142A R143A D146K S205 S208A К209А N211 \

Kd, нМ 7 6 6,5 7 10 6,2 - НС - >1000 н с 7 - >1000 330 7,4

отн акт,% 100 0,8 <0,01 <0,01 3 0,3 - 0 - 0 0 88 - 0 0,2 64

а Исследования выполнялись в Институте биохимии Университета им. Ю Либиха (Гиссен, Германия) совместно с д-ром Пингоуд В

Специфические комплексы в экспериментах по связыванию исходной (wt) и мутантных форм USsoII, R PspGI с 20-звенным ДНК-субстратом и R Mbol с 188-звенным ДНК-субстратом формировали в присутствии 5 мМ CaCh и 10 мкг/мл nom(dI dC) Гидролиз субстратов проводили при 37°С (R Ssoll, R Mbol) и при 5(fC (R PspGI), определение Kd - при 2(РС Отн акт - относительная активность Для мутантных форм ферментов отн акт определялась как [карр(мутант)/карр(ш)] 100% Указанные значения Kd и относительной каталитической активности определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%

б Красным отмечены аминокислотные остатки, вовлеченные во взаимодействие, зеленым - не участвующие во взаимодействии, фиолетовым -аминокислотные остатки, выяснение роли которых в катализе и связывании субстрата требует дальнейших исследований в «-» - не определяли г не - нет связывания

Замена консервативных аминокислотных остатков из блока К(1УК)ХИ мотива С1 приводит к потере способности ГСЗвоП, Р-РчрОТ и К.МЬо! образовывать комплекс с ДНК, В связывании с ДНК также принимают участий «латки Аге186. ОкПЭТ, Ате!88 К.ЗкоП, Лщ 164 и Ата> 166 К.РзрО! из мотива С2. Методом аффинной модификации белков ФДСГ-содержащими ДНК было установлено, что консервативные остатки мотивов С1 и С2 Р.,85о11 и К.РкрСЛ сближены с ДНК уже нз стадии образования не специфического фермент-субстратною комплекса. Были получены моноцисгсин-еодержзщие формы эндонуклеаз, в которых один из консервативных аминокислотных остатков заменяли на Сук. Эти белки вводили в реакцию тиол-дисулвфидного обмена с модифицированными исслецифическим и специфическим ДНК-дугшексами VI и VII (рис, 5). Выход кон ьюгатов в случае обоих дуплексов был одинаков и достигал 50%.

VI 5' ТССЙАААСТрввТСАСТбСАСССТ 3' 3' СССТТТСА---АСТйАССТ 5'

VII 51 ТС'ЗбТТСрЕнСТЙбСТСТ 3' 3' сдасСААБ—С5АСС'г э1

ряк - фоефорилдисульфидная группа

Участок узнавания К.КкоП и К.РкрС! выделен жирным шрифтом.

М тгЬ

40 — 30—

К Э6С

В99С К102С К164С Я166С

Л н с н с н с н с н С н с

л 8 «6

дуплекс

^_1 коиъюгаты

—] РгрСРДНК

Рис. 5. Анализ продуктов аффинной модификации Н.РкрС! ФДСГ-содержащими ДНК-дуолексами VI (Н, иеспеиифичсскпм) и VII (С, содержащим участок узнавании фермента) методом чпектрофореза. е- 15%г«ом ДСИ-ПА.\Г е последующим <5краииваиисм г&га раствором солей серебра. Концентрация дуплексов составляла 2 мкМ, концентрация 1?,РйрС1 - I мкМ. (а расчете па димер). М - маркеры молекулярной массы (кДа),

Замена внутреннего dG участка узнавания К.5коП (З'-ССЫСО-З') на 5-йод-2'-дезоксиуридин и последующая аффинная модификация белка иод действием УФ-света приводила к образованию конъюгата о выходом ~ 8%, Мы установили, что модифицированный нуклеозид Коваоентно связывается с Тф 189 эндонуклеазы. Этот аминокислотный остаток расположен рядом с Агй1.86 и Агг188, которые входят в мотив С2. 11 о лученный результат подтверждает предположение, что этот район белка отвечаеч' за связывание с ДНК и образование специфических контактов с дину клеоти дом с1(ОрО) участка узнавания. 13 случае Й,МЬо1 во взаимодействие с ДНК, вероятно. Вовлечены остатки 8ег2(!8 и Т.у5209 мотива С2. Сближенность Ьуя209 с аденином участка узнавания была показана нами методом фотоаффинной модификации К.МЬо! б^йод-2-дезокси у ридинео держащим лигапдом.

Таким образом, наличие консервативных аминокислотных остатков характерно не 'только для каталитического центра ферментов рестрикции П-го типа., но и дли районов, от вечающих за связывание ДНК-субстрата.

На основании полученных нами результатов и гомологии К.ЗкоП и К.РярСИ с К.ИцоМГУ, К.ЕсоЯИ и К.(Тг101. для которых известны данные РСА, выполнено

моделирование пространственной структуры активных центров R.SsoII и R.PspGI (рис, 6). Видно, что консервативные остатки мотива С1 занимаю]' идеальное положение для формирования контактов с у глсво до фосфатным остовом ДНК-субстрата. В гоже время остатки аргининов мотива С2 участвуют п yj'iianam™ гетероциклических оснований.

С помощью ДНК-дуплексов, содержащих иенуклеозидные вставки в участке узнавания, выявлены необычные свойства R.SsoII. Замена любого из остатков центральной пары участка узнавания па ddR или Prd, имитирующие «АР-сайт», приводит к 1,5-2-кратному повышению скорости расщепления ДНК ферментом. Аналогичный эффект наблюдался нами также при введении в центральную позицию участка узнавания R.SsoII пекомпле-ментарной ТТ-пары (Громова и др., 1991). Можно полагать, что в первую очередь субстратами R.SsoII и клетке являются ДНК с модификациями, нарушающими komj цементационные взаимодействия и индус дарующими повышенную конформационную «гибкость» участка узнавания фермента в центральной вырожденной позиции. Снижение эффективности действия R.SsoII при использовании в качестве субстрата копформациоппо ограниченного ДНК-«дамбла» подтверждает это предположение.

Доказательство правомерности разрабатываемого нами комплексного подхода к изучению ДНК-белковых взаимодействий в растворе было получено в работе (Bochtler et а}., 2006), в которой сделан РСА комплекса эндонуклеазы рестрикция EcllSkI с субстратом, содержащим участок узнавания 5'-CCWGG-3\ R.Ecl 1 Ski является изошизомером и ближайшим гомологом R.SsoII. Степень идентичности аминокислотных последовательностей этих эндонуклеаз составляет 99% (Деиьмухамепюв и др.. 1997). Данные РСА подтвердили состав каталитического центра R.EcllSkl (R.SsoII) и нашу гипотезу о том, что остатки Arg!16, Argl17 и Argll9 мотива С1 вовлечены во взаимодействие с утлеводофосфатным остовом, а аминокислотные остатки мотива С2 ArcIКб. Arg 188 и Glul87 формируют контакты с гетероциклическими основаниями участка узнавания. Более того, из данных РСА следует, что при взаимодействии R.BcllSki с субстратом происходит значительное изменение конформашш ДНК, нарушение комп лементационных взаимодействий в центральной A T паре участка узнавании и выведение аденозина и тимидина из состава двойной спирали,

Эидонукчесап рестрикции Mval R.Mval вы деле гш из мезоф ильного штамма Micrococcus various RFLJ9, характеризуется высокой термостабильностью и проявляет свойства, аналогичные

* Моделирование Трехмерны* структур комплексов эндонуклеаз рестрикции с ДНК выполнялось совместно с д-ром Бушшцкнм Я. и д-ром Коси неким Я, (Международный институт молекулярной и клеточкой биологии, Польша),

h

Рис. 6. Моделирование пространственйой структуры активного центра мономера R.PspGI.

ферменту-изошизомеру BstNI из термофильного штамма Bacillus stearothermophilus N С помощью немодифицированных субстратов мы установили, что R Mval относится к IIP-подтипу ЭР и занимает промежуточное место между мезофильными и термофильными ферментами Температурный оптимум расщепления RMval 14-звенного субстрата за 10-30 мин составляет 46-48°С

На основании результатов расщепления модифицированных ДНК-дуплексов сделано заключение, что фермент преимущественно взаимодействует с группами атомов гетероциклических оснований, расположенных по центру большой бороздки двойной спирали ДНК Характер расщепления субстратов 1а и 16, 1в и Ir RMval одинаков, независимо от того в dA- или Т-содержащей цепи участка узнавания находится модификация (табл 7) Эти данные свидетельствуют в пользу симметричной локализации контактов R Mval в асимметричном участке узнавания Вместе с тем, R Mval отличает остаток dA от остатка Т в узнаваемой последовательности ДНК Это следует из результатов расщепления ферментом квазипалиндромного субстрата 5'-AATGCCTGGCATT-3'/3'-TTACGGACCGTAA-5' Скорость гидролиза фосфодиэфирной связи между остатками dC и dA в 3 раза выше, чем между остатками dC и Т

Таблица 7 Расщепление модифицированных ДНК-дуплексов эндонуклеазой Mval

№ ДНК-дуплекс а Отн начальная б скорость гидролиза Км, Ю"7 М VMai[c, 10"8М/мин

I 5' acctacctggtggt з1 3' tggatggaccacca 5' 100 100 2,1 ±0,2 2,0 ± 0,2 1,17 ±0,09 1,03 ±0,04

1а m4C-c-t-g-g g-g-a-c-c . 0 110 - -

16 c-c-t-g—g g-g-a-c-m4C . 89 0 - -

1в c-m5C-t-g-g g---g-a-c-c . 91 53 1,5 ±0,1 1,8 ±0,1 1,07 ±0,04 0,55 ± 0,04

1г c-c-t---g-g g-g-a-m5C-c 51 153 1,7 ±0,3 2,0 ± 0,6 0,6 ±0,1 1,58 ±0,48

1д c-c---t-g-g . g-g-m'A-c-c 99 0 -

1е c-c-t-I-g g-g-a-c-c 90 39 - -

1ж c-c-rü-g-g . g-g—a-c-c 100 46

1з c-c-xT-g-g g-g—a-c-c . 77 4

а В дуплексах 1а-1з представлены только модифицированные фрагменты молекул, остальные их части идентичны исходному соединению I, г11 -рибоуридин б Отношение начальной скорости гидролиза отдельных цепей модифицированных дуплексов к степени гидролиза соответствующей цепи исходного субстрата, умноженное на 100 Данные верхней и нижней строк соответствуют расщеплению «верхней» и «нижней» цепи ДНК-дуплекса Ошибка измерений не превышала 15%

Возможность отдельно изучать расщепление каждой из цепей модифицированных ДНК-дуплексов позволила установить детали функционирования R Mval Главная особенность действия этого фермента состоит в избирательном влиянии многих модификаций на гидролиз только одной цепи субстрата Так, метилирование экзоциклических аминогрупп остатка dA и внешних остатков dC участка узнавания приводит к блокированию гидролиза только модифицированной цепи ДНК-дуплекса (субстраты 1а, 16,1д), при этом R Mval эффективно расщепляет немодифицированную цепь участка узнавания (табл 7) Эффективный гидролиз R Mval немодифицированной цепи субстратов при отсутствии продуктивного взаимодействия с модифицированной цепью свидетельствует о том, что мономер фермента формирует специфические контакты преимущественно с одной цепью ДНК и гидролизует одну фосфодиэфирную связь, находящуюся именно в этой цепи субстрата По-видимому, две субъединицы R Mval функционируют достаточно независимо С другой стороны, модификации, введенные только в одну цепь участка узнавания, но кардинально нарушающие белково-нуклеиновые взаимодействия в фермент-субстратном комплексе в целом (например, удаление или замена гетероциклических оснований), ингибируют гидролиз R Mval как модифицированной, так и немодифицированной цепи, что свидетельствует о взаимодействии каждой субъединицы R Mval с обеими цепями ДНК-дуплекса

Необычный характер расщепления обнаружен нами при гидролизе R Mval ДНК-дуплексов 1в, 1г, 1е-1з (табл 7) Введение остатков m5dC, dl, rU, хТ в одну из цепей участка узнавания не снижает скорости расщепления модифицированной цепи, но ингибирует гидролиз немодифицированной цепи Мы полагаем, что этот эффект наблюдается только в случае тех модификаций, которые не затрагивают критичных для узнавания ферментом групп атомов в ДНК Вероятно, мономер R Mval, формируя основные контакты с гидролизуемой цепью, осуществляет ряд дополнительных взаимодействий с противоположной цепью ДНК-дуплекса Вместе с тем, метилирование экзоциклической аминогруппы внутреннего остатка С, по-видимому, препятствует формированию таких дополнительных контактов и вызывает тем самым блокирование гидролиза не только модифицированной, но и немодифицированной цепи (Butkus et al, 1985)

Полученные экспериментальные данные легли в основу модели комплекса R Mval с ДНК В качестве матриц при моделировании комплекса фермента с 12-звенным дуплексом использовали структуры комплексов MutH из Haemophilus influenzae (PDB-код 2aoq) и мутантной формы RPvuII(D34G) (PDB-код 3pvi) с ДНК-субстратами На рис 7 представлены аминокислотные остатки мономера R Mval, предположительно вовлеченные во взаимодействие с группами атомов участка узнавания Согласно модели остатки Asn45, Leu67, Lysl59 R Mval взаимодействуют с углеводофосфатным остовом гидролизуемой цепи (А-цепь) Рядом с расщепляемой фосфодиэфирной связью локализован остаток Asp50 Остатки Glu36 и Glu55 взаимодействуют с фосфатной группой в гидролизуемом межнуклеотидном узле опосредованно через молекулы воды Эти аминокислоты, а также Lys57, по-видимому, составляют основу активного центра R Mval Фермент не контактирует с фосфодиэфирной связью, которая может подвергаться гидролизу в комплементарной Т-цепи Вместе с тем, R Mval посредством Lys26 образует водородную связь с

фосфатной группой в Т-цепи, расположенной напротив расщепляемой связи в А-цепи, как и предполагалось в нашем исследовании Остатки А^209 и РЬе70 играют важную роль в дискриминации центральной ¿А Т-пары участка узнавания Остаток А^230 образует водородные связи с остатками сЮ гидролизуемой цепи С комплементарными им остатками <1С взаимодействуют 11е208 и Азр207 Введение метальной группы в 5-ое положение внутреннего (1С Т-цепи препятствует реализации гидрофобного взаимодействия с Ие208, а метилирование экзоциклической аминогруппы этого цитидина создает стерические препятстствия для взаимодействия Аг§209 с центральной нуклеотидной парой и нарушает контакты фермента с углеводофосфатным остовом Эти обстоятельства, вероятно, обуславливают наблюдаемое ингибирование гидролиза ДНК в первом случае и его блокирование во втором Недостаточная достоверность моделирования ЯМуаГ в районе 212-227 остатков не позволяет точно предсказать аминокислоты, контактирующие с внешним и внутренним остатками цитидина гидролизуемой цепи В целом предложенная нами модель Я Муа! и комплекса Я Муа1 с субстратом находится в хорошем соответствии с опубликованными в 2007 г данными РСА (Каия-ОгоЬек е( а!, 2007)

Рис 7 Схематическое изображение возможных контактов мономера Я Муа1 с участком узнавания в ДНК Пунктирными линиями обозначены контакты, опосредованные молекулами воды Обведены фосфатные группы, подвергнутые модификации Аминокислотные остатки, участие которых во взаимодействии с ДНК подтверждено данными РСА, выделены желтым

_Ghi55

Эндопуклеаза рестрикции EcoRJI

Согласно существующей классификации R EcoRII относится к IIE-подтипу ЭР {Roberts et al, 2003) Эффективность расщепления ферментом синтетических субстратов с одним участком узнавания понижается с увеличением длины фланкирующих его последовательностей Мы показали, что «эффект изолированного сайта» проявляется уже на 30-звенном дуплексе VIII Скорость его гидролиза увеличивается при добавлении в реакционную смесь коротких субстратов (активаторов) длиной от 11 до 14 нуклеотидных пар (рис 8) Дуплекс, состоящий из комплементарных 14- и 17-звенных олигонуклеотидов, уже не является активатором

В процессе активации гидролиза 30-звенного субстрата короткие дуплексы сами расщепляются ферментом Это означает, что при транс-активации любой из ДНК-дуплексов, имеющих близкое сродство к ферменту, может быть как активатором, т е

связываться в N-концевой области R EcoRII (Zhou et al, 2004), так и выступать в качестве субстрата, т е попадать в каталитический центр фермента Предпочтительность образования того или иного каталитически активного комплекса, по-видимому, определяется также вероятностью нахождения ферментом своего участка узнавания Увеличение концентрации активатора приводит к увеличению скорости гидролиза протяженного субстата (рис 8)

Дуплекс VIII

5' gatgctgccaacctggctctagcttcatac 3' 3' ctacgacggttggaccgagatcgaagtatg 5'

Дуплекс I

5' acctacctggtggt 3' 3' tggatggaccacca 5'

Рис. 8. Расщепление 32Р-меченного ДНК-дуплекса VIII (CD 3,5 10"7 М) R EcoRII (0,4 ед акт ) в присутствии 14-звенного субстрата I Cd 3,5 10"7 М (2) и CD 1 10"5 М (3) 1 - Собственный гидролиз ДНК-дуплекса VIII, — - 32Р-метка в Т-цепи дуплекса VIII, ------в А-цепи

Какая из функций - связывание или расщепление активатора является определяющей для стимулирования действия R EcoRIP Для ответа на этот вопрос мы исследовали гидролиз ферментом 47-звенного ДНК-дуплекса с «изолированным» участком узнавания в присутствии дуплексов IX и X В дуплексе X в местах гидролиза пентануклеотидной последовательности R EcoRII расщепляемая фосфодиэфирная связь заменена на негидролизуемую пирофосфатную

IX 5' CACTCCTGGATCCG 3' X 5' CACTppCCTGG—ATCCG 3'

3' CAGTGAGGACCTAGGCA 5' 3' CAGTGA—GGACCppTAGGCA 5'

Известно, что такая модификация не влияет на эффективность связывания ДНК-лиганда с эндонуклеазой EcoRII (Gromova et al, 1990) Дуплекс X ингибирует гидролиз 47-звенного субстрата, в то время как дуплекс IX в тех же условиях активирует его расщепление Таким образом, только дуплексы, которые в определенных условиях сами могут формировать продуктивный комплекс с R EcoRII, могут выступать в роли активатора действия фермента

Нами было изучено комплексообразование R EcoRII с синтетическими 32Р-меченными дуплексами I и VIII Связывание как 14-, так и 30-звенного субстрата с ферментом приводит к образованию двух типов комплексов, соотношение между которыми в растворе меняется в зависимости от молярных концентраций эндонуклеазы, ДНК и ионов магния На основании оценки подвижности комплексов в геле было сделано предположение, что в образовании комплекса 1 участвуют две субъединицы R EcoRII, а в образовании комплекса 2 - одна субъединица (рис 9) При соотношении концентраций мономера фермента и субстрата 1 1 и концентрации ионов Mg2+ меньше 1 мМ наблюдается образование обоих типов комплексов

Расщепление ДНК и таких условиях практически отсутствует. При концентрации ионов больше I мМ наблюдается эффективный гидролиз субстрата и

присутствие в реакционной смеси главным образом комплекса !. Возможно, первоначально происходит связывание одной молекулы дуплекса с димером К.ЕсоКП, что соответствует образованию комплекса 1 - Е28 Такой комплекс является ■неактивным. Затем с димером К.,ВсоШ1 связыпастея вторая молекула дуплекса, что приводит к образованию комплекса Г - Е2&з. Можно предположить, что комплекс Е,Ь2 в отсутствие ионов является неустойчивым и распадается. В результате

образуются два комплекса 2, в которых мономер К.ЕсоЫГ взаимодействует с одной

присутствии ионов М^1' является

Рис, 9. Анализ связывания Р.ЕеоКП с дуплексом I метолом тель-элсктрофореза в педетгагу р иру ю щах ус лов нях, а - Авторадиограмма геля: ! - исходный 32Р-меченный дуплекс I, 2 - дуплекс I (Си 5-10"й М) I! присутствии К.ЕсДОТ (СЕ в расчете на мономер М), б — Гель,

окрашенный распором кумаеси Е250: 1 -дуплекс 1 (Се 5-10 М) в присутствии ТЕЕСОКЛ (Св 2,5-10"° М), 2 - И.ЕсоМЕ 3 -овальбумин. Справа указаны молекулярные маесьа тимера и мономера овальбумина.

Результаты проведенного нами прецизионного выравнивания аминокислотных последовательностей 30 ЭР 11-го типа (рис, 4, с. 24) и анализа данных РСА позволяют предположить, что каталитический центр К.ЕсоЮ! сформирован остатками Ахр299, Ьуз324 и (л1и337- Остатки Ьук328 и ЛгцЗЗО могут быть вовлечены в формирование контактов с гетероциклическими основаниями участка узнавания в субстрате, тогда как остаток Еуч263, возможно, сближен с углеводефосфатным остовом ДНК.

Эволюционная взаимосвязь между различными Э идонукл еазами рестрикции

Выбранные нами дня исследования ферменты оказались перспективными с точки зрения изучения эволюционного процесса среди эндонуклеаз рестрикции Н-го типа. Первоначально мы показали, что для Гч.ЗзоИ и РЕРкрО! характерна существенная гомология аминокислотной последовательности с Я.ЕсоКП, 1ЕКеоМ1\\ Й..СЙ101 и Ж.В№6341. Было доказано, ч то эти ферменты, узпагошис сходные последовательности, имеют аналогичную ортанизациго каталитического центра и ДНК-связываюдшх мотивов и родственны эволюниопно, несмотря на принадлежность к разным подтипам. Затем и.ссдедование было перенесено на Й.МЬо!, которая узнает совсем другу го нугепеотидную последовательность, но имеет в свое.м составе тс же структурные элементы для узнавания и расщепления ДНК, что и перечисленные выше ферменты. Подтвердив функциональную значимость аминокислотной гомологии между 1*.МЬо1, К.БзоП, К.РйрО!, К.ЁсоШЕ К. N со МТУ, К.С1г101 и Я.В5с6341, мы сделали вывод об эволюционном родстве этих ферментов. Это первый пример тесной эволюционной взаимосвязи ме?кду ферментами рестрикции, узнающими совершенно разные нуклеотидные последовательности.

молекулой субстрата. Комплекс в

каталитически активным.

э б

1 2. 12 3

Во вторичной структуре Я БвоП, Я РэрСТ, Я ЕсоЯП и Я МЬо1 можно выделить консервативный структурный модуль а(Р)РР(+а), аналогичный активному центру Я ЕсоМ-подобных ЭР (а-семейство) Поскольку каталитический мотив Я МЬо1 имеет лишь незначительное отклонение от классического РБ (0/Е)ХК мотива (К заменен на 14), мы полагаем, что Я МЬо1 расположена ближе к общему предшественнику, чем Я ЗбоП, Я РэрСТ и Я ЕсоЯП, имеющие более существенные вариации в каталитическом мотиве (рис 10)

В аминокислотных последовательностях ЯЗбоИ, Я ЕсоГШ и Я РэрИ обнаружен мотив (К/Я)Хп(0/Е)(К/Я), охарактеризованный в структуре Я ^оМТУ (5'-0|СС00С-3') Можно полагать, что все эти ферменты реализуют сходный механизм узнавания ОрО-динуклеотида в ДНК

Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей 30 выделенных нами ЭР, в том числе Я МЬо1, ЯБвоП, ЯР5р01, Я ЕсоГШ, Я^оМГУ, Я ОН 01 и Я В5е6341 показало дивергентный характер эволюции для этой группы ферментов Из нашей работы следует, что структурный модуль а(Р)РР(+а), который охватывает участок примерно из 70 подобных аминокислотных остатков, может быть использован для выявления новых ферментов а-семейства эндонуклеаз рестрикции

Два изошизомера Я МЬо1 - Я БаиЗАГ и МиШ, в отличие от Я МЪо1 принадлежат к Р-семейству ЕсоЯУ-подобных ЭР (рис 10) Эти ферменты являются примером функциональной схожести белков (одинаковая специфичность действия по отношению к нуклеотидной последовательности в ДНК), которые имели общего предшественника, но подверглись экстремальным изменениям структуры в процессе эволюции Я Муа1 узнает в ДНК тот же двутяжевой участок, что и Я БбоП, Я ЕсоЯП, ЯРврв!, но расщепляет его по особому механизму через стадию диссоциации фермент-субстратного комплекса после гидролиза одной из фосфодиэфирных связей Это свойство сближает Я Муа1 с МшН и с Я 8аиЗА1, также мономерами, которые димеризуются при связывании лиганда и осуществляют одноцепочечный разрыв в ДНК, но показывает на эволюционную удаленность от Я БвоП, Я ЕсоЯП и Я РврСТ (рис 10) Я ЕсоЯП не имеет особенного подобия с ЯКае1 и Я 8аиЗА1, также относящимися к НЕ подтипу Различная структурная организация этих ферментов свидетельствует о независимых путях решения одной и той же задачи - связывания двух одинаковых участков узнавания в ДНК

Рис 10. Фрагмент схематичного изображения эволюционного дерева, построенного для ферментов суперсемейства PD (D/E)XK на основе сравнительного анализа их вторичных структур (Bujmckt, 2004) и результатов данной работы Эндонуклеазы подтипа IIP представлены на белом фоне, IIF - на светло-сером, IIE - на темно-сером

4.4. ДНК-метилтрансфераза SsoII

Фермент модификации SsoII как ДНК-метилтрансфераза

М SsoII представляет собой классическую С5-цитозиновую ДНК-метилтрансферазу как по структуре (72-379 аминокислотные остатки), так и по механизму действия Ключевую роль в катализе переноса метальной группы в С5-положение цитозина играет единственный остаток цистеина фермента - Cysl42 Мы показали, что этот остаток не вовлечен в специфическое узнавание М SsoII участка метилирования в ДНК Константа диссоциации комплекса мутантного белка М SsoII(C142A) с субстратом всего в 2,5 раза больше аналогичной константы, рассчитанной для исходной формы фермента Вместе с тем, проведенные эксперименты по аффинной модификации М SsoII ФДСГ-содержащими дуплексами свидетельствуют, что сульфгидрильная группа Cysl42 фермента сближена с углеводофосфатным остовом ДНК при связывании как специфических (содержащих участок узнавания), так и неспецифических лигандов

Вопрос о том, каким образом С5-МТазы катализируют реакцию переноса метальной группы, практически решен В то же время механизмы узнавания определенной нуклеотидной последовательности в ДНК и выбора метилируемого dC еще недостаточно изучены Поэтому основное внимание в данной работе было направлено на изучение связывания М SsoII с участком метилирования ДНК Для этой цели был использован ДНК-дуплекс VIII (с 31), содержащий канонический участок метилирования М SsoII, и его аналоги Немодифицированный дуплекс XI отличается от дуплекса VIII центральной нуклеотидной парой участка метилирования (рис 11) В ДНК-лигандах XII и XIII внутренний остаток dC участка метилирования заменен на остаток 5-метил-2'-дезоксицитидина в одной из цепей Также был сконструирован ДНК-дуплекс, содержащий m5dC в обеих цепях участка узнавания

Комплексообразование М SsoII с ДНК-дуплексами изучали в присутствии 500 мкМ AdoHcy (8-аденозил-Ь-гомоцистеин) и 50 нг/мкл поли(<11 dC) В этих условиях наблюдалось образование только специфического фермент-субстратного комплекса Замена центральной (вырожденной) dA Т-пары участка узнавания на dG dC-napy не влияет на эффективность связывания МТазы с субстратом Сродство М SsoII к ДНК-лигандам возрастает в ряду диметилированная ДНК « неметилированная ДНК < монометилированная ДНК

Для идентификации групп атомов участка метилирования ДНК, вовлеченных во взаимодействие с М SsoII на стадии специфического связывания, был применен метод «отпечатков» в варианте interference footpnntmg В качестве модифицирующих реагентов были использованы муравьиная кислота, гидразин, N-3thji-N-нитрозомочевина и диметилсульфат Содержащие 32Р-метку по 5'-концу одной из цепей дуплексы VIII, XI-XIII обрабатывали соответствующим химическим реагентом в условиях статистической модификации и затем инкубировали с М SsoII Методом «торможения» в геле связавшийся с МТазой субстрат отделяли от ДНК-дуплекса, не связавшегося с ферментом Олигонуклеотиды выделяли из геля, гидролизовали по месту модификации и анализировали в ПААГ, содержащем 7 М мочевину Определяли радиоактивность зон из дорожек, соответствующих разделению продуктов гидролиза ДНК, не связавшейся (R) и связавшейся (R^) с М SsoII

Полагали, что фрагмент ДНК важен для формирования специфического комплекса с М.ЭзоИ при ЕУКск ^ 1,9. Результаты, полученные метолом «отпечатков» при анализе комплексов М.ЗкоП с ^модифицированными ДНК-субстратами VIII и XI, представлены на рис. 11 (а, б).

а

б

VIII

5 \ ._CCMCCTGGCTCT...3 1

О о

3 '...GGTlÍGSAcqSí*GA...5 1

ТТТГ

5 '..,ссАясссафтст...з'

О о

XI ООО

3 1... GGT Т GGGCdSAGA... 5 '

XII

JJ

Ъ '.. .ССАЙ 3 . -GGTT

ш

.CmaCTGG"TCT_._3 1

о о

G-GÄCC

т

3AGA...5'

ХПТ

5 '...CCABi 3 '...GGTT

IUI

ССТ-GG

о О

GSA» СС

ТТГТ

:тст...з ■

3AGA,..5 ' tft

Рис. 11. Идентифицированные с помощью метода «отпечатков» группы атомов ДНК-дуплексов VIII (а), XI (б), XII (в) и ХШ (г), вовлеченные во взаимодействие с М.ЗзоИ. Приведены только центральные фрагменты ДНК-дуплексов. Участвующие в узнавании ферментом гетеройиклические основания выделены красным, N7-атомы остатков гуанина отмечены зелеными точками, фосфатные группы - синими стрелками. Величина стрелок соответствует степени влияния модификации фосфатных фунм на связывание дуплекса с белком. Участок метилирования выделен рамкой.

Во взаимодействии с M.Ssoll на стадии связывания участвуют пуриновые основания, входящие в участок метилирования дуплексов и непосредственно примыкающие к нему с 5'-конца. В формирование специфических контактов с M.Ssoll вовлечены 1Ч7-атомы всех остатков гуанина участка узнавания. Только внешний цитозин обеих цепей участка метилирования участвует во взаимодействии с M.Ssoll. Метилируемый цитозин не важен для узнавания МТазой субстрата. M.Ssoll формирует контакты с З'-фосфатными группами всех пяти нуклеотидов участка узнавания в обеих цепях ДНК-дуплексов VIII и XI. Как и следовало ожидать, замена центральной вырожденной пуклеотидтюй пары участка метилирования не влияет на характер взаимодействия M.Ssoll с ДНК. Все участвующие во взаимодействии с M.Ssoll группы атомов участка метилирования образуют единый кластер. ДНК-белковые контакты в пределах участка метилирования носят симметричный характер.

Схемы распределения контактирующих с M.Ssoll групп атомов ДНК в неметилированных цепях дуплексов XII, XIII и в соответствующих им цепях дуплекса VIÍI практически идентичны (рис. 11). Замена внутреннего (1С участка узнавания па m dC приводит к увеличению числа функционально важных для взаимодействия с M.Ssoll гетероциклических оснований, фосфатных ipynn и N7-атомов остатков гуаеинэ в метилированных цепях дуплексов XII и XIII. В узнавание

вовлечены как ipyiuibi атомов участка метилирования, так и группы атомов, примыкающие к нему с 5'-конца. Таким образом, повышение сродства M.SsoIl к мономегилироваипым субстратам по сравнению с неметил ир о ванными обусловлено увеличением числа контактов между ферментом и цепыо, содержащей остаток m5ciC,

Фермент модификации Ssoli какрегуляторный белок

M.SsoIl формирует специфический и стабильный комплекс с нромоторной область!» генов системы рестрикции-модификации (Р-М) Ssoli В этой области локализован ДНК-фрагмент длиной 48-52 пары нуклеотидов, с которым взаимодействует фермент (Karyagina el а!., 1997). Вместе с тем, необходимо было определить «регуляторный» участок ДНК, который обеспечивает максимальное число контактов с M.SsoIl. Для решения этой задатш был получен 140-звенный фрагмент ДНК, содержащий промоторную область гскоа системы Р-М Ssoli (рис. 12). 5 ' CATAAAAAATAACCTTTTATATCTACTTGAAAGTTTTTrCATGCACGTTCATAATT 31 GTATTTTTTATTGGAAAATATAGATGAACTTTCAAAAAAGTAGGTGCAAGTATTAA R.SsoTT

I jj ] M.SsoIl _

GGfiftTCRAaACftGGACRAATTCTCCTAAAACCAACACTTAATTCTGGTAGACATGCA.TS CCTTAGTTTTGO'CCTGTTTAACAGGATTTTGGTTGrGAATTAAGACCATCTGTACGTAC t ft

Ти«. 12. Схема прсмогер/дой области гатое системы рестрикции-мсгдификацнн Ssoli. Серым фоном обозначена область, «защищаемая» M.SsoIl от гидролиза ДНКазои I (Karyagina et at, 1997). Вертикальные стрелки указывают на гуанн новые остатки, N7-атомы которых вовлечены во взаимодействие с M.SsoIl. Величина стрелок соответствует степени «защиты» N7-aTOMOB остатков (1G от метилирования димстилсульфатом. Жирным шрифтом и горизонтальными стрелками обозначены инициаторные кодоны генов sjoIIR и л-.то!ГМ.

Методом «отпечатков» с дим era л сульфатом (в варианте protection Гоо (printing) йдентнфициро ваньг 7 гуа ни новых остатков, вовлеченных во взаимодействие с белком, 6 из них расположены внутри 15-звснвдго инвертированного повтора симметрично относительно центральной dA-T пары. В дальнейших исследованиях использовали 31 -з венный ДНК-дуплекс XIV, представляющий собой центральный фрагмент промоторной области генов системы Р-М Ssoli и включающий 15-зкеппый и нвертир о ва г [ 11 ы й повтор.

XIV 5 ' АТС АДАА С AGGAC AAA TTGTCC ТА А А АС САД 3 ' 3 ' TAGTTTTGTCCTGTT'I'AACAGGATTTTGGTT 51

Методом «отпечатков» (в варианте interference footpnntmg) с муравьиной кислотой, гидра-даном, ди метил сульфатом и N-эт ил - N - нитрозомо ч е в и 1\ о й в качестве модифицирующих pea тентов идентифицированы шесть остатков гуанина, два остатка адснина и четыре остатка тиьшна инвертированною повтора, образующие два симметрично расположенных блока: 5'-GGA-3' и 5-TGT-3' в каждой из цепей ДНК-дуплекса XIV (рис. 13). Взаимодействие второго тимндинэ S'-TGT-блока с M.SsoIl было зафиксировано также методом аффинной модификации бепка brdU-содерэкащим аналогом Д![К. M.SsoIl взаимодействует с тремя фосфатными группами в каждой из цепей дуплекса XIV И образует контакты с экспонированы ми в большую

бороздку ДНК N7-атомами всех остатков гуанина инвертированного повтора, который, вероятно, и представляет собой «регуляторный» участок ДНК.

M.Ssoll,

еуЬъединииа А

M.Ssoll,

суС^единицэ Б

Lys21 Argl¿ Lys31 Tyt52

I Arg33 / \AIÎ|3O\ Arg35

1 ГУ i

/. Аг.-

А ; •) Л f .

Туг32

Lyí31

Arjl«

Arg 38

i

Рис. 13. Схема контактов аминокислотных, остатков лиги ера Н-концевой области М.ЯвоП с «рс!'улягорным:» участком ДНК. Гет ер о циклические основания и фосфатные группы, идентифицированные методом «отпечатков» как вовлеченные во взаимодействие с М,85о11, выделены красным или сипим цветом соответственно.

Малая бороздка ДНК

Большая бороздка ДНК

Симметричное взаимодействие с обеими половинами участка узнавания ДНК характерно для многих регулятор пых белков, взаимодействующих с операторной последовательностью в виде д и мера и использующих для узнанании а-спираль. локализованную в большой бороздке ДНК, Аналогичный механизм взаимодействия с «рвгуляторным» участком ДНК мы предполагаем и для M.Ssoll.

Построена модель комплекса N-концевой области M.Ssoll (1-71 аминокислотные остатки) с «регуляторным» участком ДНК (рис. 13, 14).* При моделировании были использованы данные РСА комплекса реиреесора бактериофага 434 с ДНК, а также результаты метода «отпечатков». Согласно модели N-копцсвая область M.Ssoll включает в ссбя пять а-егшралей, вторая и третья а-спирали формируют структурный мотив «спираль-поворот-спираль», при этом третья спираль является «узнающей» (рис. 14). Два N-комцевмх фрагмента M.Ssoll расположены в большой бороздке ДНК с одной стороны двойной спирали. Следует отметить, что с учетом возможности изгиба ДНК положения контактов аминокислотных остатков M.Ssoll с группами атомов «регулигорного» участка могут быть смещены относительно указанных на рис. 13.

Для исследования возможности «посадки» двух субьедишщ M.Ssoll па «регуляторный» участок были синтезированы ДНК-дуплексы XV-XV11, содержащие два остатка 2'-0-(2-оксоэтил)уридипа (табл. 8), Обе модификации вводились в одну цепь ДНК в разные половины «рйуляторного» участка в позиции, предположительно сближенные с остатками лизина N-концевой области M.Ssoll в бел ко в о-нуклеин о в ом

Вторая а-спираль

Третья о-спирэлъ

Попорот

Рис. 14, Пространственная модель комплекса димера N-концсвой области M.Ssoll с 15-звепмым «регуляторным» участком ДНК.

* Работа проводилась совместно с д.С.н Карягннои A.C. (НИИЭиМ РАМН), к.ф.'М.н. Алексеевсгош A.B. (НИИФХБ МГУ) и к.ф.-м.н. Спириным С.А. (ТГИИФ.ХБ МГУ).

комплексе. В контрольных экспериментах использовали ДНК'-дуплекс- XVIII, содержащий модификации в тех же положениях, что и ДНК-дуплекс XV, но имеющий в своем составе только одну «половину» инвертированного повтора.

Таблица 8. Результаты аффинной модификации метилтрансферазы ЗяоП ДНК-лигандани, содержащими 2'-альдегидные группы.

№ ДНК-дуплекс" Выход ДНК-белкового нонгюгата6, %

(51 3') Kí K2

XV АТС ДА AAC AGGAC - ААЯТ TGTCCT-ААААС С А А Т AGT TTTGTCCTGoUT laACAGGAoU Т Т Т GGTT 55±3 6±3

XVI ATCñAAAo UAGGACAAAT oUGTCC ТААААС CAA TAGTTTT-GTCCTGTT TA-ACAGGAT Т Т Т GG Т Т 42±4 5±2

XVII АТСААААС -AGGAC АААТТ GTCCT - А АА АС CAA TAGTTTTG OÜCC TGTT TAACAGGAo UTTTGGTT 36±4 1I±2

XVIII GC A T ATA T AT - AT AT A ATTGTCCT - Añ Añ С С Añ CGTATATAToUTATA TTAACAGGAo UT T T G G T T 26±3 -

а. Жирным шрифтом отмечен «регулятор! ¡ый» участок или его половина, серым выделен остаток 2 '■ О-(2-океоэтнл)урндии a (oUi-

б. Приведены средние значения, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. «-» —Дуплекс не образует коныогат с M.SsoII.

Аффинную модификацию M.SsoII ДНК-дуплексами XV-XVIII, меченными 32Р по 5'-концу модифицированной цепи, проводили в условиях специфического связывания. Эффективность образования коныогата одной субьединицы M.SsoII с модифицированной цепью ДНК-дуплексов XV-XVII (конъюгат KI. расчетная молекулярная масса 54,] кДа) составляла 36-55%, двух субъединиц белка (конъюгат

К2, расчетная молекулярная масса 98,7 кДа) - 5-11% (табл. 8, рис. 15). ' 2

Рис. 15. Анализ продуктов ковалентного присоединения M.SsoII к ' гР-меченному ДНК-дуплексу XV (концентрация 50 пМ). Авторадиограмма разделения реакционных смесей методом .электрофореза в 12%-ном ДСН-НААГ, Дорожки 1-3 - концентрация M.SsoII в расчете на мономер 1 мкМ, 2 мкМ и 4 месМ, соответственно. Слева стрелками указаны положения белков - маркеров молекулярной -ДНК массы, кДа.

Изменение иуклеотиднои последовательности в одной из половин «регуля горн ого» участка (дуплекс XVIII) препятствует связыванию второй субъединицы фермента. С увеличением концентрации M.SsoII в реакционной смеси выход копъюгата двух субьединиц белка с ДНК возрастает, в то время как выход конъгогата одной субъединицы МТазы с ДНК не изменяется (рис. 15). Можно предположить, что

IÍ2 KI

регуляторная функция M.SsoII связана с димеризацией фермента при взаимодействии с промоторной областью генов системы Р-М Ssoll, которая осуществляется при повышении концентрации МТазы in vivo. Особый интерес представлял вопрос, может ли белок одновременно взаимодействовать с двумя различными участками узнавания - участком метилирования и «регуляторы ым» участком. Методом компьютерного моделирования была построена гипотетическая модель, демонстрирующая возможность такого взаимодействия, Она включает в себя две полноразмерные молекулы М. Ssoll, три ДНК и две молекулы AdoHcy (рис. 16), Обе субъсдиницы M.SsoII располагаются с одной стороны «регулятор-ного» участка ДНК. Области каждой молекулы M.SsoII, ответственные за метилирование, сближены с субстратом и AdoHcy и обеспечивают белок-белковые контакты между молекулами M.SsoIL

Методом «торможения» в геле не удалось зафиксировать ДНК-белковый комплекс M.SsoII с двумя немодифипи-рованными лигандами, содержащим «регул яторный» участок и содержащим участок метилирования. Поэтому был использован метод аффинной модификации M.SsoII последовательно двумя типами модифицированных ДНК-дуплексов. Дуплекс XIX содержал фоефорилдисупьфидную группировку в участке метилирования (подчеркнут), дуплекс XX остаток 2'-0-(2-оксоэтил)уридина в «регупяторном» участке.

XIX 5' ACGTTCCpSsTGGCTATTGACTGC 3' 3: CTGCAAGG---ACCGATAACTGACGT 5'

XX 51 АТСААААС-АСБАСАААТТйТССТАДААССАА 3' 3' ТАбТТТТСоиССТеГТТААСАвбАТТТТбСТТ 5'

М.вкоП образовывала конъюгат с каждым из модифицированных ДНК-лигандов (рис. 17, дорожки 2 и 4). Результаты аффинной модификации М.ЗзоП последовательно двумя типами дуплексов (3'- Р-меченным XIX и немеченым XX) показали возможность образования «двойного» конъюгата 14$*М.5ко11«31ои -продукта ковалентного присоединения белка к реакционно способным группировкам в составе обоих участков узнавания в ДНК (рис. 17, дорожка 5). Первоначально область М.ЗяоИ, ответственная за метилирование дуплекса XIX, формирует конъюгат с входящим в его состав олигонуклеотидом 14з, зачем М-концсвая область фермента

ДНК, содержащая "регул пторный" учэсток

центр

Рис. 16. Пространстве дна я модели полноразмерной М.8зо11 в комплексе с «регули -торным» участком ДНК, двумя молекулами ДНК, содержащими участок метилирования, и двумя молекулами АйоНсу.

также может ковалеитпо связаться с модифицированной целью 31 о и дуплекса XX с «регул яторным» участком. При проведении аффинной модификации М.ЗкоП и обратном порядке - сначала 2'-альдегиде о держащим ДНК-дуплексом XX, а затем ФДСГ-содержащим дуплексом XIX - эффективность образования конъюгата .'¿*«М.5коН"3! ои ниже (рис, 17, дорожка й). Возможно, первоначальное Ковйлеитное связывание М-концевой области М.ЗзоП с «регуляторным» участком изменяет конформацию фермента, что снижает эффективное«, его взаимодействия с участком метилирования, содержащим ФДСГ.

а 6

Рис. 17. Анализ методом электрофореза в 12%-ном ДСН-ПААГ продуктов ковалентпого связывания М.ЗяоП с 2'-альдегидсо держащим Д11К-дуплексом XX (4), с 3'-32Р-меченяым ФДСГ-содержймлнм ЛПК-дуплсксом XIX (в отсутствие {2) и в присутствии (1) ЫаВН:,СК) н последовательно с двумя ДНК-пигандами (5 - Сначала с XIX, затем с XX, 6 - сначала с XX, затем с XIX). ] - Исходный белок а - Гель окрашен раствором кумасси К250. б -

Авторадиограмма геля. Молекулярные массы, соответствующие положению белковых зон, указаны слева.

Заключение

Основываясь на полученных данных, можно предложить стратегию исследования механизма действия любого ДНК-узнающего белка и зондирования контактов в комплексах, которые он образует с Д11К:

а) выявление грутттт атомов ДНК, вовлеченных в связывание с белком, методом ««шечатков», о^го№нным на статистической модификации ДНК химическими реагентами до формирования ДНК-белкового комплекса;

б) анализ взаимодействия белка с синтетическими ДНК-лигадцами, в которых модифицированы или элиминированы определенные группы атомов гетероциклических оснований и углсводофосфатного остова, повлеченные в узнавание и/или катализ;

в) поиск гомологии в аминокислотных последовательностях ДНК-узнающих белков;

г) направленная замена аминокислотных остатков белка, предположительно вовлеченных во взаимодействие с ДИК, и определение параметров взаимодействия мутаптпых форм белка с ДНК-лигандами;

д) определение аминокислотных остатков, сближенных с нуклеиновой кислотой в составе ДНК-белкового комплекса методом аффинной модификации белка лигапдами, содержащими рсакционноспособные группировки определенных типов в заданном положении о лиге нуклеотид н ой цепи;

е) построение схемы коптагстов в ДНК-белковом комплексе, моделирование его пространственной структуры.

выводы

1 Предложена стратегия исследования ДНК-белковых взаимодействий в растворе и продемонстрирована ее эффективность в применении к ДНК-узнающим белкам независимо от размера и структуры узнаваемой ими нуклеотидной последовательности

2 Сконструированы три типа лигандов для аффинной модификации ДНК-узнающих белков 1) фотоактивируемые ДНК-дуплексы, содержащие остатки 5-бром- или 5-йод-2'-дезоксиуридина, 2) ДНК-дуплексы с межнуклеотидной замещенной пирофосфатной или фосфорилдисульфидной группировкой, 3) ДНК-дуплексы, несущие активную группу (альдегидную, йодацетамидную) в 2'-положении углеводного фрагмента Разработаны и оптимизированы методики получения, выделения и анализа белково-нуклеиновых конъюгатов и подходы к идентификации участка белка, присоединенного к ДНК

3 Впервые установлено, что ДНК-лиганды, содержащие единичную фосфорил-дисульфидную или 2'-йодацетамидную группировку, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка ДНК с 2'-0-2-оксоэтильными группами в участке узнавания белка позволяют фиксировать остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом, на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда Предложена структура ДНК-дуплекса - необратимого ингибитора фактора транскрипции ОТ-кВ

4 Сконструирована серия немодифицированных ДНК-дуплексов - субстратов эндонуклеаз рестрикции Муа1, EcoR.II, ЭвоП, РярОГ и МЬо1 Исследована зависимость эффективности функционирования этих ферментов от длины и нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата Установлено, что ферменты Муа1, БвоН, РврСТ и МЬо1 принадлежат к подтипу Р эндонуклеаз рестрикции И-го типа Предложена модельная система, позволяющая исследовать механизм активации гидролиза ДНК эндонуклеазой ЕсоШ1, выявлены требования к лигандам-активаторам

5 Расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой

а) С помощью аналогов субстратов, содержащих ненуклеозидные вставки, обнаружены принципиальные различия в характере расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции ЗэоП, 8сгР1, Муа1 и ЕсоЯП, узнающими пентануклеотидную последовательность с различной степенью вырожденности центральной нуклеотидной пары б) Сделано заключение о перспективности использования лигандов, содержащих нуклеозид с инвертированной ОН-группой при С2'- или СЗ'-атоме или с модификацией в 2'-положении рибозного кольца, для оценки влияния локальных изменений в структуре углеводного фрагмента на ДНК-белковое взаимодействие в) Показано, что «шпилечные», гантелеобразные и ковалентно «сшитые» ДНК-дуплексы являются уникальными инструментами исследования механизма действия ДНК-узнающих белков

6 Впервые обнаружено, что структурные, конформационные параметры и стабильность субстрата существенно влияют на функционирование урацил-ДНК-гликозилазы Установлено, что основой специфичности действия фермента является не стадия комплексообразования, а следующие за ней стадия адаптации структуры лиганда до оптимальной и стадия катализа Продемонстрировано, что

олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остатки 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 1-(З'-дезокси-Р-В-тярео-пентафуранозил)урацила, являются уникальными негидроли-зуемыми аналогами субстратов урацил-ДНК-гликозилазы и могут быть использованы в структурных исследованиях комплекса этого фермента с ДНК

7 В первичной структуре 30 эндонуклеаз рестрикции П-го типа выявлен консервативный блок, включающий в себя примерно 70 аминокислотных остатков Внутри блока выделено 3 мотива, предположительно отвечающие за взаимодействие с углеводофосфатным остовом ДНК, образование контактов с гетероциклическими основаниями и катализ Экспериментально доказано участие консервативных аминокислотных остатков эндонуклеаз рестрикции ЗвоИ, РврСТ и МЬо1 в связывании и гидролизе ДНК-субстрата Впервые продемонстрирована эволюционная взаимосвязь между ферментами выбранной группы

8 Обнаружен особый характер функционирования эндонуклеазы рестрикции Муа1, состоящий в избирательном влиянии многих модификаций на гидролиз только одной цепи субстрата Выдвинуто предположение о принадлежности эндонуклеазы Муа1 к Р-семейству ферментов рестрикции

9 Идентифицированы группы атомов участка метилирования и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции-модификации ЭзоП, существенные для формирования комплексов с С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазой ЗэоП Установлено, что Суэ142 фермента, играющий ключевую роль в катализе, сближен с углеводофосфатным остовом уже на стадии связывания с неспецифической ДНК Показано, что с «регуляторным» участком ДНК могут связываться две субъединицы метилтрансферазы ЗэоП Предложена модель взаимодействия этого фермента с ДНК как бифункционального белка Зафиксировано образование «двойного» конъюгата метилтрансферазы ЭбоП с олигонуклеотидами, содержащими реакционноспособные группировки в составе метилируемого и «регуляторного» участков узнавания белка

10 Разработаны новые методы тестирования активности ферментов рестрикции, модификации и репарации, анализа их взаимодействия с ДНК и определения примесей нуклеаз в препаратах белков

Список основных публикаций по теме диссертации

Обзоры

1 Шефлян Г Я , Кубарева Е А . Громова Е С Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам // Успехи химии, 1996, т 65, N8, с 766782

2. Козлов И А, Кубарева Е А Взаимодействие димера субъединицы р50 фактора транскрипции ОТ-кВ с ДНК // Успехи биологич химии, 1998, т 38, с 77-93

3. Козлов И А, Кубарева Е А. Шабарова 3 А Применение синтетических олиго-нуклеотидов для ингибирования активности фактора транскрипции ОТ-кВ // Молекулярн биология, 1998, т 32, N3, с 389-400

4. Кубарева Е А . Крынецкая Н Ф , Шабарова 3 А Ингибирование фактора транскрипции №-кВ модифицированными фрагментами ДНК и их ассоциатами с фталоцианиновыми комплексами переходных металлов И Российск химич журнал, 1998, тХЫ1, N5, с 153162

5. Зацепин Т С , Долинная Н Г , Кубарева Е А . Ивановская М Г , Метелев В Г , Орецкая Т С Ковалентное связывание модифицированных нуклеиновых кислот с белками как метод изучения специфических белково-нуклеиновых взаимодействий И Успехи химии, 2005, т 74, N1, с 84-103

Статьи

6. Kubareva Е А . Pein С -D , Gromova Е S , Kuznetsova S А , Shabarova Z А , Tashhtzki V N , Cech D The role of modifications in oligonucleotides in sequence recognition by Mval restriction endonuclease II Eur J Biochem , 1988, v 175, N3, p 615-618

7. Волков E M , Кубарева E A . Сергеев В H , Орецкая Т С Синтез олигодезоксирибону-клеотидов, содержащих 1,2-дидезокси-0-рибофуранозу // Химия природы соед , 1990, N3, с 417-419

8. Кубарева Е А . Громова Е С , Романова Е А , Орецкая Т С , Шабарова 3 А Особенности расщепления эндонуклеазами рестрикции Mval и EcoRII субстратов, модифицированных по аминогруппам гетероциклических оснований // Биоорган химия,

1990, т 16, N4, с 501-506

9. Kubareva Е А . Gromova Е S , Pein С -D , Krug А , Oretskaya Т S , Cech D , Shabarova Z A Oligonucleotide cleavage by restriction endonucleases Mval and EcoRII a comprehensive study on the influence of structural parameters on the enzyme-substrate interaction // Biochim Biophys Acta, 1991, v 1088, p 395-400

10. Романова E A , Кузнецова Л Г , Кубарева Е А . Цытович А В , Меренкова И Н , Орецкая Т С, Громова Е С, Шабарова 3 А Синтез и свойства ДНК-дуплексов, содержащих 9-[Г-гидрокси-2'-(гидроксиметил)этокси]метилгуанин II Биоорган химия,

1991, т 17, N12, с 1640-1648

11. Gromova ES, Kubareva Е А . Vinogradova MN, Oretskaya TS, Shabarova ZA Peculiarities of recognition of CCA/TGG sequences in DNA by restriction endonucleases Mval and EcoRII IIJ Mol Recognit, 1991, v 4, p 133-141

12. Пятраускене О В , Кубарева Е А . Громова Е С Спектрофотометрический метод изучения расщепления ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции // Молекулярн биология, 1991, т 25, вып 5, с 1424-1426

13 Кубарева Е А . Пятраускене О В , Карягина А С , Никольская И И , Громова Е С Изменение места расщепления синтетических субстратов эндонуклеазой рестрикции SsoII при введении ненуклеотидных вставок в участок узнавания // Биоорган химия,

1992, т 18, N8, с 1133-1136

14. Карпова Е А , Кубарева Е А . Бурьянов Я И , Громова Е С Образование двух типов фермент-субстратных комплексов при взаимодействии рестриктазы EcoRII с синтетическими ДНК-дуплексами // Молекулярн биология, 1992, т 26, вып 5, с 993-998

15. Petrauskene О V , Kubareva Е А . Gromova Е S , Shabarova Z A Mechanism of the interaction of EcoRII restriction endonuclease with two recognition sites Probing of modified DNA duplexes as activators of the enzyme II Eur J Biochem, 1992, v 208, N 3, p 617-622

16. Kubareva E A . Petrauskene О V , Karyagina A S , Tashhtsky V N, Nikolskaya 11, Gromova E S Cleavage of synthetic substrates containing non-nucleotide inserts by restriction endonucleases Change m the cleavage specificity of endonuclease SsoII // Nucleic Acids Res , 1992, v 20, N17, p 4533-4538

17. Wyszynski M W , Gabbara S , Kubareva E A . Romanova E A , Oretskaya T S , Gromova E S , Shabarova Z A , Bhagwat A S The cysteine conserved among DNA cytosme methylases is required for methyl transfer, but not for specific DNA binding // Nucleic Acids Res, 1993, v 21, N2, p 295-301

18. Karpova E A , Kubareva E A . Gromova E S , Buryanov Ya I Peculiarities of the binding of restriction endonuclease EcoRII to synthetic DNA duplexes II Biochem Mol Biol Int, 1993, v29,Nl,p 113-121

19. Пятраускене О В , Кубарева Е А . Громова Е С , Пайн К -Д , Цех Д , Шабарова 3 А Изучение механизма активации эндонуклеазы рестрикции EcoRII с помощью синтетических ДНК-дуплексов И Молекулярн биология, 1993, т 27, вып 3, с 507-518

20. Шефлян Г Я, Кубарева Е А. Ташлицкий В Н Взаимодействие эндонуклеазы рестрикции Mval с синтетическими ДНК-дуплексами температурный оптимум и энергия активации ферментативной реакции, эффективные константы скорости и энергия активации процесса термоинактивации фермента // Вест Моек У-та Сер 2 Химия, 1993, т 34, N5, с 516-520

21. Brevnov М G , Kubareva Е А . Romanova Е А , Volkov Е М, Karyagina A S , Nikolskaya 11, Gromova Е S Interaction of the Mval and SsoII methyltransferases with DNAs altered at the central base pair of recognition sequence // Gene, 1995, v 157, N1-2, p 149-152

22. Kubareva E A . Volkov E M , Vinogradova N L , Kanevsky IA , Oretskaya T S , Kuznetsova S A , Brevnov M G , Gromova E S , Nevinsky G A , Shabarova Z A Modified substrates as probes for studmg uracil-DNA glycosylase II Gene, 1995, v 157, N1-2, p 167-171

23. Sheflyan G Ya , Kubareva E A . Oretskaya T S , Gromova E S, Shabarova Z A Chemical cross-linking of Mval and EcoRII enzymes to DNA duplexes containing monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond II Gene, 1995, v 157, N1-2, p 187-190

24 Petrauskene OV, Krynetskaya NF, Tashlitsky VN, Belkov VM, Kubareva EA. Gromova E S , Guschlbauer W, Shabarova Z A Use of UV spectroscopy for the study of nucleic acid cleavage by E coli RNase H and restriction endonucleases // Biochem Mol Biol Int, 1995, v 37, N6, p 1127-1135

25. Бревнов M Г , Кубарева E A . Волков E M , Романова E A , Орецкая T С , Громова E С , Шабарова 3 А Влияние точечных модификаций углеводофосфатного остова ДНК на функционирование эндонуклеаз рестрикции EcoRII, Mval и BstNI // Молекулярн биология, 1995, т 29, вып 6, с 1294-1300

26. Козлов И А , Ивановская М Г , Кубарева Е А . Волков Е М , Шабарова 3 А Синтез и свойства ковалентно связанного ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания фактора транскрипции NF-kB // Молекулярн биология, 1996, т 30, вып 4, с 852-863

27. Kubareva Е А . Fedorova О А , Gottikh М В , Tanaka Н , Malvy С , Shabarova Z A NF-кВ р50 subumt cross-linking to DNA duplexes, containing a monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond // FEBSLett, 1996, v 390, N1, p 35-38

28. Sheflyan G Ya, Kubareva E A . Kuznetsova S A , Karyagina A S , Nikolskaya 11, Gromova E S , Shabarova Z A Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs IIFEBSLett, 1996, v 390,N3, p 307-310

29. Козлов И A, Кубарева E A. Ивановская M Г, Шабарова 3 А Определение положения контактов фактора транскрипции NF-kB методом региоселективного ковалентного связывания И Молекулярн биология, 1997, т 31, N1, с 65-75

30. Kozlov IА , Kubareva Е А . Ivanovskaya М G , Shabarova Z A Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kB // Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1997, v 7, N4, p 279-289

31. Antsypovich S I, Kubareva E A . Tashlitsky V N, Oretskaya T S , Shabarova Z A Cross-linked DNA duplexes Exonuclease stability and interaction with the nucleic transcription factor of the к light-chain enhancer (NF-kB) II Eur J Biochem, 1998, v 255, N2, p 414-421

32. Shilov I, Tashlitsky V , Khodoun M, Vasil'ev S , Alekseev Ya , Kuzubov A , Kubareva E . Karyagina A DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site II Nucleic Acids Res, 1998, v 26, N11, p 2659-2664

33. Kubareva E A . Vasilenko N L , Vorobjeva О V , Volkov E M , Oretskaya T S , Korshunova G A , Nevinsky G A Role of DNA definite structural elements in interaction with repair enzyme uracil-DNA glycosylase И Biochem Mol Biol Int, 1998, v 46, N3, p 597-606

34. Sheflyan G Y, Kubareva E A . Gromova E S , Shabarova Z A Conformational transition of restriction endonuclease Mval-substrate complex under the influence of Mg2f probed by DNA-

protein cross-linking studies II Bioconjug Chem, 1998, v 9, N6, p 703-707

35. Karpova E A , Kubareva E A . Shabarova Z A A model of EcoRII restriction endonuclease action the active complex is most likely formed by one protein subunit and one DNA recognition site // IUBMB Life, 1999, v 48, N1, p 91-98

36. Kubareva E A . Thole H, Karyagina A S , Oretskaya T S , Pingoud A, Pmgoud V Identification of a base-specific contacts between the restriction endonuclease SsoII and its recognition sequences by photocross-lmkmg // Nucleic Acids Res, 2000, v28, N5, p 10851091

37. Судьина A E , Волков E M , Орецкая T С , Дегтярев С X , Гончар Д А , Кубарева Е А Экспресс-метод тестирования активности фермента репарации урацил-ДНК-гликозилазы // Биоорган химия, 2000, т 26, N6, с 442-447

38. Воробьева О В , Васильев С А , Карягина А С , Орецкая Т С , Кубарева Е А Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза SsoII - промоторная область генов системы рестрикции-модификации SsoII II Молекулярн биология, 2000, т 34, N6, с 1074-1080

39. Кубарева Е А . Вальтер И , Воробьева О В , Разумихин М В , Карягина А С , Лау П К К , Траутнер Т Определение неметилируемого остатка дезоксицитидина в участке узнавания метилтрансфераз II Биохимия, 2001, т 66, вып 12, с 1676 - 1681

40. Pmgoud V , Kubareva Е , Stengel G , Fnedhoff P , Bujmcki J M , Urbanke С , Sudma A , Pingoud A Evolutionary relationship between different subgroups of restriction endonucleases IIJ Biol Chem , 2002, v 277, N16, p 14306-14314

41. Kubareva EA. Walter J, Karyagina AS, Vorob'eva OV, Lau PCK, Trautner T Determination of methylation site of DNA-methyltransferase NlaX by a hybrid method // BioTechmques, 2002, v 33, N3, p 526-531

42. Воробьева О В , Карягина А С , Волков Е М , Вирясов М Б , Орецкая Т С , Кубарева Е А Анализ контактов метилтрансферазы SsoII с ДНК в фермент-субстратном комплексе // Биоорган химия, 2002, т 28, N5, с 402-410

43. Турутин Д В , Зацепин Т С , Тимченко М А , Кубарева Е А. Орецкая Т С Ковалентное присоединение фактора транскрипции NF-кВ к ДНК-лиганду, содержащему 2'-альдегидную группу // Молекулярн биология, 2002, т 36, N5, с 877-879

44. Метелев В Г, Кубарева Е А . Романова Е А, Орецкая Т С Синтез и свойства олигодезоксирибонуклеотидов с моно- и дифосфорилдисульфидными межнуклеотид-ными группировками II Биоорган химия, 2003, т 29, N1, с 57-63

45. Кубарева Е А. Судьина А Е Новый метод тестирования активности ферментов репарации, рестрикции и модификации с помощью олигонуклеотидов, иммобилизованных на полимерном носителе II Наукоемкие технологии, 2003, N1, с 6471

46 Metelev V G , Kubareva Е А . Vorob'eva О V , Romanenkov A S , Oretskaya Т S Specific conjugation of DNA binding proteins to DNA templates through thiol-disulfide exchange // FEBSLett, 2003, v 538, N1, p 48-52

47. Борисова О A , Романенков А С , Метелев В Г , Кубарева Е А . Зубин Е М , Тимченко М А , Орецкая Т С ДНК-дуплексы, содержащие 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридин, как реагенты для аффинной модификации белков // Молекулярн биология, 2003, т 37, N3, с 534-543

48. Романенков А С , Борисова О А , Кубарева Е А . Орецкая Т С , Метелев В Г Синтез и свойства олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих фосфорилдисульфидную группировку в заданном положении углеводофосфатного остова // Вестн Моек У-та Сер 2 Химия, 2003, т 44, N3, с 208-213

49. Pmgoud V , Conzelmann С , Kinzebach S , Sudina A , Metelev V , Kubareva E . Bujmcki J M , Lurz R, Lueder G , Xu S -Y , Pingoud A PspGI, a type II restriction endonuclease from the extreme thermophile Pyrococcus sp structural and functional studies to investigate an

evolutionary relationship with several mesophilic restriction enzymes // J Mol Biol, 2003, v 329, N5, p 913-929

50. Воробьева О В , Романенков А С , Метелев В Г , Карягина А С , Лаврова Н В , Орецкая Т С , Кубарева Е А Ковалентное связывание Cysl42 метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими фосфорилдисульфидную межнуклеотидную группу // Молекулярн биология, 2003, т 37, N5, с 906-915

51. Karyagina A S , Alexeevski А V , Golovin А V , Spinn S А , Vorob'eva О V , Kubareva Е A Computer modeling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs // Biophysics, 2003, v 48, Suppl 1, p 45-55

52 Sudina A , Volkov E , Oretskaya T , Naryshkin N , Ivanovskaya M , Kubareva E Detection of glycosylase, endonuclease and methyltransferase enzyme activities using immobilized oligonucleotides // IUBMB Life, 2004, v 56, N3, p 139-143

53. Pingoud V , Sudina A , Geyer H , Bujnicki J M , Lurz R, Luder G , Morgan R , Kubareva E. Pingoud A Specificity changes in the evolution of type II restriction endonucleases a biochemical and bioinformatics analysis of restriction enzymes that recognize unrelated sequences IIJ Biol Chem, 2005, v 280, N6, p 4289-4298

54 Pmgoud V, Geyer H , Geyer R, Kubareva E . Bujnicki J M , Pingoud A Identification of base-specific contacts m protein-DNA complexes by photocrosslinking and mass spectrometry a case study using the restriction endonuclease SsoII // Molecular BioSysterns, 2005, v 1, p 135-141

55 Судьина A E, Зацепин T С , Пингоуд В , Пингоуд А , Орецкая Т С , Кубарева Е А Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции SsoII ДНК-дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу // Биохимия, 2005, т 70, вып 8, с 1137-1144

56. Романенков А С , Устюгов А А , Зацепин Т С , Никулова А А , Колесников И В , Метелев В Г , Орецкая Т С , Кубарева Е А Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК // Биохимия, 2005, т 70, вып 11, с 14741487

57. Тимченко А А , Кубарева Е А . Волков Е М , Воронина О Л , Лунин В Г , Гончар Д А , Дегтярев С X , Тимченко М А , Кихара X , Кимура К Исследование структуры урацил-ДНК-гликозилазы из Е coli и ее комплексов с негидролизуемыми аналогами субстратов в растворе методом синхротронного малоуглового рентгеновского рассеяния // Биофизика, 2006, т 51, вып 1, с 5-12

58. Metelev V, Romanenkov А, Kubareva Е. Zubin Е, Polouchine N, Zatsepin Т, Molochkov N, Oretskaya T Structure-based cross-linking of NF-кВ p50 homodimer and decoy bearing a novel 2'-disulfide trapping site // IUBMB Life, 2006, v 58, N11, p 654-658

59 Романенков А С , Кисиль О В , Зацепин Т С , Ямскова О В , Карягина А С , Метелев В Г , Орецкая Т С , Кубарева Е А ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок особенности взаимодействия с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII II Биохимия, 2006, т 71, вып 12, с 1648-1658

60. Kosinski J, Kubareva Е . Bujnicki J М A model of restriction endonuclease Mval in complex with DNA a template for interpretation of experimental data and a guide for specificity engineering II Proteins, 2007, v 68, N1, с 324-336 *

» Автор благодарит Назаренко А В (химический факультет МГУ) за помощь в оформлении диссертации и автореферата

ц

Подписано в печать 03 10 2007 г Формат 60x90/16 Объем 3 п л Тираж 150 экз Заказ №619 от 02 10 07

Отпечатано Филиал «Типография» ГУП «ФХУ КАСРиРГ» 123060, г Москва, ул Расплетина, д 24 Тел 499 194-38-25