УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия для медицинской диагностики тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

На правах рукописи 005046128

Салмин Владимир Валерьевич

УФ ЛАЗЕР-ИНДУЦИРОВАННАЯ АУТОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

01.04.21 - лазерная физика 03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

2 2 ЮН 2012

Саратов 2012

005046128

Работа выполнена на кафедре фотоники и лазерных технологий Института инженерной физики и радиоэлектроники Сибирского федерального университета, г. Красноярск.

Научный консультант:

доктор физико-математических наук, профессор Проворов Александр Сергеевич Официальные оппоненты:

Лощенов Виктор Борисович, доктор физико-математических наук, профессор, зав. лабораторией лазерной биоспектроскопии Центра естественно-научных исследований Института общей физики им. A.A. Прохорова Российской академии наук (г. Москва)

Синичкин Юрий Петрович, доктор физико-математических наук, профессор кафедры оптики и биофотоники Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (г. Саратов)

Ушаков Николай Михайлович, доктор физико-математических наук, профессор кафедры радиотехники Саратовского государственного технического университета имени Ю.А. Гагарина (г. Саратов)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики» (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится 4 октября 2012 г. в 15 час 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 212.243.05 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: г. Саратов, ул. Университетская, 40, корпус III, ком. 34

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Автореферат разослан 1 июня 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной медицинской диагностике широкое распространение имеют оптические методы исследования живых тканей, получившие название «оптическая биопсия» (Optical Biopsy) (Bigio, 2003; Popp, 2006). В оптической биопсии используются как оптическая спектроскопия -абсорбционная, флуоресцентная, спектроскопия комбинационного рассеяния света, так и методы медицинской оптической визуализации - оптическая когерентная томография (Brezinski, 1996), конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоцитоскопия (Newton, 2011). Основное преимущество использования оптической биопсии заключается в высокой скорости проведения анализа. Вторым достоинством является возможность исследований с высоким пространственным разрешением. Уникальным свойством оптической биопсии является возможность прямого исследования метаболических превращений в клетках живых тканей (Adachi, 1999; Vishwasrao, 2005).

Среди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. Во-первых, этот метод обладает наивысшей чувствительностью. Во-вторых, параметры люминесценции весьма чувствительны к состоянию микроокружения флуоресцирующего агента (флуорофора), что позволяет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружения, включая полярность и жесткость среды, наличие поблизости зарядов и молекул -акцепторов энергии электронного возбуждения. Флуоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров -аутофлуоресценции (Monici, 2005); 2) методы, использующие различные флуоресцирующие соединения - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань для визуализации исследуемых процессов (Michalet, 2005).

Использование собственной флуоресценции (аутофлуоресценции) для прижизненной диагностики тканей является наиболее привлекательным, поскольку практически не меняются условия протекания в них основных биохимических процессов. Собственная флуоресценция тканей in vivo исследуется достаточно давно. Накоплен значительный экспериментальный материал по использованию этого метода в диагностических целях в различных областях медицины -гастроэнтерологии (Лисовский, 1984; Beuthan, 1996; Cothren, 1990; Lin, 2003), онкологии (Alfano, 1984; Loschenov, 1994; Loschenov, 1992a), гинекологии (Agrawal, 1999; Belyaeva, 2003; Zuev, 2001), офтальмологии (Docchio, 1989), f\~, стоматологии (Amaechi, 2002; Matsumoto, 2000; Qin, 2007; Sinyaeva, 2004), J

дерматологии (Синичкин, 2001; Синичкин, 2007). Определены основные тканевые флуорофоры, разработаны различные прототипы установок для клинического использования (ЬоБсЬепоу, 1998; Меегоу^И, 1995; МесгстсИ, 1996; 2009),

предложено большое количество методик изучения типовых патологических процессов. Однако, несмотря на накопленный обширный экспериментальный опыт, широкого распространения этот метод в медицинской диагностической практике до сих пор не получил. Связано это с рядом причин. Во-первых, необходимо решить вопросы стандартизации методик исследований. Сказанное в полной мере относится и ко вновь разрабатываемым методикам. Во-вторых, требуют дополнительного исследования вопросы побочных эффектов УФ лазерного излучения на биологические ткани. Третьей причиной является проблема выбора лазерного источника для возбуждения аутофлуоресценции.

Длительное время для УФ возбуждения аутофлуоресценции живых тканей использовался импульсный лазер на молекулярном азоте (Х=337,1 нм). Выбор именно этого лазера для возбуждения аутофлуоресценции тканей основан на том, что основной тканевый флуорофор - НАД(Ф)Н - имеет один из максимумов поглощения на длине волны 340 нм. Однако азотные лазеры имеют целый ряд недостатков, ограничивающих как точность исследований, так и потребительские свойства разработанных установок.

Среди основных потребительских характеристик лазеров для оптической биопсии можно назвать малогабаритность, надежность, стабильность, большой ресурс работы и невысокую стоимость. Флуоресцентный метод оптической биопсии используется в условиях значительного фонового освещения, поэтому для получения приемлемого отношения «полезный сигнал/фон» необходимо использовать высокую мощность возбуждающего излучения. Указанные параметры наиболее просто реализовать путем применения импульсно-периодических лазеров. При этом точность измерений будет зависеть от количества измерений сигнала флуоресценции, а время проведения анализа обратно пропорционально частоте повторения импульсов. Немаловажную роль играет также качество лазерного пучка, поскольку системы доставки излучения до объекта исследования используют оптико-волоконную технику и требуют тщательного согласования лазерного пучка с оптическим волокном.

Таким образом, разработка приборов и методов лазер-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для медицинской диагностики является одним из актуальных направлений лазерной физики.

Цель работы. Разработка физических основ применения новых эффективных источников УФ лазерного излучения для лазер-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии биологических тканей в медицинской диагностике.

Задачи работы:

1. Поиск новых эффективных методов возбуждения импульсных газовых лазеров и лазеров на красителях. Изучение физических процессов в азотных лазерах и разработка эффективных источников УФ лазерного излучения на их основе.

2. Разработка физических основ методов лазерной УФ-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для задач медицинской диагностики.

3. Исследование фотофизических процессов и фотобиологических эффектов при воздействии интенсивного лазерного излучения на основные эндогенные хромофорсодержащие молекулы.

Научная новизна.

1. Впервые показана высокая эффективность возбуждения азотного лазера (337,1 нм) с продольным разрядом от генератора наносекундных импульсов с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса (КПД=0,15 %, Е=1 мДж).

2. Впервые получена генерация в волноводном азотном лазере (337,1 нм) в режиме самопробоя от источника постоянного напряжения.

3. Впервые получена генерация на лазере на красителе родамин 6G при возбуждении волноводным азотным лазером, а также перестраиваемая генерация (555-580 нм) лазера на красителе родамин 6G при возбуждении азотным лазером с магнитным сжатием импульса возбуждения.

4. Впервые показано, что аутофлуоресценция органов брюшной полости (in vivo), индуцированная излучением азотного лазера (337 нм), имеет достоверно отличающиеся спектры при воспалении (перитонит).

5. Впервые показано, что при аутофлуоресценции миокарда (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), динамика флуоресценции в течение 20 мин периода острой ишемии на длинах волн 430 и 470 нм имеет монотонный характер, и достоверно отличаются как динамика флуоресценции, так и спектры флуоресценции миокарда, подвергавшегося и не подвергавшегося кардиоплегической защите. Постоянные времени динамики

флуоресценции претерпевают значимые изменения при использовании в кардиоплегическом растворе модификаторов гемопротеидов.

6. Впервые показано, что при аутофлуоресценции твердой мозговой оболочки (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), спектры флуоресценции до и во время острой ишемии мозга значимо отличаются. Наибольшие отличия в нормированных спектрах флуоресценции наблюдаются на длинах волн 430 и 470 нм.

7. Впервые показано, что при аутофлуоресценции хрусталика человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), наибольшее отличие в нормированных спектрах здоровых и пораженных возрастной катарактой хрусталиков наблюдается на длине волны 440 нм, а на длинах волн 400 и 500 нм амплитуды нормированных спектров не отличаются.

8. С использованием разработанного спектрального критерия - индекса помутнения хрусталика - впервые показано, что индекс помутнения линейно зависит от стадии развития катаракты. Впервые предложена диагностическая формула расчета стадии развития катаракты на основании измерения индекса помутнения.

9. Впервые показано, что при аутофлуоресценции роговицы человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), отношение ¡інтенсивностей флуоресценции на длинах волн 410 и 460 нм линейно возрастает с увеличением срока ношения контактных линз. Впервые продемонстрированы достоверные отличия указанного отношения при сроках ношения контактных линз 5 и 10 лет.

10. Впервые показан иммуномодулирующий эффект высокоинтенсивного (1=0,5-^5 МВт/см2) излучения азотного лазера (337 нм) в отношении иммунокомпетентных клеток.

11. Впервые показано, что при активации макрофагов усиливается их аутофлуоресценция в области 440±10 нм при возбуждении излучением с длиной волны 340±10 нм.

12. Впервые показано, что зависимость эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина от степени насыщения, имеющая максимум в области 50% насыщения, формируется за счет кооперативного характера связывания лиганда (СО) с гемоглобином.

13. Впервые определен спектр эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина в области 550-585 нм при лазерном флеш-фотололизе в цельной крови человека.

Практическая значимость работы.

1. Разработано устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. По разработанной схеме создан высоковольтный генератор наносекундных импульсов со следующими параметрами:

Энергия в импульсе 0,5 Дж Амплитуда напряжения выходного импульса 150 кВ Длительность фронта импульса напряжения 5 не Частота следования импульсов 1 ООО Гц

Генератор может быть использован для питания импульсных частотных нагрузок, импульсных газовых лазеров, ускорителей частиц, клистронов, магнетронов высоковольтными наносекундными импульсами с высокой частотой повторения.

2. Разработан эффективный компактный азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса накачки. Лазер имеет следующие характеристики:

Длина волны 337,1 нм

Частота повторения 20 - 500 Гц

Длительность импульса на полувысоте 2 не Энергия импульса 50 мкДж

Энергетическая нестабильность 5%

Импульсная мощность 25 кВт

Средняя мощность 15 мВт при 400 Гц

Диаметр пучка 2 мм круглое сечение

Ресурс работы 1.2*109 имп.

Расходимость пучка 3 мрад

Потребляемая мощность 150 Вт при 400 Гц

Размеры 30 х 15 х 15 см

Лазер предназначен для использования в следующих областях: флуоресцентная спектроскопия с высоким временным разрешением, экологический мониторинг водоемов и почвы, медицина, оптическая биопсия, лазерная масс-спектрометрия, квантовая электроника.

3. С использованием малогабаритного азотного лазера с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса накачки создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений.

Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм. Частота измерений 1000 с"1. 4. Разработаны и протестированы оригинальные спектрофлуориметрические методики оценки состояния тканей (in vivo):

• брюшной полости при перитоните;

• миокарда при ишемии в условиях кардиопротекции;

• головного мозга при аноксии и ишемии;

• хрусталика при различных стадиях развития возрастной катаракты;

• роговицы при дегенеративных изменениях, связанных с длительным ношением контактных линз.

Положения, выносимые на защиту

1. Схема магнитного сжатия и умножения напряжения импульса позволяет эффективно возбуждать газовые лазеры наносекундным продольным разрядом.

2. В волноводных азотных лазерах с продольным разрядом реализуется механизм возбуждения генерации за счет самопробоя газа в лазерной ячейке в постоянном электрическом поле.

3. Волноводный азотный лазер и азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса эффективны для возбуждения лазеров на красителях.

4. УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия при возбуждении излучением азотного лазера информативна для операционного мониторинга тканей миокарда и головного мозга при острой ишемии, тканей внутренних органов при воспалении.

5. Результаты экспериментальных исследований, методы измерений, алгоритм обработки спектров УФ лазер-индуцированной аутофлуоресценции позволяют производить дифференциальную диагностику стадий развития возрастной катаракты; степени дегенерации роговицы, вызванной ношением контактных линз.

6. Излучение азотного лазера при высоких интенсивностях модулирует активность клеток иммунной системы (молекула-мишень — НАДФН).

7. Эффективность фотодиссоциации карбоксигемоглобина имеет спектральный максимум, соответствующий пику а-полосы спектра поглощения, а зависимость модуляции оптической плотности от степени насыщения имеет максимум, связанный с точкой перегиба кривой насыщения.

Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной

медицины и патобиохимии, кафедры глазных болезней, кафедры хирургических болезней № 2, кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России, в образовательном и научно-исследовательском процессе на кафедре фотоники и лазерных технологий ФГАОУ ВПО СФУ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: 1) Second International Conference on Laser Scattering Spectroscopy of Biological Objects Pecs, Hungary, 29 Aug. - 2 Sept., 1988; 2) V Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света, Ужгород, 1989; 3) Laser Applications in Life Sciences Moscow, Russia, 27 August, 1990; 4) First Russian-Chinese Seminar on Laser Physics and Laser Technology, Krasnoyarsk, Russia, June 2-8, 1993; 5) 5th International Conference on Laser Applications in Life Sciences. Minsk, Belarus, 28 June - 2 July, 1994; 6) Первая Всероссийская конференция токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; 7) Laser Optics '95: Biomedical Applications of Lasers. St. Petersburg, Russia, 27 June 1995; 8) Russian-German Laser Symposium, St. Petersburg, Russia, 1-5 July 1995; 9) Third Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology Krasnoyarsk, Russia, October 8-10, 1996; 10) IV Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Irkutsk, Russia, 3-8 September, 1996; 11) Всероссийская научно-практическая конференция «Механизмы адаптации организма», Томск, 1996; 12) 7 Всероссийский симпозиум «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 17-22 марта 1996; 13) Гомеостаз и окружающая среда: VIII Всероссийский симпозиум, Красноярск, 10-14 марта 1997; 14) VI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Foundation, Khabarovsk, Russia, 1998; 15) IX Международный симпозиум «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; 16) XVI International Conference on Coherent and Nonlinear Optics, ICONO '98, Moscow, Russia, June 29- July 3, 1998; 17) 4th Chinese-Russian-Korean Symposium on Laser Physics and Laser Technology, Harbin, China, 1998; 18) VII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Hirosaki, Japan 16-17 September, 1999; 19) Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Достижения науки и техники - развитию сибирских регионов", Красноярск, 24-26 марта, 1999; 20) 10th European Students' Conference For Medical Students And Young Doctors, Berlin, Germany, 20-24 October 1999; 21) Научно-практическая конференция "Проблемы экологии и развитие городов" Красноярск, 5-6 июня 2000; 22) Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II Saratov Russia, 3 October 2000; 23) 3d International Symposium on Modern Problems of Laser Physics,

Novosibirsk, 2000; 24) 10th Conference on Laser Optics, St Petersburg, Russia, 2000; 25) 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology - Tomsk: 2000; 26) VIII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Blagoveshchensk, 21-22 September, 2000; 27) 2-ая Всероссийская конференция «Достижения науки и техники — развитию Сибирских регионов», Красноярск, 2000; 28) I Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика-2001", 18-22 июня 2001; 29) V Международная конференция "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул" г.Томск, 9-14 сентября 2001; 30) ICONO 2001 - International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (XVII) Minsk, Belarus, June 26 - July 1, 2001; 31) 9th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange, Kanazawa, Japan, 2001; 32) Atomic and Molecular Pulsed Lasers V Tomsk, Russia, Tomsk, 15-19 September 2003; 33) American Society for Microbiology Conference "Bio-, Micro-, and Nanosystems", New York, July 7 -10, 2003; 34) 2nd International conference "High medical technologies in XXI century" Benidorm, Spain November 1-8, 2003; 35) Optical Technologies in Biophysics and Medicine, V Saratov Fall Meeting, 2003; 36) XI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Niigata, Japan 10-11 August, 2004; 37) IV International Symposium "Modern Problems of Laser Physics" MPLP'2004, Novosibirsk, Russia, 22 - 27 August, 2004; 38) DESORPTION-2004, Saint-Petersburg, Russia, August 29 - September 2, 2004; 39) The 7th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies, Tomsk, Russia, December 20, 2004; 40) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2005: Laser Technologies for Environmental Monitoring and Ecological Applications, and Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2005 St.Petersburg, Russia, May 11-15, 2005; 41) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2007, Minsk, Belarus, 28 May 2007; 42) International Conference on Laser Applications in Life Sciences LALS 2007, Moscow, Russia,11-14 June 2007; 43) 18th International Laser Physics Workshop LPHYS' 09, July 13 - 17, 2009, Barcelona, Spain; 44) VI Russia-Japan Workshop "Integrative Neuroscience: Molecular and Translational Medicine", Krasnoyarsk, July 2011, семинарах и заседаниях кафедры квантовой электроники, кафедры фотоники и лазерных технологий Сибирского федерального университета (1990-2011 гг.), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого (2006-2011 гг.), кафедры биофизической генетики и молекулярной медицины Медицинского факультета Университета Канадзавы (Япония, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 62 печатных работы, из них 17 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получено 4 патента. Перечень основных 36 работ приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 301 странице текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 фотографий, 94 рисунка, 22 таблицы. Библиографический список включает 343 источника.

Автор выражает благодарность сотрудникам ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития РФ за помощь в проведении биомедицинских исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Методическим основанием использования флуоресцентного анализа в оптической биопсии является наличие собственной флуоресценции клеток и тканей при их облучении ультрафиолетовым и видимым светом, которая реагирует на минимальные изменения их функционального состояния. Экспериментально были обнаружены наиболее важные тканевые флуорофоры: триптофан; коллаген и эластин; восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и его фосфат (НАДФН), флавины (ФАД, ФМН) и флавопротеины, бета-каротин, порфирины.

Одним из основных источников клеточной флуоресценции в видимой области является пул нуклеотидов - пиридиновых и флавиновых, ассоциированных, прежде всего с митохондриями, а также находящихся в цитоплазме. Эти соединения участвуют в таких процессах, как гликолиз, пентозный цикл, цикл Кребса, окисление жирных кислот, работа дыхательной цепи митохондрий, биосинтетические процессы, окисление ксенобиотиков, что делает их удобными интегральными маркерами метаболизма клеток и тканей в норме и при патологии.

Спектр аутофлуоресценции ткани является результатом наложения спектров флуоресценции большого количества тканевых флуорофоров, имеющих близкорасположенные максимумы. В этих условиях определение концентрации того или иного биохимического компонента по интенсивности флуоресценции на длинах волн, соответствующих максимумам флуоресценции чистых веществ, становится весьма непростой задачей. Наличие в ткани гемоглобина, миоглобина, обладающих существенным поглощением в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, влияет на форму спектра флуоресценции ткани и должно также

учитываться при количественном флуоресцентном анализе. Совпадение пиков люминесценции тканевых флуорофоров с максимумами поглощения названных гемопротеидов, а также с максимумами поглощения самих флуорофоров, высокая оптическая плотность большинства биологических тканей приводят к существенной реабсорбции. Учет реабсорбции в оптически неоднородных и рассеивающих средах является одной из наиболее сложных проблем оптической биопсии тканей.

Перспективы применения методов лазер-индуцированной флуоресцентной спектроскопии наиболее очевидны в следующих областях:

1) Офтальмология. Наиболее значимыми эндогенными флуорофорами являются флуоресцирующие пигменты хрусталика и пигментный эпителий сетчатки. Флуоресцентные свойства этих пигментов зависят от возраста и характера патологии. Показано, что в катарактальных хрусталиках происходит снижение общего уровня пиридиновых нуклеотидов, а интенсивность флуоресценции может служить маркером появления нерастворимых белков. Наличие собственной флуоресценции клеток роговицы при их облучении ультрафиолетовым светом дает возможность применять флуоресцентный метод для диагностики её состояния при сахарном диабете и хроническом травмирующем воздействии. Однако до сих пор не были осуществлены клинические исследования информативности указанных методов.

2) Сердечно-сосудистая хирургия, актуализирующая методологию кардиомониторинга при проведении оперативных вмешательств на сердце. Лазер-индуцированная люминесценция — один из методов, перспективных к использованию для мониторинга состояния миокарда при кардиохирургическом вмешательстве. Обнаружена связь между динамикой флуоресценции НАДН кардиомиоцитов в реперфузионном периоде и длительностью, температурой и типом кардиоплегии; особенностями аутофлуоресценции ткани в разных участках ишемического повреждения. Уровень НАДН предложено оценивать по величине отношения интенсивностей 1465/Цо55 причем выбор длины волны 405 нм в качестве внутреннего эталона необходим для учета альтерации поглощения миоглобина во время гипоксии. Вместе с тем, до сих пор в клинической практике отсутствуют приборы и зонды, позволяющие проводить кардиомониторинг в режиме реального времени при кардиохирургическом вмешательстве, с учетом эффектов гемопротеидов ткани миокарда в отношении ее люминесценции.

3) Нейрохирургия. Регистрация аутофлуоресценции ткани головного мозга - один из информативных способов оценки интегральных метаболических

параметров функционирования мозга в норме и при патологии in vivo. В экспериментах на изолированных клетках и тонких срезах мозга показано, что основной вклад в аутофлуоресценцию клеток головного мозга вносят НАД(Ф)Н и ФАД, изменения пулов которых не только характеризуют особенности энергетического гомеостаза клеток, но и косвенно свидетельствуют о нейроналыюй активности, процессах нейрон-глиального метаболического сопряжения и глиального контроля церебрального кровотока. Вместе с тем, несовершенство приборного и программного обеспечения не позволило до сих пор разработать методологические основы применения такого метода в условиях in situ.

При проведении флуоресцентного анализа в условиях in vivo необходимо учитывать ограничения, накладываемые живым объектом. Зачастую ткань-мишень недоступна без использования инвазивных методик, однако возможно использование зонда. Для оптической биопсии таким зондом может являться световод. Оптический световод может быть введен в полости органов, в мутные структуры, приведен в контакт с поверхностью ткани, помещен в пунктируемые с помощью игл органы. При этом, в отличие от стандартных эндоскопических устройств, устройства для оптической спектроскопии могут быть изготовлены как гибкие катетеры с внешним диаметром менее 0,5 мм. Для получения минимального диаметра оптического датчика используются системы с одним оптическим волокном. Одноволоконные датчики привлекательны тем, что обеспечивают практически 100%-ый светосбор. При этом, для разделения луча возбуждения и сигнала используются дихроичные разделители. Однако при этом значительно возрастает амплитуда рассеянного назад излучения накачки, что искажает результаты флуоресцентных измерений за счет собственной флуоресценции световода. Поэтому для минимизации обратного сигнала предпочтительнее использование раздельных трактов для облучения и сбора излучения от исследуемого объекта.

В настоящее время ведутся разработки новых методик для оптиковолоконного флуоресцентного анализа в медицине. Urz Utzinger и R.R. Richards-Kortum проанализировали различные виды разрабатываемых световодов и наконечников, используемых в прикладной медицине. Описаны различные виды световодов, но разработка оптоволоконных зондов для оптической биопсии различных органов и тканей по-прежнему является актуальной задачей.

УФ лазеры наиболее интересны для возбуждения эндогенной флуоресценции органов и тканей. Среди широкого круга практически

используемых УФ лазеров доминирующее положение занимают четыре класса лазеров - твердотельные лазеры на кристаллах и стеклах, полупроводниковые лазеры, лазеры на красителях, лазеры на газообразных средах.

Развитие технологий создания полупроводниковых устройств в последнее десятилетие привело к существенному прогрессу полупроводниковых лазеров. Причем достижения в этой области стимулировали работы по твердотельным лазерам. Появившиеся в последнее время лазеры с оптической накачкой полупроводниковыми лазерными матрицами отличаются высоким КПД и малогабаритностью при высоких энергетических характеристиках. Однако для подобных лазеров продвижение в видимую и тем более в ультрафиолетовую область сопряжено с дополнительными затратами и необходимостью использования техники умножения частоты.

Появившиеся лазерные системы, основанные на преобразовании излучения Ш:УАО лазера в третью гармонику (А.=355 нм), использующие для возбуждения полупроводниковые лазеры и модуляцию добротности, обладают замечательными техническими характеристиками: частота повторения импульсов генерации в таких моделях может достигать десятков килогерц при высоком качестве лазерного пучка и большом ресурсе работы 109-10ш имп. Такие лазерные системы представлены большим количеством моделей различных производителей, однако общим признаком, сдерживающим широкое применение таких лазерных систем, является их высокая стоимость (30000-50000$). Еще одним недостатком таких систем для оптической биопсии по сравнению с азотными лазерами является большая разница в длине волны излучения лазера и пика поглощения НАД(Ф)Н (Я=340 нм), что снижает эффективность возбуждения аутофлуоресценции живых тканей.

Перспективным классом лазеров для систем оптической биопсии являются УФ полупроводниковые лазеры, которые обладают большим ресурсом работы до 5000 ч и сравнительно малой стоимостью (менее 1000$). Однако, использование таких лазеров в системах оптической биопсии, основанных на регистрации аутофлуоресценции тканей, ввиду невысокой импульсной мощности ограничено, по-видимому, только контактными (инвазивными) датчиками. Для полупроводниковых УФ лазеров сдвиг линии генерации (Х=370 нм) относительно пика полосы поглощения НАД(Ф)Н в еще большей степени снижает эффективность возбуждения аутофлуоресценции живых тканей.

Характеристики лазеров на красителях с когерентной накачкой в значительной степени определяются источником накачки, в качестве которых используются твердотельные лазеры с умножением частоты и газовые лазеры.

Очевидно, что наиболее универсальными лазерными источниками света для возбуждения эндогенной и экзогенной флуоресценции являются перестраиваемые лазеры, поскольку перестройка длины волны возбуждения позволяет дифференцировать отдельные флуорофоры по красной границе возбуждения. Получение указанной возможности в УФ диапазоне может быть реализовано с помощью умножения частоты лазеров на красителе. Однако сложность подобных лазерных систем, очевидно, будет являться одним из сдерживающих факторов для их широкого использования в медицинских диагностических комплексах.

Анализ различных УФ лазерных систем показывает, что УФ газовые лазеры в ряде случаев имеют сходные массогабаритные и энергетические характеристики, однако они более просты и имеют меньшую стоимость. Схожесть массогабаритных и энергетических характеристик связана со значительным снижением КПД твердотельных лазерных систем при преобразовании излучения в 3, 4 и 5 гармоники.

Одно из требований, предъявляемых к флуоресцентным лазерным системам для медицинской диагностики, - возможность проведения анализа в условиях посторонней засветки (внешнее освещение операционного поля либо эндоскопическая подсветка исследуемых органов). Для улучшения отношения «сигнал/фон» очевидна необходимость увеличения полезного сигнала флуоресценции. При регистрации аутофлуоресценции интенсивность сигнала, как правило, мала по сравнению с методиками, использующими экзогенные флуоресцентные зонды. В этих условиях увеличение мощности накачки является одним из путей решения указанной задачи. Очевидно, что использование импульсных лазеров для этих целей предпочтительнее, поскольку исключается термическое повреждение ткани.

Среди импульсных УФ газовых лазеров традиционно выделяют эксимерные лазеры и лазеры на молекулярном азоте. Эксимерные лазеры достаточно часто используются для возбуждения аутофлуоресценции. Причем в большинстве работ используется излучение ХеС1 лазеров (?.=308 нм), что позволяет эффективно возбуждать основной тканевый флуорофор НАД(Ф)Н. Однако более короткая длина волны излучения по сравнению с излучением азотного лазера значительно повышает риск нежелательных фотобиологических эффектов. Так, данные по УФ-индуцированной катаракте указывают на снижение порога эффективной дозы с 48 Дж/см2 для 340 нм до 0,095 Дж/см2 для 305 нм, то есть фототоксическое действие на хрусталик излучения ХеС1 лазера более чем в 500 раз выше, чем у излучения азотного лазера. Вероятность повреждения ДНК на поглощенный квант

увеличивается от 5*10"6 для 340 нм до 10"3 для 310 нм. Аналогичные результаты получены и для относительной спектральной чувствительности по канцерогенной и провоспалительной активности УФ излучения. Указанные факторы свидетельствуют о предпочтительном выборе в качестве источника возбуждения аутофлуоресценции тканей излучения азотного лазера (Х=337,1 нм). В большинстве работ по прижизненному исследованию аутофлуоресценции биотканей используется азотный лазер.

В настоящее время на рынке представлены разнообразные малогабаритные лазеры на молекулярном азоте стоимостью 3000-7000$, однако все представленные модели имеют малый ресурс работы до 108 имп. и невысокую частоту повторения импульсов до 100 Гц вследствие выбора поперечной схемы накачки. Большинство из представленных моделей имеют многомодовый пучок прямоугольной формы, что затрудняет его эффективное согласование с оптическим волокном малого сечения.

В то же время, для азотного лазера продольная схема возбуждения имеет значительные преимущества для получения высокой частоты следования и ресурса работы. Показанный ресурс работы азотных лазеров с продольным разрядом составляет ~109 имп. Продемонстрированная предельная частота повторения импульсов генерации азотных лазеров с продольным разрядом и диффузионным охлаждением составляет 10 кГц в регулярном режиме. Сопоставимые энергетические характеристики лазеров с продольной и поперечной накачкой были показаны также в случае лазеров на второй положительной полосе молекулярного азота А,=337,1 нм. При использовании продольного разряда лимитирующим фактором для формирования короткого импульса тока разряда является индуктивность разрядной ячейки. Методом уменьшения индуктивности ячейки с продольным разрядом является использование конструкции, предложенной Geller, в которой разрядный капилляр снабжен дополнительной оболочкой из проводящего материала, расположенной коаксиально с разрядным каналом, и образует коаксиальную передающую длинную линию, индуктивность которой значительно меньше, нежели индуктивность разрядного промежутка. Такие конструкции разрядных ячеек азотных лазеров с продольным разрядом позволили продемонстрировать наиболее высокую удельную мощность генерации (30 МВт/л), сопоставимую с азотными лазерами с возбуждением поперечным разрядом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка лазерных источников излучения осуществлялась с использованием экспериментального стенда газовых лазеров, созданного на кафедре квантовой электроники Красноярского государственного университета (в настоящее время - кафедра фотопики и лазерных технологий Сибирского федерального университета). Стенд включал в себя следующие блоки и узлы: вакуумную систему, источники высокого напряжения, генераторы наносекундных импульсов высокого напряжения, систему регистрации лазерного излучения.

Вакуумная система включала в себя масляный пластинчато-роторный вакуумный насос типа 2НВР 5 ДМ, газовый пост, вакуумметр ионизационно-термопарный ВИТ-2. Контроль остаточного давления в системе осуществлялся с помощью преобразователя манометрического термопарного ПМТ-2. Вакуумная система обеспечивала разрежение до давления не хуже 10"3 мм рт.ст. Контроль давления в системе осуществлялся с помощью вакуумметра ВТИ ГОСТ 2405-80 и манометра МТИ ГОСТ 2405-80. Для приготовления газовых смесей использовались газы технической чистоты: азот, аргон, гелий.

В качестве источников высокого напряжения использовались: 1) источник с регулируемым 0-50 кВ выходным напряжением положительной и отрицательной полярности (Tesla BRNO, Чехословакия); 2) источник ВИП 2 (СКБ НП, Екатеринбург, Россия) мощностью 600 Вт с выходным регулируемым напряжением 0-25 кВ и стабилизацией тока не хуже 3%; 3) компактный источник питания UMW15P125 (SPELLMAN, США), который обеспечивал регулируемое постоянное напряжение 0-15 кВ и максимальную выходную мощность 125 Вт. Подключение наносекундных генераторов импульсов к источникам высокого напряжения осуществлялось через балластное сопротивление, собранное из последовательно подключенных 30 керамических резисторов сопротивлением 18 кОм, мощностью 10 Вт. Батарея резисторов погружалась в картер емкостью 5 литров, заполненный трансформаторным маслом.

Генераторы наносекундных импульсов высокого напряжения собирались с использованием емкостных накопителей энергии по схемам с перезарядкой емкостного накопителя - схема Блюмлейна, разрядкой обострителыюй емкости, одно- и многозвенной цепей магнитного сжатия импульса. В качестве коммутаторов использовались тиратроны типа ТГИ 325/16, ТГИ 1000/25. Тиратроны помещались в коаксиальный проводящий кожух для снижения уровня электромагнитных помех.

В качестве емкостных накопителей энергии и обострительных емкостей использовались керамические высоковольтные конденсаторы различной емкости и предельного напряжения марок КВИ-1, КВИ-3. Дроссели схем магнитного сжатия импульсов были выполнены на кольцеобразных сердечниках из ферритов марок 1000 НН, 2000 НМ, различного размера с намоткой монтажным проводом во фторопластовой изоляции марки МГТФ. Электронная схема ГИН помещалась в картер, заполненный трансформаторным маслом, а подключение разрядных ячеек и тиратрона осуществлялось через коаксиальные фторопластовые разъемы. Поджиг тиратрона осуществлялся подачей импульсного напряжения положительной полярности с амплитудой 500 В и длительностью 5 мкс на сетку тиратрона от релаксационного управляемого генератора, управляющие импульсы на который подавались от генератора импульсов Г5-54. Контроль формы импульса напряжения осуществлялся с помощью осциллографа С1-75 и калиброванного резистивного делителя.

Регистрация лазерного излучения осуществлялась с помощью коаксиального фотоприемника ФЭК-22СПУ, импульс с которого регистрировался с помощью осциллографа С1-75. Синхронизация запуска осуществлялась с помощью проволочной петли, размещенной возле лазерной ячейки. Лазерное излучение ослаблялось перед поступлением в фотоприемник с помощью калиброванных ослабителей. Средняя мощность лазерного излучения измерялась с помощью ИМО-2Н. Калибровка мощности сигнала, получаемого на осциллографе, осуществлялась по значению энергии импульса и его длительности.

Биомедицинские исследования (в формате доклинических и клинических исследований) выполнялись на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и были одобрены Локальным этическим комитетом КрасГМУ.

Биофизические исследования проводились в секторе иммунологии Института биофизики СО РАН, на кафедре квантовой электроники и медико-физическом центре Красноярского государственного университета, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого», кафедре экспериментальной и медицинской физики и кафедре фотоники и лазерных технологий ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет».

Исследование аутофлуоресценции тканей брюшной полости при перитоните выполнено на беспородных кроликах-самцах массой 2,5-3,0 кг, содержащихся на обычном рационе в стандартных условиях вивария. В эксперименте использованы две группы животных: 1) контрольная группа интактных животных (п=9); 2) экспериментальная группа (п=13). Использована стандартная модель перитонита с применением жидкой культуры метициллинрезистентного штамма Staphylococcus aureus, вводимой внутрибрюшинно однократно (микробное число 107 на пептонном бульоне в количестве 10 мл/животное).

Для записи спектров флуоресценции использовался контактный метод:

т 2

оптическии зонд накладывался на участок исследуемои ткани площадью L мм , плотно прижимался к нему и оставался неподвижным в течение всего периода записи спектра. Поскольку ткань обладает мозаичностью, спектры флуоресценции решено было записывать in situ с нескольких участков исследуемых тканей каждого животного в диапазоне 425-495 нм. Спектры записывались с шагом в 1 нм.

Аутофлуоресценция миокарда при острой ишемии исследовалась на беспородных кроликах-самцах массой 2,5-3,0 кг, содержащихся на обычном рационе в стандартных условиях вивария. Острая ишемия миокарда экспериментально моделировалась путем наложения зажимов на аорту. В эксперименте использованы две группы животных: 1) контрольная группа животных (п=16), у которых защита миокарда не проводилась; 2) экспериментальная группа животных (п=24), у которых защита миокарда в период остановки кровотока осуществлялась охлажденным раствором «Консол» по стандартной методике. Доставку кардиоплегического раствора к миокарду выполняли антеградно в корень аорты.

Для записи спектров флуоресценции использовался контактный метод: после наложения зажимов на аорту оптический зонд накладывался на участок эпикарда площадью 2 мм2 или устанавливался над поверхностью эпикарда бесконтактным способом (на расстоянии 2-3 см). Спектры флуоресценции записывались в интервале 425-520 нм в течение 20 минут. От участка эпикарда каждого кролика было записано 40 спектров флуоресценции (по 2 спектра в минуту).

Влияние гемопротеидов на флуоресценцию миокарда исследовалось на беспородных белых крысах-самцах (п=59), содержащихся на обычном рационе в стандартных условиях. Операция проводилась под общим наркозом. Состояние ишемии вызывалось наложением зажима на аорту. Для остановки сердца в левый желудочек вводился кардиоплегический деполяризующий раствор. Для выяснения влияния гемоглобина на динамику флуоресценции миокарда были использованы

препараты, вызывающие образование превалирующей лигандированной или нелигандированной его формы. Были выделены три группы животных: 1) контрольная группа; 2) группа, в которой остановка сердца проводилась кардиоплегическим раствором с дитионитом натрия, выступающим в роли восстановителя гемо- и миоглобина; 2) группа, в которой остановка сердца производился кардиоплегическим раствором, насыщенным СО, для образования карбоксиформы гемопротеидов.

После введения всего объема плегического раствора на сердце устанавливался зонд или он устанавливался над поверхностью эпикарда бесконтактным способом (на расстоянии 2-3 см). Запись спектров флуоресценции миокарда осуществлялась в интервале от 380 до 550 нм с шагом 10 нм, с временными промежутками 30 секунд в течение 20 минут ишемии.

Аутофлуоресценция ткани головного мозга исследовалась на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г., содержащихся в стандартных условиях вивария. Для моделирования острой аноксии и ишемии головного мозга животным (п=15) под ингаляционным наркозом использовали метод пережатия трахеи и билатеральной окклюзии общих сонных артерий, соответственно. Для размещения оптического зонда был произведен полулунный разрез в левой теменной области головы крысы, выполнены 4 трепанационных отверстия, произведена резекционная трепанация черепа. Пережатие трахеи или лигирование артерий производилось через 10 минут после установки оптического зонда. Аутофлуоресценция ткани мозга регистрировалась путем многократной записи спектров люминесценции твердой мозговой оболочки при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 337 нм. Диаметр облучаемой зоны при этом не превышал 5 мм. Перемещение зонда в координатных направлениях XYZ осуществлялось с помощью манипулятора стереотаксической рамки (Narishige, Япония). Общее время мониторинга составляло 20 минут. Спектры люминесценции регистрировались в интервале 390-560 нм с шагом 10 нм. Среднее время однократной записи одного спектра составляло 20 с.

Исследование флуоресценции хрусталика при катаракте проводилось с привлечением нескольких групп добровольцев при обязательном информированном согласии каждого из них: в 1-ую группу (60 человек) входили здоровые люди, без нарушения функции зрения в возрасте до 25 лет, во 2-ю группу (27 человек) - здоровые люди, без нарушения функции зрения в возрасте после 25 лет (со сформировавшимся ядром хрусталика - факосклероз), в 3-ю группу (93 человек) — больные возрастной катарактой разной степени зрелости.

Излучение азотного лазера доставлялось через оптическое волокно до окулярного зонда, установленного на глазнице, для возбуждения люминесценции хрусталика. Диагностическая зона представляла собой круг диаметром 6-7 мм. Значение энергетической экспозиции в экспериментах не превышало Н=336 ДжАГ. Часть излучения люминесценции улавливалась вторым оптоволокном и поступала во входную щель монохроматора. Спектры люминесценции записывались в интервале 360-590 нм с шагом 10 нм.

Исследование флуоресценции роговицы осуществлялось с привлечением групп добровольцев с обязательным информированным согласием каждого из них: 23 человека, не носящие контактные линзы, 17 человек со сроком ношения линз менее 5 лет, 9 человек со сроком ношения от 5 до 10 лет. Для возбуждения и регистрации флуоресценции роговицы было сконструировано приспособление, позволяющее закрепить световоды в щелевой лампе и установить оптимальное расстояние от выходного отверстия световода до роговицы, а также регулировать его угол наклона и XY положение. Оптимальным считали такой угол падения, при котором лазерный луч, пройдя через роговицу, не достигнет хрусталика, а отразится от радужной оболочки глаза (УФ излучение, отразившись от радужки, поглотится и не будет вносить вклад во флуоресценцию роговицы). Спектры записывались с 2-х участков роговицы, расположенных за пределами видимой проекции хрусталика, в положении 3 и 9 часов. Положение 6 часов не использовалось из-за попадания излучения накачки в хрусталик. Положение 12 часов не использовалось по причине прикрытия этой зоны веком, а также высокой вероятности перекрытия луча при моргании. Спектры записывались однократно с каждой зоны каждого глаза в диапазоне 390-530 нм с шагом 10 нм.

Клеточные механизмы действия лазерного излучения исследовались с помощью оценки иммуномодулирующих эффектов лазерной радиации, влияния лазерной радиации на генерацию АФК иммунокомпетентными клетками, аутофлуоресценции макрофагов in vitro, роли гемопротеидов в качестве акцепторов лазерного излучения.

Иммуномодулирующие эффекты лазерной радиации оценивались на культуре лимфоцитов периферической крови, выделенных от 42 пациентов с хроническим обструктивным бронхитом в стадии обострения в возрасте от 34 до 45 лет. Облучение осуществлялось излучением азотного лазера (337 нм) через кварцевый световод диаметром 500 мкм со следующими параметрами: средняя мощность на частоте 100 Гц - 2 мВт, длительность импульса по полувысоте - 2 не. Средняя мощность излучения измерялась с помощью измерителя мощности

оптического излучения типа ИМО-2Н. Облучение осуществлялось погружением конца световода непосредственно в культуру. Облучение производилось в течение 1 мин. Экспозиционная доза составила 0,12 Дж. После воздействия лазерного излучения на лимфоциты исследовали экспрессию трех видов антигенов (CD2, CD4, CD8) на клетках с помощью метода розеткообразования.

Влияние лазерной радиации на генерацию активных форм кислорода иммунокомпетентными клетками определялась в цельной крови, взятой из пальца, в микрометоде хемилюминесцентного анализа с использованием

автоматизированного анализатора хемилюминесценции Chemiluminometer-3601 (ИБФ СО РАН), работающего в режиме счета фотонов, с обеспечением термостатирования и перемешивания испытуемых образцов. Кровь разводили в соотношении 1:10 неокрашенным раствором Хенкса, люминол (Sigma) использовался в концентрации 2,2*104 М/л. В качестве активатора клеток использовали частицы латекса размером 2,4 мкм в концентрации 5*108 мл"1 (ВНИИСК, С.-Петербург), опсонизированные свежей сывороткой крови, взятой от 10 доноров. Время записи кинетики хемилюминесцентной реакции составляло 90 мин при 37°С при перемешивании образцов. Облучение крови осуществлялось излучением N2 лазера (337 нм). В кварцевый световод диаметром 500 мкм, открытый конец которого погружался в облучаемый образец крови, вводилось излучение N2 лазера со следующими параметрами: импульсная мощность 1,1 кВт, средняя мощность 0,1 мВт, средняя интенсивность 50 мВт/см2, импульсная интенсивность 0,56 МВт/см2, частота повторения лазера 30 Гц, длительность импульса генерации по полувысоте 3 не; интегральная экспозиционная доза облучения составляла 6 мДж при времени экспозиции образца крови 1 мин.

Аутофлуоресценция макрофагов in vitro исследовалась на макрофагах перитонеальной полости, полученных из перитонеального экссудата наркотизированных и умерщвленных экспериментальных животных, в асептических условиях путем перфузии брюшной полости охлажденным раствором Хенкса (+4°С). Объектом исследования являлись беспородные белые мыши-самцы средней массой 18-20 г (п=14) контрольной и опытной (модель перитонита) групп. Отдельная серия экспериментов была выполнена с использованием беспородных кроликов-самцов с моделью перитонита и интактных животных. Макрофаги перитонеальной полости кроликов получали при проведении лапаротомии под общей анестезией.

Динамику флуоресценции суспензии цельных макрофагов в растворе Хенкса (при клеточности суспензии не менее 105мл"', жизнеспособности более 90%,

минимальный объем клеточной суспензии — 100 мкл) регистрировали при +37°С на длине волны 420 нм при возбуждении 340 нм, в течение 15 минут. Регистрацию кинетики флуоресценции макрофагов проводили на спектрофлуориметре СМ2203 («SOLAR», Беларусь). Для количественной оценки функциональной активности клеток использовалась максимальная амплитуда интегральной кривой (отн. ед.) и время достижения полувысоты (т/2) интегральной кривой (сек.).

Оценка индуцированных лазерных излучением изменений в гемопротеидах проводилась с использованием препарата гемоглобина лошадиного, лиофилизированного, кристаллического (Россия), в фосфатном буфере, 0,05 М, рН 7,4, 8,0; а также гемолизированной и цельной человеческой донорской крови. Для получения раствора гемолизированной крови 2 мл исходной крови разбавлялись в 50 раз дистиллированной водой. После этого проводилось центрифугирование в течение 10 минут при 3000 об/мин. Получившуюся надосадочную жидкость разводили до тех пор, пока значение ее оптической плотности не становилось порядка единицы на длине волны 532 нм. Конечное разведение составило приблизительно 250 раз. В полученный раствор добавлялся дитионит натрия (Na2S204) в количестве 1мг/10мл, который обеспечивал присутствие в растворе только карбокси- и дезоксиформы НЬ.

Получение препарата карбоксигемоглобина из дезоксиформы осуществлялось пропусканием через перемешиваемый раствор гемоглобина (или эритроцитарную взвесь) СО (в темноте). Парциальное давление СО, необходимое для получения насыщенных растворов НЬ, соответствует концентрации свободных молекул газа в растворе 10"7 М, в то же время для предохранения препарата от распада на димеры концентрация белка составляла не менее 5х10"6 М. Использовался раствор гемоглобина в концентрации 1,2x1o-4 М по гему. Насыщение СО производилось в присутствии восстановителя (дитионит натрия, 10 мг/мл). После пропускания СО в течение 10-15 минут достигалась концентрация НЬСО 70-80%. Модуляция исходного уровня НЬСО в дальнейшем производилась за счет сдвига равновесия реакции спонтанной диссоциации и реассоциации НЬСО в атмосфере аргона в течение различных периодов времени. Для получения раствора негемолизированной крови исходная кровь разбавлялась 0,1 М фосфатным буфером (рН = 7,4) до достижения оптической плотности раствора, близкой к единице. В полученный раствор также добавлялся дитионит натрия (0,1 г/мл). Контроль содержания НЬСО в растворе проводился спектрофотометрически.

Регистрация фотодиссоциации производилась на экспериментальной лазерной установке для изучения флеш-фотолиза с перекрещивающимися пучками.

В работе использовались два источника фотолизирующего излучения. Для нахождения зависимости эффективности фотолиза от интенсивности облучения, а также зависимости эффективности фотолиза от концентрации карбоксигемоглобина использовался импульсный твердотельный Nd:YAG-лазер марки ЛТИ-404, работающий в режиме модуляции добротности с удвоением частоты, излучающий на длине волны 532 нм. Параметры излучения: длительность импульса излучения т=25 не, мощность импульса Римп=60 кВт, площадь сечения пучка S=0,5 см2. Изменение частоты следования импульсов генерации в пределах от 1 до 50 Гц и, соответственно, средней мощности от 1,5 мВт до 42,5 мВт обеспечивало среднюю плотность мощности фотолизирующего излучения от 3 мВт/см2 до 85 мВт/см2.

Для нахождения зависимости эффективности фотолиза от длины волны фотолизирующего излучения в качестве источника фотолизирующего излучения использовался перестраиваемый импульсный твердотельный лазер марки ЛКИ-301 с оптической накачкой от импульсного Nd:YAG—лазера ЛТИ-404. В лазере ЛКИ-301 активной средой являлись матрицы из полиметилметакрилата двух типов: с внедрением красителя родамина незамещенного и родамина 6G. При этом обеспечивалась стабильная генерация в диапазоне длин волн 544-600 нм. Максимальная мощность импульса на длине волны максимума интенсивности люминесценции родамина незамещенного достигала Римп = 4 кВт. Установка обеспечивала регистрацию изменения оптической плотности не хуже 0,005 D. Регистрация изменений оптической плотности AD на установке лазерного флеш-фотолиза производилась на длинах волн, соответствующих максимумам поглощения карбокси- и дезоксигемоглобина ( соответственно, 534 и 555 нм), на пике полосы Соре дезоксигемоглобина 435 нм, а также в изобестической точке 548 нм. Выделение нужной длины волны осуществлялось монохроматором МДР-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Наносекундный генератор мощных импульсов напряжения. Нами разработано устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса (Рис. 1), которое содержит активный коммутатор 1, N-звенную цепь из последовательно подключенных LC-инверторов 2,3. Узел нагрузки содержит нагрузочный элемент 4, параллельно которому подключены шунтирующий конденсатор 5 и индуктивность 6. Каждый LC-инвертор содержит четыре конденсатора 7,8,9,10 в первом инверторе, 11,12,13,14, соответственно, во втором, и т.д. При этом величины емкостей конденсаторов в каждом LC-инверторе имеют

одинаковые соотношения С7:С8:С9:Сю = 12:4:1:1 и, соответственно, С^С^С^С^ = 12:4:1:1. При этом суммарная емкость конденсаторов последующего ЬС-инвертора равна половине емкости последнего конденсатора предыдущего ЬС-инвертора Сц+С^+Си+Сн^!^. Каждый ЬС-инвертор имеет четыре пассивных магнитных коммутатора: 15,16,17,18 в первом и 19,20,21,22 во втором. В процессе магнитного сжатия импульса при переходе энергии от звена к звену происходит умножение напряжения в шесть раз. Величина выходного напряжения устройства составляет и0'6ы, где и0 - напряжение питания устройства, а N - число последовательно включенных ЬС-инверторов. Кроме того, при переходе от звена к звену происходит сокращение длительности фронта нарастания импульса напряжения в g4 раз, а общий коэффициент сжатия равен

Рис. 1. Принципиальная схема устройства магнитного сжатия и умножения напряжения.

С использованием принципов, описанных выше для устройства магнитного сжатия и умножения напряжения, мы создали малогабаритный высоковольтный генератор наносекундных импульсов, принципиальная схема которого приведена на рис. 2. В качестве коммутатора 1 мы использовали тиратрон ТГИ 325/16. Импульсное напряжение на выходе схемы при зарядке до 15 кВ составило не менее 90 кВ, а длительность фронта импульса составила 4-5 не.

и„о-

Г

—^^Л^—

С1 С2

Рис. 2. Принципиальная схема цепи магнитного сжатия и умножения напряжения высоковольтного генератора наносекундных импульсов.

С,=1410 пФ, С2=470 пФ, С3=С4=120 пФ.

Лазерные источники

Нами разработан компактный импульсный газовый лазер на молекулярном азоте с возбуждением от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. При использовании ячейки диаметром канала 2 мм и длиной 170 мм при напряжении питания 15 кВ получена генерация на молекулярном азоте со следующими параметрами: Длина волны Частота повторения Длительность импульса на полувысоте Энергия импульса Энергетическая нестабильность Импульсная мощность Средняя мощность Диаметр пучка Ресурс работы Расходимость пучка Потребляемая мощность Размеры, 1 х V/ х Ь Вес

337,1 нм 20 - 400 Гц 2 не

50 мкДж 5%

25 кВт

15 мВт при 400 Гц

2 мм круглое сечение 2*109 имп.

3 мрад

150 Вт при 400 Гц 30x15x15 см

4 кг

При использовании в качестве активного элемента Ы2-лазера двухсекционной разрядной ячейки длиной 400 мм и внутренним диаметром 6 мм, и возбуждении от цепи магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, в

которой в качестве ключа использовался тиратрон

ТГИ 1000/25, мы получили энергию лазерной генерации 1 мДж при напряжении зарядки цепи 25 кВ. Длительность импульса генерации по полувысоте составила 4 не. Зависимости выходной энергии от давления газа и состава газовой

Рис. 3. Экспериментальные зависимости энергий смеси приведены на рис. 3.

в импульсе Кг-лазера с продольным _ _

с- Поскольку общая емкость цепи

односекционным разрядом от общего давления и 3 ц

10

™> т°рр

12 14 16 18

состава газовой смеси.

магнитного

составляет

2120 пФ, то запасенная в цепи энергия при напряжении питания 25 кВ составит 0,66 Дж, а общий КПД лазера 0,15%.

Нами проведены исследования кривых Пашена для азота для капилляров различного диаметра (Рис. 4), которые показали, что при уменьшении диаметра разрядной ячейки происходит существенный сдвиг точки Столетова вправо и увеличение минимального пробойного напряжения. Указанное обстоятельство позволяет существенно повысить давление газа при пробое в постоянном поле, при котором выполняется оптимальное отношение Е/р=150 В/см* мм рт. ст., необходимое для эффективного возбуждения лазерной генерации в азотном лазере, работающем на переходе С3Пи—>В3Пв второй положительной системы.

Проведенные эксперименты

показали, капилляре 120 мкм и

иЛ,кУ

что в стеклянном с диаметром канала длиной разрядного

10

І

■ 0,12 шш = 0,5 тт • 4,7 тт

ь,

/7

□□□п-Ъ □

Р*<1,1огг*ст

1

, уел Интенсивность ел 1.<И]

10

100

1000

промежутка 11=14,2 см при

давлении 6,5 мм рт. ст. величина

ипр/с1*р~150 В/см*мм рт. ст. В

интервале давлений 3-9 мм рт. ст.

при самопробое азота наблюдалась

сверхсветимость, а в присутствии , „

Рис. 4. Кривые Пашена для азота в ячейках резонатора— генерация на длине различного диаметра.

волны 337 нм. Мощность

генерации составляла 33 Вт при

длительности импульса т=3 не.

Рабочий объем газоразрядной ячейки

составлял 3 мм3, что соответствовало

удельному энергосъему - 33

мкДж/см3.

Нами разработан

перестраиваемый лазер на красителе

родамин 6 О с возбуждением

псевдопродольным способом

излучением компактного Ы2-лазера с

линией магнитного сжатия. При

Рис. 5. Перестроечные кривые лазера на энергии импульса накачки 18 мкДж Красителе

и длительности 2 не нами были

560 570

Длина волны излучения ЛК, нм

сняты перестроечные кривые лазера на красителе (Рис. 5). При использовании только одной 45° призмы в качестве дисперсионного элемента резонатора (кривая 1) были достигнуты следующие параметры лазерного излучения: на длине волны 565 нм максимальная энергия импульса 1,25 мкДж при эффективности преобразования 7%. Перестройка длины волны излучения осуществлялась в диапазоне 555 нм-580 нм. Ширина линии излучения составляла 0,38 нм в середине диапазона перестройки. Кривая 2 соответствует использованию одной призмы с углом 60°. При использовании двухпризменного расширителя (кривая 3) сократился диапазон перестройки до 557-575 нм, а ширина линии выходного излучения уменьшилась до 0,22 нм.

Лазерный спектрофлуориметр

Нами разработан автоматизированный лазерный спектрофлуориметр с оптико-волоконной доставкой излучения. Электронная функциональная блок-схема лазерного спектрофлуориметра для оптической биопсии представлена на рис. 6.

Рис. 6. Электронная функциональная блок-схема лазерного спектрофлуориметра

для оптической биопсии.

Спектрофлуориметр имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений. Возбуждение люминесценции осуществляется компактным импульсным газовым лазером на молекулярном азоте (Х=337 нм) с возбуждением от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели варьируется в пределах 0,3 - 20 нм. Частота измерений - 1000 Гц. При этом четные измерения используются для определения уровня фона, а нечетные - для определения суммарного сигнала «люминесценция + фон». Разработанное программное обеспечение позволяет без перекомпиляции реализовать любую методику (в пределах технических возможностей прибора) измерений спектров и кинетики флуоресценции за счет единого описания методики с помощью скрипта, а также алгоритм обработки полученных данных (на лету) за счет использования технологии OLE автоматизации в управлении табличным процессором Excel.

УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия при типовых патологических процессах Диагностика перитонита. На рис. 7 показаны нормированные на стандартное отклонение разностные спектры между группами здоровых и больных животных, иллюстрирующие выбор реперных длин волн. В таблице 1 приведены отношения интенсивностей флуоресценции на реперных длинах волн и значение достоверности различий по Т-тесту. Изменения наблюдаются во всех исследуемых тканях.

Рис. 7. Разностные спектры для брыжейки (А), кишечной стенки (Б) и париетальной брюшины (В) больных и здоровых животных.

Таблица 1.

Оценка информативности регистрации аутофлуоресценции тканей

брюшной полости для флуоресцентной диагностики перитонита

Характеристики Брыжейка Кишечная стенка Париетальная брюшина

Лпах> НМ 452 433 452

Лшщ НМ 473 473 471

3, отн. ед. Больные 1,09+0,01 0,99+0,02 1,07+0,01

Здоровые 1,05+0,01 0,88+0,01 1,02+0,01

Достоверность по Т-тесту,% 99,723 99,997 99,998

Исследование флуоресценции миокарда при острой ишемии. Усредненный спектр

флуоресценции миокарда имеет типичную для аутофлуоресценции живых тканей форму с максимумом на длине волны 470 нм, который соответствует максимуму флуоресценции

свободной формы НАД(Ф)Н. Анализ разностного спектра люминесценции миокарда по группам контроля и кардиоплегии, нормированного на суммарное значение дисперсии (Рис. 8), показывает достоверное различие в спектре люминесценции на длине волны 460 нм. При этом длины волн 440 и 480 нм могут быть использованы как реперные точки.

Спектр флуоресценции миокарда до наступления ишемии не мог быть снят с помощью

X (нм)

Рис. 8. Нормированный разностный спектр люминесценции миокарда экспериментальных животных по группам контроля и кардиоплегии.

Рис. 9. Средний спектр временной корреляции нормированной интенсивности люминесценции миокарда в периоде острой ишемии (20 мин).

контактного оптоволоконного датчика, так как миокард находился в постоянном сократительном движении. Поэтому поиск реперных точек спектра люминесценции осуществлялся с помощью среднего спектра временной корреляции по выборке (Рис. 9). Как видно из представленной диаграммы, наибольшие значения коэффициент корреляции принимает на длине волны 470 нм. Указанная длина волны соответствует максимуму люминесценции свободной формы НАД(Ф)Н. Следующая точка спектра корреляции, имеющая максимальное отрицательное значение, расположена на длине волны 430 нм, которая соответствует пику полосы Соре дезоксигемоглобина.

Для оценки динамики метаболических показателей (пул НАД(Ф)Н) и оценки роли гемопротеидов (пул НЬ и Mb), мы использовали усредненные к моменту времени t значения интенсивностей на длинах волн 470 и 430 нм, соответственно, а также отношение средних интенсивностей люминесценции на длинах воли 430 и 470 нм и назвали указанный метаболический показатель как «индекс жизнеспособности» или «viability index».

Средние нормированные

динамические кривые при ишемии миокарда в контрольной группе и группе с использованием кардиоплегии аппроксимировались двух-

экспоненциальной зависимостью.

Значения постоянной времени «медленной» экспоненты для группы экспериментальных животных

(кролики), представленные в таблице 2, иллюстрируют их существенный рост при использовании кардиоплегии. Постоянные времени «медленной» экспоненты, полученные на другой группе экспериментальных животных (крысы) приведенные в таблице 3, иллюстрируют возможность альтерации метаболических показателей путем введения в кардиоплегический раствор дополнительных ингредиентов. Так, дитионит натрия (NajSjC^) является сильным восстановителем и способен восстанавливать оксигемопротеиды, цитохромы и пиридиновые коферменты. Соответственно, можно ожидать усиления ишемических изменений в ткани миокарда при использовании этого соединения в кардиоплегическом растворе. Как видим из второй колонки приведенной таблицы, налицо выраженное сокращение соответствующих постоянных времени. В противоположность эффектам дитионита

Таблица 2.

Постоянные времени «медленной экспоненты» для метаболических показателей при острой ишемии миокарда

^контроль (с) ^плегия (с)

Индекс жизнеспособности 506±8 601±10

НЬ 577±11 682±14

НАД(Ф)Н 535±12 986±120

натрия, мы наблюдали увеличение постоянных времени при включении в состав кардиоплегического раствора моноксида углерода (СО).

Таблица 3.

Постоянные времени «медленной» экспоненты (с) для различных показателей ишемии при модификации состава кардиоплегического раствора

Плегический раствор Плегический раствор +Ыа28204 Плегический раствор+СО

НАД(Ф)Н 492±5 425±10 853±20

НЬ 486±6 430±10 650±5

Индекс жизнеспособности 465±5 406±10 654±6

Флуоресценция тканей головного мозга при ишемии и аноксии. В отличие от миокарда, для поиска реперных точек при исследовании головного мозга можно было воспользоваться спектрами флуоресценции тканей до наступления ишемии или аноксии. При анализе разностного спектра флуоресценции твердой мозговой

оболочки при аноксии (Рис. 10) мы отметили, что пик с длиной волны 430 нм соответствует пику полосы Соре дезоксигемоглобипа, а минимум 470 нм - максимуму люминесценции НАД(Ф)Н. На разностном спектре также наблюдается слабо выраженный минимум на длине волны 410 нм, соответствующей положению пика полосы Соре оксигемоглобина. При этом длина волны 450 нм может быть использована как реперная точка.

Кинетические изменения в спектре люминесценции, вызванные аноксией, анализировались с помощью отношения интенсивностей люминесценции Снь=14зс/145о, которое интерпретировалось как изменение относительного уровня

Рис. 10. Средний нормированный разностный спектр люминесценции твердой мозговой оболочки крыс при острой аноксии.

дезоксигемоглобина, и Сцад(Ф)][—I.; ^которое интерпретировалось как изменение относительного уровня НАД(Ф)Н. Кроме того, нами оценивалось отношение 1470/Т430» которое трактуется нами как индекс жизнеспособности ткани. Нами произведено сравнение кинетики для указанных параметров после усреднения соответствующих кинетических кривых по выборке животных, подвергшихся острой аноксии. Налицо достоверное различие в кинетических константах, отвечающих за изменение пула гемоглобина 1Нъ=185±42 с и пиридиновых нуклеотидов ^[дД(ф)Ц=1 14±12 с. Интересно, что изменения в системе НАД(Ф)Н проявляются раньше, чем в системе гемоглобина. Индекс жизнеспособности имеет постоянную времени 1нЪ0Л1АД(Ф)Ц=128±14 с близкую к 'илд(Ф)1ь- Мы показали, что индекс жизнеспособности и уровень НАД(Ф)Н имеют высокий уровень корреляции. Коэффициент корреляции между выборками значений относительного уровня НАД(Ф)Н ткани и индекса жизнеспособности не хуже 11=0.995.

Флуоресцентная диагностика стадий возрастной катаракты. По усредненным спектрам флуоресценции

хрусталиков здоровых людей и больных возрастной катарактой максимальной стадии зрелости был построен разностный спектр, нормированный на стандартное Рис. И. Нормированный разностный спектр

отклонение (Рис. 11). Были люминесценции хрусталиков глаза «здоровый -

катарактальныи»

выявлены 2 реперные точки с

длиной волны 400 нм и 500 нм, и одна точка с максимальной амплитудой отклонения на 440 нм. По значениям интенсивности люминесценции в трех реперных точках спектра 400, 440, 500 нм для пациентов с разным клиническим диагнозом (разная стадия заболевания) вычислялись значения индекса помутнения хрусталика а и стандартные отклонения. Значения индекса помутнения хрусталика для различных стадий развития возрастной катаракты представлены в таблице

4.Ошибка! Источник ссылки не найден.

Мим)

Таблица4.

Значения индекса помутнения хрусталика для различных стадий развития возрастной катаракты

N Название а (отн.ед.)

0 норма 0±0,069

3 факосклероз 0,52±0,075

4 начальная катаракта 0,6±0,1

5 незрелая катаракта 0,864±0,047

6 зрелая катаракта 1±0,16

При соответствующем представленном в таблице 4 выборе номера стадии возрастной катаракты получается весьма высокая корреляция между стадией развития и средним значением индекса помутнения хрусталика. При этом равномерный характер увеличения индекса помутнения хрусталика с увеличением стадии развития катаракты позволяет предложить использование равномерной шкалы для установления стадии развития катаракты по значению индекса помутнения. В этом случае номер стадии вычисляется по величине индекса помутнения в соответствии со следующей формулой:

N = гоипй\ ——— (,0,167 )

Исследование аутофлуоресценции роговицы Выбор реперных длин волн для оценки эффектов ношения контактных линз осуществлялся с помощью спектра корреляций со сроком ношения, построенного с помощью усредненных в трех выборках нормированных спектров люминесценции роговицы (Рис. 12). Из приведенной диаграммы видно, что наибольшие корреляции со сроком ношения контактных линз выполняются для длин волн 410 и 460 нм, причем значения на этих длинах волн имеют различные знаки. Нами было предложено использовать отношение интенсивностей люминесценции на указанных длинах волн для оценки срока ношения контактных линз. Нами были вычислены средние значения указанного соотношения по выборкам. Соответствующая диаграмма представлена на рис. 13. Достоверность различия с контрольным уровнем для различных сроков ношения контактных линз по Т-тесту составила для 5 лет Р=0,9873, для 10 лет РЮ.9988.

Рис. 12. Спектр корреляций люминесценции интенсивностей люминесценции роговицы роговицы глаза, построенный по трем глаза на длинах волн 410 нм и 460 нм от срокам ношения контактных линз. срока ношения контактных линз.

Изучение молекулярно-клеточных механизмов интенсивной импульсной лазерной радиации УФА и видимого диапазонов

Исследование активности Т-лимфоцитов при УФА лазерном облучении. Мы не зарегистрировали цитотоксического эффекта излучения в примененных нами условиях эксперимента. Мы обнаружили, что биологический эффект излучения азотного лазера в отношении иммунокомпетентных клеток in vitro реализуется в зависимости от исходного уровня экспрессии их специфических поверхностных молекул и количества клеток определенной субпопуляции (CD2, CD4, CD8), и может быть охарактеризован как иммуномодулирующий.

С учетом важной роли окислительно-восстановительных процессов в механизмах физиологической активации лейкоцитов (в т.ч. за счет активности НАДФН-оксидазы лейкоцитов, генерирующей активные формы кислорода), мы предположили, что существенный вклад в действие на иммунокомпетентные клетки может вносить прямое влияние излучения азотного лазера на ключевой флуорофор редокс-систем клеток - НАД(Ф)Н. Для проверки этой гипотезы мы оценили эффект излучения азотного лазера на клетки, в которых активность НАДФН-оксидазы и продукция активных форм кислорода носят наиболее выраженный и легко регистрируемый характер - полиморфноядерные лейкоциты периферической крови.

Исследование активности полгшорфноядерных лейкоцитов периферической крови при УФА лазерном облучении. Анализ параметров кривых хемшпоминесцентной реакции (XJIP) показал, что облучение образца крови излучением Ыз-лазера обеспечивало достоверное снижение уровня генерации активных форм кислорода (АФК) при высоких исходных его показателях. Это касалось таких локальных и интегральных параметров, как Imax (амплитуда кривой XJIP) и S (площадь под кривой XJTP), соответственно, без изменения временных характеристик кривой XJIP. При действии излучения Nz-лазера на образец крови с дефицитным типом функциональной активности, характеризовавшимся низким уровнем генерации АФК, отмечался достоверный эффект стимуляции. При этом достоверно увеличивался локальный параметр Imax. При уровне генерации АФК в пределах физиологической нормы облучение Nj лазером не приводило к изменению функциональной активности иммунокомпетентных клеток и, соответственно, параметров XJIP. Таким образом, нами показан иммуномодулирующий эффект излучения ^-лазера in vitro, который, вероятно, связан с влиянием на молекулу НАД(Ф)Н.

Исследование люминесценции макрофагов in vitro. С учетом полученных нами данных о НАД(Ф)Н-опосредованном иммуномодулирующем эффекте излучения азотного лазера, интересным представляется изучение возможности регистрации функциональной активности НАД(Ф)Н-оксидаза-экспрессирующих клеток с помощью лазер-индуцированной флуоресцентной спектроскопии (А=337 нм). Типичная кривая динамики флуоресценции перитонеальных макрофагов представлена на рис. 14. Исходная кривая зависимости интенсивности люминесценции культуры макрофагов на длине волны 420 нм, получаемая с помощью спектрофлуориметра, имеет форму серии импульсов различной амплитуды, что может быть интерпретировано как спонтанная активация отдельных групп клеток после помещения культуры в термостат. Обработка полученных данных осуществлялась по формуле:

5(г) = }/(/)Л

- Люминесценция

- Сглаженная

На основании этих данных строится интегральная кривая динамики флуоресценции S(t). В качестве количественной оценки функциональной активности макрофагов используется максимальная амплитуда интегральной кривой Smax=S(T) (отн. ед.) и время достижения полувысоты Smax/2 интегральной кривой Ti/2(ceK.).

Мы апробировали представленный метод оценки активности макрофагов для изучения функциональной активности перитонеальных макрофагов, выделенных из перитонеальной полости двух видов животных (кролики, крысы) с экспериментальной моделью __ перитонита. Полученные

О 5 10 15

Т(мин) результаты подтвердили

Рис. 14. Динамика флуоресценции макрофагов на перспективность использования

Х=420 нм при активации повышением предлагаемого способа для оценки температуры in vitro.

функциональной активности

макрофагов.

Клеточные гемопротеиды как мишени действия лазерного излучения в модельных системах. Экспериментально мы установили, что значимое влияние на

-Д-ярет

параметры аутофлуоресценции биологических объектов оказывают гемопротеиды ткани и крови, что, с одной стороны, позволяет оценить состояние клеточного метаболизма и косвенно судить о перфузии/оксигенации ткани, но, с другой стороны, может существенно затруднять интерпретацию данных, полученных при проведении оптической биопсии с использованием УФА лазерного излучения. В связи с этим, задачей следующего этапа работы стало изучение поведения гемопротеидов клеток тканей и периферической крови в модельных системах при облучении интенсивным лазерным излучением. Излучение второй гармоники Nd'.YAG-лазера с длиной волны 532 нм может индуцировать фотодиссоциацию лиганда в гемопротеидах.

Исследование фотодиссоциации гемопротеидов при действии лазерного излучения. Для изучения лазер-индуцированной фотодиссоциации в молекулах гемопротеидов мы использовали модельную систему in vitro, состоящую из раствора карбоксигемоглобина или цельной крови, насыщенной угарным газом, и источника импульсного лазерного излучения. Наши исследования подтвердили факт фотодиссоциации карбоксигемоглобина при воздействии импульсно-периодического лазерного излучения (режим flash-фотолиза) с длиной волны 532

нм, которая имеет обратимый

~■ Data . ,

— ньсо dissociation model характер. Модуляция исходного

уровня карбоксигемоглобина в

0 550« 0 2232 -g \

j г \ буферном растворе изменяет

/ \ характеристики реакции

/ \ фотодиссоциации. Установлено,

/ \ что наибольшей амплитуды она

/ I достигает при исходном

I/ содержании в растворе ~50%

I карбоксигемоглобина. Нами

—|---1---1---1---- предложена модель, описывающая

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

Y^foTH ед.) указанную зависимость, которая

Рис. 15. Зависимость амплитуды модуляции базируется на кооперативном сигнала зондирующего излучения при связывании лиганда

фотодиссоциации от исходной степени

насыщения карбоксигемоглобина. гемопротеидом. Экспери-

ментальные точки и модельная кривая приведены на рис. 15.

Сканирование спектров пропускания растворов гемолизата и цельной крови по длинам волн во время облучения фотолизирующим облучением показало, что

информативными в плане наличия изменения оптической плотности являются следующие длины волн: 540 нм, 570 нм, 555 нм и 435 нм. Эти длины волн соответствуют наибольшим изменениям оптической плотности в спектрах поглощения растворов крови. Исследование зависимости амплитуды изменения сигнала зондирующего излучения в районе полосы Соре дезоксиформы Hb от длины волны зондирующего излучения при степенях насыщения HbCO Y=0,53 и 0,74 обнаружило достоверный батохромный сдвиг при увеличении степени насыщения карбоксигемоглобина относительно пика полосы Соре дезоксигемоглобина >.==430 нм. Максимумы изменения сигнала при фотодиссоциации для указанных степеней насыщения приходятся на длины волн 436 и 438 нм, соответственно. Мы исследовали изменение отклика интенсивности сигнала зондирующего излучения при фотодиссоциации на значимых длинах волн 540 нм, 570 нм, 555 нм и 435 нм, при вариации степени насыщения в пределах Y=0,4 - 0,75. Выявлено, что длина волны 435 нм и начальная концентрация НЬСО, равная 50%, являются оптимальными параметрами для фиксирования диссоциации НЬСО и ассоциации DoxHb в буферном растворе гемолизированной крови.

Зависимость эффективности фотодиссоциации НЬСО в буферных растворах цельной человеческой крови от длины волны фотолизирующего излучения в области 550 — 585 нм (Рис. 16.) построена с помощью значений изменений пропускания растворов с разной степенью насыщения НЬСО в зависимости от длины волны фотолизирующего излучения с помощью нормировки на коэффициент поглощения

растворов в данной области, а также на относительный спектр мощности генерации лазера на красителе. Обнаружен максимум эффективности реакции, который соответствует пику а-полосы спектра поглощения НЬСО.

555 560 565 570 575 560 585 Длина волны, нм

Зависимость относительной

РИС. 16.

эффективности фотодиссоциации комплекса НЬСО в буферном растворе человеческой крови от длины волны фотолизирующего излучения.

выводы

1) Разработаны эффективные источники лазерного излучения для задач лазер-индуцированной флуоресцентной спектроскопии живых клеток и тканей:

а) малогабаритный отпаянный лазер на молекулярном азоте (Х=337 нм) с возбуждением продольным разрядом от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, обеспечивающий энергию генерации 50 мкДж, при частоте следования 400 Гц и ресурс работы 2*109имп;

б) лазер на молекулярном азоте (Х=337 нм) с возбуждением продольным разрядом от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, с энергией генерации 1 мДж;

в) волноводный лазер на молекулярном азоте (Я.=337 нм) с возбуждением продольным разрядом без коммутатора на явлении самопробоя в ячейке диаметром 120 мкм, обеспечивающий выходную импульную мощность 33 Вт;

г) перестраиваемый лазер на красителе R6G с накачкой компактным Ы2-лазером с линией магнитного сжатия, обеспечивающий перестройку в диапазоне 555 нм - 580 нм с шириной линии выходного излучения 0,38 нм и максимальной энергией ипульса 1,25 мкДж.

2) Создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений. Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм. Частота измерений 1000 с"1. Разработанное программное обеспечение позволяет без перекомпиляции реализовать любую методику (в пределах технических возможностей прибора) измерений спектров и кинетики флуоресценции за счет единого описания методики с помощью скрипта, а также алгоритм обработки полученных данных (на лету) за счет использования технологии OLE автоматизации в управлении табличным процессором Excel.

3) Разработаны физико-технические основы применения УФА лазерного излучения для диагностики типовых патологических процессов методом лазер-инцуцированной флуоресцентной спектроскопии:

а) воспаление — диагностика перитонита;

б) ишемия - контроль острой ишемии миокарда и головного мозга;

в) дегенеративные изменения - диагностика патологии хрусталика при различных стадиях возрастной катаракты, диагностика патологии роговицы при длительном ношении контактных линз.

4) Подтверждена ключевая роль основного тканевого флуорофора НАДФН в изменениях спектров флуоресценции живых тканей при типовых патологических процессах, связанная с изменением баланса восстановленной и окисленных форм. Выявлена ключевая роль гемопротеидов (гемоглобина, миоглобина) как тканевых хромофоров в изменениях спектра флуоресценции живых тканей при таких патологических процессах, как воспаление и ишемия, связанная с изменением баланса окси- и дезоксиформ. Показано in vitro, что изменения спектра поглощения гемопротеида - карбоксигемоглобина - в поле интенсивного лазерного излучения связаны с фотодиссоциацией. Выявлено, что наибольшие изменения в спектре поглощения происходят в области полосы Соре. Обнаружен спектральный максимум фотодиссоциации карбоксигемоглобина на длине волны А,=570 нм.

5) Показано in vitro, что при облучении клеточных суспензий лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов импульсным излучением с длиной волны Х=ЪЪ1 нм при интенсивностях и дозах, соответствующих экспериментам с использованием прототипа лазерного спектрофлуориметра и зонда для одноточечных измерений, токсическое действие излучения на иммунокомпетентные клетки человека отсутствует, но наблюдается модулирующий эффект в отношении их функциональной активности. Показано, что активация макрофагов сопровождается усилением их собственной флуоресценции при возбуждении УФ излучением Я=340 нм, связанная с активацией НАДФН-оксидазы при дыхательном взрыве.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Patrin V.V., Provorov A.S., Salmin V.V. Pulsed dye laser pumped by N2 waveguide laser // First Russian-Chinese Seminar On Laser Physics And Laser Technology / Krasnoyarsk Scientific Centre, 1993. - P. 90-92.

2. Patrin V.V., Provorov A.S., Salmin V.V. Dye laser pumped by a waveguide N2 laser // Quantum Electronics. - 1994. - N 10: Vol. 24. - P. 857-858.

3. Pukhova 1.1., Salmin V.V. The effect of N2-laser radiation on the kinetics of the generation of active forms of oxygen by the granulocytic-macrophagal cells in a whole-blood system // Radiatsionnaia biologiia, radioecologiia / Rossiiskaia akademiia nauk -1995. - N 2: Vol. 35. - P. 286-291.

4. Pukhova Y.I., Provorov A.S., Salmin V.V. Immunomodulation action of ultraviolet Nj-laser radiation // 5th International Conference on Laser

Applications in Life Sciences / Proceedings of SPIE, 1995. - Vol. 2370. - P. 531540.

5. Ставицкая Е.Ю., Салмин B.B., Суворова E.B., Проворов А.С., Иванов В.В. Патогенетическое обоснование применения новых фотофизических и химических методов коррекции гомеостаза при острых отравлениях угарным газом // Гомеостаз и окружающая среда: VIII Всероссийский симпозиум (с международным участием) / КНЦ СО РАН, 1997. - С. 112-116.

6. Ставицкая Е.Ю., Егорова А.Б., Салмин В.В., Тимофеев Д.А., Иванов В.В. Клеточно-молекулярные механизмы реконструкции функциональной активности гемоглобина при острых отравлениях СО лазерным излучением и раствором гипохлорита натрия // «Реконструкция гомеостаза» / СО РАН, 1998. - С. 64-67.

7. Provorov A.S., Salmin V.V., Kozhevnikova Т.А., Kozhevnikov V.N. Clinical immunology aspects of laser influence // 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology. / TSU, 2000. - P. 230-232.

8. Provorov A.S., Salmin V.V., Stavickaya E.Y., Egorova A.B. Laser detoxication of sharp poisonings with carbon monoxide // 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology. / TSU, 2000. - P. 191-194.

9. Provorov A.S., Kozhevnikova T.A., Salmin V.V. Effects of N2 laser radiation on the immune system cells of patients with chronic bronchitis // Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II. / Proceedings of SPIE, 2001. - Vol. 4241. - P. 507-515.

10. Provorov A.S., Kozhevnikova T.A., Salmin V.V. Influence of UV Laser Radiation on the Main Subpopulations of the T-Lymphocytes // Laser Physics. - 2001. - N 11: Vol. 11. - P. 1212-1216.

11. Provorov A.S., Salmin V.V., Stavitskaya E.Y., Egorova A.B. Laser detoxication of acute poisonings with carbon monoxide // ICONO 2001: Novel Trends in Nonlinear Laser Spectroscopy and Optical Diagnostics and Lasers in Chemistry, Biophysics, and Biomedicine. / Proceedings of SPIE, 2002. - Vol. 4749. - P. 245248.

12. Kuzmin V.V., Salmin V.V., Salmina A.B., Provorov A.S. Study of carboxyhemoglobin photodissociation with laser flash-photolysis // Saratov Fall Meeting 2003: Optical Technologies in Biophysics and Medicine V / Proceedings of SPIE, 2004. - Vol. 5474. - P. 88-95.

13. Popov A.Y., Salmin V.V., Fursov A.A., Stepanenko A.V., Sokolovich A.G., Salmina A.B., Rebenkova A.A., Makarov R.A., Provorov A.S. Automated Laser

Spectrofluorimeter for Medical Applications // The 7-th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies. The Conference on Lasers and Laser Technologies for Students and Young Investigators. / Tomsk State University, Press,, 2004. - P. 214-216.

14. Salmin V.V., Nekrasov A.A., Provorov A.S. Waveguide pulsed gas lasers // Atomic and Molecular Pulsed Lasers V. / Proceedings of SPIE, 2004. - Vol. 5483.

- P. 67-74.

15. Salmin V.V., Provorov A.S. UV Pulsed Gas Lasers with Longitudinal Discharge and Their Application in Medicine // The 7-th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies. The Conference on Lasers and Laser Technologies for Students and Young Investigators. / Tomsk State University, Press,, 2004. - P. 90-92.

16. Попов А.Ю., Салмин B.B., Салмина А.Б., Фурсов А.А., Степаненко А.В., Соколович А.Г., Макаров Р.А., Ребенкова А.А., Проворов А.С. Спектрофлуориметрический метод оценки ишемии миокарда // Вестник КрасГУ. Серия физ.-мат. науки. - 2005. - №4. - С. 89-92.

17. Салмин В.В. Устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса: пат. 2265952. - Российская Федерация, опубл. 10.12.05, Бюл. № 34,

2005.

18. Салмин В.В., Проворов А.С. Азотные лазеры с продольным разрядом для масс-спектрометрии // Масс-спектрометрия. - 2005. - № 1: том 2. - С. 51 -56.

19. Салмин В.В., Проворов А.С. Компактный импульсный газовый лазер и устройство магнитного сжатия импульса для его возбуждения: пат. 2254650.

- Российская Федерация, опубл. 20.06.05 Бюл. № 17, 2005.

20. Provorov A.S., Salmin V.V., Salmina А.В., Fursov A.A., Stepanenko A.V., Sokolovich A.G., Lazarenko V.I., Rebenkova A.A., Popov A.Y., Testov A.A., Trusova E.Y., Mikhutkina S.V., Lopatina O.L., Olovyannikova R.Y. Pulsed Gas Lasers with Longitudinal Discharge and Their Application in Medicine // Laser Physics. - 2005. - N 9: Vol. 15. - P. 1299-1302.

21. Кузьмин B.B., Салмин В.В., Салмина А.Б., А.С. П. Изучение зависимости эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина от длины волны фотолизирующего излучения // Вестник КрасГУ. Серия физ.-мат. науки. -

2006. - №7. - С. 63-67.

22. Салмин В.В., Ребенкова А.А., Попов А.Ю., Салмина А.Б., Степаненко А.В., Соколович А.Г., Проворов А.С. Спектрофлуориметрический метод

диагностики перитонита // Вестник КрасГУ. Серия физ.-мат. науки. - 2006. -№9. - С. 43-47.

23.Popov A.Y., Salmin V.V., Fursov A.A., Stepanenko A.V., Sokolovich A.G., Salmina A.B., Rebenkova A.A., Makarov R.A., Provorov A.S. Automated laser spectrofluorimeter for monitoring of myocardial metabolism // International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2005: Laser Technologies for Environmental Monitoring and Ecological Applications, and Laser Technologies for Medicine. / Proceedings of SPIE, 2006. - Vol. 6284. - P. 62840J.

24. Малиновская H.A., Салмина A.B., Карачева A.A., Салмин В.В., Лопатина O.JI., Соколович А.Г., Степаненко A.B., Перьянова О.В., Зыкова Л.Д. Роль НАД+ гликогидролазы в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей при перитоните // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - №5. - С. 30-32.

25. Малиновская H.A., Салмина А.Б., Карачева A.A., Соколович A.A., Степаненко A.B., Лопатина О.Л., Салмин В.В., Перьянова О.В., Реушева Н.В., Попова H.H. Роль CD3 8 -ассоциированных сигнальных внутриклеточных механизмов в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов при перитоните // Сибирское медицинское обозрение -2007. - №2. - С. 39-43.

26.0скирко С.А., Лазаренко В.И., Салмин В.В., Салмина А.Б., Проворов A.C., Владимирова Е.С., Фокина Д.С. Способ диагностики возрастной катаракты: пат. 2326582. - Российская Федерация, опубл. 20.06.08 , Бюл. № 17, 2007.

27,Оскирко С.А., Салмин В.В., Лазаренко В.И., Проворов A.C., Владимирова Е.С., Фокина Д.С., Салмина А.Б. О роли пиридиновых нуклеотидов в диагностике катаракты // Сибирское медицинское обозрение -2007. - №3. -С. 33-36.

28. Салмин В.В., Лазаренко В.И., Проворов A.C., Оскирко С.А., Салмина А.Б., Владимирова Е.С., Фокина Д.С. Устройство регистрации флуоресценции хрусталика (in vivo): пат. 2338454. - Российская Федерация, опубл. 20.11.08 , Бюл. № 32, 2007.

29. Салмин В.В., Салмина А.Б., Лазаренко В.И., Проворов A.C., Оскирко С.А., Владимирова Е.С., Фокина Д.С. Лазерно-флуоресцентная диагностика стадий возрастной катаракты // Сибирский медицинский журнал -2007. -№6.-С. 9-11.

30. Kuzmin V.V., Salmin V.V., Salmina A.B., Provorov A.S. HbCO photodissociation at the photolysing radiation wavelength range 550 - 585 nm // International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine. / Proceedings of SPIE, 2007. - Vol. 6734. - P. 67341T.

31. Salmin V.V., Provorov A.S., Lazarenko V.I., Salmina А.В., Oskirko S.A., Fokina D.S., Vladimirova E.S. Laser fluorescent method for differential diagnostics of cataract // International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine. / Proceedings of SPIE, 2007. - Vol. 6734. - P. 67341S.

32. Kuz'min V.V., Salmin V.V., Salmina A.B., Provorov A.S. Study of photodissociation parameters of carboxyhemoglobin // Quantum Electronics. -2008. - N 7: Vol. 38. - P. 695-701.

33.Malinovskaya N.A., Salmina A.B., Karacheva A.A., Salmin V.V., Uspenskaya Y.A., Lopatina O.L., Sokolovich A.G., Stepanenko A.V., Peryanova O.V., Zykova L.D. The role of P2X7 receptors in modulation of the functional activity of peritoneal macrophages in mice with model peritonitis // Eksperimental'naya i Klinicheskaya Farmakologiya. - 2008. - N 3: Vol. 71. - P. 49-53.

34. Салмин B.B., Салмина А.Б., Фурсов A.A., Фролова О.В., Лалетин Д.И., Фурсов М.А., Юдин Г.В., Малиновская Н.А., Зыкова Л.Д., Проворов А.С. Использование флуоресцентной спектроскопии для оценки ишемического повреждения миокарда // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. - 2011. - N 2: т 2. - с 142-157.

35. Салмина А.Б., Салмин В.В., Фролова О.В., Лалетин Д.И., Фурсов М.А., Скомороха Д.П., Фурсов А.А., Кондратов М.А., Медведева Н.Н., Малиновская Н.А., Манторова Н.С. Лазер-индуцированная аутофлуоресценция для оценки метаболизма и гемодинамики головного мозга. // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2011. - N 3: т 5.-с 32-39.

36. Vladimirova E.S., Salmin V.V., Salmina А.В., Oskirko S.A., Lazarenko V.I., Provorov A.S. Fluorescence diagnostics of human lens status in vivo // Journal Of Applied Spectroscopy. - 2012. - N 1: V 79. - p 135-139.

Подписано в печать 17.05.2012. Печать плоская. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 2,8. Тираж 100 экз. Заказ 7932

Отпечатано полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а Тел./факс: 8(391)206-26-58, 206-26-49 E-mail: print_sfu@mail.ru; http://lib.sfu-kras.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клеточная люминесценция как индикатор метаболизма. Эндогенные флуорофоры и хромофоры.

1.1.1 Триптофан, тирозин и фенилаланин.

1.1.2 Коллаген и эластин.

1.1.3 Пиридиновые нуклеотиды и флавопротеиды.

1.1.4 Эндогенные порфирины.

1.1.5 Витамины.

1.2. Использование флуоресцентной спектроскопии in situ в клинической диагностике - флуоресцентная биопсия.

1.2.1. Гастроэнтерология.

1.2.2. Офтальмология.

1.2.3. Диагностика атеросклеротических бляшек.

1.2.4. Диагностика онкопатологии.

1.2.5. Диагностика ишемии миокарда.

1.2.6. Мониторинг состояния головного мозга.

1.3. Аппаратура для флуоресцентной биопсии.

1.3.1. Оптоволоконные зонды.

1.3.2. Лазеры.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Лазерный стенд.

2.1.1. Вакуумная система.

2.1.2. Источники высокого напряжения.

2.1.3. Генераторы наносекундных импульсов высокого напряжения.

2.1.4. Система регистрации лазерного излучения

2.2. Разработка методик медицинской диагностики для лазерного спектрофлуориметра.

2.3.1 Использование лазерного спектрофлуориметра для проведения доклинических исследований.

Флуоресценция тканей брюшной полости при перитоните.

Флуоресценция миокарда при острой ишемии.

Флуоресценция тканей головного мозга.

2.3.2 Использование лазерного спектрофлуориметра для проведения клинических исследований.

Исследование катаракты.

Исследование роговицы.

2.3.3 Алгоритмы обработки данных измерений лазерным спектрофлуориметром.

2.3. Исследование молекулярных мишеней действия лазерного излучения в биологических комплексах.

2.3.1 Исследование пиридиновых нуклеотидов.

Иммунологические эффекты лазерной радиации.

Влияние лазерной радиации на генерацию АФК клетками системы иммуногенеза.

Флуоресценция макрофагов in vitro.

2.3.2 Исследование гемопротеидов.

Исследование лазерной фотодиссоциации карбоксигемоглобина.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Наносекундный генератор мощных импульсов напряжения.

3.3.1. Цепь магнитного сжатия и умножения напряжения импульса.

3.3.2. Высоковольтный генератор наносекундных импульсов.

3.2. Лазерные источники.

3.2.1. Компактный импульсный газовый лазер и устройство магнитного сжатия импульса для его возбуждения.

3.2.2. Азотный лазер с продольным разрядом, возбуждаемый схемой магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, с выходной энергией 1 мДж.

3.2.3. Самопробойный волноводный азотный лазер.

3.2.4. Перестраиваемый лазер на красителе с накачкой компактным ^-лазером с линией магнитного сжатия.

3.3. Лазерный спектрофлуориметр для оптической биопсии.

3.3.1. Общая компоновка и функционирование.

Оптическое волокно, датчики и зонды.

Система регистрации.

Блок питания.

3.3.2. Программное обеспечение лазерного спектрофлуориметра.

3.4. Исследование флуоресценции тканей брюшной полости при перитоните.

3.5. Исследование флуоресценции миокарда при острой ишемии.

3.5.1 Исследование влияния кардиоплегии на динамику острой ишемии миокарда.

3.5.2 Влияние восстановительного потенциала кардиоплегического раствора на динамику метаболических показателей миокарда.

3.6. Флуоресценция тканей головного мозга при ишемии и аноксии

3.7. Флуоресцентная диагностика стадий возрастной катаракты.

3.8. Исследование аутофлуоресценции роговицы.

3.9. Исследование активности Т-лимфоцитов при УФА лазерном облучении.

3.10. Исследование активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови при УФА лазерном облучении.

3.11. Исследование флуоресценции макрофагов in vitro.

3.12. Клеточные гемопротеиды как мишени действия лазерного излучения в модельных системах.

3.13. Исследование фотодиссоциации гемопротеидов при действии лазерного излучения.

3.13.1. Раствор гемоглобина.

3.13.2. Цельная кровь.

3.13.3. Спектр фотодиссоциации карбоксигемоглобина.

ВЫВОДЫ.

В современной медицинской диагностике широкое распространение получили оптические методы исследования живых тканей in situ, получившие название «оптическая биопсия» (Optical Biopsy) (Bigio, 2003, Popp, 2006). Применение оптической биопсии, в отличие от обычной биопсии, предполагает, что ткань не извлекается и не модифицируется тем или иным способом (например, для гистологического исследования), а используется та или иная форма оптических измерений, часто спектроскопических, выполняемых неинвазивно или минимально инвазивно с целью поставить диагноз, на месте, in vivo и в режиме реального времени. В оптической биопсии используются как оптическая спектроскопия -абсорбционная, флуоресцентная, спектроскопия комбинационного рассеяния света ( Приезжев, 1989, Тучин, 2010, Li, 2004, Li, 2006, Mahadevan-Jansen, 1996, Mahadevan-Jansen, 1997, Mahadevan-Jansen, 1998a, Mahadevan-Jansen, 1998b, Mahadevan, 1995, Majumder, 2008, Utzinger, 2001, Yazdi, 1999), так и методы медицинской оптической визуализации - оптическая когерентная томография (Brezinski, 1996), конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоцитоскопия (Newton, 2011). Основное преимущество использования оптической биопсии по сравнению с другими способами прижизненного исследования органов и тканей заключается в высокой скорости проведения анализа. Зачастую результат может быть получен в режиме реального времени, а также имеется возможность исследования быстропротекающих процессов в пикосекундном и фемтосекундном интервале длительностей. Вторым достоинством является возможность исследований с высоким пространственным разрешением. Размер анализируемой зоны в сочетании с конфокальной сканирующей микроскопией (Gu, 1996, Wahl, 2004, Wilson, 1989а, Wilson, 1989b, Wilson, 1999) может быть по порядку величины сравним с длиной волны оптического диапазона, а со сканирующей микроскопией ближнего поля (Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM/SNOM)) (Kumar, 2006) - значительно меньше. Наконец, уникальным свойством оптической биопсии по сравнению с другими средствами медицинской визуализации является возможность прямого исследования метаболических превращений в клетках живых тканей (Adachi, 1999, Vishwasrao, 2005).

Среди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. Во-первых, этот метод обладает наивысшей чувствительностью. В отдельных случаях удается детектировать единичные атомы или молекулы в анализируемой зоне (Brau, 2006, Cannone, 2003, Johnson, 2005, Peleg, 1999, Wahl, 2004, Weiss, 1999). Во-вторых, параметры люминесценции весьма чувствительны к состоянию микроокружения флуоресцирующего агента (флуорофора), что позволяет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружения, включая полярность и жесткость среды, наличие поблизости зарядов и молекул - акцепторов энергии электронного возбуждения (Lakowicz, 2006). Флуоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров -аутофлуоресценции (Monici, 2005); 2) методы, использующие различные флуоресцирующие соединения - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань для визуализации исследуемых процессов (Michalet, 2005).

В настоящее время накоплен обширный материал по использованию флуоресцентных зондов в исследовании клеток, клеточных мембран и липопротеинов (Владимиров, 1980, Добрецов, 1989). Имеется также обширный арсенал методов, основанных на использовании меченых флуорофором соединений - иммуногистохимические (Renshaw, 2007) и иммуноцитохимические протоколы (Polak, 1997). Для перечисленных методов разработано и продолжает разрабатываться огромное количество соединений, однако большей частью применение этих соединений для прижизненной диагностики не представляется возможным либо вследствие их высокой токсичности, либо неустойчивости соединений в метаболически активной ткани. Еще одним недостатком использования флуоресцентно меченых соединений является то, что наличие флуоресцентной метки значительно отличает соединение от исходного по своим биохимическим, транспортным и конформационным свойствам. В этом контексте методы, использующие меченые радиоактивными атомами соединения, являются более точными.

Использование собственной флуоресценции для прижизненной диагностики тканей является наиболее привлекательным, поскольку практически не меняются условия протекания в них основных биохимических процессов. Собственная флуоресценция тканей исследуется достаточно давно. Накоплен значительный экспериментальный клинический материал по использованию этого метода в диагностических целях в различных областях медицины - гастроэнтерологии (Лисовский, 1984, Beuthan, 1996, Cothren, 1990, Lin, 2003), онкологии (Alfano, 1984, Loschenov, 1992a, Loschenov, 1994), гинекологии (Agrawal, 1999, Belyaeva, 2003, Zuev, 2001), офтальмологии (Docchio, 1989), стоматологии (Amaechi, 2002, Matsumoto, 2000, Qin, 2007, Sinyaeva, 2004), дерматологии ( Синичкин, 2001, Синичкин, 2007). Определены основные тканевые флуорофоры, разработаны различные прототипы установок для клинического использования (Loschenov, 1998, Meerovich, 1995, Meerovich, 1996, Rogatkin, 2009), предложено большое количество методик изучения типовых патологических процессов (ишемия, воспаление, неоплазия, дегенеративные изменения).

Однако, несмотря на обширный накопленный экспериментальный опыт, широкого распространения этот подход в медицинской диагностической практике до сих пор не получил. Связано это с рядом причин. Во-первых, необходимо решить вопросы стандартизации методик исследований. Сказанное в полной мере относится и ко вновь разрабатываемым методикам. Во-вторых, требуют дополнительного исследования вопросы побочных эффектов УФ лазерного излучения на живые биологические ткани. Третьей причиной является проблема выбора лазерного источника для возбуждения аутофлуоресценции. Длительное время для УФ возбуждения аутофлуоресценции живых тканей использовался импульсный УФ лазер на молекулярном азоте (^=337,1 нм). Выбор именно этого лазера для возбуждения аутофлуоресценции тканей основан на том, что основной тканевый флуорофор - НАД(Ф)Н - имеет один из максимумов поглощения на длине волны 340 нм. Однако азотные лазеры имеют целый ряд недостатков, ограничивающих как точность исследований, так и потребительские свойства разработанных установок.

Среди основных потребительских характеристик лазеров для оптической биопсии можно назвать малогабаритность, надежность, стабильность, большой ресурс работы и невысокую стоимость. Если важность перечисленных параметров лазеров для оптической биопсии достаточно очевидна, то такие параметры, как высокая импульсная мощность и высокая частота повторения импульсов генерации требуют пояснения. Флуоресцентный метод оптической биопсии зачастую используется в условиях значительного фонового освещения, поэтому для получения приемлемого отношения «полезный сигнал/фон» необходимо использовать метод синхронного детектирования с модуляцией источника возбуждения и высокую интенсивность возбуждающего излучения. Указанные параметры наиболее просто реализовать путем применения импульсно-периодических лазеров. При этом точность измерений будет зависеть от количества измерений сигнала флуоресценции. Очевидно, что время проведения анализа будет иметь обратную зависимость от частоты повторения импульсов. Немаловажную роль имеет также качество лазерного пучка, поскольку системы доставки излучения до объекта исследования используют оптиковолоконную технику и требуют тщательного согласования лазерного пучка с оптическим волокном.

Цель работы. Разработка физических основ применения новых эффективных источников УФ лазерного излучения для лазериндуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии биологических тканей в медицинской диагностике.

Задачи работы

1. Поиск новых эффективных методов возбуждения импульсных газовых лазеров и лазеров на красителях. Изучение физических процессов в азотных лазерах и разработка эффективных источников УФ лазерного излучения на их основе.

2. Разработка физических основ методов лазерной УФ-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для задач медицинской диагностики.

3. Исследование фотофизических процессов и фотобиологических эффектов при воздействии интенсивного лазерного излучения на основные эндогенные хромофорсодержащие молекулы.

Научная новизна

1. Впервые показана высокая эффективность возбуждения азотного лазера (337,1 нм) с продольным разрядом от генератора наносекундных импульсов с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса (КПД=0,15 %, Е=1 мДж).

2. Впервые получена генерация в волноводном азотном лазере (337,1 нм) в режиме самопробоя от источника постоянного напряжения.

3. Впервые получена генерация на лазере на красителе родамин 6G при возбуждении волноводным азотным лазером, а также перестраиваемая генерация (555-580 нм) лазера на красителе родамин 6G при возбуждении азотным лазером с магнитным сжатием импульса возбуждения.

4. Впервые показано, что аутофлуоресценция органов брюшной полости (in vivo), индуцированная излучением азотного лазера (337 нм), имеет достоверно отличающиеся спектры при воспалении (перитонит).

5. Впервые показано, что при аутофлуоресценции миокарда (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), динамика флуоресценции в течение 20 мин периода острой ишемии на длинах волн

430 и 470 нм имеет монотонный характер, и достоверно отличаются как динамика флуоресценции, так и спектры флуоресценции миокарда, подвергавшегося и не подвергавшегося кардиоплегической защите. Постоянные времени динамики флуоресценции претерпевают значимые изменения при использовании в кардиоплегическом растворе модификаторов гемопротеидов.

6. Впервые показано, что при аутофлуоресценции твердой мозговой оболочки (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), спектры флуоресценции до и во время острой ишемии мозга значимо отличаются. Наибольшие отличия в нормированных спектрах флуоресценции наблюдаются на длинах волн 430 и 470 нм.

7. Впервые показано, что при аутофлуоресценции хрусталика человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), наибольшее отличие в нормированных спектрах здоровых и пораженных возрастной катарактой хрусталиков наблюдается на длине волны 440 нм, а на длинах волн 400 и 500 нм амплитуды нормированных спектров не отличаются.

8. С использованием разработанного спектрального критерия - индекса помутнения хрусталика - впервые показано, что индекс помутнения линейно зависит от стадии развития катаракты. Впервые предложена диагностическая формула расчета стадии развития катаракты на основании измерения индекса помутнения.

9. Впервые показано, что при аутофлуоресценции роговицы человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), отношение интенсивностей флуоресценции на длинах волн 410 и 460 нм линейно возрастает с увеличением срока ношения контактных линз. Впервые продемонстрированы достоверные отличия указанного отношения при сроках ношения контактных линз 5 и 10 лет.

10.Впервые показан иммуномодулирующий эффект высокоинтенсивного (I=0,5-j-5 МВт/см2) излучения азотного лазера (337 нм) в отношении иммунокомпетентных клеток.

И.Впервые показано, что при активации макрофагов усиливается их аутофлуоресценция в области 440±10 нм при возбуждении излучением с длиной волны 340±10 нм.

12.Впервые показано, что зависимость эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина от степени насыщения, имеющая максимум в области 50% насыщения, формируется за счет кооперативного характера связывания лиганда (СО) с гемоглобином.

13. Впервые определен спектр эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина в области 550-585 нм при лазерном флеш-фотололизе в цельной крови человека.

1. Разработано устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. По разработанной схеме создан высоковольтный генератор наносекундных импульсов со следующими параметрами:

Энергия в импульсе 0,5 Дж

Амплитуда напряжения выходного импульса 150 кВ

Длительность фронта импульса напряжения 5 не

Частота следования импульсов 1000 Гц

Генератор может быть использован для питания импульсных частотных нагрузок, импульсных газовых лазеров, ускорителей частиц, клистронов, магнетронов высоковольтными наносекундными импульсами с высокой частотой повторения.

2. Разработан эффективный компактный азотный лазер с устройством

Практическая значимость работы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса накачки. Лазер имеет следующие характеристики:

Длина волны Частота повторения

337,1 нм 20 - 500 Гц

Длительность импульса на полувысоте 2 не

Энергия импульса Энергетическая нестабильность Импульсная мощность Средняя мощность

25 кВт

15 мВт при 400 Гц

50 мкДж 5%

Диаметр пучка Ресурс работы Расходимость пучка Потребляемая мощность

2 мм круглое сечение 1.2*109 имп.

3 мрад

150 Вт при 400 Гц

Размеры

30 х 15 х 15 см

Лазер предназначен для использования в следующих областях: флуоресцентная спектроскопия с высоким временным разрешением, экологический мониторинг водоемов и почвы, медицина, оптическая биопсия, лазерная масс-спектрометрия, квантовая электроника.

3. С использованием малогабаритного азотного лазера с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса накачки создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений.

Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм. Частота измерений 1000 с"1.

4. Разработаны и протестированы оригинальные спектрофлуориметрические методики оценки состояния тканей (in vivo):

• брюшной полости при перитоните;

•миокарда при ишемии в условиях кардиопротекции;

•головного мозга при аноксии и ишемии;

•хрусталика при различных стадиях развития возрастной катаракты;

•роговицы при дегенеративных изменениях, связанных с длительным ношением контактных линз.

Положения, выносимые на защиту

1. Схема магнитного сжатия и умножения напряжения импульса позволяет эффективно возбуждать газовые лазеры наносекундным продольным разрядом.

2. В волноводных азотных лазерах с продольным разрядом реализуется механизм возбуждения генерации за счет самопробоя газа в лазерной ячейке в постоянном электрическом поле.

3. Волноводный азотный лазер и азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса эффективны для возбуждения лазеров на красителях.

4. УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия при возбуждении излучением азотного лазера информативна для операционного мониторинга тканей миокарда и головного мозга при острой ишемии, тканей внутренних органов при воспалении.

5. Результаты экспериментальных исследований, методы измерений, алгоритм обработки спектров УФ лазер-индуцированной аутофлуоресценции позволяют производить дифференциальную диагностику стадий развития возрастной катаракты; степени дегенерации роговицы, вызванной ношением контактных линз.

6. Излучение азотного лазера при высоких интенсивностях модулирует активность клеток иммунной системы (молекула-мишень - НАДФН).

7. Эффективность фотодиссоциации карбоксигемоглобина имеет спектральный максимум, соответствующий пику а-полосы спектра поглощения, а зависимость модуляции оптической плотности от степени насыщения имеет максимум, связанный с точкой перегиба кривой насыщения.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, кафедры глазных болезней, кафедры хирургических болезней № 2, кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России, используются в образовательном и научно-исследовательском процессе на кафедре фотоники и лазерных технологий ФГАОУ ВПО СФУ.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: 1) Second International Conference on Laser Scattering Spectroscopy of Biological Objects Pecs, Hungary, 29 Aug. - 2 Sept., 1988; 2) V Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света, Ужгород, 1989; 3) Laser Applications in Life Sciences Moscow, Russia, 27 August, 1990; 4) First Russian-Chinese Seminar on Laser Physics and Laser Technology, Krasnoyarsk, Russia, June 2-8, 1993; 5) 5th International Conference on Laser Applications in Life Sciences. Minsk, Belarus, 28 June - 2 July, 1994; 6) Первая Всероссийская конференция токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; 7) Laser Optics '95: Biomedical Applications of Lasers. St. Petersburg, Russia, 27 June 1995; 8) Russian-German Laser Symposium, St. Petersburg, Russia, 1-5 July 1995; 9) Third Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology Krasnoyarsk, Russia, October 8-10, 1996; 10) IV Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Irkutsk, Russia, 3-8 September, 1996; И) Всероссийская научно-практическая конференция «Механизмы адаптации организма», Томск, 1996; 12) 7 Всероссийский симпозиум «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 17-22 марта 1996; 13) Гомеостаз и окружающая среда: VIII Всероссийский симпозиум, Красноярск, 10-14 марта 1997; 14) VI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Foundation, Khabarovsk, Russia, 1998; 15) IX

Международный симпозиум «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; 16) XVI International Conference on Coherent and Nonlinear Optics, ICONO '98, Moscow, Russia, June 29- July 3, 1998; 17) 4th Chinese-Russian-Korean Symposium on Laser Physics and Laser Technology, Harbin, China, 1998; 18) VII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Hirosaki, Japan 16-17 September, 1999; 19) Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Достижения науки и техники - развитию Сибирских регионов", Красноярск, 24-26 марта, 1999; 20) 10th European Students' Conference For Medical Students And Young Doctors, Berlin, Germany, 20-24 October 1999; 21) Научно-практическая конференция "Проблемы экологии и развитие городов" Красноярск, 5-6 июня 2000; 22) Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II Saratov Russia, 3 October 2000; 23) 3d International Symposium on Modern Problems of Laser Physics, Novosibirsk, 2000; 24) 10th Conference on Laser Optics, St Petersburg, Russia, 2000; 25) 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology - Tomsk: 2000; 26) VIII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Blagoveshchensk, 21-22 September, 2000; 27) 2-ая Всероссийская конференция «Достижения науки и техники — развитию сибирских регионов», Красноярск, 2000; 28) I Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика-2001", 18-22 июня 2001; 29) V Международная конференция "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул" г.Томск, 9-14 сентября 2001; 30) ICONO 2001 -International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (XVII) Minsk, Belarus, June 26 - July 1, 2001; 31) 9th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange, Kanazawa, Japan, 2001; 32) Atomic and Molecular Pulsed Lasers V Tomsk, Russia, Tomsk, 15-19 September 2003; 33) American Society for Microbiology Conference "Bio-, Micro-, and Nanosystems", New York, July 7 -10, 2003; 34) 2nd International conference "High medical technologies in XXI century" Benidorm, Spain November 1-8, 2003; 35) Optical Technologies in Biophysics and Medicine, V Saratov Fall Meeting, 2003; 36) XI

Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Niigata, Japan 10-11 August, 2004; 37) IV International Symposium "Modern Problems of Laser Physics" MPLP'2004, Novosibirsk, Russia, 22 - 27 August, 2004; 38) DESORPTION-2004, Saint-Petersburg, Russia, August 29 - September 2, 2004; 39) The 7th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies, Tomsk, Russia, December 20, 2004; 40) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2005: Laser Technologies for Environmental Monitoring and Ecological Applications, and Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2005 St. Petersburg, Russia, May 11-15, 2005; 41) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2007, Minsk, Belarus, 28 May 2007; 42) International Conference on Laser Applications in Life Sciences LALS 2007, Moscow, Russia, 11-14 June 2007; 43) 18th International Laser Physics Workshop LPHYS' 09, July 13-17, 2009, Barcelona, Spain; 44) VI Russia-Japan Workshop "Integrative Neuroscience: Molecular and Translational Medicine", Krasnoyarsk, July 2011, семинарах и заседаниях кафедры квантовой электроники, кафедры фотоники и лазерных технологий Сибирского федерального университета (1990-2011 гг.), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого (2006-2011 гг.), кафедры биофизической генетики и молекулярной медицины Медицинского факультета Университета Канадзавы (Япония, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 85 печатных работ, из них 23 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получено 4 патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 301 странице текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 фотографий, 94 рисунка, 22 таблицы. Библиографический список включает 343 источника.

263 ВЫВОДЫ

1) Разработаны эффективные источники лазерного излучения для задач лазер-индуцированной флуоресцентной спектроскопии живых клеток и тканей: а) малогабаритный отпаянный лазер на молекулярном азоте (А,=337 нм) с возбуждением продольным разрядом от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, обеспечивающий энергию генерации 50 мкДж, при частоте следования 400 Гц и ресурс работы 2*109имп; б) лазер на молекулярном азоте (А.=337 нм) с возбуждением продольным разрядом от схемы магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, с энергией генерации 1 мДж; в) волноводный лазер на молекулярном азоте (Х=337 нм) с возбуждением продольным разрядом без коммутатора на явлении самопробоя в ячейке диаметром 120 мкм, обеспечивающий выходную импульную мощность 33 Вт; г) перестраиваемый лазер на красителе R6G с накачкой компактным ^-лазером с линией магнитного сжатия, обеспечивающий перестройку в диапазоне 555 нм - 580 нм с шириной линии выходного излучения 0,38 нм и максимальной энергией ипульса 1,25 мкДж.

2) Создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений. Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм. Частота измерений 1000 с'1. Разработанное программное обеспечение позволяет без перекомпиляции реализовать любую методику (в пределах технических возможностей прибора) измерений спектров и кинетики флуоресценции за счет единого описания методики с помощью скрипта, а также алгоритм обработки полученных данных (на лету) за счет использования технологии OLE автоматизации в управлении табличным процессором Excel.

3) Разработаны физико-технические основы применения УФА лазерного излучения для диагностики типовых патологических процессов методом лазер-инцуцированной флуоресцентной спектроскопии: а) воспаление - диагностика перитонита; б) ишемия - контроль острой ишемии миокарда и головного мозга; в) дегенеративные изменения - диагностика патологии хрусталика при различных стадиях возрастной катаракты, диагностика патологии роговицы при длительном ношении контактных линз.

4) Подтверждена ключевая роль основного тканевого флуорофора НАДФН в изменениях спектров флуоресценции живых тканей при типовых патологических процессах, связанная с изменением баланса восстановленной и окисленных форм. Выявлена ключевая роль гемопротеидов (гемоглобина, миоглобина) как тканевых хромофоров в изменениях спектра флуоресценции живых тканей при таких патологических процессах, как воспаление и ишемия, связанная с изменением баланса окси- и дезоксиформ. Показано in vitro, что изменения спектра поглощения гемопротеида - карбоксигемоглобина в поле интенсивного лазерного излучения связаны с фотодиссоциацией. Выявлено, что наибольшие изменения в спектре поглощения происходят в области полосы Соре. Обнаружен спектральный максимум фотодиссоциации карбоксигемоглобина на длине волны ^=570 нм.

5) Показано in vitro, что при облучении клеточных суспензий лимфоцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов импульсным излучением с длиной волны Х=337 нм при интенсивностях и дозах, соответствующих экспериментам с использованием прототипа лазерного спектрофлуориметра и зонда для одноточечных измерений, токсическое действие излучения на иммунокомпетентные клетки человека отсутствует, но наблюдается модулирующий эффект в отношении их функциональной активности. Показано, что активация макрофагов сопровождается усилением их собственной флуоресценции при возбуждении УФ излучением ?i=340 нм, связанная с активацией НАДФН-оксидазы при дыхательном взрыве.

1. Агравал, Г. Нелинейная волоконная оптика / Г. Агравал М.: Мир, 1996.

2. Баранов, В. Ю. Контракция распадающейся плазмы разряда в азоте /В. Ю. Баранов, В. Г. Высикайло, А. П. Напартович, В. П. Низьев, С. В. Пигульский, А. Н. Старостин // Физика плазмы 1978. - Т. 4, - С. 358.

3. Бекефи, Д. Плазма в лазерах / Д. Бекефи М.: Энергоиздат, 1982.

4. Борисов, С. Ф. Взаимодействие газов с поверхностью твердых тел / С. Ф. Борисов, Н. Ф. Балахонов, В. А. Губанов М.: Наука, 1988.

5. Букина, JI. П. Спектрофотометрическое определение карбоксигемоглобина /Л. П. Букина, JI. И. Ушакова // Судебно-медицинская экспертиза 1979. - Т. 12, № 2. - С.39-42.

6. Владимиров, Ю. А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю. А. Владимиров, Г. Е. Добрецов Москва: Наука, 1980.

7. Гольд орт, В. Г. Мощный УФ Ы2-лазер с продольным разрядом /В. Г. Гольдорт, М. А. Дернов, В. Н. Ищенко, С. А. Кочубей // Известия вузов. ЭЛЕКТРОНИКА 1996 -№ 1-2. - С. 51-54

8. Добрецов, Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов / Г. Е. Добрецов Москва: Наука, 1989.

9. Елецкий, А. В. Эксимерные лазеры /А. В. Елецкий // УФН 1978. - Т. 125,, вып. 2. - С. 279-314.

10. И. Ермаков, Ю. А. Исследование фотодиссоциации карбоксигемоглобина при разных степенях насыщения /Ю. А. Ермаков, В. И. Пасечник, С. В. Тульский // Биофизика 1975. - Т. 20, № 4. - С. 591-595.

11. Земсков, В. М. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток) / В. М. Земсков,

12. A. А. Барсуков М.: МЗ СССР, 1988.

13. Иванов, И. Г. Ионные лазеры на парах металлов / И. Г. Иванов, Е. Л. Латуш, М. Ф. Сэм М.: Энергоатомиздат, 1990.

14. Ильюшко, В. Г. Металлические сегментированные разрядные трубки для ультрафиолетового лазера на азоте с продольным разрядом /В. Г. Ильюшко,

15. B. Ф. Кравченко, В. С. Михалевский // Приборы и техника эксперимента -1984. -№ 1. С. 178 - 180. .

16. Ищенко, В. Н. Импульсный ультрафиолетовый лазер на азоте /В. Н. Ищенко, В. Н. Лисицын, В. Н. Старинский // Оптико-механическая промышленность 1974. - №3. - С. 32-34. .

17. Ищенко, В. И. Ультрафиолетовый лазер на азоте с большой средней мощностью. / В. Н. Ищенко, В. Н. Лисицын, А. М. Ражев, В. Н. Старинский // Газовые лазеры / Новосибирск: Наука, 1977. - С.213. .

18. Казангапов, А. Н. Волоконная оптика в измерительной и вычислительной технике / А. Н. Казангапов, А. Л. Патлах, Р. Вильш Алма-Ата: Наука, 1989.

19. Каслин, В. М. Влияние температуры на свойства импульсной генерации на электронных переходах двухатомных молекул /В. М. Каслин, Г. Г. Петраш // Журнал экспериментальной и теоретической физики 1968. - Т. 54, № 4.1. C. 1051-1063.

20. Конев, С. В. Фотобиология / С. В. Конев, И. Д. Волотовский Минск: БГУ издат., 1979.

21. Копылов, С. М. Перестраиваемые лазеры на красителях и их применение / С. М. Копылов, Б. Г. Лысой, С. Л. Серегин, О. Б. Чередниченко М.: Радио и связь, 1991.

22. Лебедев, К. А. Иммунограмма в клинической практике: введение в прикладную иммунологию / К. А. Лебедев, И. Д. Понякина, В. С. Авдеева -М.: Наука, 1990.

23. Лисовский, В. А. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии / В. А. Лисовский, В. В. Щедрунов, Н. Я. Барский, Г. В. Папаян, В. О. Самойлов, В. В. Гущ, Ю. А. Грухин, С. Н. Шуленин, В. Н. Соловьев Ленинград: Наука, 1984.

24. Месяц, Г. А. Импульсная энергетика и электроника / Г. А. Месяц М.: Наука, 2004.

25. Паштаев, Н. П. Влияние мягких контактных линз на структуру и биомеханических свойств роговицы /Н. П. Паштаев, С. Г. Бодрова, Н. В. Бородина, М. М. Зарайская, Н. В. Майчук // Офтальмохирургия 2009. - № 4.- С. 10-14.

26. Приезжев, А. В. Лазерная диагностика в биологии и медицине / А. В. Приезжев, В. В. Тучин, Л. П. Шубочкин М.: Наука, 1989.

27. Пухов, К. И. Автоматизированный хемилюминесцентный мониторинг функциональной активности клеток белой крови. / К. И. Пухов, Я. И. Пухова- Шушенское,: ИФ СО АН СССР, 1990

28. Пушкина, Н. Н. Биохимические методы исследования / Н. Н. Пушкина -М.: Медицина, 1963.

29. Рыльков, В. В. Особенности фотохимических свойств гемоглобина в нативных условиях /В. В. Рыльков, М. Ю. Тарасьев // Биохимия 1991. - Т. 56, вып. 7. - С. 1296.

30. СаНПиН5 804-91 Санитарные нормы и правила устройства и эксплуатации лазеров / М.: ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСФСР САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА 1991.

31. Синичкин, Ю. П. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. / Ю. П. Синичкин, С. Р. Утц Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2001.

32. Синичкин, Ю. П. Отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека in vivo / Ю. П. Синичкин, Н. Коллиас, Г. Зониос, С. Р. Утц, В. В. Тучин // Оптическая биомедицинская диагностика. В 2 т. / М.: ФИЗМАТЛИТ, 2007. - С. 77-124.

33. Тучин, В. В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях / В. В. Тучин М.: ФИЗМАТ ЛИТ, 2010.

34. Федоров, А. И. XeCI -лазер низкого давления с продольным разрядом /А. И. Федоров // Оптика атмосферы и океана 1994. - Т. 7, № 1. - С. 96-101.

35. Федоров, А. И. Азотный лазер с продольным разрядом и УФ-предыонизацией /А. И. Федоров // Оптика атмосферы и океана 1996. - Т. 9, №2.-С. 163-165.

36. Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фримель М.: Медицина, 1987.

37. Abel, В. Excimer-laser-induced fluorescence spectroscopy of human arteries during laser ablation / B. Abel, H. Hippler, B. Koerber, A. J. Morguet, W. Neu // Proc. SPIE, 1991. Vol. 1525 - P. 110-118.

38. Abramov, A. G. Investigation of the spatial and temporal dynamics of the pump and radiation waves in a nitrogen laser /А. G. Abramov, I. E. Asinovski, L. M. Vasilyak // Soviet Journal of Quantum Electronics 1983. - Vol.13, N 9. - P. 1203-1206.

39. Amaechi, B. T. Quantitative light-induced fluorescence: A potential tool for general dental assessment /B. T. Amaechi, S. M. Higham // Journal of Biomedical Optics 2002. - Vol. 7, N 1. - P. 7-13.

40. Ambach, W. Biological effectiveness of solar UV radiation in humans /W. Ambach, M. Blumthaler // Cellular and Molecular Life Sciences 1993. - Vol. 49, N9. - P. 747-753.

41. Andersson-Engels, S. Laser-induced fluorescence used in localizing atherosclerotic lesions /S. Andersson-Engels, A. Gustafson, J. Johansson, U. Stenram, K. Svanberg, S. Svanberg // Lasers in Medical Science 1989. - Vol. 4, N 3. -P. 171-181.

42. Andersson, P. Autofluorescence of various rodent tissues and human skin tumour samples /P. Andersson, E. Kjellen, S. Montan, K. Svanberg, S. Svanberg // Lasers in Medical Science 1987a. - Vol. 2, N 1. - P. 41-49.

43. Andersson, P. Diagnosis of arterial atherosclerosis using laser-induced fluorescence /P. Andersson, A. Gustafson, U. Stenram, K. Svanberg, S. Svanberg // Lasers in Medical Science 1987b. - Vol. 2, N 4. - P. 261-266.

44. Apollonov, V. V. Efficiency of an electric-discharge N2 laser /V. V. Apollonov, V. A. Yamshchikov // Quantum Electronics 1997. - Vol. 27, N 6. - P. 469-472.

45. Apollonov, V. V. Once again on the efficiency of a nitrogen laser /V. V. Apollonov, V. A. Yamshchikov // Quantum Electronics 2002. - Vol. 32, N 2. - P. 183-184.

46. Atanasov, P. A. Tea gas lasers excited by a sliding discharge along the surface of a dielectric /P. A. Atanasov, A. A. Serafetinides // Optics Communications -1989. Vol. 72, N 6. - P. 356-360.

47. Atanasov, P. A. Simultaneous ultraviolet and infrared emission in a sliding-discharge excited laser /P. A. Atanasov, K. A. Grozdanov // IEEE Journal of Quantum Electronics 1996 -Vol. 32, N 7. - P. 1122 - 1125

48. Atezhev, V. V. Nitrogen laser with a pulse repetition rate of 11 kHz and a beam divergence of 0.5 mrad /V. V. Atezhev, S. K. Vartapetov, A. K. Zhigalkin, K. E. Lapshin, A. Z. Obidin // Quantum Electronics 2004. - Vol. 34, N 9. - P. 790-794.

49. Aubert, A. Interaction between astrocytes and neurons studied using a mathematical model of compartmentalized energy metabolism /A. Aubert, R. Costalat // J Cereb Blood Flow Metab 2005a. - Vol. 25, N 11. - P. 1476-1490.

50. Aubert, A. A coherent neurobiological framework for functional neuroimaging provided by a model integrating compartmentalized energy metabolism /A. Aubert, L. Pellerin, P. J. Magistretti, R. Costalat // PNAS 2007. - Vol. 104, N 10. - P. 4188-4193.

51. Augusteyn, R. C. Distribution of Fluorescence in the Human Cataractous Lens /R. C. Augusteyn // Ophthalmic Research 1975. - Vol. 7, N 3. - P. 217-224.

52. Avrillier, S. Laser-induced autofluorescence diagnosis of tumors /S. Avrillier,

53. E. Tinet, D. Ettori, M. Anidjar // Physica Scripta 1997. - Vol. 1997, N T72. - P. 87.

54. Babizhayev, M. Lipid fluorophores of the human crystalline lens with cataract /M. Babizhayev // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology- 1989. Vol. 227, N 4. - P. 384-391.

55. Baker, H. J. An efficient laser pulser using ferrite magnetic switches /H. J. Baker, P. A. Ellsmore, E. C. Sille // Journal of Physics E: Scientific Instruments -1988.-Vol. 21, N2.-P. 218-224.

56. Baksht, E. K. Nitrogen laser pumped by a longitudinal discharge from inductive and capacitative energy storage units /E. K. Baksht, A. N. Panchenko, V.

57. F. Tarasenko // Quantum Electronics 1998. - Vol. 28, N 12. - P. 1058-1061.

58. Baryshev, M. V. Optimization of optical fiber catheter for spectral investigations in clinics / M. V. Baryshev, V. B. Loschenov // Proc. SPIE, 1994. -Vol. 2084 P. 106-118.

59. Belyaeva, L. A. Fluorescence diagnostics in oncological gynecology / L. A. Belyaeva, L. V. Adamyan, V. P. Kozachenko, A. A. Stratonnikov, E. F. Stranadko, V. B. Loschenov // Proc. SPIE, 2003. Vol. 5068 - P. 55-60.

60. Bensch, K. G. The role of ascorbic acid in senile cataract /K. G. Bensch, J. E. Fleming, W. Lohmann // PNAS 1985. - Vol. 82, N 21. - P. 7193-7196.

61. Bessems, G. J. Non-tryptophan fluorescence of crystallins from normal and cataractous human lenses /G. J. Bessems, E. Keizer, J. Wollensak, H. J. Hoenders // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1987. - Vol. 28, N 7. - P. 1157-1163.

62. Beuthan, J. Quantitative optical biopsy of liver tissue ex vivo /J. Beuthan, O. Minet, G. Muller // IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics -1996. Vol. 2, N4. - P. 906-913.

63. Bigio, I. J. Optical Biopsy /1. J. Bigio, J. R. Mourant, R. G. Driggers London: Taylor & Francis 2003.

64. Billinton, N. Seeing the Wood through the Trees: A Review of Techniques for Distinguishing Green Fluorescent Protein from Endogenous Autofluorescence /N. Billinton, A. W. Knight // Analytical Biochemistry 2001. - Vol. 291, N 2. - P. 175-197

65. Blair, N. Vitreous fluorophotometry in patients with cataract surgery /N. Blair, M. Elman, M. Rusin // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1987. - Vol. 225, N 6. - P. 441-446.

66. Bonanno, J. A. Corneal acidosis during contact lens wear: effects of hypoxia and C02 /J. A. Bonanno, K. A. Poise // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1987.-Vol. 28, N 9. - P. 1514-20.

67. Brachmanski, M. Separation of fluorescence signals from Ca2+ and NADH during cardioplegic arrest and cardiac ischemia /M. Brachmanski, M. M. Gebhard, R. Nobiling // Cell Calcium 2004. - Vol. 35, N 4. - P. 381-391.

68. Brandes, R. Increased work in cardiac trabeculae causes decreased mitochondrial NADH fluorescence followed by slow recovery /R. Brandes, D. M. Bers // Biophysical Journal 1996. - Vol. 71, N 2. - P. 1024-1035.

69. Brau, R. R. Interlaced Optical Force-Fluorescence Measurements for Single Molecule Biophysics /R. R. Brau, P. B. Tarsa, J. M. Ferrer, P. Lee, M. J. Lang // Biophysical Journal 2006. - Vol. 91, N 3. - P. 1069-1077.

70. Brubaker, R. Use of a xenon flash tube as the excitation source in a new slit-lamp fluorophotometer /R. Brubaker, R. Coakes // American Journal of Ophthalmology 1978. - Vol. 86, N 4. - P. 474.

71. Bruce, A. S. Corneal pathophysiology with contact lens wear /A. S. Bruce, N. A. Brennan // Survey of Ophthalmology 1990. - Vol. 35, N 1. - P. 25-58.

72. Buffa, R. High repetition rate operation of a N2 waveguide laser /R. Buffa // Journal of Physics D: Applied Physics 1983. - Vol. 16, N 4. - P. L67.

73. Burkhard, P. XeF excimer laser pumped in a longitudinal low-pressure discharge /P. Burkhard, T. Gerber, W. Luthy // Applied Physics Letters 1981. -Vol. 39, N 1. - P. 19-20.

74. Bursell, S. E. Vitreous fluorophotometric evaluation of diabetics /S. E. Bursell, F. C. Delori, A. Yoshida, J. S. Parker, G. D. Collas, J. W. McMeel // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1984. - Vol. 25, N 6. - P. 703-10.

75. Bychkov, Y. I. Enhancement of the efficiency of the N2 laser /Y. I. Bychkov, V. F. Losev, V. V. Savin, V. F. Tarasenko // Soviet Journal of Quantum Electronics 1975. - Vol. 5, N 9. - P. 1111-1115.

76. Cannone, F. Two-photon interactions at single fluorescent molecule level /F. Cannone, G. Chirico, A. Diaspro // Journal of Biomedical Optics 2003. - Vol. 8, N3. - P. 391-395.

77. Caristi, R. Development of a high average power pulsed nitrogen laser /R. Caristi, D. Leonard // IEEE Journal of Quantum Electronics 1967. - Vol. 3, N 6. -P. 271-271.

78. Carlson, K. H. Effect of long-term contact lens wear on corneal endothelial cell morphology and function /K. H. Carlson, W. M. Bourne, R. F. Brubaker // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1988. - Vol. 29, N 2. - P. 185-93.

79. Chance, B. Intracellular Oxidation-Reduction States in Vivo /B. Chance, P. Cohen, F. Jobsis, B. Schoener // Science 1962. - Vol. 137, N 3529. - P. 499-508.

80. Chance, B. Properties and kinetics of reduced pyridine nucleotide fluorescence of the isolated and in vivo rat heart /B. Chance, J. Williamson, D. Jamieson, B. Schoener // Biochem. Z 1965. - Vol. 341, - P. 357-377.

81. Chuck, R. S. 193-nm Excimer Laser-Induced Fluorescence Detection of Fluoroquinolones in Rabbit Corneas // Arch Ophthalmol 2004b. - V 122, N 11. -P 1693-1699.

82. Cleschinsky, D. XeF-laser with longitudinal discharge excitation /D. Cleschinsky, D. Dammasch, H. J. Eichler, J. Hamisch // Optics Communications -1981.-Vol. 39, N 1-2. -P. 79-82.

83. Conway, B. Technical variables in vitreous fluorophotometry /B. Conway // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1985. - Vol. 222, N4. - P. 194-201.

84. Craiu, A. Ocular fluorophores /A. Craiu // Oftalmologia (Bucharest, Romania : 1990) 2007. - Vol. 51, N 2. - P. 18-27.

85. Cunha-Vaz, J. Configuration of the normal vitreous fluorophotometry recording: Symbols /J. Cunha-Vaz, R. Zeimer // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1985a. - Vol. 222, N 4. - P. 234-236.

86. Cunha-Vaz, J. G. Characterization of the early stages of diabetic retinopathy by vitreous fluorophotometry /J. G. Cunha-Vaz, J. R. Gray, R. C. Zeimer, M. C. Mota, B. M. Ishimoto, E. Leite // Diabetes 1985b. - Vol. 34, N 1. - P. 53-59.

87. Curry, J. J. High duty cycle pulsed dye laser using a waveguide excimer pump /J. J. Curry, F. N. Skiff, C. P. Christensen // Optics Communications 1991. - Vol. 82, N 3-4. - P. 289-292.

88. Daniel J. McAuliffe, S. Photochemical and thermal changes in tissue autofluorescence during excimer laser irradiation / S. Daniel J. McAuliffe, S. L. Jacques, A. S. Hayes // Proc. SPIE, 1990. Vol. 1202 - P. 93-102.

89. Delori, F. Origin of Fundus Auto fluorescence 2 / F. Delori, C. Keilhauer, J. R. Sparrow, G. Staurenghi Berlin Heidelberg: Springer Verlag, 2007.

90. Delori, F. C. Spectrophotometer for noninvasive measurement of intrinsic fluorescence and reflectance of the ocular fundus /F. C. Delori // Appl. Opt. 1994. -Vol. 33, N31. - P. 7439-7452.

91. Deyl, Z. Studies on the chemical nature of elastin fluorescence /Z. Deyl, K. Macek, M. Adam, Vancikova // Biochimica et Biophysica Acta 1980. - Vol. 625, N2. - P. 248-254.

92. Docchio, F. Ocular fluorometry: Principles, fluorophores, instrumentation, and clinical applications /F. Docchio // Lasers in Surgery and Medicine 1989. -Vol. 9, N6. - P. 515-532.

93. Dreuw, A. Characterization of the Relevant Excited States in the Photodissociation of CO-Ligated Hemoglobin and Myoglobin /A. Dreuw, B. D. Dunietz, M. Head-Gordon // Journal of the American Chemical Society 2002. -Vol. 124, N41.-P. 12070-12071.

94. Dunietz, B. D. Initial Steps of the Photodissociation of the CO Ligated Heme Group /B. D. Dunietz, A. Dreuw, M. Head-Gordon // The Journal of Physical Chemistry B 2003. - Vol 107, N 23. - P. 5623-5629.

95. Durkin, A. J. Optically dilute, absorbing, and turbid phantoms for fluorescence spectroscopy of homogeneous and inhomogeneous samples /A. J.

96. Durkin, S. Jaikumar, R. Richardskortum // Applied Spectroscopy 1993. - Vol. 47, N12.-P. 2114-2121.

97. Durkin, A. J. Relation between fluorescence-spectra of dilute and turbid samples /A. J. Durkin, S. Jaikumar, N. Ramanujam, R. Richardskortum // Applied Optics 1994. - Vol. 33, N 3. - P. 414-423.

98. Durkin, A. J. Application of the method of partial least squares to determine chromophore concentrations from fluorescence spectra of turbid samples / A. J. Durkin, R. R. Richards-Kortum // Proc. SPIE, 1996a. Vol. 2678 - P. 475-484.

99. Durkin, A. J. Comparison of methods to determine chromophore concentrations from fluorescence spectra of turbid samples /A. J. Durkin, R. Richards-Kortum // Lasers in Surgery and Medicine 1996b. - Vol. 19, N 1. - P. 75-89.

100. Eichler, H. J. KrF laser with longitudinal discharge excitation /H. J. Eichler, J. Hamisch, B. Nagel, W. Schmid // Applied Physics Letters 1985. - Vol. 46, N 10. -P. 911-913.

101. El-Osealy, M. A. Oscillation and gain characteristics of high power co-axially excited N2 gas lasers /M. A. El-Osealy, T. Ido, K. Nakamura, T. Jitsuno, S. Horiguchi // Optics Communications 2001. - Vol. 194, N 1-3. - P. 191-199.

102. El-Osealy, M. A. Longitudinally excited F2 laser and gain measurement at a total gas pressure of 40 Torr / M. A. El-Osealy, T. Ido, K. Nakamura, T. Jitsuno, T. Goto // Proc. SPIE, 2002a. Vol. 4747 - P. 117-127.

103. El-Osealy, M. A. M. Gain characteristics of longitudinally excited F2 lasers /M. A. M. El-Osealy, T. Jitsuno, K. Nakamura, S. Horiguchi // Optics Communications 2002b. - Vol. 205, N 4-6. - P. 377-384.

104. El-Osealy, M. A. M. Oscillation and gain characteristics of longitudinally excited VUV F2 laser at 40 Torr total pressure /M. A. M. El-Osealy, T. Jitsuno, K. Nakamura, Y. Uchida, T. Goto // Optics Communications 2002c. - Vol. 207, N 16. - P. 255-259.

105. El-Oseary, M. A. Coaxially excited gas lasers: toward the vacuum ultraviolet region / M. A. El-Oseary, T. Jitsuno, M. Nakatsuka, Y. Ohoguchi, T. Ido, K. Nakamura, S. Horiguchi // Proc. SPIE, 2000. Vol. 3889 - P. 774-779.

106. Ettori, D. Clinical laser-induced autofluorescence diagnosis of bladder tumors: dependence on the excitation wavelength / D. Ettori, S. Avrillier, M. Anidjar, O. Cussenot, A. L. Due // Proc. SPIE, 1995. Vol. 2627 - P. 25-32.

107. Fahim, M. Fluorophotometry as a diagnostic tool for the evaluation of dry eye disease /M. Fahim, S. Haji, C. Koonapareddy, V. Fan, P. Asbell // BMC Ophthalmology 2006. - Vol. 6, N 1. - P. 20.

108. Fantaguzzi, S. Corneal autofluorescence in diabetic and normal eyes /S. Fantaguzzi, F. Docchio, L. Guarisco, R. Brancato // International Ophthalmology -1994.-Vol. 18, N4.-P. 211-214.

109. Finazzi, A. A. Intrinsic fluorescence of a protein devoid of tyrosine and tryptophan: Horse hepatocuprein /A. A. Finazzi, V. Albergoni, A. Cassini // FEBS Letters 1974. - Vol. 39, N 2. - P. 164-166.

110. Fishier, H. J. Excimer lasers with capacitively excited tubular discharges / H. J. Fishier, H. Herweg, J. de la Rosa // Proc. SPIE, 1988. Vol. 1023 - P. 55-58.

111. Franzen, S. Heme Photolysis Occurs by Ultrafast Excited State Metal-to-Ring Charge Transfer /S. Franzen, L. Kiger, C. Poyart, J.-L. Martin // Biophysical Journal 2001. - Vol. 80, N 5. - P. 2372-2385.

112. Fujimoto, D. The structure of pyridinoline, a collagen crosslink /D. Fujimoto, T. Moriguchi, T. Ishida, H. Hayashi // Biochemical and Biophysical Research Communications 1978. - Vol. 84, N 1. - P. 52-57.

113. Furuhashi, H. Longitudinal discharge XeCl excimer laser with automatic UV preionization /H. Furuhashi, M. Hiramatsu, T. Goto // Applied Physics Letters -1987. Vol. 50, N 14. - P. 883-885.

114. Furuhashi, H. Longitudinal discharge N2 laser with automatic preionization using an LC inversion circuit /H. Furuhashi, T. Goto // Review of Scientific Instruments 1988. - Vol. 59, N 12. - P. 2552-2556.

115. Furuhashi, H. Longitudinal discharge N2 laser with rectangular cross section /H. Furuhashi, M. Shimizu, T. Goto // Measurement Science and Technology -1990. Vol. 1,N 5. - P. 401-405.

116. Geller, M. A Pulsed, Coaxial Transmission Line Gas Laser /M. Geller, D. E. Altman, T. A. DeTemple // Journal of Applied Physics 1966. - Vol. 37, N 9. - P. 3639-3640.

117. Gerber, T. Miniature high-power KrF laser excited with a capacitively coupled discharge /T. Gerber, H. M. J. Bastiaens, P. J. M. Peters // IEEE Journal of Quantum Electronics 1985a.-Vol. QE-21,N3.-P. 191-193.

118. Gerber, T. A KrF-laser excited by a capacitively coupled longitudinal discharge /T. Gerber, P. J. M. Peters, H. M. J. Bastiaens // Optics Communications 1985b. - Vol. 53, N 6. - P. 401-404.

119. Gerry, E. T. Pulsed-molecular-nitrogen laser theory /E. T. Gerry // Applied Physics Letters 1965. - Vol. 7, N 1. - P. 6-8.

120. Giaume, C. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions // Nat Rev Neurosci 2010. - Vol. 11, N 2. - P. 87-99.

121. Gibson, Q. H. Hemoproteins, ligands, and quanta /Q. H. Gibson // Journal of Biological Chemistry 1989. - Vol. 264, N 34. - P. 20155-20158.

122. Girardeau-Montaut, J. P. Preparation of a laser amplifier reaching a power of 50 MW at 3371 A in molecular nitrogen /J. P. Girardeau-Montaut, M. Roumy, J. Hamelin, L. Avan // Comt. Rend. Acad. Sci., Paris 1972. - Vol. 274, - P. 607-610.

123. Godard, B. A very simple high-power high efficiency N2UV laser /B. Godard // IEEE Journal of Quantum Electronics 1973. - Vol. 9, N 6. - P. 645- 646.

124. Godard, B. A simple high-power large-efficiency N2 ultraviolet laser /B. Godard // IEEE Journal of Quantum Electronics 1974. - Vol. 10, N 2(1). - P. 147153.

125. Gray, J. Optimized protocol for Fluorotron Master /J. Gray, M. Mosier, B. Ishimoto // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1985. -Vol. 222, N4.-P. 225-229.

126. Grozdanov, K. A. Investigation Of A Nitrogen Laser Excited By Sliding Discharges / K. A. Grozdanov, P. A. Atanasov // Proc. IEEE, 1994. P. 146-146

127. Gu, M. Principles of three dimensional imaging in confocal microscopes / -: World Scientific Pub Co Inc, 1996.

128. Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy, an inner vision of the cornea a major review /R. F. Guthoff, A. Zhivov, O. Stachs // Clinical & Experimental Ophthalmology - 2009,- Vol. 37, N 1. - P. 100-117.

129. Hatanaka, H. High efficiency operation of the high-repetition-rate all-solidstate magnetic pulse compressor for KrF excimer lasers /H. Hatanaka, M. Obara // Measurement Science and Technology 1991. - Vol. 2, N 1. - P. 42-48.

130. Heard, H. G. Ultraviolet Gas Laser at Room Temperature /H. G. Heard // Nature 1963. - Vol. 200, N 4907. - P. 667-667.

131. Hohla, A. UV-excited autofluorescence for the detection of neoplasias in the urothelium / A. Hohla, H. Stepp, R. Baumgartner, D. Zaak, H. Alfons // Proc. Optical Society of America, 2000. Vol. 38 - P. SuB3.

132. Holden, B. A. Effects of long-term extended contact lens wear on the human cornea /B. A. Holden, D. F. Sweeney, A. Vannas, K. T. Nilsson, N. Efron // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1985. - Vol. 26, N 11. - P. 1489501.

133. Horvath, K. A. Intraoperative myocardial ischemia detection with laser-induced fluorescence /K. A. Horvath, K. T. Schomacker, C. C. Lee, L. H. Cohn // J Thorac Cardiovasc Surg 1994. - Vol. 107, N 1. - P. 220-225.

134. Ido, Y. NADH: sensor of blood flow need in brain, muscle, and other tissues /Y. Ido, K. Chang, T. A. Woolsey, J. R. Williamson // The FASEB Journal 2001. -Vol. 15, N8. - P. 1419-1421.

135. Ishchenko, V. N. Ultraviolet nitrogen laser with an output power of 0.5 W /V. N. Ishchenko, V. N. Lisitsyn, A. M. Razhev, V. N. Starinskii // Soviet Journal of Quantum Electronics 1975. - Vol. 5, N 8. - P. 965-967.

136. Isner, J. M. Current status of lasers in the treatment of cardiovascular disease /J. M. Isner, R. H. Clarke // IEEE Journal of Quantum Electronics 1984. - Vol. QE-20,N 12. - P. 1406-1420.

137. Ivanov, I. G. Metal vapour ion lasers : kinetic processes and gas discharges / I. G. Ivanov, E. L. Latush, M. F. Sem, C. E. Little Chichester; New York: Wiley, 1996.

138. Janiec, S. The relation between corneal autofluorescence, endothelial cell count and severity of the diabetic retinopathy /S. Janiec, M. Rzendkowski, S. Bolek // International Ophthalmology 1994. - Vol. 18, N 4. - P. 205-209.

139. Johnson, C. K. Single-Molecule Fluorescence Spectroscopy: New Probes of Protein Function and Dynamics /C. K. Johnson, K. D. Osborn, M. W. Allen, B. D. Slaughter// Physiology 2005. - Vol. 20, N 1. - P. 10-14.

140. Kahraman, S. Anoxia-Induced Changes in Pyridine Nucleotide Redox State in Cortical Neurons and Astrocytes /S. Kahraman, G. Fiskum // Neurochemical Research 2007. - Vol. 32, N 4. - P. 799-806.

141. Karras, T. W. Pulsed Metal Vapor Lasers / T. W. Karras, R. S. Anderson, B. G. Bricks, W. E. Austin Ft. Belvoir: Defense Technical Information Center, 1973.

142. Khabbaz, K. R. Intraoperative metabolic monitoring of the heart: II. Online measurement of myocardial tissue pH /K. R. Khabbaz, F. Zankoul, K. G. Warner // The Annals of Thoracic Surgery 2001. - Vol. 72, N 6. - P. S2227-S2233.

143. Kittreil, C. Diagnosis of fibrous arterial atherosclerosis using fluorescence /C. Kittrell, R. L. Willett, C. de los Santos-Pacheo, N. B. Ratliff, J. R. Kramer, E. G. Malk, M. S. Feld // Appl. Opt. 1985. - Vol. 24, N 15. - P. 2280-2281.

144. Klang, G. Measurements and studies of the fluorescence of the human lens in vivo /G. Klang// Acta Ophthalmol 1948. - Vol. 31, - P. 1-152.

145. Knudsen, L. L. Long-term kinetic vitreous fluorophotometry /L. L. Knudsen, T. Olsen, F. Nielsen-Kudsk // Acta Ophthalmologe 1992. - Vol. 70, N 5. - P. 561-569.

146. Kukhlevski, S. V. Single-mode waveguide XeCl laser with diffraction-limited divergence /S. V. Kukhlevski, V. V. Patrin, A. S. Provorov, M. Y. Reushev // Soviet Journal of Quantum Electronics 1990. - Vol. 20, N 5. - P. 488-489.

147. Kumar, C. S. S. R. Nanosystem characterization tools in the life sciences / -Weinheim: Wiley-VCH, 2006.

148. Kürzel, R. B. Tryptophan Excited States and Cataracts in the Human Lens /R. B. Kürzel, M. Wolbarsht, B. S. Yamanashi, G. W. Staton, R. F. Borkman // Nature 1973. - Vol. 241, N 5385. - P. 132-133.

149. Laing, R. A. Noninvasive measurements of pyridine nucleotide fluorescence from the cornea /R. A. Laing, J. Fischbarg, B. Chance // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1980. - Vol. 19, N 1. - P. 96-102.

150. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy / New York, NY: Springer, 2006.

151. Larsen, M. Lens fluorometry: light-attenuation effects and estimation of total lens transmittance /M. Larsen, H. Lund-Andersen // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1991. - Vol. 229, N 4. - P. 363-370.

152. MEANS FOR PRODUCING LONG GAS DISCHARGES: US 3460053 United States: H015 3/09 / D. A. Leonard; Issuing Organization; Air, Force US. -Nov. 8, 1966, ;

153. Lerman, S. Lens proteins and fluorescence /S. Lerman // Israel journal of medical sciences 1972. - Vol. 8, N 8. - P. 1583.

154. Lerman, S. Spectroscopic Evaluation and Classification of the Normal, Aging, and Cataractous Lens. (With 1 color plate) /S. Lerman, R. Borkman // Ophthalmic Research 1976a. - Vol. 8, N 5. - P. 335-353.

155. Lerman, S. Lens fluorescence in aging and cataract formation /S. Lerman // Doc Ophthalmol Proc Series 1976b. - Vol. 8, - P. 241-260.

156. Li, X. Spectral analysis for diagnosis of esophagus dysplasia using fluorescence Raman spectroscopy / X. Li, J. Lin, H. Jin, J. Tang, S. QiHg, Q. Liu // Proc. IEEE, 2004. Vol. 1 - P. 141-144.

157. Li, X. Study of method and system for diagnosis of cancer using autofluorescence and Raman spectroscopy / X. Li, X. Guo, D. Wang, Y. Wang, X. Li, M. Lei, J. Lin // Proc. IEEE, 2006. P. 5453-5456.

158. Liang, J. N. Front surface fluorometric study of lens insoluble proteins /J. N. Liang, M. R. Pelletier, L. T. Chylack // Current Eye Research 1988. - Vol. 7, N 1. -P. 61 - 67.

159. Liesegang, T. J. Physiologic Changes of the Cornea with Contact Lens Wear /T. J. Liesegang // Eye & Contact Lens 2002. - Vol. 28, N 1. - P. 12-27.

160. Limatibul, S. Theophylline modulation of E-rosette formation: an indicator of T-cell maturation /S. Limatibul, A. Shore, H. M. Dosch, E. W. Gelfand // Clin Exp Immunol. 1978. - Vol. 33, N 3. - P. 503-513.

161. Lin, W. C. Effect of thermal damage on the in vitro optical and fluorescence characteristics of liver tissues /W. C. Lin, C. Buttermere, A. Mahadevan-Jansen // IEEE Journal on Selected Topics in Quantum Electronics 2003. - Vol. 9, N 2. - P. 162-170.

162. Line, K. Corneal fluorescence in relation to genetic and environmental factors: a twin study /K. Line, H. Jesper Leth, K. Kirsten Ohm, S. Birgit, I. A. S. Thorkild, L. Michael // Acta Ophthalmologica Scandinavica 2003. - Vol. 81, N 5. -P. 508-513.

163. Little, C. E. Pulsed metal vapour lasers / C. E. Little, N. V. Sabotinov -Dordrecht; Boston: Kluwer Academic, 1996.

164. Little, C. E. Metal vapour lasers : physics, engineering and applications / C. E. Little Chichester; New York: Wiley, 1999.

165. Lohmann, W. Native fluorescence of lenses with nuclear cataract /W. Lohmann // Lens research 1988a. - Vol. 5, N 1-2. - P. 33-39.

166. Lohmann, W. Device for measuring native fluorescence of lenses /W. Lohmann, W. Schmehl, P. Bernhardt, H. Wickert, M. Ibrahim, J. Strobel // Journalof Biochemical and Biophysical Methods 1988b. - Vol. 17, N. 2. - P. 155-158.1

167. Device for measuring eye lens opacity: Pat. 4,852,987 United States: IPC A61B 3/10, A61B 5/00 / W. Lohmann; Issuing Organization; August 1, 1989; - 9 P.

168. Lois, N. Fundus Autofluorescence / -: Lippincott Williams & Wilkins, 2009.

169. Lomaev, M. I. N2 laser pumped by a generator with inductive energy storage and a semiconductor current breaker /M. I. Lomaev, V. F. Tarasenko // Quantum Electronics 1995. - Vol. 25, N 5. - P. 416.

170. Loschenov, V. B. Spectral-auto fluorescent diagnostics of stomach and lung cancer / V. B. Loschenov, M. V. Baryshev, M. I. Kuzin, V. Y. Zavodnov, L. V. Uspensky, U. A. Ablitsov, L. E. Loginov, V. K. Rybin // Proc. SPIE, 1992a. Vol. 1641 - P. 177-192.

171. Loschenov, V. B. Multichannel fiber system for luminescence diagnostics of tumors / V. B. Loschenov, M. V. Baryshev, N. N. Zharkova, V. G. Artioushenko,

172. A. Krjukov, A. Startsev, K. B. Moran, J. D. Brown // Proc. SPIE, 1992b. Vol. 1649-P. 135-138.

173. Loschenov, V. B. Autofluorescent identification of head and neck cancer / V.

174. B. Loschenov, M. V. Baryshev, E. M. Belkina, T. A. Kramarenko, V. V. Shental, N. A. Abdullin, V. K. Poddubny, Y. P. Kuvshinov // Proc. SPIE, 1994. Vol. 2081 -P. 209-213.

175. Loschenov, V. B. Portable spectroscopic system for fluorescent diagnostics and photodinamic therapy /V. B. Loschenov // Russian Chemical J 1998. - Vol. 42, N5.-P. 50-53.

176. Lu, G. Optical fiber for UV-IR broadband spectroscopy / G. Lu, G. F. Schoetz, J. Vydra, D. G. Fabricant//Proc. SPIE, 1998. Vol. 3355 - P. 884-891.

177. Luigi, R. Autofluorescence methods in ophthalmology /R. Luigi, D. Franco // Journal of Biomedical Optics 2004. - Vol. 9, N 1. - P. 9-21.

178. Lyubutin, S. High-frequency pulse generators based on SOS diodes with subnanosecond current cutoff time /S. Lyubutin, S. Rukin, B. Slovikovskii, S. Tsyranov // Instruments and Experimental Techniques 2000. - Vol. 43, N 3. - P. 331-338.

179. Lyutskanov, V. Autofluorescence spectra analysis of human arteries / V. Lyutskanov, N. Minkovski, D. Angelinova // Proc. SPIE, 1996. Vol. 3052 - P. 400-404.

180. Mahadevan-Jansen, A. Raman spectroscopy for the detection of cancers and precancers /A. Mahadevan-Jansen, R. Richards-Kortum // Journal of Biomedical Optics 1996. - Vol. 1, N 1. - P. 31-70.

181. Mahadevan-Jansen, A. Raman spectroscopy for cancer detection: a review /A. Mahadevan-Jansen, R. Richards-Kortum // Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Proceedings - 1997. - Vol. 6, - P. 2722-2728.

182. Mahadevan, A. Study of the fluorescence properties of normal and neoplastic human cervical tissue /A. Mahadevan, M. F. Mitchell, E. Silva, S. Thomsen, R. R. Richards-Kortum // Lasers in Surgery and Medicine 1993. - Vol. 13, N 6. - P. 647-655.

183. Mair, J. Markers for perioperative myocardial ischemia: what both interventional cardiologists and cardiac surgeons need to know /J. Mair, A. Hammerer-Lercher // The Heart Surgery Forum 2005. - Vol. 8, N 5. - P. 319-325.

184. Masters, B. R. In vivo flavoprotein redox measurements of rabbit corneal normoxic-anoxic transitions /B. R. Masters, S. Falk, B. Chance // Current Eye Research 1981. - Vol. 1, N 10. - P. 623-627.

185. Matsumoto, H. Applications of fluorescence microscopy to studies of dental hard tissue /H. Matsumoto, S. Kitamura, T. Araki // Frontiers of Medical and Biological Engineering 2000. - Vol. 10, N 4. - P. 269-284.

186. Maurice, D. M. A new objective fluorophotometer /D. M. Maurice // Experimental Eye Research 1963. - Vol. 2, N 1. - P. 33-38.

187. Mayevsky, A. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies /A. Mayevsky, G. G. Rogatsky // American Journal of Physiology Cell Physiology - 2007. - Vol. 292, N 2. - P. C615-C640.

188. McLaren, J. W. A two-dimensional scanning ocular fluorophotometer /J. W. McLaren, R. F. Brubaker // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1985. - Vol. 26, N 2. -P. 144-152.

189. McLaren, J. W. A scanning ocular spectrofluorophotometer /J. W. McLaren, R. F. Brubaker // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1988. - Vol. 29, N 8. - P. 12851293.

190. Merin, S. Vitreous fluorophotometry in patients with senile macular degeneration /S. Merin, N. P. Blair, M. O. Tso // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1987. - Vol. 28, N 4. - P. 756-9.

191. Mesiats, G. A. Pulsed gas lasers / G. A. Mesiats, V. V. Osipov, V. F. Tarasenko Bellingham, Wash., USA: SPIE Optical Engineering Press, 1995.

192. Michalet, X. Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics /X. Michalet, F. F. Pinaud, L. A. Bentolila, J. M. Tsay, S. Doose, J. J. Li, G. Sundaresan, A. M. Wu, S. S. Gambhir, S. Weiss // Science 2005. - Vol. 307, N 5709. - P. 538-544.

193. Mohamed, A. E.-O. Coaxially excited gas lasers: toward the vacuum ultraviolet region / A. E.-O. Mohamed, J. Takahisa, N. Masahiro, O. Yasunari, I. Takuya, N. Kenshi, H. Shiro // Proc. SPIE, 2000. Vol. 3889 - P. 774-779.

194. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications / M. R. El-Gewely // Biotechnology Annual Review / -: Elsevier, 2005. -P 227-256.

195. Montan, S. Multicolor imaging and contrast enhancement in cancer-tumor localization using laser-induced fluorescence in hematoporphyrin-derivative-bearing tissue /S. Montan, K. Svanberg, S. Svanberg // Optics Letters 1985. -Vol. 10, N2. - P. 56-58.

196. Munnerlyn, C. Design considerations for a fluorophotometer for ocular research /C. Munnerlyn, J. Gray, D. Hennings // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1985. - Vol. 222, N 4. - P. 209-211.

197. Myakov, A. Fiber optic probe for polarized reflectance spectroscopy in vivo: Design and performance /A. Myakov, L. Nieman, L. Wicky, U. Utzinger, R. Richards-Kortum, K. Sokolov // Journal of Biomedical Optics 2002. - Vol. 7, N 3. - P. 388-397.

198. Nehmadi, M. Magnetic pulse compression for a copper vapour laser /M. Nehmadi, Z. Kramer, Y. Ifrah, E. Miron // Journal of Physics D: Applied Physics -1989. Vol. 22, N 1. - P. 29-34.

199. Newman, L. A. XeF* and KrF* waveguide lasers excited by a capacitively coupled discharge /L. A. Newman // Applied Physics Letters 1978. - Vol. 33, N 6. - P. 501-503.

200. Newman, L. A. N2+ waveguide laser: experiment and theory /L. A. Newman // IEEE Journal of Quantum Electronics 1981. - Vol. 17, N 7. - P. 1182-1195.

201. Newton, R. Progress Toward Optical Biopsy: Bringing the Microscope to the Patient /R. Newton, S. Kemp, P. Shah, D. Elson, A. Darzi, K. Shibuya, S. Mulgrew, G.-Z. Yang // Lung 2011. - Vol. 189, N 2. - P. 111-119.

202. Nishi, N. Co-axially excited pulsed gas lasers for precise machining / N. Nishi, Y. Nakajima, T. Jitsuno // Proc. SPIE, 2000. Vol. 3888 - P. 773-777.

203. Nishioka, T. Basic and Clinical Studies of Cardioplegia on Myocardial Metabolism /T. Nishioka // Acta medica Kinki University 1984. - Vol. 9, N 2. - P. 217-233

204. Oliveira dos Santos, B. A 3% efficiency N2 laser /B. Oliveira dos Santos, C. E. Fellows, J. B. Oliveira e Souza, C. A. Massone // Applied Physics B: Lasers and Optics 1986. - Vol. 41, N 4. - P. 241-244.

205. Oriowo, O. M. Action Spectrum and Recovery for In Vitro UV-Induced Cataract Using Whole Lenses /0. M. Oriowo, A. P. Cullen, B. R. Chou, J. G. Sivak // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. - Vol. 42, N 11. - P. 2596-2602.

206. Pacala, T. J. Ultranarrow linewidth, magnetically switched, long pulse, xenon chloride laser /T. J. Pacala, I. S. McDermid, J. B. Laudenslager // Applied Physics Letters 1984. - Vol. 44, N 7. - P. 658-660.

207. Panchenko, A. N. Long-pulse discharge nitrogen lasers / A. N. Panchenko, I. N. Konovalov, A. I. Suslov, V. F. Tarasenko, A. E. Tel'minov // Proc. SPIE, 2007a. Vol. 6735 - P. 67350G-7.

208. Panchenko, A. N. Gas discharge lasers pumped by generators with semiconductor opening switch / A. N. Panchenko, V. F. Tarasenko, A. E. Tel'minov // Proc. SPIE, 2007b. Vol. 6735 - P. 67350C-10.

209. Papazoglou, T. G. Control of excimer laser aided tissue ablation via laser-induced fluorescence monitoring /T. G. Papazoglou, T. Papaioannou, K. Arakawa, M. Fishbein, V. Z. Marmarelis, W. S. Grundfest // Appl. Opt. 1990. - Vol. 29, N 33.-P. 4950-4955.

210. Perrella, M. Allosteric Proteins: Lessons to be Learned From the Hemoglobin Intermediates M. Perrella, R. Russo // Physiology 2003. - Vol. 18, N 6. - P. 232236.

211. Pokorny, J. Aging of the human lens /J. Pokorny, V. C. Smith, M. Lutze // Appl. Opt. 1987. - Vol. 26, N 8. - P. 1437-1440.

212. Polak, J. M. Introduction to immunocytochemistry / Oxford, OX, UK; New York: BIOS Scientific Publishers ; Springer, 1997.

213. Poise, K. A. Etiology of corneal sensitivity changes accompanying contact lens wear /K. A. Poise // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1978. -Vol. 17, N 12. - P. 1202-6.

214. Poise, K. A. Hypoxic effects on corneal morphology and function /K. A. Poise, R. J. Brand, S. R. Cohen, M. Guillon // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1990. - Vol. 31, N 8. - P. 1542-54.

215. Poniakina, I. D. A rapid method of the rosette formation test /1. D. Poniakina, K. A. Lebedev, D. V. Stefani, M. I. Vasenovich, E. M. Shibanova // Laboratornoe delo- 1983. -N 9. P. 48-50.

216. Popp, J. Biophotonics visions for better health care / Weinheim: Wiley-VCH, 2006.

217. Pshenichnyi, I. P. Kinetics of corneal fluorescence in experimental keratitis /1. P. Pshenichnyi, P. N. Aleksandrov, A. M. Chernukh // Bulletin of Experimental Biology and Medicine 1976. - Vol. 82, N 6. - P. 1767-1769.

218. Pukhov, K. Analiser for chemiluminescence anallysis of white blood cells / B. Jezowska-Trzebiatowska//Proc. World Scientific, 1989. P. 582—590.

219. Raines, M. Vitreous fluorophotometry: a review /M. Raines // Journal of the Royal Society ofMedicine 1988. - Vol. 81, N 7. - P. 403.

220. Ramanujam, N. Development of a multivariate statistical algorithm to analyze human cervical tissue fluorescence spectra acquired in vivo /N. Ramanujam, M. F. Mitchell, A. Mahadevan, S. Thomsen, A. Malpica, T. Wright, N. Atkinson, R.

221. Richards-Kortum // Lasers in Surgery and Medicine 1996. - Vol. 19, N 1. - P. 4662.

222. Ramanujam, N. Fluorescence Spectroscopy In Vivo / N. Ramanujam // Encyclopedia of Analytical Chemistry / Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2000. - P. 20-56.

223. Reinert, K. C. Flavoprotein Autofluorescence Imaging of Neuronal Activation in the Cerebellar Cortex In Vivo /K. C. Reinert, R. L. Dunbar, W. Gao, G. Chen, T. J. Ebner // Journal of Neurophysiology 2004. - Vol. 92, N 1. - P. 199-211.

224. Renault, G. A laser fluorimeter for direct cardiac metabolism investigation /G. Renault, E. Raynal, M. Sinet, J. P. Berthier, B. Godard, J. Cornillault // Optics & Laser Technology 1982. - Vol. 14, N 3. - P. 143-148.

225. Renault, G. Cardiac metabolism monitored by fiberoptic laser fluorimeter /G. Renault, E. Raynal, M. Sinet, M. Muffat-Joly, J.-M. Vallois, J.-P. Berthier, J. Cornillault, B. Godard // American Heart Journal 1984a. - Vol. 108, N 2. - P. 428-429.

226. Renault, G. In situ monitoring of myocardial metabolism by laser fluorimetry: relevance of a test of local ischemia /G. Renault, M. Sinet, M. Muffat-Joly, J. Cornillault, J. J. Pocidalo // Lasers Surg Med 1985. - Vol. 5, N 2. - P. 111-22.

227. Renshaw, S. Immunohistochemistry / Bloxham, Oxfordshire: Scion, 2007.

228. Rex, A. Applications of laser-induced fluorescence spectroscopy for the determination of NADH in experimental neuroscience /A. Rex, F. Fink // Laser Physics Letters 2006. - Vol. 3, N 9. - P. 452-459.

229. Rhodes, C. K. Excimer lasers / C. K. Rhodes Berlin / Heidelberg: Springer, 1979.

230. Richards-Kortum, R. Description and Performance of a Fiber-Optic Confocal Fluorescence Spectrometer /R. Richards-Kortum, A. Durkin, J. Zeng // Applied Spectroscopy 1994. - Vol. 48, N 3. - P. 350-355.

231. Rogatkin, D. A. Multifunctional Laser Noninvasive Spectroscopic System for Medical Diagnostics and Metrological Provisions for That / I. P. J. Georgakoudi, K. Svanberg // European Conference on Biomedical Optics (ECBO) Munich, Germany V 7368 P 73681Y.

232. Rothe, D. Magnetically switched voltage multipliers for high-prf, megavolt pulsed power / // Proc. IEEE, 1992. P. 197.

233. Rovati, L. Auto fluorescence methods in ophthalmology /L. Rovati, F. Docchio // Journal of Biomedical Optics 2004. - Vol. 9, N 1. - P. 9.

234. PULSE MAGNETIC COMPRESSION DEVICE RU2089042C1 RU: H03K3/53; H03B11/00; H03K3/00; / S. N. Rukin; Issuing Organization; INST ELEKTROFIZIKI URAL OTDEL 1997-08-27; - 4 P.

235. Sagnella, D. E. Vibrational population relaxation of carbon monoxide in the heme pocket of photolyzed carbonmonoxy myoglobin: Comparison of time-resolved mid-IR absorbance experiments and molecular dynamics simulations /D.

236. E. Sagnella, J. E. Straub, T. A. Jackson, M. Lim, P. A. Anfinrud // Proceedings of the National Academy of Sciences 1999. - Vol. 96, N 25. - P. 14324-14329.

237. Satoh, K. Fluorescence in human lens /K. Satoh, M. Bando, A. Nakajima // Experimental Eye Research 1973. - Vol. 16, N 2. - P. 167-172.

238. Schmitz-Valckenberg, S. Fundus Autofluorescence Iimaging: Review and Perspectives /S. Schmitz-Valckenberg, F. G. Holz, A. C. Bird, R. F. Spaide // Retina 2008. - Vol. 28, N 3. - P. 385-409

239. Schmitz-Valckenberg, S. Fundus Autofluorescence and Progression of Age-related Macular Degeneration /S. Schmitz-Valckenberg, M. Fleckenstein, H. P. N. Scholl, F. G. Holz // Survey of Ophthalmology 2009. - Vol. 54, N 1. - P. 96-117.

240. Seki, H. Development of a highly efficient nitrogen laser using an ultra-fast magnetic pulse compression circuit /H. Seki, S. Takemori, T. Sato // IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics 1995. - Vol. 1 N 3. - P. 825-829.

241. Setlow, R. B. The Wavelengths in Sunlight Effective in Producing Skin Cancer: A Theoretical Analysis /R. B. Setlow // PNAS 1974. - Vol. 71, N 9. - P. 3363-3366.

242. Siik, S. Light scatter in aging and cataractous human lens /S. Siik, P. J. Airaksinen, A. Tuulonen // Acta Ophthalmologica 1992. - Vol. 70, N 3. - P. 383388.

243. Siik, S. Lens autofluorescence. In aging and cataractous human lenses. Clinical applicability: Dissertation: / University of Oulu, 1999b.

244. Sinyaeva, M. L. Fluorescence diagnostics in dentistry /M. L. Sinyaeva, A. A. Mamedov, S. Y. Vasilchenko, A. I. Volkova, V. B. Loschenov // Laser Physics -2004. Vol. 14, N 8. - P. 1132-1140.

245. Smith, C. H. Terawatts and nanoseconds-Metallic glasses in pulse power systems /C. H. Smith // Journal of Materials Engineering 1990. - Vol. 12, N 1. -P. 35-40.

246. Stavridi, M. Spectro-temporal studies of XeDCl excimer laser-induced arterial wall fluorescence /M. Stavridi, V. Z. Marmarelis, W. S. Grundfest // Medical Engineering &amp; Physics 1995. - Vol. 17, N 8. - P. 595-601.

247. Stewart, A. Pyridine nucleotides in normal and cataractous human lenses /A. Stewart, R. C. Augusteyn // Experimental Eye Research 1984. - Vol. 39, N 3. - P. 307-315.

248. Stolwijk, T. R. Corneal auto fluorescence in diabetic and penetrating keratoplasty patients as measured by fluorophotometry /T. R. Stolwijk, J. A. van Best, J. P. Boot, J. A. Oosterhuis // Experimental Eye Research 1990. - Vol. 51, N 4. - P. 403-409.

249. Stolwijk, T. R. Corneal auto fluorescence: an indicator of diabetic retinopathy /T. R. Stolwijk, J. A. van Best, J. A. Oosterhuis, W. Swart // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1992. - Vol. 33, N 1. - P. 92-7.

250. Sviridov, A. N. Sealed nitrogen laser with 10 kHz pulse repetition frequency /A. N. Sviridov, Y. D. Tropikhin // Soviet Journal of Quantum Electronics 1976. -Vol. 6, N 11. - P. 1333-1335.

251. Sviridov, A. N. Stimulated emission kinetics of an N2 laser under pulseperiodic conditions. I. Theory /A. N. Sviridov, Y. D. Tropikhin // Soviet Journal of Quantum Electronics 1978a. - Vol. 8, N 9. - P. 1136-1141.

252. Sviridov, A. N. Stimulated emission kinetics of an N2 laser under pulseperiodic conditions. II. Experiment /A. N. Sviridov, Y. D. Tropikhin // Soviet Journal of Quantum Electronics 1978b. - Vol. 8, N 10. - P. 1177-1183.

253. Taguchi, H. In vivo quantitation of peroxides in the vitreous humor by fluorophotometry /H. Taguchi, Y. Ogura, T. Takanashi, M. Hashizoe, Y. Honda // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1996. - Vol. 37, N 7. - P. 144450.

254. Tai, D. C. S. Illumination and fluorescence collection volumes for fiber optic probes in tissue /D. C. S. Tai, D. A. Hooks, J. D. Harvey, B. H. Smaill, C. Soeller //Journal of Biomedical Optics 2007. - Vol. 12, N 3. - P. 034033-12.

255. Tarasenko, V. F. Efficiency of a nitrogen UV laser pumped by a self-sustained discharge /V. F. Tarasenko // Quantum Electronics 2001. - Vol. 31, N 6. - P. 489-494.

256. Tarasenko, V. F. Answer to the note 'Once again on the efficiency of a nitrogen laser' /V. F. Tarasenko // Quantum Electronics 2002. - Vol. 32, N 2. - P. 185-186.

257. Tarasenko, V. F. Gas discharge lasers pumped by generators with inductive energy storage / V. F. Tarasenko, A. N. Panchenko, A. E. Tel'minov // Proc. SPIE, 2006. Vol. 6261 - P. 626137-11.

258. Targ, R. Pulse nitrogen laser at high repetition rate /R. Targ // IEEE Journal of Quantum Electronics 1972. - Vol. 8, N 8. - P. 726- 728.

259. Thakker, M. Staphylococcus aureus Serotype 5 Capsular Polysaccharide Is Antiphagocytic and Enhances Bacterial Virulence in a Murine Bacteremia Model /M. Thakker, J.-S. Park, V. Carey, J. C. Lee // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N 11. -P. 5183-5189.

260. Tokunov, Y. M. Ultraviolet longitudinally excited nitrogen lasers / Y. M. Tokunov//Proc. SPIE, 1994. Vol. 2257 - P. 171-174.

261. Trung, D. Q. High-efficiency compact TEA nitrogen laser / D. Q. Trung, T. P. Dat, T. T. Tam, D. D. Manh // Proc. SPIE, 1995. Vol. 2538 - P. 230-235.

262. Tsubota, K. Noninvasive measurements of pyridine nucleotide and flavoprotein in the lens /K. Tsubota, R. A. Laing, K. R. Kenyon // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1987. - Vol. 28, N 5. - P. 785-9.

263. Tsubota, K. Metabolic Changes in the Corneal Epithelium Resulting from Hard Contact Lens Wear /K. Tsubota, R. A. Laing // Cornea 1992. - Vol. 11, N 2. -P. 121-126.

264. Tzolov, V. P. Nitrogen laser employing twin sliding discharges /V. P. Tzolov, K. A. Grozdanov, P. A. Atanasov // Journal of Applied Physics 1994. - Vol. 75, N2. -P. 1210-1212.

265. Uma, L. In situ fluorescence spectroscopic studies on bovine cornea /L. Uma, D. Balasubramanian, S. Yogendra // Photochemistry and Photobiology 1994. -Vol. 59, N5.-P. 557-561.

266. Utzinger, U. Near-Infrared Raman Spectroscopy for in Vivo Detection of Cervical Precancers AJ. Utzinger, D. L. Heintzelman, A. Mahadevan-Jansen, A. Malpica, M. Follen, R. Richards-Kortum // Applied Spectroscopy 2001. - Vol. 55, N8. - P. 955-959.

267. Van Schaik, H. J. Auto fluorescence of the Diabetic and Healthy Human Corneain vivoat Different Excitation Wavelengths /H. J. Van Schaik, C. Alkemade, W. Swart, J. A. Van Best // Experimental Eye Research 1999a. - Vol. 68, N 1. - P. 1-8.

268. Van Schaik, H. J. Autofluorescence Distribution Along the Corneal Axis in Diabetic and Healthy Humans /H. J. Van Schaik, J. Coppens, T. J. T. P. Van den Berg, J. A. Van Best // Experimental Eye Research 1999b. - Vol. 69, N 5. - P. 505-510.

269. Waltman, S. R. A New Objective Slit Lamp Fluorophotometer /S. R. Waltman, H. E. Kaufman // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1970. - Vol. 9, N 4. - P. 247-249.

270. Weber, G. Intramolecular Transfer of Electronic Energy in Dihydro Diphosphopyridine Nucleotide /G. Weber // Nature 1957. - Vol. 180, N 4599. - P. 1409-1409.

271. Weiss, S. Fluorescence Spectroscopy of Single Biomolecules /S. Weiss // Science 1999. - Vol. 283, N 5408. - P. 1676-1683.

272. Welch, A. J. Propagation of fluorescent light /A. J. Welch, C. Gardner, R. Richards-Kortum, E. Chan, G. Criswell, J. Pfefer, S. Warren // Lasers in Surgery and Medicine 1997. - Vol. 21, N 2. - P. 166-178.

273. Wilson, J. Nitrogen laser action in a supersonic flow /J. Wilson // Applied Physics Letters 1966. - Vol. 8, N 7. - P. 159-161.

274. Wilson, T. Three-dimensional imaging in confocal systems /T. Wilson // J Microsc 1989a. - Vol. 153, N Pt 2. - P. 161-9.

275. Wilson, T. Techniques of optical scanning microscopy /T. Wilson // Journal of Physics E: Scientific Instruments 1989b. - Vol. 22, N 8. - P. 532.

276. Wilson, T. Principles of Three Dimensional Imaging in Confocal Microscopes /T. Wilson//Journal of Microscopy 1999. - Vol. 193, N 1. - P. 91-92.

277. Wittenberg, J. B. Myoglobin function reassessed /J. B. Wittenberg, B. A. Wittenberg // Journal of Experimental Biology 2003. - Vol. 206, N 12. - P. 20112020.

278. Yappert, M. C. Age dependence and distribution of green and blue fluorophores in human lens homogenates /M. C. Yappert, S. Lai, D. Borchman // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1992. - Vol. 33, N 13. - P. 3555-3560.

279. Yu, N. T. Fluorescence/Raman intensity ratio for monitoring the pathologic state of human lens /N. T. Yu, M. Bando, J. F. Kuck // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1985. - Vol. 26, N 1. - P. 97-101.

280. Zeimer, R. The performance of a new commercial ocular fluorophotometer in the clinical environment /R. Zeimer, N. Blair, M. Rusin, J. Cunha-Vaz // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1985. - Vol. 222, N 4. - P. 223-224.

281. Zeimer, R. C. A New Method of Measuring in vivo the Lens Transmittance, and Study of Lens Scatter, Fluorescence and Transmittance /R. C. Zeimer, J. M. Noth // Ophthalmic Research 1984. - Vol. 16, N 5. - P. 246-255.

282. Zhou, L. Regulation of lactate production at the onset of ischaemia is independent of mitochondrial NADH/NAD+: insights from in silico studies /L.

283. Zhou, W. C. Stanley, G. M. SaidelTX. Yu, M. E. Cabrera // The Journal of Physiology 2005. - Vol. 569, N 3. - P. 925-937.

284. Zhou, Z. XeCl excimer laser excited by longitudinal discharge /Z. Zhou, Y. Zeng, M. Oiu // Applied Physics Letters 1983. - Vol. 43, N 4. - P. 347-349.

285. Sealed excimer laser with longitudinal discharge and transverse preionization for low-average-power uses: Pat. 5,260,961 USA: HOIS 3/22 / Z. Zhou, F. R. Pothoven, W. R. L.; Issuing Organization; Florod Corporation (Gardena, CA) -Nov. 9,1993 -39 P.

286. Zima, A. V. Effects of cytosolic NADH/NAD+ levels on sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in permeabilized rat ventricular myocytes /A. V. Zima, J. A. Copello, L. A. Blatter // The Journal of Physiology 2004. - Vol. 555, N 3. - P. 727-741.

287. Zuclich, J. A. In situ measurements of lens fluorescence and its interference with visual function /J. A. Zuclich, R. D. Glickman, A. R. Menendez // Investigative Ophthalmology & Visual Science 1992. - Vol. 33, N 2. - P. 410-5.

288. Zuev, V. M. Autofluorescence diagnostic of gynecological diseases ex vivo / V. M. Zuev, L. A. Beliaeva, E. V. Tevlina, G. U. Zaiceva, V. B. Loschenov, A. A. Stratonnikov, A. I. Volkova // Proc. SPIE, 2001. Vol. 4156 - P. 26-30.