Структурное и энзиматическое исследование дуоденазы - новой эндопептидазы двенадцатиперстной кишки быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

• ; О

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. АКАДЕМИКОВ М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЗАМОЛОДЧИКОВА Татьяна Степановна

СТРУКТУРНОЕ И ЭНЗИМАТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДУОДЕНАЗЫ —НОВОЙ ЭНДОПЕПТИДАЗЫ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ БЫКА

02.00.10. — Биоорганическая химия, химия природных соединений, и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва—1994

Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской Академии наук

д. х. н., профессор Степанов В. М.; д. б. н., профессор Мосолов В. В.

Ведущая организация: МГУ им. М. В. Ломоносова, химический факультет.

Защита диссертации состоится !б марта 1994 года в часов на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор химических наук,

профессор 1В. К. Антонов

кандидат химических наук Т. И. Воротынцева Официальные оппоненты:

16/10.

Автореферат разослан « //

»

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты (протеазы) - биологические катализаторы, ускорявшие реакции гидролиза пептидов и белков. Протеазк играют важую роль в регуляции ».шого-образннх биологических процессов всех живых организмов. Большое внимание исследователей уделястся сериноши прслемиазам, группе протео-дитичсских ферментов, содержащих в активном центре реакционноспособ-ный остаток серина. Такие процессы как пищеварение, свертывание крови, осуществление процессинга ферментов и гормонов, реакции иммунной защита протекает при участии сершювнх протеиназ. В последние годы большой интерес исследователей вызывает группа сершювнх протеиназ (гранзимы цитотоксических 'Г-лимфоцитов. химазы тучнчх клеток, катеп-син С), характеризующихся достаточно внеокей структурной гомологией (около 50%) и наличием характерного консервативного участка 11е-Пе-С1у-С:1у в М-конпевой последовательности. Биологическая роль этих ферментов окончательно ке установлена, однако существует предположение, что гранзимы могут принимать участие в цитотоксических процессах, осуществляемых Т-лимфоцитамл. В хода систематического исследования ферментов слизистой тонкого кишечника млекопитающих, проводимого в нашей лаборатории, из экстракта слизистой двенадцатиперстной ккпкн биш'была выделена ранее неизвестная протеиназа (дуодепаза). Предварительные структурные исследования нового фермента показали, что дуояеназа структурно близка к группе вышеназванных протеиназ. На этом основании можно предположить, что физиологическая роль дуодена-зы имеет отношение к защитным реакциям организма. Исследование структуры, физико-химических и энзиматических свойств луоденазы поможет приблизиться к понимании биологической роли этого фермента.

Цель работы. Цель представленной работы состояла в получении высокоочиденного препарата луоденазы из экстракта слизистой двенадцатиперстной кишки быка, изучении физико-химических и энзиматических свойств фермента, определении его первичной структуры и проведении сравнительного анализа первичных структур дуоденазы и других сериновых протеиназ. Были поставлены следующие задачи: 1) разработка эффективной методики очистки дуоденазы: 2} определение физико-химических свойств белка: 3) исследование субстратной специфичности фермента с использованием как синтетических так, и природных субстратов, определение клшетичес-

них параметров гидролиза дуоденазой пептидных субстратов;

4) Поиск эффективных ингибиторов дуоленазы и использование их для характеристики фермента;

5) определение первичной структуры фермента;

6) сравнительный анализ первичных последовательностей дуоленазы и ряда структурно близких дуоденазе протеаз.

Научная новизна. В настоящей работе исследована и охарактеризована ранее неизвестная протеиназа (дуоденаза), являющаяся, по-видимому, доминирующим ферментом слизистой двенадцатиперстной кишки быка. Показано, что дуоденаза принадлежит к группе сериновых протеиназ. Результаты изучения каталитических свойств дуодеиазы показали. что фермент обладает выраженной трипсино- и химотрипсино-подобной специфичностью. Определена первичная структура нового фермента (в ЕМВ1) банке структурных данных первичной последовательности дуоленазы присвоен номер Р80219). На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей дуоденазы и структурно близких ей протеиназ локализован субстратсвязывающий участок исследуемого фермента. Выявлены особенности субстратсвязываюшего участка дуоденазы, позволяющие объяснить двойственный характер ее специфичности.

Публикации. По теме диссертации опубликована одна статья, материалы диссертации докладывались на 11-ом Российско- Израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва 1992) и на Ш-ем симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 1993).

Объбы и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного сериновым протеазам млекопитающих, структурно и энзиматически близким дуоденазе (трипсин, химотри-псин, гранзимы цитотоксических Т-лимфоцитов, химазы тучных клеток), результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (184 наименования).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДУОДЕНАЗЫ ИЗ СЛИЗИСТОЙ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ БЫКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА..

Схема выделения дуоденазы из 800 г слизистой двенадцатиперстноГ кишки быка приведена в таблице 1. Получение дуоденазы включает экст-

ракшпо белков слизистой 0,01 М трис-НС1 буфером, (рН 7,6), содержащим ингибиторы протеаз ЭДТА и овомукоид (стадия 1). Дуоденаза не является мембранным белком, так как использование детергента (Тритон Х-100) не приводит к увеличению выхода фермента на этой стадии.

После центрифугирования последовательно проводили высаливание балластных белков супернатанта сульфатом аммония (30% насыщения) и кислое осаждение при рН 4,0 (стадия 2). Осадок отделяли центрифугированием, рН надосадочной жидкости доводили до 8,0 и осаждали белки сульфатом аммония (7СЗ> насыщения) (стадия 3).

Активность дуоденазы определяли начиная со второй стадии очистки по гидролизу субстрата Ас-Ьеи-Ьуз-Агд-рНА в присутствии овомукои-ла, ингибирующего примесную активность трипсина.

Осадок, полученный на стадии 3, отделяли центрифугированием, растворяли з 2,3 л 0,01 М Иа-ацетатного буфера (рН 4,0), содержащего ЭДТА и овомукоид, диализовали против него же (без ингибиторов) и концентрировали ультрафильтрацией до 500 мл. Полученный раствор наносили на колонку с КМ-целлюлозой в 10 мЫ На-ацетатном буфере (рН 4,0) и промывали тем же буфером (стадия 4).

Элюшпо белков проводили линейным градиентом концентрации НаС1 в том же буфере (0,0-0,5 II; 750-750 мл).

Фракции, содержащие активный фермент, объединяли, рН белкового раствора доводили до 8,0 и полученный раствор наносили на колонку с аффиннш сорбентом БП-сефарозой 4В, уравновешенным 10 мМ буфером трис-Ш (рН 8,0), содержащим 0,5 Ы КаС1 (стадия 5). Колонку промывали тем же буфером до полного исчезновения поглощения при 280 нм. В процессе аффинной хроматографии фермент сорбировался на лиганде. Элюцию дуоденазы проводили линейным градиентом рК 4,0-3,0 (0,1 Н На-

Сокрсщгтя: PHSF - бензилсульфонилфторид, ЭДТА - Иа-соль этиленди-аминтетрауксусной кислоты, DFP-диизопропилфторфосфат, STI - ингибитор трипсина из соевых бобов, LTI - ингибитор трипсина из легких быка, OVO-ингибитор трипсина из яичного белка курицы, LBTI - ингибитор трипсина и химотрипсина из лимской фасоли, БСА - бычий сывороточный альбумин, SDS - додецилсульфат Нз, PAGI - электрофорез в полиакрил-амидном геле, NA - нитроанилид, PAG - полиакридамидный гель, КМ -карбоксиметил.

Табл. 1 . Оалсвт Оуобежа.

Содержание дуодеказы в препарате оценивали по гидролизу субстрата Ас-Ьеи-Ьуз-Аге-рНА.

Стадия Белок Активность Удельная активность Выход

1. Гомогенат слизистой мг Ы570 ед.акт. ед/мг бедка %

2. (1Ш4)2504 (0-30%)

и кислое освждские 11550 7950 0,69 100

3. (К34)2504 (0-70%) 6270 5830 0,93 . 73

Ультрафильтраиия 1700 4770 2,80 60

4. КМ-целлюлоза 52 1010 3710 3,67 47

5. Ш-сефароза 4В 39 2067 53 26

формиатный буфер; 0,1 М НаС1; 100-100 мл). На профиле элации активной дуоденазе соответствуют два пика с максимумами при рН 3,2 и 3,0 (рис. 1). Препараты дуоленазы, соответствующие каждому из пиков, имели одинаковую специфическую активность, электрофоретическую подвижность (рис. 2) и И-конневую последовательность. Этот факт, по-видимому, можно объяснить наличием двух форм (I и II) фермента, незначительно различающихся по аминокислотному составу (табл. 2), а именно, два остатка .Ме1 формы I фермента .замещены остатками Азх и РЬе в форме II. Дальнейшие исследования проводили в основном с формой I.

Специфическая активность полученного препарата дуоденаза была 53 нмол мин"Ьлг""1 (за единицу активности принимали такое количество фермента, которое требуется для образования 1 нмол п-нитроанилина за 1 мин в стандартной реакционной смеси, содержащей субстрат Ас-Ьеи-Ьуэ-Агв-рНа).

Общий выход фермента составил 26% (табл. 1). Его гомогенность была доказана электрофорезом в РАй/БЮ (рис. 2). хроматографией на колонке с Т5К 0-2000, капиллярным электрофорезом и определением

Н-конневой последовательности.

Как видно из данних табл. 1, содержание дуодепазы в слизистой составляет как минимум 0,3% от суммарного количества белка. Для сравнения укажем, что солсргшше знтеропептидазн в слизистой двенадцатиперстной киекй бшш не престает 0,01%, т. е., по-видимому, дуо-деназа является дстдашруюзей протеиназой слизистой.

Молекулярная масса дуодеказа, определенная методом аналитической гельфильтрацик нативного фермента на колонке TSX о-2СШ составила 29,0-0,5 кДа. SIS/PAGE в восстанавливающих условиях фермента (форглц I и II) обнаруживает единственную белковую полосу, соответствующую молекулярной кассе 29 - 1 кДа (рис.2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что дуоденаза является мономером и молекула фермента ииеет одноцепочечное строение.

Пай). Скорость таиесення и щхкевхз - 5 мл/час. Луоденазу алотрова-га 0,1 И Па-ф>ра»теш буфером, градивктся рН 4,0-3,0 (100-100 ил). Скорость элиот луолгяаза 40 ' мл/час, объем фрвювн 4 мл. Смогшая шхя - поглоиенке при 280 ем, пргркнзстая - активность в ед. активности Au. I и II - фэрма I к форма II дуоленазн.

Табл. 2. Ажошжжй сослав Оуобеноза быта (форм I и И). Расчет числа аминокислотных остатков на молекулу белка (форма I и II) выполнен в предположении, что Ыг=29 Ша. Содержание остатков Тгр рассчитывали спектрофотометрически. А - данные аминокислотного анализа; В - число остатков определено из первичной структуры белка.

Аминокислота Аминокислотный состав

Форма I ' Форма II

A В A '

Ala 13,2 (13) 12 13i3 (13)

Arg 14,4 (14) 14 14.2 (14)

А 32 24,3.(24) 12 (Asp) ' 25,2 (25)

10 (АЗП)

1/2 Суз не onp. ' .6 не onp.

10 (Glu) 19,5 (19)

Gl 2 19,4 (19) 6 (Gin) -

Gly 20,7 (21) 19 20,8 (21)

His 6.9 (7) 6 6,8 (7)

Ile 10,8 (11) ; i3 10,8 (11)

Leu 18,2 (18) 18 , 18.3 (18)

Lys 12,0 (12) 14 12,1 .(12)

Met 6.9 (7) 7 5.0 (5)

Phe' 8.3 (8) 9 . 9,2 (9)

Pro 13.6 (14) 15 13,6 (14)

Ser 16.1 (16) 15 16,1 (16)

Thr 13.2 (13) 12 13,2 (13)

Trp 2.0 (2) 2 2,0 ¡2)

Tyr 6.7 (7) 6 6.6 (7)

Val 12.0 (12) 15 11.9 (12)

06'jee содержание 218 226 ; . 218

Дуоденаза относится к гликопротеинам. Анализ моносахаридов по казал. что молекула фермента (форма I) содержит 3,47% сахара!

(D-галактоза, D-манноза и Н-ацетил-В-глюкозамин ) в соотношении 1:8:11, соответственно, форма II содержит 2,1% Сахаров в том же соотношении.

Определенная изозлектрическим фокусированием в Ъ% PAG с градиентом рн 3-10 и 8-10,5 изоэлектрическая точка дуоденазы (форма I и XI) составляет 10,0 ±0,2.

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДУОДЕНАЗЫ И ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ.

Субстратную специфичность дуоденазы тестировали в стандартной реакгоюниой смеси, содержащей следующие конечные концентрации компонентов: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1,03 Mli субстрата; 1 мк11 фермента в общем объеме 0,3 мл. Активность дуоденазы определяли спектрофотомет-рически при 405 нм (37°С), в 1 см кювете по гидролизу нитроанилидных субстратов. Детекцию гидролиза эфирных субстратов вели при 255 нМ. Субстраты, чепользованные для определения субстратной специфичности представлены в таблице 3. Лучшими среди субстратов - акшшдных производных оказались три-, тетра- и пентапептидп, содержащие остатки Lys, Arg или РЬз в Р1 положении (по Шехтеру). Как трипскновые, так и химотрипсиновые субстраты гидролизовались дуоденазой с сопоставимыми значениями'К^/Кд (1(г-10* - Mceif1 ). Фермент не проявлял заметной активности по отношению к классически! "коротким" субстратам трипсина (Bz-Arg-pNA) и хилотрипсина' (Suc-Phe-jüA, Ас-Туг-рНА), однако, проявлял зстеразную активность по отноиению к'субстрату Bz-Arg-Oît. Результаты исследования гидролиза дуоденазой анилидных субстратов (эффективный гидролиз.только пептидных производных) дают основание предполагать существование у исследуемого фермента протяженного суб-стратсвяззвакмго участка'.

Кроме синтетических субстратов, для:исследования субстратной специфичности дуоденазы были использованы природные пептиды и белки. Активность фермента по отношению к таким субстратам определяли методом H PLC no возрастанию площадей пиков, соответствующих продуктам пиролиза дуоденазой этих соединений. В природных субстратах фермент наиболее эффективно расщеплял пептидные связи, образованные карбоксильной группой остатков Ьуз, Arg, Fhe, Туг. Наблщали единичные случаи гидролиза дуоденазой по остаткам Leu, Set, Val. Связь Ьуз-Рго в.пептиде ЬШЬКГШУЬКЬ не гидролизовалась ферментом, однако происходил эффективный пиролиз по остатку Leu, которому предшествует

ю

остаток Pro.

На основании полученных данных был сделан вывод, что субстратная специфичность дуоденазы носит двойственный характер: с одной стороны, для фермента характерен триптический тип гидролиза субстратов (в Р1 положении Ьуз или Arg), с другой стороны, дуоденаза, подобно химотрипсину, эффективно гидролнзует субстраты, содержащие в Р. положении гидрофобные остатки Не, Туг, Leu.

Рис.2. Электрофорез очищенной дуолеквзн ■ в 12% полиакрклащцнш геле (в восстанавливавши условия). Объем наносимой пробы 20 мкл ( 50 мкг белка). I - смесь стандартных белков (фосфолшаза Ь, 94 кЛа; БСА, 67 кДа: овальбушн, 43 кДа; карбонильная ангилраза, 30 кЛа: ингибитор трипсина, 20 кЛа; оС-лакгальбумпн, 14,4 кДа): 2, 3 - адоденаза быка, фэрыа I и II. соответственно.

Табл. 3. Кинетические копаяши гидрата тщюатиидюа и пелхидюа субсщхтв дуоденазой. Кинетические параметры гидролиза определены по уравнению Лайнуивера-Берка.

Субстрат *cat ** Гидролизами зуемая связь

сек-1 mS Н"1сек-1

Ac-Leu-beu-Arg-p-HA 0.01 9.1 1.1 Arg - р-НА

Ac-Leu-Lys-Arg-p-NA . 0.02 4.5 5.2 Arg - р-НА

Cbz-Ala-Ala-Ala-Arg-p-HA 0.3 1.1 240 Arg - р-НА

Cbz-Al a-Al a-11 e- Arg-Arg-p-HA 0.2 0.3 656 Arg - р-НА

Bz-Arg-OEt 0.3 2.5 133 Arg - OEt

Bz-Arg-p-NA не ] гидролизуется

Suc-Ala-Ala-Phe-p-HA 0.08 0.7 105 Phe - р-НА

Phe-llet-Arg-Phe-H32 0.07 0.1 667 Phe - НН2

LIEELKPLEEVLHL 1.0 1.0 1000 PL - ЕЕ

Ac-Phe-p-NA не гидролизуется

Ac-Tyr-OEt не гидролизуется

Двойная специфичность фермента не является мнимой (связанной с. присутствием активных примесей),- поскольку соотношение двух типов активностей не изменялось в ходе очистки фермента.

В таблице 4 приведены результаты исследования ингибирующего эффекта различных соединений на активность дуоденазы. полное ингибиро-вание фермента PHSF и DFP свидетельствует в пользу того, что дуоде-наза относится к числу сериновых протеаз. Обе активности дуоденазы эффективно подавлялись белковыми ингибиторами трипсина (STI, LTI) и ингибитором трипсина и химотрипсина - LBTI. Овомукоид из куриного

яйца с ферментом не связывался. Как триптическая так и химотрипти-ческая активности дуоденазы подавлялись ингибитором трипсина Тоз-Ьуз-СНрМ и ингибитором химотрипсина Тоз-РЬе-СН2С1, что свидетельствует о перекрывании "триптического" и "химотриптического" субстрат-связываюших участков дуоденазы.

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ДУОДЕНАЗЫ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДУОДЕНАЗЫ И ДРУГИХ СТРУКТУРНО БЛИЗКИХ ДУОДЕНАЗЕ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ.

Первичная структура дуоденазы (форма I) (рис. 3) была реконструирована в результате выделения и идентификации почти полного набора индивидуальных пептидов, полученных в ходе триптического гидролиза пиридилэтилированного препарата белка. Дополнительные фрагменты -продукты гидролиза модифицированного 4-винилпирилином препарата дуоденазы протеазой У8 из Staph.ylococcuз Атеиз, активной дуоденазой и расщепления бромцианом - обеспечили необходимое перекрывание пептидов для правильной реконструкции первичной последовательности.

Молекула дуоденазы состоит из 226 остатков аминокислот. Молекулярная масса, рассчитанная по данным определения первичной структуры фермента, составляет 29,06 кДа, что хорошо согласуется со значениями Мр, полученными другими методами (БЕБ/РАСЕ, аналитическая гель-фильтрация ).

Н-концевая последовательность дуоденазы (24 остатка) была определена прямым секвенированием интактного белка.

С-концевая последовательность дуоденазы была определена на основании данных по кинетике накопления определбннах аминокислот в ходе гидролиза фермента карбоксипептилазами А, В, У. Реконструированная таким методом последовательность - Ме1-Туг-Ьеи-РЬе-Ьуз226 подтверждена секвенированием бромцианового пептида (остатки 223-226).

При секве'нировании одного из фрагментов полипептидной цепи дуоденазы (остатки 37-60, гидролиз протеазой 48), не был идентифицирован (в нескольких повторах) остаток, соответствуший положению 50 последовательности белка. По нашему предположению, это остаток - абп, образующий единственный сайт гликозилирования дуоденазы (типа -АкШОЬХ-Тйг-).

Первичная последовательность дуоденазы содержит 6 остатков 1/2 Суз, в положениях, топологически эквивалентных занимаемым консерва-

Табл.4. Влияние разлмш соейшай т щипсиноподобнув и шхщиг-синоподовную ажВноапь дуоденазы (гидролиз суОсщшоб Ас-Ьеи-Ьуз-Аг8-рИА и 5ис-А1а-А1а-РЬе-рШ. Фермент (0,5 ед. акт.) инкубировали с каждым тестируемым соединением при 37° в течение 5 мин в стандартной реакционной смеси. Реакция начиналась при добавлении субстрата. Инкубация с ТозЬузСН2С1 и ТозРЬеСН2С1 - 80 мин. В скобках - активность определяли по гидролизу субстрата Рйе-йе1-АГ8-РЬе-НН2.

Соединение Концентрация Остаточная триптическал активность Остаточная химотриптическая активность

шй о» Л 7.

- 100 100

PMS? 5.0 0 2

DFP 5.0М0"2 0 0

ТозЬузСН2С1 3.0 5 75;(0)

ТозРЬеСН2С1 3.0 8 0

Бекзамидин 10.0 100 100

STI 3.0М0"3 4 2

LTI 3.0*10"3 5 -

070 3.0-10"3 100 100

LBTI 3.0'Ю"3 0 5

EDTA 4.0-Ю"3 100 100

Тритон Х-100 1 % 100 100

Са+2 5.0 100 100

тивннми остатками Суз в последовательностях гранзимов человека и мыши (исключая гранзимн А), химаз I и II тучных клеток крысы (Ш!СР I, РМСР II), катепсинв в человека, наиболее структурно близких дуо-денвзе (48-55* идентичности) (Рис. 4). Мы предполагаем, что 6 остат-

ков 1/2Cys дуоденазы в нативном белке образуют 3 дисульфидных мостика по типу образования -S-S-связей, определенных для RHCP II: (Суз29-Суз45, Cysl2l-Cys187, Суз152-Суз166). Свободные SH-группы при определении с помощью реактива Эллмана в нативном белке не были обнаружены.

Остаткам аминокислот, образующим каталитическую триаду серино-вых протеиназ (Н1з57, Asp102, Ser195, нумерация химотрипсиногена А), соответствуют остатки Hls44, Asp87, Serl81 в структуре дуоденазы (Рис. 3). Положения, занимаемые каталитически активными остатками дуоденазы, топологически эквивалентны положениям, в которых расположены остатки каталитической триады в первичной последовательности других сериновых протеиназ (Рис. 4).

Известно, что остаток, находящийся в положении минус 6 от каталитического остатка Ser, во многом определяет субстратную специфичность сериновых протеиназ. В соответствующем положении в последовательности дуоденазы расположен остаток Asn. К субстратсвязывающему карману сериновых протеиназ относится остаток в положении 226 (нумерация химотрипсиногена А). Остаток Азр20б (топологический эквивалент) в структуре дуоденазы не имеет гомологичного аналога в структуре других известных сериновых протеиназ.

Молекула дуоденазы в целом имеет основный характер: в её полипептидной цепи содержится 28 положительно заряженных остатков и 22 кислых остатка. С таким соотношением заряженных остатков аминокислот хорошо согласуется высокое значение pl (10 - 0,2), определённое для дуоденазы.

В настоящее время известно 15 сериновых протеиназ, имеющих строго консервативные участки в М-концевой последовательности: 1-4 и 9-16. Такие консервативные участки найдены в N-концевой последовательности дуоденазы (рис. 4).

Наиболее интересными оказались результаты сопоставления первичной структуры дуоденазы и других структурно-близких дуоденазе протеиназ в области субстратсвязываюшего участка. Известно, что в структуре участка специфического связывания субстрата сериновых протеиназ, (остатки 185-230, здесь и далее нумерация остатков по химотрип-синогену А быка), в определенных положениях имеются критические остатки, природа которых в значительной степени определяет сродство

фермента к- тем или иным субстратам, иначе говоря, его специфичность. Для трипсина и трипсиноподобных протеаз таким остатком является Asp189 (рис. 4), который, как показывают рентгено-структурные исследования, вступает в электростатическое взаимодействие с Р1-остатком Ьуз или Arg субстрата, что, в конечном итоге, обуславливает высокую эффективность связывания таких субстратов в активном центре фермента.

В структурах химотрипсиноподобных протеаз (в т. ч. и химотри- ' псина) положение 189 занимают остатки незаряженных аминокислот (Ser, Ala, Ihr) и, в целом, субстратсвязывающий "карман" таких ферментов имеет гидрофобную природу. Эффективное связывание субстрата в "кармане" специфичности хииотрипсина и химотрипсиноподобных ферментоз возможно при наличии гидрофобного остатка в Р1 положении субстрата, так как определяющими в этом случае являются гидрофобные взаимодействия между Р^-остатком субстрата и су.бстратсвязываю-щим "карманом" упомянутых протеаз.

■ Недавно охарактеризованные и, пока не имеющие аналогов по специфичности среди известных протеаз животного происхождения, структурно-близкие дуоденазе гранзимы В из цнтотоксических лимфоцитов человека и мыши, эффективно расщепляют связи, образованные

Рис. 3. Первичная структура дуоденазы. Сплошная линия - пепгши, использованные для анализа последовательности. Прерывистой линией указаны участки последовательности, при определении которых был использован аминокислотный анализ соответствуют пептидов. (*■ *■ »), деградация по Эдыану тфидилэтилированного белка; (■* * ■* ), С-конпевая последовательность, определенная с ло.чозь® . пиролиза хзрбохсипелти-даз&чи А, В и Y; Тг, триптические пептиды; BrCIi; пептщы, полученные в ходе раквеплния бромцианом; БгСТ/VS, брощиановые пептиды, дополнительно расцепленные протеазой V8 из S. aureus; V8, пептиды, полученные в ходе гидролиза протеазой V8 из S. aureus; Duod, пеппш. полученные в результате гидролиза денатурированного препарата дуоденазы нативной дуоденазой; +, надежно идентифицированные остатки; неиденпфшроваяные остатки; прерванный сиквеис. Сайт.

Ч-гликозширования обозначен #. Остатки, • образуйте каталитическую триаду, помечены *. Остатки Суз .(определенные как пиридилчтилирован-ные производные) обозначены 1.

10

20

Тг

ВгСЯ

Y8

Duod

Duod..

I I GGBEARPBSRPYHAFLLrKTSGKSfl

t + + + + +

+++++++++++++++++ + + + +'+ + + + t +

+ + t + + +h + + + + + + + +'

+ -- + + + + + + + + + +

30 40 50

I « I *

I С G G F L V В E D f V I T A A В С L G 5 I К V И G

Tr + + + + + + + + + + + + + + +)

¿cu + + + + + + + + + + + + + + + + t + +)

Y8 + ++++++++t+++++++

Duód t + + + t + + + + + + + .. .... i

Duod + + t + + + + + + + t +1+ + + +)

60

70

80

Тг" BrCN

те

УЗ

üiod

Duoíl

Тг

Тг

ВгСЯ

V8

tmd

AHNIHERERTQQVIPVRRPIPHPDYHD .+ + + t + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + t + + + t+ t ++'+ + + + + + + + + +

1 ГТТТТТТТТТ$ 1

i FT +++++++++

+ + + + + + + - + + + + - + +) 7

so

100-

I TLA К DI 8 L L'K LTRKADITDKVSPIHL +++++++++++ +++++++++++++

J . _______

+ + + + + - + - + + Г + + + + + + + + + + + -+ + + +

t +H + + + + +- + + +

♦ t +

Tr

Tr

BrCN

BrCN

V3

Duod

Tr

BrCN У8

та

Duod

110 120 130 • I

PRSLAEVKPGHHCSVAGWGRLGVÍÍMPS + + + + + + t + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ^-----:----,-

и ( t t t ♦ tt »»hthhh h-tt

"I tttttttttttttI

+ + + + + + + + + + + + + <■ + + + ++' + + + + + + + + + + + +

--1-

140 150 160

TDXL QEV DLIV QSEEKCIARFK NY I P F ++++++++++++++++-+++ +++++

+ t + + + -+ t + + + +tt ++>+ + +ТЧ ++++++ +"+"+■ + Ч + + + + tt+ + + + + + + + '

I + + - + + - + t) '

+ + + + + + + + +TTT) ни t

170 180

T Q I CAGDPSKRRHSFSGDSGGPLVCNG

( h ( h h h hh»h)t)hh-t)

+ + + + + + - + +- -- + ++)

+ + + + + + + +)

( f H t H H

Tr BrCN

VÖ ______

BrCN/V8 _

yy a +++ + + + + + + + t+ +t +

шоа _

190 200 210

Y A Q G I V SYGKNDGTTPDVYTRISS'FLP jj, + + + + + + + + +++++++++++*+++

BrCN ^

^/ygt + + + + + ?+ + + + + ' ++ + + + + + ++ +

iw* + + + + + + + +

Duod _^

220

I I KRVHYLFK ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

+ + + t + + + +) BrCN » + +

H

BrCN/V8

карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Предполагают, что в субстратсвязываюием участке гранзишв В критическим для определения специфичности фермента является остаток Arg, занимающий положение 226. Считают, что Arg226 гранзимов В электростатически взаимодействует с Р,-остатком Asp субстрата, что, в основном, и обуславливает высокое сродство фермента к таким субстратам.

При сопоставлении первичных последовательностей дуоденазы и вышеупомянутых ферментов обнаруживаются уникальные особенности структуры дуоденазы в области субстратсвязыващего участка, а именно, в отношении природы критических для специфичности сериновых протеиназ остатков в положениях 189 и 226.

Выше было сказано, что субстратная специфичность дуоденазы носит двойственный характер - трипсино- и химотрипсиноподобный. причём, степень выраженности двух типов специфичности примерно одинакова. В первичной последовательности дуоденазы в 189-ом положении (нумерация остатков по химотрипсиногену А) находится незаряженный и довольно объемистый остаток Asn, не встречающийся в топологически эквивалентном положении в последовательностях других сериновых протеиназ, структурно сходных с дуоденазой. Исходя из этого, можно предположить, что для нового фермента будет характерна химотрипсино-подобная специфичность, возможно, качественно несколько отличная от

Рис. 4. Сравнение перданьа последовательностей дуоденазы в сериновых протеиназ с шсоксС стшодьо структурной идентичности. Приведены первичные структуры таюш . трипсина в юшотрипсика. После- ' довательности расположены таким -образом, чтобы достичь • максимальной степени структурного сходства. . Участки последовательностей, заключенные в рамку, содержат идентичные остался. Сокрааения: IXJ0D, дуоденаза; h-CCPX, протеиназа - из штотоксически Т- , лимфоцитов человека: h-SECT, гранзим В человека; т-ССР1; гранзин В шши; Ш-ССР2, гранзим С ш; GLP I и GLP II, граизшякшбные протеин азы I и И из двенадцатиперстной кишки крысы; RKCP I и II, ямазы тучных клеток кгнсы; САГ 0, катепсин С. человека; TRP, бычла трипсин; CHT, бычий хюотгяпсин а; СНИг, нумерация остатков по шотрипсиногену. Все последовательности . получена кз банка первичных структур ЕШЬ Data Bank.

'jHT'Nr 16 20 30 40 50 57.

DUOD I I G G H E A К PHSRPYHA F L L F К T S G R 5 Б I С G G F L V R E DF 7 L T A A H С

h-CCPX I I G G H l A К PHSRPYMA F 7 Q - FLQIKSRRR С G G I L V R К D F 7 L T A A H С

h-SECT I I G G H ï A к P a S R P Y » A Y L il - I Щ D Q X S LRR С G G F L I R DDF 7 L T A A H С

Л-ССР1 I I G G II I 7 к P H S R P Y H A 11- S I Ä В 0 Q P I A I С G G F L I R I D î 7 L T' A A H С

Э-ССР2 I I G G H E I s P H S R P Y И A Y Y E F L S. 7 G G К К il F С G G F L 7 R D RF 7 L T A A H с

o:? i I I G G H E A D P H S R P Y 51 A TLQYX1IIDSRDTI С G G F L I R E û F V L T A A H С

01? II I I W G ï E S К P H S R P Y H A F I К F Y D S И S E P H S С G G F L V A R D I 7 M T A A H с

RI1CP I I I G G 7 E S R PHSRPYHA HLEITTIRGYKAT С G G F L 7 T R Q F 7 M T A A H с

R.' JCP II r I G G 7 E S I P H S R P Y H A H L D I 7 T î К G L R 7 I С G G ï? L I S R QF 7 L T A A HC

CAT G I T G G R E S R P 3 S :t P Y H A Y L Q I QSPSAGQSR С G G F L 7 R E D F 7' L T A A H с

тар I 7 0 G Y T С G Д li ï 7 P Y Q Y S L H - S — — - Y H P 0 G G S L I M S Q fl Y Y S A A H 0

CHT I 7 я G E E'A V ? G 3 W P Tf Q V S L Q - D X ï - 7 H F С G G s L I N E H Я V Y 1И H с

СНИг • 60 70 80- 90 100 102

DUüD T, G S - - I N V T L G A H H I M E - R e' R Г Q Q 7 T P V.R R P I P II P D y' 11 D E T L A Ii D I

h-CCPX Q G S - - I 11 V T L G A H H I К E - Q E R T Q Q f I P 7 R R P I P H P A Y H P К N F S H D I

h-SICT II G S - - I î! V T L G-A H И I К E - Q E P T Q Q F I P V R R A I P H P A Y .4 P R II F S 11 D I

3-CCPI F G s - - I И Y T L G A H H I К E - Q E X T Q Q V I P H V К С I P H P D Y H P R T FSH D I

Я-ССР2 X G s - - ■J T 7 T L û A H H I К A - К E E T Q Q I I P 7 A К A I P H P D Y 11 P D D R S Я D I

01,P I S G s - К I N 7 T L G A H ¡1 I К E - Q E X T Q Q 7 I P 7 7 R I I P H P A Y 11 A S T I 5 11 D I

OLP II H 0 R - H I К 7 T L G A H N I К К - Q E N T Q - 7 I S 7 7 К A К P H L 1! Y D R D S 3 F H D I

R.'iCP I к 'J R - E T T 7 T L G V H D .7 S К - T E S T Q Q К I HI R Q I 7 H P 11 Y H F Y s H L H D I

KMC? II X G R - £ I T V I L G A H D 7 R К - R E S T Q Q К I R 7 E R Q I I H E 3 Y II S 7 p N L H D I

CAT G II G 5 - H I 11 7 T L G A H 11 I Q R - R E II T Q Q H I T R R A I R R H P Q Y !I Q R T I Q 11 D Г

TRP V X S - G I Q V R L G 0 5 N I H Y - V E a N Q Q F I SAS К S I V H P S Y Я S H T L Я Я S I

CHT '3 Y f T S D V Y Y AGE? d a g S S 3 E - К I Q К L X I A К V F ï. Ы S X Y к s L г I Я я D I

CHlUr 110 IZO 130 140

DÜOD S L L к L T R К A D I T D К V S P I H I р R S L A E V К P G H »fcT S Y А G W G R L G Y H - H

h-CCPX M L L 0 I I R С A К » T T A Y R P I R I р S S К A Q Y Я P G Q L С S V А G W G - Г V S В - S

Ь-SECT ILL Q L E R К A К R T R A Y Q P I R I р S H К A Q Y К P G Q T с S Y А G w G Q T A p L - G

B-CCP1 I II К L К S К A К R T R A Y R P I H I р R R H Y H V К P G D.V С Y V А G w G R a A P M - G

D-CCP2 ILL К L Y R N A л Р. T R A V R P I 11 L Р R R-H A H V К P G JB E с T V А G w G К V T P D - G

GLP I В L L к L KSK A К R T R A Y К TL S Ь Р R S H F-К Y К P G D Y с Y V А- G w G К L G P H - G

GLP II I II к L E R К A Q L N G V V KT I A L Р R S Q D W Y К P G Q V с T Y А G я G R L A H C - -

R1CP I ILL к L Q К К A К Y T P A Y D Y I P L Р Q P К F К Y К P G D Y с Y Y А G I G Q T G V T - К

RSCP II ILL к L E KK V E L T P A Y H Y V P L Р S P S D P I Б P G A N с W А А G w G К T G V R - D

CAT G ILL Q L S R R V R R H R R Y H P VA L Р R A Q E G LR P G T L с T Y А G w G R V S a - - R

TRP a it-1 К L К S Л i 5 1 S S H ASI S L Т T - - S CAS i G г q с L i S G я G Я Г К S S G T

CHT Î I n L S T A i 5 У S 'Q ï l SAY С LPS A 5. D D F A A G T T с V.î T G я G L T R Y - - A

СНТМг 150 160 170 180 189

DOOB PSID К Ъ Q E V D LE Y Q S E E К 1 I A R F К - H Y I P P T Q I C А G D P S К R R N S F S

h-CCPX TLA TT L Q E V LLTYQKDC. Q С ERL F H G H Y S R A TE I с V G D P К К T Q T G F К

h-SÏCT К H S H.I L Q E V К й I Y Q E D P. К с E S D L R H Y Y D S T I EL с V G D P E I К К T S F К

и-ССР) K.Y SUT L Q E V E L T V Q К DRE с ES Y F К H R Y N К T HQ I с А G D P к T К Р. A S F R

B-CCP2 П PK т L H E V X II V Q К D Q V с ESQ F Q S S Y H R A H E I с V G D S K I X G A S F E

GLP I К F P D К L Q E V E L T Y Q E D QI с E T Y L К H A Y D К A N Q I с А G D P к i. К C A S F Q

GLP II . Т S S К Т I Q E V HIEVQKGQK с Q D Я SED Y H D S I - Q L с V С К p с E G К A T G К

RHCP I Р TS в т L R E Y К Q RT Я D К E A с К H Y F H - - Y H Y N F Q V с Y G S P R К I R S A Y К

RïCP II P T. S Y ï L R e' V E L R I HD E К A с 7 D Y R - - Y Y E Y К F Q Y с V G S P T T I R A A F il

CAT G R С T D T L R E Y ELRISDEKA с L R - IF G S Y D P R R Q I с Y G DR R E R К A A F К

îkp s y p 5 .у L К С L К A P I I 5 N S S 0 К S A y p G q i t - S N Î1 f с А G y L q 0 G К D S С q

cht Я î P D R LQQASIiPIiL-S N: î Я С К К Y î? G T к i e - D A Ы i с A G A - - S G y s S с H

снтнг

195

200

210

220

226

230

DUOD G D S G G P L V С H - - G V A Q G I V S ï G К HD G T - T P DYÏTRISSPLP W

h-CCPX G D S G G P L V С к - - D Y A Q G I E S Y G И К К Gl - P P GVTIKVSHF LP W

h-SECT G D S G G P L' Y с H - - - - К V A Q G I 7 S Y GROGS-- .P P R A С T K7 S S F.Y 3 К

Ш-ССР1 G D S G G P L V с к - - К V A A G I V S Y G Y К D G S - - - P P RAFTKYSSFbS W

B-CCP2 E D S G G P L V с к - - й А A A G I V S Y G Q T D G S - - A P Q V P T R V L S P V S W

GLP I G D S G G P L V с к - - К V A A G I V S Y G R К D GS - - - T P RAFTKVSTPLS W

GLP II G D S G G P P V с D - - G V A Q G I Y S Y R L С T G T - - - L P RYPTRISSFIP W

R4CP I G D S G G P L V с к - - G V A H G I V S Y G R G D AK - - - - P P AYPTRISPYVP я

RMCP II G D S G G P L L с к - - G V A H G I V S'Y G H P D AK - - P P AIFTRYS. TYYP w

CAT G G D S G G P L L с п - - - - Я V A H G I V S Y G К S S G V - - P P EVFTRYSSFL? w

TRP CHT G D S G G D S G G P -Y Y 0 S -G -P' Ь Y С К К

CHTNr 240 245

DUOD I К R Y H Y Б F К

h-CCPX I К R T M KR L

h-SECT ï К К T H К P Y

Ш-ССР1 I К К T H К S S

Ш-ССР2 I К К T M К H s

GLP I I E E T M к к s

GLP II I Q К T a К V L Q Q s

RMCP I I N К Y I К G К D

RSCP II I HAY I H T S S

CAT G I R T T ï R S F KL L

TRP CHT I К Q T V Q Q T I A S N L A A H

G А

GKbQGIYSWGSG-CAQKHKPGYYTKYCHYVSÏÏ WTLYGIYSÏÏGSSTCSTS -IPQTÏi Hîi LYHÏÏ

D Q îl I TPL

специфичности самого хшотрипскна, так как при связывании субстрата, имевшего в Р, положении такую объемистую группу как остаток триптофана, возможна стерические затруднения. Действительно, мы не наблюдали случаев гидролиза дуоденазсй пептидных связей, образованных триптофаном.

Проявление дуоденазой триасиноподоб^щ: каталитических свойств мы связываем с присутствием в ей послздоватедькостк уникального остатка Asp в положении, топологически эквивалентном 226-му в структуре хшотрплепногенз А. Логично прелподояйть. что Агрйб дуоденазы вступает в электростатическое взаимодействие с Ррсстаткк.ш Lys или Агв субстратов, в результате чего обеспечивается з£Фектавпое связывание последних в субстратсвязываюабц участке дуоденазы.

Здесь можно провести аналогии с одной стороны с трипсином и трипсиноподобнши лротеазаьи, исходя из природы специфичность-определяющего остатка. С другой еторсйн, топологическое расположение этого остатка совпадает с таковкм. предполагаемым для гранзжов В.

Известно, что исследователями предпринимались многократные попытки изменить природную специфичность феркентов методами направленного мутагенеза в области субетратсвяз1таздего участка, а именно, заменой критических для специфичности остатков в ььзеупошшутш; положениях первичной последовательности беки: на остатки с качественно другими свойствами. Суиестзетш ускехов в аток направлена к настоящему вреиени достигнуто не было, поскольку иуташчше. ферменты либо оказывались неактивными, либо проявлял;! крайне шзкую каталитическую активность. В известном смысле, луоденаза - интереснейший объект, имеющий уникальные остатка сразу в двух критических для'специфичности фермента тюлоиениях субстратсвязавзхеего участка.

В настоящее время источник .биосинтеза и точная гистологическая локализация дуоденазы не установлены. Цв оснсззнка кгэюшхея данных, можно предположить,что дуоденаза з слизистой двенадцатиперстной низки быка может выполнять какую-либо из к.аепрйьедешш функций:

а) участие в тмушшх реакщях;

б) участие в пищеварении: '

в) осуществление процессинга ферментов или горноноз.

. ювола

1. Из слизистой двенадцатиперстной юшки быка выделен и получен в гомогенном состоянии новый протеолитически]! фермент, получивший название дуоденаза.

2. Определены физико-химические и молекулярные свойства дуоденазы. Установлено, что фермент является мономером и 'имеет молекулярную массу 29 кДа. Обнаружены две формы дуоденазы, незначительно отличаю-ииеся по составу аминокислот.

3. На основании ингибиторного анализа выявлены эффективные ингибиторы дуоденази; полное пнгибированпе фермента лиизопропилфторфосфатом и бензилсульфонилфторидом свидетельствует о принадлежности дуоденазы к группе сериновых протеиназ.

4. На основании исследования каталитических свойств дуоденазы в отношении пептидных и белковых субстратов показано, что фермент обладает выраженной трипсиноподобной и химотрипсиноподобной специфичностью.

5. Определена полная первичная последовательность дуоденазы, состоя-аая из 226 остатков аминокислот, структуре дуоденазы присвоен персональный номер в ГШЬ банке структурных данных.

5. На основании сравнительного анализа первичных структур дуоденазы и структурно-родственных протеиназ предложено объяснение двойной специфичности фермента.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях

1.Vorotyntseva т. I.. Zaaolodchltowa Т. S., Antono? V. К., Duodenase, а пет ti^psln-Ше protease from bovine duodenum. Partial structure and properties. 8th Symposium on chemistry oi peptides and proteins (FRG-USSR), (Aachen. 1991), Atotr., p. 73.

2. Antonov V.-X, Zamolodchltora T. S., VorotyntseTa Т. I., Americ A. Yu., Grlgorenko V. C., Yamol S. V., Duodenases, а пей group oi serine otfopcptldases structurally related to granzymes., II Russian-Israel ; Sluposlum on peptides and proteins (Moscow, 1992), Abstr., p. 27.'

3. Антонов В. К., Воротынцева Т. И., Звмолодчикова Т. С., Дуоденаза - новая сериновая протеиназа с необычной специфичностью., Докл. Акад. наук, 1992, т. 324, й 6, с. 1318-1322. .

4.' Воротынцева Т. И., Заыолодчикова Т. С., Антонов В. К., Дуоденаза - новая сериновая протеиназа двенадцатиперстной кишки быка. Свойства и особенности первичной структуры фермента. III Симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 9.

МП «Пети. Зк.4£7в(7