Структурные элементы, существенные для высокоэффективного взаимодействия нейротоксинов с холинорецепторами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

003494156

Мордвннцев Дмитрий Юрьевич

СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ, СУЩЕСТВЕННЫЕ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕЙРОТОКСИНОВ С ХОЛИНОРЕЦЕПТОРАМИ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2010

2 5 МАР 2010

003494156

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ нейросигнализации Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук, Уткин Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук Балезина Ольга Петровна

профессор, доктор химических наук Ефимов Александр Васильевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

_часов на заседании диссертационного совета

Защита состоится « 10 » марта 2010 г. в. Д.002.019.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «_» 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалъность проблемы. Одной из основных проблем современной нейробиологии является выяснение молекулярных механизмов передачи нервного импульса и, как следствие, исследование функционирования рецепторов, вовлеченных в этот процесс.

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) представляют собою классический образец лиганд-управляемых ионных каналов. Эти рецепторы играют важную роль в различных физиологических процессах, как в норме, так и при некоторых патологических состояниях. Существует несколько подтипов нАХР, различающихся по своим фармакологическим свойствам. Вследствие этого направленный рациональный дизайн лигандов нАХР, обладающих различной селективностью и сродством, представляет значительный интерес как для фундаментальных исследований (в качестве инструментов для изучения молекулярных основ передачи нервного импульса), так и для практики (в качестве потенциальной основы для создания новых лекарственных препаратов).

Возможность применения методов направленного дизайна селективных лигандов нАХР обусловлена наличием большого количества высокоспецифичных природных лигандов с известной структурой, в частности, полипептидных токсинов из ядов змей (а-нейротоксины) и моллюсков рода Conus (а-конотоксины). Кроме того, прорывом в изучении структуры нАХР стало открытие и установление пространственной структуры гомолога лиганд-связывающего домена нАХР - водорастворимого ацетилхолинсвязывающего белка (АХСБ). Так, на основании полученных кристаллографических данных о комплексах АХСБ с лигандами сделаны выводы о конформационных перестройках отдельных участков молекулы рецептора, приводящих к открытию ионного канала при связывании агониста.

Тем не менее, для методов рационального дизайна необходимо детальное картирование лиганд-связывающих участков нАХР и АХСБ, определение структурных элементов молекулы лиганда, взаимодействующих с отдельными областями участков связывания, и установление конкретных межмолекулярных взаимодействий. Подобное картирование позволит применить накопленные данные о взаимодействии лигандов с нАХР для конструирования молекул, обладающих высокой селективностью и сродством к определенному типу нАХР.

Данная работа посвящена изучению структурных детерминант пептидных токсинов из ядов змей и моллюсков, определяющих их сродство и селективность к нАХР, а также картированию участков рецептора, вовлеченных во взаимодействие с токсинами. Таким образом, она направлена на решение проблемы рационального дизайна пептидных лигандов нАХР и является актуальной и обоснованной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление подробной топологии участка связывания лигандов в нАХР и определение молекулярных механизмов взаимодействия с ним пептидных токсинов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Установить методологическую применимость вычислительного моделирования при анализе взаимодействия пептидных лигандов с нАХР, для чего на основании биохимических и структурных данных о взаимодействии лигандов и рецепторов воспроизвести или же определить заново возможные конформационные положения различных конотоксинов в участке связывания ацетилхолина, а также объяснить со структурной точки зрения полученные в реальных экспериментах данные;

2) Провести апробацию предсказательных способностей получаемых моделей на основании определения их функционального потенциала на примере комплексов нАХР с коротким а-нейротоксином и его мутантной формой, а также со слабыми нейротоксинами;

3) На основании полученных данных определить потенциальные пары взаимодействия и структурные детерминанты токсинов, определяющие их сродство и селективность к определенному типу рецептора;

4) Предсказать возможные свойства ряда аналогов конотоксина PnIA и провести сравнение предсказанных и наблюдаемых в эксперименте параметров взаимодействия.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые построены структурные модели нАХР и АХСБ в комплексе с полипептидными лигандами с учетом подвижности отдельных элементов структуры рецептора, в частности петли С (обозначения элементов структуры молекул нАХР, АХСБ и трехпетельных токсинов приведены на рис.1). Установлены области структуры рецептора и соответствующие им участки токсинов, определяющие характер взаимодействия между нАХР и пептидными антагонистами. Показано, что пептидные антагонисты нАХР имеют в целом сходный механизм взаимодействия с каноническим участком связывания ацетилхолина, однако некоторые детали взаимодействия существенно различаются. Впервые методом рационального дизайна сконструированы пептидные лиганды с качественно заданной селективностью и сродством. Практическое значение данного исследования состоит в построении вычислительной модели участка связывания пептидных токсинов, которая может быть использована для рационального дизайна лигандов с заданными фармакологическими свойствами.

Апробация работы. Отдельные результаты работы представлялись на XII Международном симпозиуме по холинергическим механизмам (Аликанте, 2005), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), Международном симпозиуме «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007), Международном симпозиуме «Никотиновые холинорецепторы как терапевтические мишени» (Сан Диего, 2007), Российско-немецкой конференции «Новые достижения а изучении рецепторов нейротрансмиттеров» (Франкфурт-на-Майне, 2008), 8 конференции Азиатско-тихоокеанской секции Международного общества токсинологии (Ханой, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей в реферируемых международных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 287 цитируемых работ. Работа изложена на 140 страницах, содержит 9 таблиц и 29 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы и методы исследования. Для решения поставленных задач использовались методы вычислительного моделирования и симуляции поведения молекулярных систем, а также филогенетический анализ. Так, в частности, применялось гомологичное моделирование с использованием программы MODELLER (http://modeller.salilab.org). Для симуляции межмолекулярных взаимодействий использовали программы DOCK

(http://dock.compbio.ucsf.edu/), HEX (http://www.loria.fr/~ritchied/hex/), AUTODOCK (http://autodock.scripps.edu/), HADDOCK (http://www.nmr.chem.uu.nl/haddock/). Молекулярно-динамические симуляции выполняли с применением программ GROMACS и TINKER (http://dasher.wustl.edu/tinker). Получаемые модели сравнивались с литературными данными, а также с результатами реальных экспериментов. Для проверки моделей in vitro использовались методы кристаллографии, конкурентного радиолигандного анализа и электрофизиологии. Автор выражает признательность коллегам, предоставившим экспериментальные данные, которые были необходимы для проведения моделирования, анализа и подтверждения полученных моделей.

Данные о кристаллической структуре конотоксина PnIA[L10, К14] с АХСБ Aplysia californica получены в сотрудничестве с проф. А.Б.Смитом (Свободный Университет Амстердама) и проф. Т.Сиксмой (Нидерландский Институт Канцерогенеза). Данные по взаимодействию токсина WTX с мускариновыми холинорецепторами получены в сотрудничестве с проф. В.Долежалем (Институт физиологии Чешской Академии Наук). Данные по взаимодействию сконструированных аналогов конотоксинов с никотиновыми холинорецепторами и ацетилхолин-связывающими белками любезно предоставлены д.х.н. И.Е.Кашеверовым (ИБХ РАН).

Рисунок 1. Номенклатура обозначений структурных частей: а) АХСБ и экстрацеллюлярного домена нАХР; 6) а-нейротоксинов из яда змей

Модель взаимодействия конотоксича Рп1А!Ы0, К141 с АХСБ и нАХР а7 типа

Для решения первой задачи работы было сконструировано несколько моделей взаимодействия а-конотоксинов с АХСБ и нАХР. Выбор конотоксинов был обусловлен относительно небольшим размером и простотой молекулы лиганда и возможностью проверки получаемых моделей различными методами, в частности кристаллографическими.

Конотоксин Рп1А является конкурентным ингибитором нескольких типов нейронапьных нАХР, проявляя при этом более высокое сродство к нАХР аЗ(52 типа. Замена остатка А1а10 на Ьеи делает его более селективным к нАХР а7 типа (Ьио е! а!., 1999). Введение положительного заряда в положение 14 приводит к увеличению сродства полученного производного к нАХР а.7 типа. Кроме того, Рп1А[1_10, К14] демонстрирует значительное сродство к ацетилхолинсвязывающему белку из Ар1уз1а саН/огтса (Ас-АХСБ), и потому был выбран для установления кристаллической структуры комплекса АХСБ-конотоксин (СеПе ег а1„ 2005). Указанная структура (код РРВ - 2ВЯ8) стала первой структурой комплекса пептидного лиганда с гомологом экстрацеллюлярного домена нАХР, каковым является АХСБ, и открыла I возможности для широкого применения вычислительных методов при изучении нАХР. Поскольку ранее построенные вычислительные модели, не учитывающие подвижности различных элементов молекулы рецептора, были опровергнуты полученной структурой, было необходимо произвести дополнительный методологический анализ применимости методов вычислительного моделирования для изучения АХСБ и нАХР. С этой целью были построены модели комплексов Рп1А[Ы0, К14] с Ас-АХСБ (для проверки метода), а также с ацетилхолинсвязывающим белком из Ьутпеа 81а§паИв (Ьэ-АХСБ) и нАХР а! типа (для проверки возможности качественного объяснения различий в сродстве одного и того же токсина к разным мишеням).

Полученная модель комплекса Рп1А[Ы0, К14] с Ас-АХСБ практически полностью совпадала с реальной кристаллической структурой (рис. 2а, б). Токсин располагался в участке связывания ацетилхолина под С-петлей протомера так называемой основной стороны (поверхность субъединицы АХСБ или нАХР со стороны С-петли) с образованием контактов с ароматическими остатками. Положение боковых цепей этих остатков Ас-АХСБ было практически таким же, как в комплексе с никотином.

Все наблюдаемые в кристаллической структуре взаимодействия были обнаружены в полученной модели. М-концевой фрагмент токсина был обращен к нижней стороне АХСБ, в то время как С-концевой располагался в верхней части участка связывания. Связывание токсина, как в случае модели, так и в случае кристаллической структуры, определялось гидрофобными

5

ЫШ

64 Sefl65

Рисунок 2. Модель взаимодействия конотоксина PnlAfAIOL, D14K] с АХСБ и нАХР а.7 типа: а) структура 2BR8, показаны два протомера АХСБ и одна молекула конотоксина (красным); 6) основные взаимодействия конотоксина в участке связывания, показан один участок и токсин (отмечен зеленым), взаимодействующие с конотоксином боковые цепи аминокислот рецептора отмечены оранжевым, введенные в последовательность конотоксина замены показаны красным; в) сравнение ориентации молекулы конотоксина в участках связывания Ас-АХСБ (показана кирпичным) и Ls-АХСБ (показана фиолетовым), взаимодействующие остатки комплементарной стороны участка связывания Ас-АХСБ показаны синим, Ls-АХСБ - зеленым; г) сравнение ориентации молекулы конотоксина в участках связывания Ас-АХСБ (показана кирпичным) и нАХР а.7 типа (показана фиолетовым), взаимодействующие остатки комплементарной стороны участка связывания нАХР а7 типа показаны синим.

взаимодействиями, главным образом, с остатками основной стороны участка. Положение молекулы токсина также стабилизировано 6 водородными связями, связью карбонильной группы Тгр145 рецептора с атомом азота Рго7 токсина, а также солевым мостом между Aspl 10 рецептора и Lys 14 токсина. Интересно, что при этом указанная ионная связь наблюдалась только в одном случае из пяти в реальной структуре, в то время как при моделировании она воспроизводилась регулярно, хотя и не во всех повторениях.

Полученный результат позволил экстраполировать модель на Ls-АХСБ, к которому сродство PnlA[L10, К14] было более высоким, чем к Ас-АХСБ. При этом было обнаружено, что участки его связывания в Ls-АХСБ и Ас-АХСБ стерически отличаются, что обуславливает

слегка измененное положение токсина в Ls-АХСБ (рис. 2в). Так, с комплементарной стороны участка связывания в Ls-АХСБ расположен Тгр53 вместо Тут53 в Ас-АХСБ. Измененное положение конотоксина приводит к тому, что становится постоянной ионная связь Lys 14 токсина и Glu 110 комлементарной стороны участка связывания Ls-АХСБ. Возможно, это и является причиной повышенного сродства PnIA[L10, К14] к Ls-АХСБ.

Моделирование структуры комплекса PnIA[L10, К14] с а7-нАХР было произведено с использованием данных по известным парам взаимодействия остатков конотоксина PnIB и нАХР (Duterte and Lewis, 2004). В целом положение токсина в участке связывания нАХР практически не отличалось от положения в участке связывания АХСБ. Фрагмент токсина, включающий остатки 5-10, взаимодействовал с остатками Тгр148, Туг187 и Туг194 рецептора. Однако, боковая цепь Lys 14 токсина при этом не формировала связей с комплементарной стороной рецептора, а наоборот выталкивалась в сторону растворителя положительно заряженными боковыми цепями Hisl 14 и Lys75 рецептора. В то же время, эти же остатки обуславливали возможность образования дополнительной межмолекулярной связи с случае Aspl4 (рис. 2г).

Полученные результаты позволили говорить о методологической применимости вычислительного моделирования при качественном анализе механизмов взаимодействия конотоксинов и АХСБ, однако не позволили однозначно оценить их использование при описании взаимодействия пептидного лиганда и нАХР в случае ограниченных данных о структуре рецептора и самого токсина. Для определения этого были построены следующие две модели.

Модель взаимодействия фотоактивируемого производного конотоксина GI с нАХР мышечного типа

Фотоактивируемые метки широко используются при изучении взаимодействия белков и пептидов. В частности, имеется значительное количество данных, полученных в результате их применения при изучении механизмов взаимодействия пептидных токсинов и нАХР. Так, были получены производные контоксина GI, содержащие бензоилфенилаланин (Вра) в положениях 4 или 12. При этом производное GI-Bpa4 не связывалось с нАХР мышечного типа, в то время как метка в положении 12 не препятствовала такому взаимодействию. Использование GI-Bpal2 позволило провести картирование связывающего участка рецептора (Kasheverov et al., 2006а).

При моделировании взаимодействия меченных конотоксинов с нАХР был использован метод докинга подвижного лиганда к неподвижному рецептору. Это стало возможно в первую очередь благодаря наличию установленной пространственной структуры модифицированного токсина (Kasheverov et al., 2006а). При симуляции взаимодействия конотоксина GI-Bpal2 с а-у участком нАХР Torpedo californica были получены две возможные пространственные структуры комплекса (рис. 3). При этом в одном случае положение молекулы токсина было сходным с наблюдаемым в структуре 2BR8 (рис. За), а во втором - молекула токсина была повернута на 80° относительно наблюдаемой в 2BR8. Вычисленные энергии взаимодействия в обоих случаях были весьма схожими, а сами структуры показали себя одинаково стабильными в условиях молекулярной динамики.

Тем не менее, ни одна из полученных конформаций не могла быть отброшена как ложно-положительное решение, поскольку обе удовлетворяли полученным экспериментальным данным по локализации участков мечения в последовательности рецептора. Так, в случае первой ориентации возможно мечение сегментов D и Е (обозначения по Kasheverov et al., 2006а) у-субъединицы, в то время как вторая создает условия для мечения участка F (рис. 3), а также обе благоприятны для мечения участка С а-субъединицы. Таким образом, результаты моделирования полностью совпадали с полученными экспериментальными данными.

В то же время моделирование взаимодействия GI-Bpa4 было неудачным, поскольку массивная метка в положении 4 создает значительные пространственные затруднения в образовании комплекса токсин-рецептор. Это также совпадает с отсутствием связывания этого производного с рецептором.

Рисунок 3. Ориентация конотоксина G1 с фотоактивируемой меткой ВРА в положении 12 в участке связывания нАХР Torpedo californica: а) каноническое; 6) альтернативное. Показан один а-у участок связывания, а-субъединица показана белым, у-субьединица показана пшеничным. Конотоксин показан зеленым, фрагменты С, D, Е и F аминокислотной последовательности нАХР показаны синим, красным, кирпичным и сиреневым, соответственно. Показано положение фотоактивируемой метки. Оранжевым показаны два ароматических остатка участка связывания ацетилхолина.

Таким образом, была продемонстрирована возможность применения вычислительного моделирования для комплекса, образованного конотоксином с известной структурой с нАХР, структура которого в анализируемой конформации неизвестна. Было также показано отсутствие значительных различий в архитектуре комплексов конотоксинов различных типов с нАХР.

Модель взаимодействия конотоксинов SIA. SIAÍS12I и SIAIK12I с нАХР мышечного типа Torpedo californica

Для демонстрации возможности использования вычислительного моделирования как полноценного метода анализа взаимодействия пептидного лиганда и нАХР была построена модель конотоксина с неизвестной структурой и нАХР мышечного типа. Данные этого моделирования были использованы для объяснения увеличения сродства конотоксина SIA к нАХР Torpedo californica при замене остатка аспарагиновой кислоты в положении 12 токсина на лизин (Kasheverov et al., 2006b).

По данным моделирования структура конотоксина остается практически неизменной при введении замены D12S или D12K (среднеквадратичное отклонение 0.19-0.22Á). Тем не менее, наблюдается увеличение подвижности N-концевой части молекулы токсина при замене аспартата на серии и, особенно, на лизин. Так, в случае нативного S1A положение С- и N-концевых участков молекулы друг относительно друга стабилизировано образованием внутримолекулярной ионной пары боковой цепи Aspl2 и N-концевой аминогруппы. При замене аспартата на серин эта связь замещается водородной, а боковая цепь лизина, при его введении в это же положение, ориентирована собственно на С-концевой корбоксил. Однако эти отличия в структуре не являются критическими для взаимодействия с рецептором.

Структуры моделей комплексов SIA и его производных с участком связывания ацетилхолина нАХР Torpedo californica весьма похожи на структуру 2BR8 и описанную выше структуру комплекса GI-Bpal2 с этим же рецептором (рис.4). При этом положение собственно молекулы токсина SIA в участке связывания мало зависело от того, какой остаток был в положении 12 его последовательности. Основную массу межмолекулярных взаимодействий, как и в случае 2BR8, составляли гидрофобные взаимодействия, а также водородные связи остатков Tyrl, His4, Pro5, А1а6, Lys9 и Phell конотоксина с уТгр170, аТуг93, yArg79, aThrl50, aAspl52, уГугШ, yTyrl 17 рецептора. Боковая цепь и отрицательный заряд Aspl2 не играет сколько-нибудь заметной роли в связывании конотоксина рецептором. Введение серина не оказывает значительного влияния на положение токсина или формируемые межмолекулярные

Рисунок 4. Модель взаимодействия конотоксинов SIA и S1A[K12] с участком связывания ацетилхолина нАХР мышечного типа Torpedo californica. Показан один а-у участок связывания. Конотоксин SIA показан зеленым, конотоксин SIA[K12] показан синим. Красным отмечены остатки Lysl2 конотоксина и yGlu57 рецептора. Сиреневым помечены остатки комплементарной стороны участка связывания, известные как взаимодействующие с Lys9 конотоксина. Оранжевым отмечены ароматические остатки участка связывания агонистов.

связи. В то же время, Lysl2 конотоксина непосредственно взаимодействует с Glu57 комплементарной стороны участка связывания рецептора, в то время как боковые цепи еще нескольких прилегающих остатков (Gln59, Tyrl 17 и некоторые другие) создают для этого благоприятные условия (рис.4).

Полученные результаты не только хорошо коррелировали с экспериментальными данными, но и явились первым объяснением изменения сродства конотоксина к определенному типу рецептора, полученным исключительно вычислительными методами. Этот успех позволил нам в дальнейшем уверенно использовать моделирование и математические симуляции взаимодействия полипептидных лигандов с нАХР как самостоятельные аналитические методы. Кроме того, данные по моделированию связывания SIA, а также Gl и PnIA[L10, К14] показали, что отдельные небольшие структурные элементы последовательности конотоксина (и соответствующие им элементы структуры рецептора, как расположенные в участке связывания низкомолекулярных лигандов, так и вне этого участка) имеют решающее значение для определение сродства конотоксина к конкретному типу рецептора.

Модель взаимодействия короткого а-нейротоксина NT11 с нАХР мышечного типа Torpedo californica

На следующем этапе работы были построены модели взаимодействия трехпетельных нейротоксинов из ядов змей с нАХР. В качестве лигандов были использованы короткий а-нейротоксин II из яда Naja oxiana (NTII), слабые (необычные) токсины и химерный а-нейротоксин.

Рисунок 5. Модель взаимодействия короткого а-нейротоксина NTII с нАХР мышечного типа Torpedo californica: а) общий вид модели, показан один а-у участок связывания, а-субъединица отмечена белым, у-субъединица - пшеничным, токсин - синим; б) изменение конформации токсина при формировании комплекса с нАХР, зеленым показана структура молекулы в растворе, желтым — в комплексе с нАХР, красным и сиреневым отмечены остатки лизинов и положительно заряженные остатки на конце петли II; в) динамика расстояния между взаимодействующими группами боковых цепей отдельных аминокислотных остатков NTII и участка связывания

Поскольку за последние 25 лет изучения змеиных токсинов огромное количество экспериментальных данных (Tsetlin, 1999; Tsetlin and Hucho, 2004) было получено для NTH, именно этот токсин был выбран для моделирования взаимодействия с нАХР. В то время как положение конотоксинов и длинных а-нейротоксинов в участке связывания нАХР было

Рисунок 6. Детерминанты взаимодействия короткого а-нейротоксина NTII с нАХР мышечного типа Torpedo californica: а) поверхность взаимодействия NTII с а-у участком связывания, вид с вогнутой (слева) и выпуклой сторон молекулы токсина, остатки, идентифицированные как важные для связывания при помощи докинга отмечены красным, МД- синим, неучаствующие во взаимодействии отмечены показаны зеленым; 6) Сравнение ориентации боковых цепей участка связывания нАХР в случае связывания никотина (красный, ориентация по структуре 1UW6) или NT11 (показан конец петли II, оранжевый), вид со стороны большой полости (слева) и В-петли основной стороны участка связывания (справа). Ориентация боковых цепей остатков участка связывания в случае комплекса с никотином показаны синим, в случае комплекса с NTII - голубым.

установлено, оставался невыясненным детальный механизм взаимодействия коротких а-нейротоксинов с нАХР. Следует отметить, что наличие структурного описания взаимодействия короткого а-нейротоксина с нАХР дает возможность создать практически полный набор вариантов комплексов основных полипептидных лигандов с нАХР. Значительный объем экспериментальных данных, которые можно было использовать в качестве проверочных критериев для построенной модели, позволял произвести анализ взаимодействия NTII с нАХР исключительно вычислительными методами. Модель комплекса была построена на основании данных по связыванию азидобензоильных производных этого

токсина (Kreienkamp et al., 1992; Tsetlin et al., 1982) и проверялась при помощи всех остальных экспериментальных данных.

Согласно полученной модели, NTII при связывании с нАХР мышечного типа Torpedo californica располагается на расстоянии 30Á от мембраны. При этом молекула токсина развернута на -80° относительно оси симметрии рецептора и лежит под углом по отношению к поверхности цилиндра экстрацеллюлярного домена, практически перпендикулярно к поверхности мембраны (рис. 5а). Примерно одна треть объема петли II токсина погружена в участок связывания ацетилхолина, в то время как петли I и III взаимодействуют с рецептором только окончаниями (рис. 5а). Петли II и III взаимодействуют с С-петлей а-субъединицы рецептора, а петля I, N-конецевой участок и «выпуклая» сторона петли III экспонированы в растворитель. Петля III токсина также взаимодействует с петлей F прилегающей у или 5 субъединицы рецептора.

Такое положение токсина подтверждается разнообразными экспериментальными данными по связыванию коротких а-нейротоксинов змей. В частности, модель коррелирует с данными по экспонированности и пространственной ориентации отдельных частей молекулы токсина, важности отдельных остатков молекул токсина для образования комплекса , а также по взаимодействию различных производных NTII с рецептором.

При построении модели было обнаружено, что концы петель I и II изгибаются в сторону выпуклой поверхности молекулы токсина со смещением С° атомов на 3.0Ä в случае Ser8, 3.5Ä для Ser9, 5.9Ä - His31 и 4.1Ä - Arg32 (рис. 56). Конформации молекулы токсина при образовании комплекса с участком связывания изменяется весьма быстро (рис. 5в). Примечательно, что имеются экпериментапьные свидетельства подвижности петли II при его связывании с нАХР (Krabben et al., 2004).

Значительный интерес представляет тот факт, что согласно модели при формировании комплекса короткого а-нейротоксина с нАХР мышечного типа детали механизма взаимодействия лиганда отличаются от таковых для длинного а-нейротоксина или конотоксина (рис. 6). Предположительно, вхождение молекулы NT1I в участок связывания обеспечивается положительным зарядом на конце петли II, в момент, когда свободно движущаяся петля С рецептора находится в положении, наиболее удаленном от петель В и F участка связывания. Однако данное утверждение требует дополнительной проверки, в том числе при помощи длительных динамических симуляций системы NTII - нАХР.

Тем не менее, сравнение всех известных экспериментальных данных с моделью подтверждает ее корректность и реалистичность. Таким образом, можно предположить, что все три основных класса пептидных антагонистов нАХР имеют несколько различающиеся способы связывания. Однако, механизм взаимодействия коротких и длинных а-нейротоксинов с рецептором (Hansen et al., 2005) имеет значительное сходство. Так, основную роль в формировании комплексов а-нейротоксинов играют положительные заряды на конце петли II, эмулирующие заряд агониста. При этом связывание токсина приводит к стерическому подавлению формирования конформации участка связывания, характерной для комплекса нАХР-агонист.

Часть межмолекулярных взаимодействий при этом формируется областями рецептора вне участка связывания низкомолекулярных лигандов. Значительная же часть молекулы токсина при этом непосредственно не участвует в межмолекулярном взаимодействии и служит, по-видимому, исключительно целям правильной ориентации взаимодействующих остатков. В то же время, связывание конотоксина PnIA, а также конотоксинов, селективных по отношению к нАХР мышечного типа, приводит к ориентации боковых цепей ароматических остатков участка связывания, сходной с таковой в комплексе никотин-АХСБ (Celie et al., 2004,2005).

Модель взаимодействия слабых (необычных) нейротоксинов с чАХРмышечного и а.7

типов

Слабые (необычные) нейротоксины представляют собой группу трехпетельных токсинов змей, объединяемую наличием дополнительной пятой дисульфидной связи в петле I. Слабые

12

_fPilOJO '

| >-РШН

Mycupmtoftw* ТО«СИИЫ

Слабы* нейротоксины

Длинны* и-немротоксииы

Коротки* ir-немротоксины

Рисунок 7. Филогенетическое древо трехпетельных токсинов из яда змей. Показаны функциональные группы токсинов. Подчеркиванием выделено положение кандоксина и \¥ТХ.

нейротоксины являются обычно конкурентными ингибиторами нАХР мышечного и а7 типов. Тем не менее, их сродство может значительно варьировать в пределах группы, а для некоторых из токсинов показано отсутствие подобной активности. Кроме того, в аминокислотной последовательности слабых нейротоксинов отсутствуют некоторые аминокислотные остатки остатки, идентифицированные в а-нейротоксинах как необходимые для взаимодействия с нАХР.

В связи с этим возникает вопрос о способе взаимодействия слабых нейротоксинов с нАХР, поскольку, по-видимому, он может отличаться от механизмов связывания коротких и длинных а-нейротоксинов. При изучении данной группы токсинов приходится также учитывать тот факт, что она является, по сути, искусственной (Fry et al., 2003; Mordvintsev et al., 2007). В частности, слабые нейротоксины из ядов кобр демонстрируют большую филогенетическую удаленность от слабых нейротоксинов из ядов крайтов, чем, скажем, от мускариновых токсинов из ядов мамб (рис.7). Кроме того, некоторые слабые нейротоксины способны к взаимодействию с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами (мАХР). Так, мы показали, что слабый токсин WTX из яда Naja kaouthia является не только антагонистом нАХР мышечного и а.7 типов, но и взаимодействует с мАХР различных типов. При этом WTX блокирует ортостерический участок связывания нАХР, в то время как взаимодействие с мАХР аллостерическое.

Следовательно, для разных слабых нейротоксинов механизм взаимодействия с нАХР может быть различным. Молекулярное моделирование комплексов различных слабых токсинов с нАХР представляется разумным подходом к изучению механизмов действия этих токсинов.

Для изучения были выбраны четыре слабых нейротоксина: букандин, кандоксин, у-бунгаротоксин и WTX, - для трех из которых (кандоксина, букандина и у-бунгаротоксина) была

установлена пространственная структура. Структура WTX была смоделирована с учетом данных ЯМР (Eletsky et al., 2001), причем информация о вторичной структуре молекулы была решающей для построения корректной пространственной модели токсина (рис. 8). При этом было обнаружено, что наиболее подвижным элементом структуры WTX является петля I, содержащая дополнительный пятый дисульфид.

При проведении моделирования комплексов букандина и у-бунгаротоксина с нАХР не удалось получить решений, которые бы отвечали критерию конкурентного взаимодействия с каноническим участком связывания агонистов. Кандоксин и WTX, напротив, оказались способны к формированию комплексов с участком связывания ацетилхолина нАХР как мышечного, так и а7 типов. Несмотря на то, что эти токсины принадлежат к различным филогенетическим группам и имеют заметно различающееся сродство к нАХР, ориентация молекул обоих токсинов в комплексе с нАХР является схожей. Конец второй петли токсина располагается непосредственно в участке связывания ацетилхолина, входя в него со стороны т.н. «большой полости» справа и сверху от петли С, если смотреть на участок с внешней стороны рецептора. Петля III при этом обращена к мембране. Подобное положение похоже на ориентацию NTII в комплексе с нАХР мышечного типа, однако молекула слабых нейротоксинов располагается под углом 60-80° к плоскости мембраны и ~25° к радиальной плоскости рецептора. Как и в случае с другими пептидными лигандами, для формирования комплекса требуется, чтобы петля С рецептора находилась в положении, наиболее удаленном от петель В и F участка связывания.

Несмотря на внешнее сходство комплексов, они существенно различаются в деталях. Эти различия обусловлены в первую очередь строением конца петли II токсинов. Кандоксин, будучи более сходным с классическими змеиными а-нейротоксинами, имеет положительно заряженный остаток, находящийся на самом конце петли II - Arg35. Этот остаток, наподобие Arg3I и His32 в NTII, взаимодействует с ароматическими боковыми цепями остатков Тгр149 и Туг151 участка связывания. При этом, согласно модели, происходит переориентация этих боковых цепей так, что получающаяся конформация участка связывания отличается от той, которая наблюдается в случае связывания положительно заряженного агониста. Этот структурный механизм напоминает действие NTII и должен обуславливать высокое сродство кандоксина к нАХР. Действительно, кандоксин обладает сравнительно высокой токсичностью (LD5o 0.83 мг/кг) и имеет высокое сродство к нАХР мышечного (2,2 нМ и 98 нМ в зависимости от участка связывания) и а7 типов (50 нМ).

Тем не менее, динамические параметры данного взаимодействия остаются необъясненными. В частности, непонятно различие в обратимости связывания кандоксина с рецептором мышечного и а7 типов. Также неясно, существует ли определенная роль в связывании токсина у дополнительного дисульфида в петле I. По крайней мере, размыкание этого дисульфида или замена Cys6 и Cysll на остатки серина по результатам симуляций не приводила к изменению ориентации молекулы токсина в комплексе с рецептором, а также не оказывала значительного влияния на вычисленную энергию связывания (около 1550 кДж/моль в случае а7-нАХР и 1350 кДж/моль в случае мышечного типа по сравнению с 1530 кДж/моль и 1370 кДж/моль при связывании нативного токсина). Поведение комплекса в последующих молекулярно-динамических симуляциях также не различалось, вне зависимости от того, какие остатки (цистина, цистеина или серина) находились в положениях 6 и 11 последовательности токсина.

Рисунок 8. Модель пространственной структуры слабого а-нейротоксина ]¥ТХ: а) показана вторичная структура, отмечены петли и дополнительный цистеиновый мостик в петле I (красный). Крайнее положение петли I, возможное при ее колебании, показано сиреневым; б и в) молекулярные поверхности молекулы токсина, вид с "вогнутой" стороны (б) и со стороны петли I (в), показаны боковые цепи аминокислот.

При моделировании комплекса ШТХ с нАХР было обнаружено, что, несмотря на отсутствие точечного положительного заряда на конце петли II, участок 29-39 этой петли обладает значительным кумулятивным положительным зарядом, который, по-видимому, обуславливает первичное связывание молекулы токсина с нАХР. По сравнению со значениями энергий связывания, полученных при докинге кандоксина, расчетная энергия взаимодействия \¥ТХ и нАХР невелика (порядка 500 кДж/моль). Однако молекулярно-динамическая симуляция поведения комплекса демонстрирует медленную реорганизацию комплекса \VTX-hAXP (-650 псек), затрагивающую положение конца петли II в участке связывания. При этом обнаруживаемые докингом потенциальные ван-дер-Ваальсовы взаимодействия замещаются водородными и ионными. Так, при связывании ШТХ с нАХР а7 типа первоначально слабо вовлеченные в межмолекулярпое взаимодействие остатки петли II формируют устойчивые ионные связи с остатками рецептора (в частности, А^31 с Азр163 комплементарной стороны рецептора), а также водородные (например, А^32 с С1и192 основной стороны). Таким образом, \УТХ, возможно, связывается с нАХР в две последовательные стадии: сначала формируется слабый ассоциат, который, после перестройки, переходит в более устойчивый конечный

15

комплекс. Скорее всего, именно этот механизм является причиной низкого сродства WTX к нАХР. Как и в случае кандоксина, дополнительный дисульфид в петле I не оказывает значительного влияния на конечную конформацию комплекса токсин-рецептор.

Полученная модель показывает, что, несмотря на отсутствие точечного положительного заряда на конце петли II WTX, этот токсин также стерически занимает участок связывания ацетилхолина. Для подтверждения этого выводы мы провели исследование влияния различных низкомолекулярных лигандов нАХР на связывание радиоактивного WTX с нАХР а7 типа. Проведенный радиолигандный анализ показал наличие конкуренции за участки связывания, и, следовательно, WTX действительно должен занимать область связывания ацетилхолина каким-либо фрагментом своей структуры.

Таким образом, моделирование взаимодействия слабых и коротких нейротоксинов с нАХР и сравнение полученных данных с данными по кристаллической структуре комплексов длинных а-нейротоксинов с нАХР и АХСБ позволяет заключить, что в случае змеиных нейротоксинов связывание с каноническим участком нАХР обусловлено в первую очередь положительным зарядом на петле II токсина. Такой механизм в корне отличается от способа образования комплексов конотоксинов с нАХР. Проникновение нейротоксина в участок связывания происходит в момент отхода петли С от петли В. При этом движение петли С не зависит от присутствия лиганда и не вызывается им. Ориентация собственно токсина зависит от его структуры и может заметно отличаться для разных классов нейротоксинов. Значительная часть молекулы лиганда не вовлечена в непосредственное взаимодействие с рецептором и служит, скорее всего, исключительно элементом, определяющим правильную структурную организацию петли II, или же сохранилась от исходных белков-предшественников (Fry et al., 2008). Эти выводы подтверждаются как вышеизложенными данными, так и данными по взаимодействию химерного а-нейротоксина NTI/NTII.

Модель взаимодействия химерного а-нейротоксина с нАХР нейроналъных типов Химерный а-нейротоксин КТП/1, содержащий элементы последовательности как короткого а-нейротоксина N111, так и длинного МТ1, был получен методом гетерологической экспрессии для изучения роли петли II токсина в определении селективности к нАХР различных нейрональных типов (Ьуиктапоуа а!., 2007). Было получено два варианта химерного токсина. В первом часть последовательности петли II короткого а-нейротоксина >Ш1 была заменена на участок длинного а-нейротоксина N11 (токсин 1Л" рис. 9), что привело к появлению способности эффективно взаимодействовать с нАХР а7 типа. Во втором варианте для проверки гипотезы (Воигпе Й а1., 2005) о том, что Ьуэ29 является ключевым остатком, определяющим селективность к-бунгаротоксинов по отношению к нАХР аЗ(52 типа, была в была сделана дополнительная замена А29К (токсин АК рис. 9) Эта замена привела к значительному уменьшению сродства химерного токсина к нАХР а7 типа, но не к появлению у

NTII LECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNC'

NTI ITCYKTPII---TSETCAPGQNLCYTK'

aCtx IRCFITPDI—TSKDCPNG-HVCYTK' aBtX IVCHTTATSP-ISAVTCPPGENLC'

JcBtx RTCLISPSS---TPQTCPNGQDICFLKAj

LT LECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNCYKKWWICD AK LECHNQQSSQPPTTKTCSG-ETNC'

_ <0 I 150 601 I I 70

"-—ifeGTIIERGCG—CPKVKP-GVNLNCCRTDRCNN.......61

ICGS ^GKVIELGCMTCPTVESY-QDIKCCSTDNCNPHPKQKRP 72

'CSHGKRVDLGCAATCPTVKTG-VDIQCCSTDNCNPFPTRKRP 71

'CSS RGKWELGCAATCPS-KKPYEEVTCCSTDKCNPHPKQRPG 74

'CSIRGPVIEQGCVATCPQFRSNYRSLLCCTTDNCNH.......66

ICGSpGTIIERGCG—CPKVKP-GVNLNCCRTDRCNN-------65

¡GTIIERGCG—CPKVKP-GVNLNCCRTDRCNN.......65

Рисунок 9. Выравнивание аминокислотных последовательностей трехпетельных токсинов короткого а-нейротоксина NTII, длинных а-нейротоксинов NTI, а-кобратоксина (aCtx), а-бунгаротоксина (aBtx), к-бунгаротоксина (кВ!х) и химерного токсина NTII/I без замены А29К (LT) и с указанной заменой (АК). Рамкой обведен вводимый в последовательность NTII фрагмент, характерный для длинных а-нейротоксинов.

Рисунок 10. Модель взаимодействия химерного а-нейротоксина NTII/I с нАХР а7 типа: а) общий вид модели, показан один участок связывания, токсин показан синим, вставка последовательности NT1 отмечена красным, подробнее показано взаимодействие остатков вставки с С-петлей основной стороны участка связывания: б) пространственное выравнивание модели NTII/I с коротким а-нейротоксином NTII; в) пространственное выравнивание модели NTII/I с длинным а-нейротоксином NTI

него способности взаимодействовать с нАХР а3(32 типа.

Модель пространственной организации NTII/I демонстрирует, что этот пептид сохраняет консервативную организацию молекулы, характерную для трехпетельных токсинов (рис. 106, в.). Введение замены А29К не привело к изменению общей укладки полипептидной цепи или увеличению подвижности какого-либо элемента структуры химерного токсина. В результате контрольных докинг-симуляций NTI и NTII к моделям участка связывания нАХР а7 и аЗ |32 типов было получено решение только для системы NTI-нАХР а7 типа (схожее с экспериментальной структурой 1YI5). Докинг химерного токсина NTI1/I давал положительные решения для взаимодействия с нАХР как а7, так и аЗ(52 типов, однако последующая молекулярно-динамическая симуляция привела к недопустимой дезорганизации комплекса с нАХР аЗр2 типа. Связывание токсина с рецептором а7 типа осуществлялось посредством межмолекулярных взаимодействий между концом петли II токсина и петлей С рецептора. Образующиеся контакты были подобны тем, что наблюдаются для комплекса а-кобратоксина и Ас-АХСБ. Тем не менее, положение самой молекулы химерного токсина в комплексе с рецептором было больше похоже на ориентацию короткого а-нейротоксина (рис. 10а). По данным моделирования, введение замены А29К не оказывает влияния на положение NTII/I[K29] в комплексе с рецептором. Как и в случае с исходным NTI/II, решения докинга были возможны для систем с обоими типами нАХР (расчетные энергии взаимодействия 1400 кДж/моль и 340 кДж/моль для нАХР а7 и а3|32 типов, соответственно), однако для комплекса с нАХР аЗр2 типа не удалось получить разумного результата молекулярной динамики системы.

Полученные данные опровергают гипотезу о решающей роли Lys29 в определении селективности а-нейротоксинов с дисульфидной связью в петле II к нАХР а3(32 типа. Согласно

.7

построенным моделям Lys29 NTII/I[K29] может образовывать контакты с Glul90 аЗ-субъединицы в комплексе с нАХР аЗр2 типа. Тем не менее, поскольку взаимодействия токсина с рецептором этого типа в реальном эксперименте не наблюдается, остается предположить, что селективность трехпетельных нейротоксинов змей к нАХР аЗр2 типа является следствием не единичных замен аминокислотных остатков конца петли II, а наличием набора структурных элементов, включая, возможно, и димерную организацию к-бунгаротоксинов. С другой стороны, Lys29 NTII/I не мог образовать каких-либо специфических контактов с а7-субъединицей, поскольку его положительно заряженная боковая цепь выталкивалась в сторону растворителя близлежащим Lysl92 (нумерация по нАХР а7 человека), - рис. 10а. Напротив, А1а29 был способен к образованию слабых контактов с основной цепью аминокислотных остатков С-петли рецептора. Возможно, это объясняет пониженное сродство NTII/I[K29] к нАХР а7 типа.

Кроме того, полученные результаты демонстрируют некоторую ограниченность вычислительных методов применительно к моделированию взаимодействия а-нейротоксинов с нАХР. Указанные методы могут успешно применяться для качественного анализа экспериментальных данных и помогать в планировании исследования, однако не могут использоваться обособленно от других экспериментальных методов. В частности, моделирование не может дать однозначный количественный прогноз сродства конкретного токсина к рецептору, что обусловлено, в первую очередь, сложностью учета динамических параметров взаимодействия пептидного лиганда с рецептором, играющих, по-видимому, значительную роль в случае нейротксинов из ядов змей. Это ограничение налагается в основном невозможностью произвести подобный расчет за приемлемое время.

В дополнение к указанным препятствиям значительный размер молекулы змеиных а-нейротоксинов вызывает существенные затруднения при получении структурных библиотек производных токсинов с желаемыми аминокислотными заменами и, соответственно, для проверки предположений о пространственных детерминантах связывания с рецептором. Кроме того, сравнительно большой размер молекулы токсина приводит к необходимости учета взаимодействий вне собственно участка связывания ацетилхолина. Так, к примеру, недавно была продемонстрирована важная роль углеводных остатков нАХР в определении сродства длинных а-нейротоксинов к рецептору (Delissantti et al., 2007).

Таким образом, полученные данные по моделированию комплексов а-конотоксинов и а-нейротоксинов с нАХР приводят к выводу о целесообразности использования более компактных пептидных лигандов для подробного изучения архитектуры участка связывания нАХР и получения новых лигандов с заданными свойствами. Такими лигандами могут быть аналоги а-конотоксинов, сконструированные на основе построенных моделей.

Рациональный дизайн производных конотоксина PnIA с повышенной селективностью к АХСБ Aplysia californica

Рациональный дизайн лигандов представляет собой конструирование веществ с заданными свойствами, в частности высоким сродством и селективностью к определенному рецептору. Конотоксин PnIA представляет собой удачное соединение для подобных манипуляций. Во-первых, этот токсин и его производные могут быть получены прямым химическим синтезом. Во-вторых, имеются данные о его расположении в участке связывания АХСБ и нАХР (рис. 2а). В-третьих, будучи относительно небольшой молекулой, указанный токсин взаимодействует с рецептором ~60% своей поверхности (827±32 А2 в случае PnIA[L10, К14]), что дает значительный простор для внесения модификаций в структуру токсина. Мы использовали в качестве подхода к рациональному дизайну точечные замены остатков отдельных аминокислот последовательности PnIA в соответствии с представлениями, следующими из моделирования комплексов производных PnIA с АХСБ, а также результатов аланинового скрининга конотоксина GID (Millard et al., 2009) и кристаллической структуры комплекса конотоксина Iml с Ас-АХСБ (Hansen et al., 2005; Ulens et al., 2006).

В соответствии с этими данными, отдельные элементы структуры токсина определяли

Таблица 1. Производные конотоксина PnIA и их сродство к АХСБ Aplysía californica и Lymnea stagnalis

Конотоксин Сродство к АХСБ, нМ

Модификация PnIA Аминокислотная последовательность Aplysia californica Lymnea stagnalis

Нативный токсин GCCSLPPCAANNPDYC Нет данных 915±145*

L10 GCCSLPPCALNNPDYC 55±12 200±40

LIO, К14 GCCSL PPCAL NNPKYC GCCSDPPCALNNPDYC 47±9 8.2±1.2

D5, LIO 5200±1900 35000±3000

R7, LIO qccslprcalnnpdyc 1250±300 160000±40000

D5, R7, LIO GCCSDPRCALNNPDYC 51=Ь11 38000*8000

D5, R7, VIO GCCSDP RCAVNNPDYC 45±11 6400± 1300

D5, R7, LIO, R14 GCCSDPRCALNNPRYC 46±8 1200±250

»Duterte et al., 2007

его сродство и селективность к нАХР с соответствующим строением участка связывания и прилегающих областей. При этом преследовалась цель увеличения селективности PnIA к Ас-АХСБ. Были произведены замены аминокислотных остатков в положения 5, 7, 10 и 14 последовательности конотоксина PnIA[L10, К14] - рис. 11, табл. 1. Ожидалось, что введение одиночных зарядов в положения 5 и 7 приведут к резкому снижению сродства конотоксина к обоим АХСБ вследствие динамических затруднений при вхождении молекулы токсина в участок связывания, в то время как введение солевой пары D5-R7 по аналогии с конотоксином Iml сделает полученный лиганд более селективным по отношению к Ас-АХСБ. Введение остатка Arg7 должно было, в случае Ас-АХСБ, приводить к образованию дополнительных взаимодействий с боковыми цепями остатков Туг91, Serl44, Туг147, lie 194 и, возможно, Aspl95 основной стороны участка связывания (рис.116). Аспартат в положении 5, задавая фиксированное положение заряда аргинина в пространстве, в то же время формировал контакты с Туг186 и Glnl84 (рис. 11а). Важным при этом является то, что указанные остатки Ас-АХСБ не вовлечены в связывание низкомолекулярных лигандов и, таким образом, являются дополнительными детерминантами селективности пептидных лигандов. В случае Ls-АХСБ эти замены создавали бы стерические затруднения нахождению токсина в участке связывания. Замены в положениях 10 и 14 должны были привести к увеличению сродства токсина к обоим АХСБ. Во-первых, за счет увеличения площади взаимодействия боковой цепи остатка 10 с АХСБ (рис. 11в), во-вторых, за счет увеличения вероятности образования связи положительно заряженной цепи остатка 14 конотоксина с отрицательно заряженными аминокислотными остатками комплементарной стороны участка связывания (11г). Как следует из результатов радиолигандного анализа, сделанные предположения в целом подтвердились. Были получены производные конотоксина PnIA, имеющие значительно повышенную селективность к Ас-АХСБ: аналоги PnIA[D5, R7, VIO], PnIA[D5, R7, LIO, R14] и особенно PnIA[D5, R7, L10] (табл.1). Однако влияние замен в положениях 10 и 14 конотоксина на сродство к Ас-АХСБ оказалось незначительно, хотя эффект этих модификаций был очевидным в случае Ls-АХСБ. Так, аналоги PnIA[L10] и PnIA[L10, К14] не различались по сродству к Ас-АХСБ, так же, как и PnIA[D5, R7, LIO], PnIA[D5, R7, VIO], PnIA[D5, R7, LIO, R14], В то же время, введение положительного заряда в положение 14 конотоксина увеличивало сродство конотоксина к Ls-АХСБ в несколько десятков раз, а замена LlOHaVlO-вб раз, что соответствует предсказаниям на основании построенных моделей. Таким образом, полученные результаты подтверждают предсказательную способность построенных моделей взаимодействия пептидных лигандов и АХСБ и их применимость в разработке веществ с заданными параметрами

Рисунок 11. Участок связывания PnIA[D5, R7, LIO, R14] на АХСБ Aplysia californica: а) остатки рецептора, взаимодействующие с аспартатом в положении 5 (показаны голубым), вид от f)7 основной стороны; б) остатки рецептора, взаимодействующие с аргинином в положении 7 (показаны розовым), вид от петли F комплементарной стороны; в) остатки рецептора, взаимодействующие с лет/ином в положении 10 (показаны светло-оранжевым), вид от [¡3 комплементарной стороны; г) остатки рецептора, взаимодействующие с аргинином в положении 14 (обе области показаны фиолетовым), вид от петли С основной стороны параллельно радиальной плоскости АХСБ; д) молекулярная поверхность участка связывания конотоксина на Ас-АХСБ; показано расположение областей взаимодействия (D5 - голубым, R7 - красным, LIO - светло-оранжевым, R14 -фиолетовым, остаток ОЫ184 - коричневым), вид от [¡1 комплементарной стороны. Показан один участок связывания, боковые цепи основных остатков участка связывания ацетилхолина показаны салатовым.

выводы

1. Использование комбинации экспериментальных и вычислительных методов позволило провести детальную сравнительную характеристику взаимодействия нескольких групп пептидных и белковых токсинов с никотиновыми холинорецепторами.

2. Построены структурные модели комплексов различных пептидно-белковых лигандов с мышечными и нейронными (а7 и а3(32) никотиновыми холинорецепторами Показано, что в зависимости от строения непосредственно взаимодействующего с рецептором участка лиганда детали механизма взаимодействия конкурентных пептидно-белковых нейротоксинов с каноническим участком связывания ацетилхолина в нАХР могут различаться.

3. С использованием поведенческнх тестов и радиолигандного анализа показано, что слабый токсин \УТХ взаимодействует как с никотиновыми, так и с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами, при этом в нАХР \УТХ связывается с ортостерическим участком холинорецептра, а в мускариновом рецепторе с аплостерическим. Построены молекулярные модели взаимодействия \УТХ и других слабых токсинов с нАХР, которые позволили объяснить разницу в сродстве различных слабых токсинов к рецептору.

4. Установлено, что детерминантами связывания пептидных лигандов с нАХР являются отдельные участки молекулы пептида, а специфичность к тому или иному подтипу рецептора обуславливается взаимодействием с основным участком связывания низкомолекулярных агонистов, отдельными группировками рецептора вне его, а также конформационной подвижностью лиганда в участке связывания.

5. С применением построенных моделей осуществлен рациональный дизайн производных а-конотоксина Рп1А, обладающих повышенной селективностью к АХСБ Лр/уэта саИ/огмса.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Celie Р.Н., Kasheverov I.E., Mordvintsev D.Y., Hogg R.C., van Nierop P., van Elk R., van Rossum-Fikkert S.E., Zhmak M.N., Bertrand D„ Tsetlin V., Sixma Т.К., Smit A.B. Crystal structure of nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP in complex with an alpha-conotoxin PnIA variant. Nat. Struct. Mol. Biol. 2005, 12(7), 582-588

2. Mordvintsev D.Y.. Polyak Y.L., Levtsova O.V., Tourleigh Y.V., Kasheverov I.E., Shaitan K.V., Utkin Y.N., Tsetlin V.I. A model for short alpha-neurotoxin bound to nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica: comparison with long-chain alpha-neurotoxins and alpha-conotoxins. Comput. Biol. Chem. 2005,29(6), 398-411.

3. Kasheverov I.E., Zhmak M.N., Vulfius C.A., Gorbacheva E.V., Mordvintsev D.Y.. Utkin Y.N., van Elk R., Smit A.B., Tsetlin V.I. Alpha-conotoxin analogs with additional positive charge show increased selectivity towards Torpedo californica and some neuronal subtypes of nicotinic acetylcholine receptors. FEBSJ. 2006,273(19), 4470-4481.

4. Smit A.B., Celie P.H., Kasheverov I.E., Mordvintsev D.Y., van Nierop P., Bertrand D., Tsetlin V., Sixma Т.К. Acetylcholine-binding proteins: functional and structural homologs of nicotinic acetylcholine receptors. J. Mol. Neurosci. 2006, 30(1-2), 9-10.

5. Mordvintsev D.Y.. Polyak Y.L., Kuzmine D.A., Levtsova O.V., Tourleigh Y.V., Kasheverov I.E. A model for short alpha-neurotoxin bound to nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica. J. Mol. Neurosci. 2006, 30(1-2), 71-72.

6. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Schulga A.A., Ermolyuk Y.S., Mordvintsev D.Y.. Utkin Y.N., Shoulepko M.A., Hogg R.C., Bertrand D„ Dolgikh D.A., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P. Bacterial expression, NMR, and electrophysiology analysis of chimeric short/long-chain alpha-neurotoxins acting on neuronal nicotinic receptors. J. Biol. Chem. 2007, 282(34), 2478424791.

7. Mordvintsev D.Y.. Polyak Y.L., Kuzmin D.A., Levtsova O.V., Tourleigh Y.V., Utkin Y.N., Shaitan K.V., Tsetlin V.I. Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetylcholine receptors. Comput. Biol. Chem. 2007, 31(2), 72-81.

8. Mordvintsev D.Y.. Rodionov D.I., Makarova M.V., Kamensky A.A., Levitskaya N.G., Ogay A.Y., Rzhevsky D.I., Murashev A.N., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. Behavioural effects in mice and intoxication symptomatology of weak neurotoxin from cobra Naja kaouthia. Basic Clin. Pharmacol Toxicol. 2007, 100(4), 273-278.

9. Mordvintsev D.Y.. Polyak Y.L, Rodionov D.I, Jakubik J, Dolezal V., Karlsson E„ Tsetlin V.I., Utkin Y.N. Weak toxin WTX from Naja kaouthia cobra venom interacts with both nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors. FEBSJ. 2009,276(18), 5065-5075.

Тезисы докладов

1. Smit A.B., Celie P.H., Kasheverov I.E., Mordvintsev D.Y., van Nierop P., Bertrand D., Tsetlin V., Sixma Т.К. Acetylcholine-binding proteins: functional and structural homologs of nicotinic acetylcholine receptors. XII International Symposium on Cholinergic Mechanisms, Alicante 2005

2. Осипов A.B., Макарова Я.В., Мордвинцев Д.Ю.. Поляк Я.Л., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Минорные компоненты яда кобр с новыми свойствами. Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), стр. 12.

3. Victor Tsetlin, Igor Kasheverov, Maxim Zhmak, Dmitry Mordvintsev. Ronald Hogg, Daniel Bertrand, August Smit. Interaction of a-conotoxins with acetylcholine-binding proteins and nicotinic acetylcholine receptors. Abstracts of symposium "Neuroreceptors: structure, mechanism of action and role in pathologies" (Moscow, 2007), p.7.

4. Ekaterina N.Lyukmanova, Zakhar O.Shenkarev, Alexey A.Shulga, Yaroslav S.Ermolyuk, Dmitry Yu.Mordvintsev. Yuri N.Utkin, Mikhail A.Shoulepko, Ron C.Hogg, Daniel Bertrand,

Alexander S.Arseniev, Dmitry A.Dolgikh, Victor I.Tsetlin, and Mikhail P.Kirpichnikov. Heterologously expressed three-finger toxins for analysis of ligand-receptor interactions. Abstracts of symposium "Neuroreceptors: structure, mechanism of action and role in pathologies" (Moscow, 2007), p. 19.

5. Victor Tsetlin, Igor Kasheverov, Maxim Zhmak, Dmitry Mordvintsev, Ronald Hogg, Daniel Bertrand, August Smit. Interaction of a-conotoxins with acetylcholine-binding proteins and nicotinic acetylcholine receptors. Abstracts of symposium "Nicotinic acetylcholine receptors as therapeutic targets: emerging frontiers in basic research and clinical science" (San-Diego, USA, 2007). Biochem.Pharmacol.74, SMA-7.

6. Utkin Y.N., Osipov A.V., Starkov V.G., Mordvintsev D.Y., Makarova Y.V., Tsetlin V.I. Diversification of biological activity in three-fingered toxins. Abstracts of 8th IST-Asia Pacific Meeting on Animal, Plant & Microbial Toxins, (Hanoi, 2008), p.71.

7. Кашсверов И.Е., Жмак M.H., Хрущев А.Ю., Мордвинцев Д.Ю.. Цетлин В.И. Молекулярные основы специфичности взаимодействия а-конотоксинов с никотиновыми холинорецепторами. Тезисы докладов IV Российского симпозиума "Белки и пептиды», (Казань, 2009), стр. 235.

Заказ № 20-а/02/10 Подписано в печать 04.02.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:'т/о@с/г.ги