Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса

Ульянова, Екатерина Владимировна

Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Ульянова, Екатерина Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса»

Автореферат диссертации на тему "Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса"

На правах рукописи

485491»

УЛЬЯНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса

Специальность 02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 9 СЕН 2011

Москва 2011

4854918

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (ИФХЭ РАН)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ларионов Олег Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович,

доктор химических наук Ларин Александр Васильевич

Ведущая организация:

Институт биохимии имени

А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится 6 октября 2011 года в 15 час. 00 мин на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.259.02 при ИФХЭ РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химической литературы по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 31. ИОНХ РАН.

Автореферат размещен на сайте Института: ЬИр:/рЬусЬе.ac.ru

Автореферат разослан "_' сентября 2011 года.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.259.02

кандидат химических наук

Н.П. Платонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

С развитием ядерной энергетики все более актуальными становятся не только вопросы влияния ионизирующих излучений на живые организмы и среду их обитания, но и вопросы противостояния возникающему в биосистемах в результате воздействия данных излучений окислительному стрессу. Известно, что потенциальной способностью регулировать окислительно-восстановительные процессы обладают вина - источники биологически активных фенольных соединений (ФС) с антиоксидантными и радиопротекторными свойствами. Однако механизм этого процесса неясен. При у-облучении данные соединения претерпевают химические превращения. В связи с этим весьма важными являются исследования влияния радиационного воздействия на состав и физико-химические свойства вин. Метод ВЭЖХ позволяет определять продукты этого воздействия, а также рассчитывать степень превращения исходных веществ. Первое играет важную роль в изучении механизма проявления протекторных свойств вин, а второе необходимо при оценке радиационной устойчивости биологически активных соединений, входящих в их состав, поскольку в последнее время на предприятиях винодельческой отрасли всё чаще используется у-облучение с целью биологической стабилизации вин.

Кроме того, изучение антиоксидантных свойств продукции данной отрасли необходимо для разработки методики экспрессного выявления фальсификатов, например, коньячных изделий, представленных на отечественном рынке. В этом случае перспективным является использование амперометриче-ского метода измерения антиоксидантной активности (АОА), которая характеризует общее содержание фенольных соединений в исследуемом коньяке. Величина антиоксидантной активности, помимо выявления явных случаев фальсификации, позволяет в определенной степени оценить возраст натурального коньяка. Таким образом, развитие комплексного подхода, включающего использование таких физико-химических методов, как хроматография, амперо-

мегрия и др., для исследования антиоксидантных и радиопротекторных свойств винодельческой продукции позволяет решать целый ряд современных задач.

Цель работы; исследование физико-химическими методами (хромато-графическим, спектрофотометрическим, амперометрическим) протекторных свойств фенольных соединений и вин различных сортов, регионов и сроков хранения в условиях у-облучения по отношению к дрожжам Б. сегеУ131ае.

В соответствии с поставленной целью определены задачи диссертации:

1. Выбрать оптимальные с точки зрения поставленных целей условия разделения ФС в винах различных сортов, регионов и сроков хранения, получить их хроматографические и спектральные характеристики.

2. С использованием разработанной методики ВЭЖХ разделить продукты радиационно-химических превращений ФС в винах и растворах индивидуальных соединений, зарегистрировать их спектры и рассчитать степени превращения исходных веществ для оценки их радиационной устойчивости.

3. Сопоставить общие массовые концентрации ФС в винах, а также их радиопротекторные и антиоксидантные активности, определить радиопротекторные активности индивидуальных ФС, с которыми могут быть связаны радиопротекторные свойства вин.

4. Изучить изменение радиопротекторной активности вин в процессе хранения.

5. Изучить зависимость антиоксидантной активности коньяков от их качества и срока выдержки для разработки методики выявления фальсификатов.

Научная новизна определяется совокупностью полученных в работе новых результатов:

1. Впервые получены физико-химические характеристики (хроматографические и спектральные) продуктов радиационно-химических превращений ФС в винах и оценены степени превращения исходных веществ.

ловиях моделирования окислительного стресса проявили протекторные свойства, которые не сохранялись в процессе хранения вин.

3. Амперометрическим методом определены значения АОА ряда вин и коньяков; показано, что, при практически близком содержании ФС в образцах вин из одного сорта винограда, их АОА различны. Вина с более высокими значениями АОА по данным ВЭЖХ отличались большим содержанием радиаци-онно-лабильных ФС, в том числе кверцетина, (+)катехина - соединений, которые относятся к группе сильных антиоксидантов.

4. Методом ВЭЖХ показано, что в результате воздействия радиолиза в винах третьего года хранения произошли менее значительные изменения содержания ФС по сравнению с молодыми винами, т.е. в последних ФС являются более радиационно-лабильными.

5. Установлена зависимость антиоксидантной активности коньяков от их качества, которая может быть использована для разработки методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста продукции.

6. Заложены основы в разработку методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста коньяков с использованием амперометриче-ского определения их антиоксидантной активности.

Практическая значимость:

• Разработан метод исследования радиационно-химической стабильности ряда флавоноидов с использованием обращённо-фазовой ВЭЖХ. Метод может использоваться для прогнозирования поведения флавоноидов в биологических системах, а также при выборе оптимальных фенольных антиоксидантов в медицине, биотехнологии и винодельческой промышленности.

• Полученные физико-химические (хроматографические и спектральные) характеристики природных флавоноидов дополнили существующую базу данных ФС, которая может быть использована при разработке методов разделения и идентификации флавоноидов в сложных смесях, в том числе в винах.

• Заложены основы в разработку методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста коньяков с использованием амперометриче-ского определения их антиоксидантной активности.

• Поскольку наиболее выраженными радиопротекторными свойствами в отношении модельных организмов по данным работы обладали молодые красные вина, то именно их можно рекомендовать для смягчения воздействия ионизирующего излучения на организм человека в зонах с повышенной радиацией.

На защиту выносятся следующие положения:

• сопоставление радиопротекторных и антиоксидантных свойств ряда красных и белых вин с их составом;

• изучение методом обращённо-фазовой ВЭЖХ радиационно-химической стабильности флавоноидов;

• изучение методом обращённо-фазовой ВЭЖХ продуктов радиационно-химических превращений ФС в винах.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи, из них 2 статьи в рекомендованных ВАК научных журналах, и 11 тезисов докладов.

Основные результаты диссертации доложены на научно-практической конференции "Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий" (Углич, 5-6 сентября 2007 г.); симпозиуме "Биотехнология" (Москва, 11-15 марта 2008 г.); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва-Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.), получена грамота; конференции молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2008" (Москва, 11-12 ноября 2008 г.) (получена премия им. члена-корреспондента РАН К.В. Чмутова); Всероссийской конференции "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.); VII Международном Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 19-23 октября 2009 г.); Московской конференции-конкурсе молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2009" (Москва, 1 ноября - 4 декаб-

ря 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции "Хроматография - народному хозяйству" (Дзержинск, 19-23 апреля 2010 г.); V конференции молодых учёных, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН "Физикохимия-2010" (Москва, 1-30 ноября 2010 г.) (III премия).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, четырёх глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (116 наименований). Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 51 рисунок и 32 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цели и задачи, отражены научная и практическая значимость работы.

Обзор литературы обобщает информацию по классификации флавонои-дов, методам их определения в винах и радиационно-химическим превращениям в результате радиолиза; анализируются данные по методам исследования антиоксидантных активностей вин и о роли в этих исследованиях ВЭЖХ, рассмотрены работы, посвященные зависимости антиоксидантной активности вин от состава, затронута проблема фальсификации винодельческой продукции.

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования использовали:

- фенольные соединения (for HPLC, Sigma):

галловая кислота, кофейная кислота, ванилин, сиреневый альдегид, кумарин, эскулетин, 8-нитрозоэскулетин, (+)катехин, морин, кверцетин, рутин, галангин, апигенин, акацетин, нарингин, нарингенин, пиноцембрин, гесперидин;

- образцы красных (Каберне-Совиньон, Мерло) и белых (Совиньон Блан, Шардоне) столовых сухих вин урожая 2005 г. и 2006 г. из разных винодельческих регионов, широко представленных на отечественном рынке. Исследования проводили с образцами вин первого года хранения (1±0,5 лет) и после выдержки образцов этой же партии вин в течение 3±0,5 лет при 16 °С;

-8- образцы коньяков и коньячных спиртов низкого и высокого качества, предварительно проанализированные методом ГХ-МС в лабораториях токсикологии Национального научного центра наркологии Росздрава и центральной химико-токсикологической лаборатории ММА им. И.М.Сеченова.

Оборудование для ВЭЖХ включало: жидкостный хроматограф Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, США), диодно-матричный детектор Agilent 1100 Series Diode Array and Multiple Wavelength Detectors, предколонку Hypersil ODS C18 (5 mkm, 20x2,1 мм) и колонку Hypersil ODS C18 (3 мкм, 100><2,1 мм). Пробы вводили стеклянным микрошприцем для ВЭЖХ Microliter Hamilton (Reno, США) объёмом 25 мкл.

В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил - вода с добавкой ортофосфорной кислоты до значения рН 3. Элюенты: А - вода (рН 3, Н3Р04), В - ацетонитрил (рН 3, Н3Р04). Объём вводимой пробы - 5 мкл. Детектирование ФС проводили при длине волны 230, 254, 280, 330 и 500 нм, спектр сканировали в диапазоне 200 - 700 нм. Температура колонки - 20 °С. Систему кондиционировали 30 минут.

Условия градиентного элюирования для определения продуктов радиолиза индивидуальных ФС и компонентов вин (градиент 1): 0-5 мин. - 3% В, 5-22 мин. - 3-100% В, 22-25 мин. - 100% В, 25-28 мин. - 100-3% В, 28-32 мин. - 3% В. Расход элюента - 300 мкл/мин.

Условия градиентного элюирования для разделения и детектирования флавоноидов в винах (градиент 2): 0-30 мин. - 5-18% В, 30-50 мин. - 18-27,5% В, 50-60 мин. - 27,5-50% В, 60-75 мин. - 50% В. Расход элюента - 200 мкл/мин.

Массовую концентрацию ФС (со) определяли колориметрическим методом с применением реактива Фолина-Чокальтеу.

Антиоксидантную активность (АОА) коньяков и вин определяли на приборе "Цвет Яуза 01-АА" (ОАО НПО "Химавтоматика", Россия) с амперо-метрическим детектором. За единицу АОА принималась активность, проявляемая раствором кверцетина с концентрацией 1 мг/дм3.

Радиационно-химическое моделирование окислительного стресса проводили на установке РХМ-у-20 РХТУ им. Д.И. Менделеева. Источник излучения у-лучей - 60Со. Поглощенная доза 2,5 кГр (при мощности поглощённой дозы 0,26±0,01 Гр/с, определённой по ферросульфатному дозиметру). Облучение проводили в стеклянных бюксах. Спектры оптического поглощения исходных и облучённых растворов записывали на спектрофотометре СФ-2000 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Растворами сравнения служили используемые растворители (бидистиллированная вода и этиловый спирт).

Для определения радиопротекторных свойств дрожжи Б. сегеу1з1ае выращивали в жидкой питательной среде (3,5%-ное солодовое сусло) с добавлением этилового спирта (10 об. %), рН 3,5 при 28 °С. Инокулятом служила культура дрожжей в логарифмической фазе роста. Содержание дрожжей - 107 КОЕ/см3. В инокулят дрожжей вносили исследуемые образцы (индивидуальные флавоноиды или вина), прединкубировали в течение 30 мин. (28 °С), затем подвергали у-облучению и через 30 мин. инкубации (28 °С) определяли численность жизнеспособных клеток.

Для определения реактивирующего действия исследуемые образцы вносили после облучения клеточной суспензии и через 2 ч инкубации (28 °С) определяли численность жизнеспособных клеток дрожжей.

Жизнеспособность дрожжей определяли при высеве соответствующих разведений клеточных суспензий на солодовый агар и выражали в КОЕ/см3. Расчёт радиопротекторного и реактивирующего действий проводился относительно контроля (пробы без добавления образца), принятого за 100 %.

Определение степеней превращения ФС и идентификация продуктов их радиолиза методом ВЭЖХ

С целью идентификации продуктов радиолиза, а также расчёта степеней превращения флавоноидов и кумаринов были получены хроматограммы их 10'3 М растворов в 40% этиловом спирте до и после 1,5 часов радиолиза в присутствии растворённого кислорода. Поскольку анализируемые смеси достаточно

просты, был выбран режим (градиент 1), позволяющий за приемлемое время элюировать основной компонент. Из полученных хроматограмм видно, что в результате облучения происходит уменьшение площадей пиков основных компонентов. Степени их превращения (а) рассчитывались по следующей формуле:

а = 100%

, где Б0 - площадь пика основного компонента до облучения, - площадь пика основного компонента после облучения.

При радиолизе флавоноидов образование продукта радиолиза зарегистрировано только в случае пиноцембрина (рис. 1). Как видно из рисунка, данный продукт элюируется до основного компонента. Продукты радиолиза других флавоноидов являются, вероятно, низкомолекулярными и сильно полярными, поэтому они не удерживаются на используемой колонке. На рис. 2 представлены степени превращения исследованных флавоноидов. Наибольшие степени превращения отмечены для кверцетина, морина, акацетина и апигенина. Возможно, это связано со стабилизацией образующихся из этих молекул радикалов за счёт сопряжения трёх бензольных колец в их структурах. Кроме того, наблюдаются следующие закономерности: кверцетин и нарингенин являются более радиационно-лабильными по сравнению с их соответствующими гликози-дами, рутином и нарингином.

В процессе радиолиза кумаринов происходит нарастание концентраций имеющихся продуктов их окисления, образовавшихся при хранении, а также возникновение новых продуктов. В результате облучения растворов эскулетина образуются продукты с большими временами удерживания, а в случае 8-нитрозоэскулетина - с меньшими, чем у основного компонента. Меньшее время удерживания продукта свидетельствует о его большей полярности (или меньшей молекулярной массе). Таким образом, в первом случае, вероятно, имеет место образование конденсированных соединений, а во втором, как и при радиолизе пиноцембрина, - присоединение полярных алкокси- и гидроксигрупп.

Рис. 1. Хроматограммы 10'3 М раствора пиноцембрина в 40 % этиловом спирте до (п) и после (□) облучения при 280 нм. Спектр приведен для продукта радиолиза.

% превращения

351 30

Я о.

о.

3 »

о §

Рис. 2. Степени превращения флавоноидов в результате радиационно-химического воздействия.

-12В табл. 1 представлены хроматографические данные радиолиза изученных ку-маринов и их АОА. Было установлено, что кумарин имеет минимальную АОА и, в то же время, проявляет наименьшую радиационную лабильность, т. е. имеет минимальную степень превращения. Эти два факта хорошо согласуются друг с другом, однако для эскулетина и 8-нитрозоэскулетина подобной закономерности не выявлено, что подтверждает сложный механизм проявления антиок-сидантной активности.

Таблица 1. Хроматографические данные радиолиза кумаринов и их АОА.

Вещество tr, мин. 5до обл.» AU* s ^послеобл.) AU*S a, % АО A, мг/л

Coum 13,93 1090 1070 <2 0,05

Esc 11,44 4100 3800 7 2,55

8-NO-Esc 13,32 1740 1420 18 1,40

Coum - кумарин, Esc - эскулетин, 8-NO-Esc - 8-нитрозоэскулетин,

tr- время удерживания, 5ДООбл, Snoaieo6* - площади пиков до и после облучения.

Исследование радиопротекторной активности вин Проведена оценка возможности использования клеток дрожжей в качестве биологического объекта при определении радиопротекторной активности и реактивирующей способности индивидуальных ФС: рутина, гесперидина, квер-цетина, нарингина, нарингенина, апигенина, пиноцембрина, морина, акацетина, (+)катехина. Результаты исследований представлены в табл. 2. Установлено, что все исследованные вещества в условиях моделирования окислительного стресса проявили радиопротекторную активность по отношению к клеткам дрожжей, т.е. способствовали сохранению их жизнеспособности при воздействии у-облучения. В наибольшей степени данное свойство было выражено у гесперидина, (+)катехина и нарингина; в наименьшей степени - у нарингенина, пиноцембрина и акацетина. Как было отмечено ранее, кверцетин и нарингенин являются более радиационно-лабильными по сравнению с их соответствующими гликозидами, рутином и нарингином. Следовало бы ожидать, что и радиопротекторные активности первых двух веществ будут выше. Однако радиопро-

текторная активность рутина близка к активности кверцетина, а активность на-рингина значительно превышает активность нарингенина.

Таблица 2. Радиопротекторная активность и реактивирующее действие инди^ видуальных флавоноидов (в %).__

Соединение Радиопротекторная активность Реактивирующее действие

Контроль 100 100

Рутин 125 63

Гесперидин 182 65

Кверцетин 127 78

Нарингин 157 69

Нарингенин 112 64

Апигенин 127 85

Пиноцембрин ИЗ 72

Морин 139 81

Акацетин 114 72

(+)катехин 169 88

Полученные результаты убедительно показали, что клетки дрожжей Б. сегеу1$1ае могут служить модельной системой для оценки защитных свойств различных флавоноидов, не относящихся к метаболитам дрожжей, и позволили использовать данный метод для установления радиопротекторных свойств вин.

В табл.3 представлены результаты определения антиоксидантных и радиопротекторных активностей вин, а также массовых общих концентраций в них ФС. Как видно из табл., по содержанию ФС как красные, так и белые вина одного наименования, но произведенные в разных регионах, незначительно отличались между собой. Однако содержание ФС в красных винах в среднем в 8 раз больше, чем в белых. Следует обратить внимание, что при практически близком содержании ФС в образцах вин одного наименования их АОА различны. Так, в красных винах Чили АОА в 5 раз, а в белых - в 2 раза выше, чем в исследованных образцах аналогичных марок французских вин. Таким образом, за проявление антиоксидантных свойств вин ответственны не только феноль-ные вещества, но и вещества нефенольной природы.

Таблица 3. Антиоксидантная (АОА) и радиопротекторная (РА) активности об' разцов вин и общее содержание в них фенольных соединений (со).__

№ п/п Наименование образца со, г/л АОА, мг/л РА, %

Вина столовые сухие красные

1 Каберне Совиньон №1, Франция 2,4 135,1 124

2 Каберне Совиньон №2,Чили 1,9 593,0 132

3 Каберне Совиньон №3, Чили 2,2 802,2 140

4 Мерло №1,Франция 1,8 111,1 101

5 Мерло №2, Чили 1,9 757,9 127

6 Мерло №3 ,Чши 2,0 517,7 135

Вина столовые сухие белые

7 Совиньон Блан №1, Франция 0,3 72,1 102

8 Совиньон Блан №2,Чили 0,2 162,6 103

9 Совиньон Блан №3,¥шш 0,2 153,5 101

10 Шардоне №1, Франция, 0,3 87,9 105

11 Шардоне №2, Чили 0,3 282,1 103

12 Шардоне №3,Чия« 0,2 137,6 102

Далее по тексту номер образца вина соответствует порядковому номеру в табл. 3

Радиопротекторными свойствами обладали практически все образцы красных вин. Исключение составил образец Мерло № 4, доля выживших клеток дрожжей в котором незначительно отличалась от контроля. Следует также отметить, что образец Каберне-Совиньон № 1, имея низкое значение антиоксидантной активности, в условиях у-облучения проявил высокую радио протекторную активность. Антиоксидантная активность чилийского белого вина Шардоне №2 более чем в 2 раза превосходила соответствующую величину для французского Каберне-Совиньон, однако радиопротекторных свойств данный образец, как и другие белые вина, почти не проявил. Таким образом, корреляция между анти-оксидантными и радиопротекторными свойствами вин не наблюдалась. Отсутствие радиопротекторных свойств белых вин может быть обусловлено меньшим содержанием в них, по сравнению с красными винами, всех форм ФС, в т.ч. и антоцианов.

Известно, что в процессе хранения вин происходят различные реакции окислительной конденсации и полимеризации ФС, что приводит к изменению биохимического состава вин и влияет на их протекторные свойства. По данным

работы оказалось, что красные вина через три года хранения полностью теряют радиопротекторные свойства.

Хроматографическое определение ФС и продуктов их радиационно-химических превращений в вине

ВЭЖХ в обращённо-фазовом варианте - один из наиболее широко используемых методов для определения ФС в винах. Для работы нами был выбран обращённо-фазовый сорбент Hypersil ODS.

Известно, что для каждой группы исследуемых ФС необходимо подобрать свои условия хроматографического разделения. Поскольку в работе предполагалось изучать сложные смеси ФС в присутствии веществ нефенольной природы с широким диапазоном полярностей до и после радиолиза, то необходимо было выбрать оптимальный градиентный режим элюирования, позволяющий за сравнительно небольшой промежуток времени получать достаточное хроматографическое разделение изучаемых соединений.

Была составлена модельная смесь из наиболее часто встречающихся в природе флавоноидов с различными полярностями. Для выбора оптимальных условий элюирования были изучены хроматографические параметры модельной смеси флавоноидов, полученные при их разделении в нескольких градиентных режимах. Таким образом, на основании проведённого исследования и литературных данных были выбраны оптимальные условия (градиент 2) хроматографического разделения и детектирования ФС в винах. В выбранных условиях получена хроматограмма модельной смеси (рис. 3). Результаты измерения времён удерживания и площадей пиков компонентов модельной смеси приведены в табл. 4. Погрешности их определения не превышали 0,5 и 7 %, соответственно. В табл. 5 представлены хроматографические параметры модельной смеси, полученные при температуре колонки 20°С. Как видно из данной таблицы, коэффициенты ёмкости (к') для большинства соединений, составляющих модельную смесь, очень.велики. В тех же условиях, в которых была получена хроматограмма модельной смеси, был выполнен анализ четырёх красных

вин производства Франции, Венгрии, Чили и Италии на содержание рутина,

кверцетина, катехина и галловой кислоты. В табл. 6 приведены времена удерживания идентифицированных ФС, относительные стандартные отклонения (ЯБО) их определения и соответствующие значения к.

Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси флавоноидов

Таблица 4. Оценка воспроизводимости результатов хроматографического определения флавоноидов (п=5, Р=0,95) на колонке Hypersil ODS С18 (3 мкм, 100x2,1 мм) (прибор Agilent 1100 Series).__

Названия соединений tr, мин. S, mAU*s

Рутин 30,36±0,07 4400±200

Нарингин 32,81±0,05 8600±600

Морин 42,46±0,07 8500±600

Кверцетин 48,2±0,2 6300±200

Нарингенин 50,3±0,2 12900±900

Апигенин 55,7±0,1 6000±300

Пиноцембрин 62,5±0,2 1210±60

Галангин 63,6±0,3 990±30

Акацетин 65,8±0,2 550±20

Таблица 5. Хроматографические параметры модельной смеси на колонке

Названия соединений к' n кв а8

Рутин 15,4 36083 1,61 1,45

Нарингин 16,7 23812 9,57 1,17

Морин 21,9 20051 5,42 2,33

Кверцетин 25,1 37957 1,90 2,12

Нарингенин 26,2 32035 5,03 1,51

Апигенин 29,1 50330 1,16 2,55

Пиноцембрин 32,8 219825 1,05 1,42

Галангин 33,4 368030 3,52 1д1

Акацетин 34,6 93911 1,68

Примечание к табл. 4: к' - коэффициент ёмкости; N - число теоретических тарелок; - разрешение; А5 - коэффициент асимметрии.

Таблица 6. Воспроизводимость времён удерживания и коэффициент ёмкости ФС вин. _

Аналит 1г, мин. яво, % к*

рутин 30,3 0,34 15,4

кверцетин 48,2 0,21 25,1

галловая кислота 5,4 0,10 1,9

кофейная кислота 8,5 0,12 4,3

(+)катехин 14,2 0,38 6,7

Как видно из данной таблицы, времена удерживания не очень хорошо воспроизводятся, а к для кверцетина очень велик. Для определения содержаний рутина, кверцетина, (+)катехина, кофейной и галловой кислот в винах были построены градуировочные графики по 6 точкам, для каждой точки было выполнено по 3 измерения. В табл. 7 приведены линейные диапазоны определения данных соединений, пределы их обнаружения, рассчитанные по Зэ-критерию, а также коэффициенты корреляции полученных градуировочных прямых. Линейные диапазоны были определены после серии инжекций стандартной смеси, содержащей различные концентрации исследуемых веществ. В табл. 8 представлены результаты количественного определения упомянутых ФС, кроме кофейной кислоты, в красных винах четырёх стран-производителей, которые были выбраны для апробации методики. Содержание кофейной кислоты в красных винах значительно ниже, чем в белых. Обнаружить в них данное соедине-

ние не удалось. Установлено, что вино производства Венгрии по сравнению с другими содержит очень мало ФС. Наиболее богато кверцетином и рутином чилийское вино.

Таблица 7. Параметры количественного определения ФС в образцах вин.

Аналит ПО, мг/л Линейный диапазон, мг/л Коэффициент корреляции

Рутин 0,6 1-30 0,9957

кверцетин 0,060 0,100-100 0,9933

галловая кислота 0,090 0,100-70 0,9998

кофейная кислота 0,050 0,050 - 50 0,9942

(+)катехин 1,5 10-200 0,9951

Таблица 8. Содержание ФС (мг/л) в образцах красных вин некоторых стран.

.Аналит Чили Франция Венгрия Италия

Рутин 3,0±0,2 2,8±0,7 <ПО 1,3±0,4

кверцетин 40,2±0,7 10,7±0,7 5,1±0,3 11,3±0,9

галловая кислота 47,2±0,5 34,1±0,2 14,1±0,1 20,1 ±0,2

(+)катехин 59,3±0,7 24,0±0,7 10,8±0,2 33,7±0,7

Поскольку в четырёх красных винах, выбранных для апробации методики, были количественно определены только четыре ФС со значительно различающимися временами удерживания, для эффективного проведения дальнейших исследований и экономии времени предложен режим элюирования, использовавшийся ранее для определения продуктов радиолиза индивидуальных соединений (градиент 1).

Для фенольных веществ красных вин характерны четыре области спектра поглощения: в УФ-области при Х=200-230 нм (танины), 1=240-290 нм (лейкоан-тоцианы, флавононы, танины), Х=256-370 нм (оксикоричные и оксибензойные кислоты), и в видимой области при Х=420-580 нм (антоцианы). Для белых вин характерны полосы поглощения первых трех областей. Об изменении содержаний неидентифицированных компонентов вина судили по увеличению или уменьшению площадей соответствующих пиков на хроматограммах, записанных при 280 и 334 нм. Количественное соотношение отдельных групп соедине-

ний на хроматограмме оценивали по суммам площадей пиков, определенных при 230,254,280,334 и 500 нм и выраженных в относительных единицах.

Для того чтобы проанализировать изменение состава вин в процессе радиолиза и хранения были получены хроматограммы молодых белых и красных вин производства Франции и Чили с наименьшими и наибольшими АОА в своих группах (образцы №№ 1, 3, 10, 11 в табл.3) до и после радиолиза, а также хроматограммы этих же вин после трехлетнего хранения.

При взаимодействии ФС с образовавшимися при радиолизе активными формами кислорода (АФК) возможно уменьшение концентраций исходных веществ и возникновение новых оптически активных соединений. Из табл. 9 видно, что из двух вин одного наименования вино с более высоким значением АОА отличалось большим содержанием кверцетина, (+)катехина и кофейной кислоты - соединений, которые относятся к группе сильных антиоксидантов. В случае галловой кислоты данной закономерности не наблюдалось.

За время хранения и в процессе радиолиза в образцах чилийских вин Ка-берне-Совиньон и Шардоне произошло более значительное изменение концентраций фенольных соединений, чем в соответствующих образцах французских вин. Скорее всего, это также связанно с более высокими исходными АОА чилийских вин. В молодых винах, как белых, так и красных, ФС оказались более радиационно-лабильными, о чём свидетельствуют более значительные изменения содержаний всех исследуемых групп соединений. Это объясняется тем, что ФС в молодых винах находятся в неустойчивой конформационной форме и под действием ионизирующего излучения, вызывающего окислительную деструкцию, переходят в другие, более активные формы - семихиноны, которые могут либо конденсироваться в высокомолекулярные соединения с другой АОА, либо регенерировать и переходить в исходные соединения. После воздействия радиолиза в винах третьего года хранения произошли менее значительные изменения содержания ФС по сравнению с молодыми винами. Это свидетельствует о том, что конформационные формы ФС последних, как более чувствительные, переходят за время хранения в стабильные формы.

Таблица 9. Содержание индивидуальных ФС в образцах красных и белых вин первого и третьего годов хранения до и после радиолиза (мг/дм )._

№ образца год хранения кверцетин (+)катехин кофейная к-та галловая к-та

ДО обл. после обл. ДО обл. после обл. ДО обл. после обл. ДО обл. после обл.

1 1-ый 24,6 5,7 49,6 39,9 - - 61,6 59,6

3-ий 4,3 7,3 24,9 31,5 - - 56,6 54,8

3 1-ый 26,0 - 89,7 79,8 - - 26,9 24,0

3-ий - - 21,5 18,1 - - 54,4 54,8

10 1-ый - - 4,0 5,2 8,0 0 - -

3-ий 29,7 30,7 19,3 18,7 - -

11 1-ый - - 6,5 4,8 9,6 18,7 - -

3-ий - - 24,6 26,8 27,0 24,9 - -

Условные обозначения: «- » - ниже предела обнаружения

В Шардоне№1 содержание флавоноидов снизилось на 10 %, а оксикоричных и оксибензойных на 20 %, тогда как в Шардоне № 2 на 1 и 6 % соответственно. В красных винах произошло незначительное увеличение содержаний всех групп ФС, кроме содержания оксикоричных и оксибензойных кислот в образце Каберне Совиньон № 1, которое снизилось на 20%. При этом в данном вине на 23 % повысилось содержание флавонов, что, вероятно, связано с расщеплением полимерных молекул в результате радиолиза, которые в Каберне Совиньон № 1 оказались наименее стабильными.

Потерю радиопротекторных свойств красных вин третьего года хранения можно объяснить уменьшением содержания отдельных форм ФС, в т.ч. и анто-цианов, а также снижением содержания кверцетина и (+)катехина. Кроме того, возможно уменьшение биодоступности ФС в результате образования в процессе хранения полимерных форм, которые не способны проникнуть сквозь клеточную стенку.

Применение амперометрического метода для выявления фальсификатов коньячной продукции

Представляет интерес разработка методики, позволяющей из огромного потока контрольных образцов коньячной продукции быстро выявлять большую часть фальсификатов. С этой целью перспективным является использование амперометрического метода измерения антиоксидантной активности, которая характеризует общее содержание ФС в исследуемом коньяке. Величина антиоксидантной активности, помимо выявления явных случаев фальсификации, позволяет в определенной степени оценить возраст натурального коньяка. При этом следует признать, что для реализации методики необходимо накопление огромного количества статистического материала.

В табл. 10 приведены значения антиоксидантной активности исследованных образцов коньяков. Как видно из данной таблицы, антиокидантные активности натуральных коньяков (образцы 10-15), кроме коньяка Грейт Велли Царь Тигран трёхлетней выдержки, значительно выше, чем фальсифицированных (образцы 1-9). Вероятно, это связано с разбавлением коньяков ректифицированным спиртом или водно-спиртовой смесью, или недостаточным сроком выдержки и, как следствие, более низким содержанием ФС в последних. При увеличении срока выдержки натурального коньяка Грейт Велли Царь Тигран от 3 до 12 лет, т.е. в 4 раза, его антиокидантная активность также возрастает в 4 раза. При дальнейшем увеличении срока выдержки данного коньяка до 30 лет, его антиоксидантная активность возрастает ещё на 20%. Антиоксидантная активность фальсифицированного пятизвездочного в-Б коньяка в 3 раза выше, чем трёхзвёздочного.

Таблица 10. Антиоксидантная активность образцов коньяков.

№ Название АОА, мг/л № Название АОА, мг/л

1 Коньяк армянский 5* 11,0 9 Коньяк российский 5* 10,1

2 Коньяк российский 10,7 10 Бастион КВВК 18,8

3 Коньяк 3* 11,7 11 Грейт Велли Царь Ти-гран 3 года 10,9

4 Коньяк Три Звезды 3,2 12 Грейт Велли Царь Ти-гран 12 лет 44,0

5 Винный дистиллят (Франция) 14,1 13 Грейт Велли Царь Ти-гран 30 лет 53,3

6 Коньяк (Украина) 8,1 14 КС Дербентский з-д 54,4

7 Коньячный спирт №1 18,4 15 Бастион 4 года 22,6

8 Коньяк 5 звездочек 10,5

Выводы

1. Установлено, что наибольшей радиопротекторной активностью в отношении дрожжей 8. сегеу!з1ае среди исследованных флавоноидов обладают гесперидин, (+)катехин и нарингин, наименьшей - нарингенин, пиноцембрин и акацетин. Радиопротекторное действие было установлено практически для всех образцов красных вин первого года хранения. Белые вина, а также вина третьего года хранения не обладали радиопротекторным действием.

2. Показано, что метод ВЭЖХ можно использовать для исследования протекторных свойств вин в условиях у-облучения, поскольку данным методом удалось разделить и зарегистрировать спектры продуктов радиолиза, а также рассчитать степени превращения исходных веществ.

3. Для индивидуальных фенольных соединений (ФС) наблюдается следующая закономерность: вещества, обладающие низкой антиоксидантной активностью (АОА), проявляют наименьшую радиационную лабильность по данным ВЭЖХ.

4. Если рассматривать вина из одного сорта винограда, то за время хранения и в процессе радиолиза в тех из них, которые обладали более высоким значением АОА (чилийские вина), по данным ВЭЖХ произошли более значительные изменения концентраций ФС, чем в других (французские вина).

-235. Методом ВЭЖХ показано, что в результате воздействия радиолиза в винах третьего года хранения произошли менее значительные изменения содержания ФС по сравнению с молодыми винами, т.е. в последних ФС являются более радиационно-лабильными.

6. Установлена зависимость антиоксидантной активности коньяков от их качества, которая может быть использована для разработки методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста продукции.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Андриевская Д.В., Песчанская В.А., Рейтблат Б.Б., Урусова J1.M., Ре-вина A.A., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Научно-практическая конференция "Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий" (Углич, 5-6 сентября 2007 г.) Тезисы. Углич. 2007. с. 22-24

2. Оганесянц J1.A., Песчанская В.А., Ревина A.A., Андриевская Д.В., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Симпозиум "Биотехнология" (Москва, 11-15 марта 2008 г.). Тезисы. Москва. 2008.

3. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A., Андриевская Д.В., Урусова Л.М. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва - Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.) Тезисы. Москва -Клязьма. 2008. с. 168

4. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A., Фенин A.A. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва -Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.) Тезисы. Москва - Клязьма. 2008. с. 169

5. Кочетова М.В., Ларионов О.Г., Ульянова Е.В. Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ. // Сорбционные и хромато-графические процессы. 2008. Т.8 №4 С.658-667

6. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г. Конференция молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2008" (Москва, 11-12 ноября 2008 г.). Тезисы. Москва. 2008. с. 43

-247. Яшин А .Я., Федина П.А., Ревина A.A., Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Белякова Л.Д. Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.) Тезисы. Самара. 2009. с. 242

8. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Антропова И.Г., Фенин A.A., Тимонина O.K. Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.) Тезисы. Самара. 2009. с. 213

9. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A. VII Международный Симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 19-23 октября 2009 г.) Тезисы. Москва. 2009. с. 263

10. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A. Московская конференция-конкурс молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2009" (Москва, 1 ноября - 4 декабря 2009 г.). Тезисы. Москва. 2009. с. 88

11. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г. Всероссийская научно-практическая конференция "Хроматография - народному хозяйству" (Дзержинск, 19-23 апреля 2010 г.). Тезисы Дзержинск. 2010. с. 27

12. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A., Андриевская Д.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании антиоксидантных свойств вин. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т.10 №4 С.522-532

13. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Ревина A.A., Андриевская Д.В., Фенин A.A. V конференция молодых учёных, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН "Физикохимия-2010" (Москва, 1 - 30 ноября 2010 г.). Тезисы. Москва. 2010. с. 14

14. Оганесянц Л.А., Андриевская Д.В., Песчанская В.А., Урусова Л.М., Ревина A.A., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Влияние различных сроков хранения на биологическую ценность вин. // Виноделие и виноградарство. 2010. №6 С.11-14

Подписано в печать: 01.09.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 468 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, 6/1 (495)978-43-34; www.reglet.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Ульянова, Екатерина Владимировна

Введение

СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Понятия "антиоксидант" и "антиоксидантная активность"

1.2. Общая характеристика флавоноидов

1.2.1. Флавоноиды вина

1.3. Физико-химические методы обработки вин

1.3.1. Радиационно-химические методы обработки вин

1.4. Методы определения антиоксидантной активности вин

1.4.1. Прямые методы

1.4.2. Косвенные методы

1.4.3. Роль ВЭЖХ в исследовании антиоксидантной 29 активности вин

1.5. Методы определения полифенолов в винах

1.5.1. Пробоподготовка образцов вин для анализа

1.5.2. Детекторы для определения флавоноидов в ви- 35 нах

1.5.3. Сорбенты для определения флавоноидов в винах

1.5.4. Подвижные фазы для определения флавоноидов 37 в винах

1.5.5. Примеры определения флавоноидов в винах

1.6. Зависимость антиоксидантной активности вин от состава

1.7. Проблема фальсификации винодельческой продукции 44 Выводы главы

Экспериментальная часть

Глава 2. Исходные вещества, приборы, методики экспериментов

2.1. Растворы, реагенты, объекты исследования

2.2. Приборы и методы исследования

Формулы для расчёта

Глава 3. Определение степеней превращения фенольных веществ и 53 идентификация продуктов их радиолиза методом ВЭЖХ

Глава 4. Исследование антиоксидантных и радиопротекторных 63 свойств вин

4.1. Хроматографическое определение фенольных веществ в 66 вине

4.2. Радиационно-химические превращения фенольных ве- 80 ществ в вине

Глава 5. Применение хроматографического и амперометрического 110 методов для выявления фальсификатов коньячной продукции

Выводы

Введение диссертация по химии, на тему "Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании протекторных свойств вин в условиях окислительного стресса"

Актуальность темы.

Кроме того, изучение антиоксидантных свойств продукции данной отрасли необходимо для разработки методики экспрессного выявления фальсификатов, например, коньячных изделий, представленных на отечественном рынке. В этом случае перспективным является использование амперометри-ческого метода измерения антиоксидантной активности (АОА), которая характеризует общее содержание фенольных соединений в исследуемом коньяке. Величина антиоксидантной активности, помимо выявления явных случаев фальсификации, позволяет в определенной степени оценить возраст натурального коньяка. Таким образом, развитие комплексного подхода, включающего использование таких физико-химических методов, как хроматография, амперометрия и др., для исследования антиоксидантных и радиопротекторных свойств винодельческой продукции позволяет решать целый ряд современных задач.

Цель работы: исследование физико-химическими методами (хромато-графическим, спектрофотометрическим, амперометрическим) протекторных свойств фенольных соединений и вин различных сортов, регионов и сроков хранения в условиях у-облучения по отношению к дрожжам 8. сегеу1з!ае.

В соответствии с поставленной целью определены задачи диссертации:

2. С использованием разработанной методики ВЭЖХ разделить продукты радиационно-химических превращений, ФС в винах и растворах индивидуальных соединений, зарегистрировать их спектры и. рассчитать степени превращения исходных веществ для оценки их радиационной устойчивости.

4. Изучить изменение радиопротекторной активности вин в процессе хранения.

Научная новизна определяется совокупностью полученных в работе новых результатов:

1. Впервые получены физико-химические характеристики (хромато-графические и спектральные) продуктов радиационно-химических превращений ФС в винах и оценены степени превращения исходных веществ.

2. Определены радиопротекторные активности и реактивирующие способности индивидуальных ФС и вин по отношению к клеткам дрожжей; показано, что все исследованные флавоноиды, а также молодые красные вина в условиях моделирования окислительного стресса проявили протекторные свойства, которые не сохранялись в процессе хранения вин.

3. Амперометрическим методом определены значения АОА ряда вин и коньяков; показано, что, при практически близком содержании ФС в образцах вин из одного сорта винограда, их АОА различны. Вина с более высокими значениями АОА по данным ВЭЖХ отличались большим содержанием радиационно-лабильных ФС, в том числе кверцетина, (+)катехина - соединений, которые относятся к группе сильных антиоксидантов.

6. Заложены основы в разработку методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста коньяков с использованием амперометри-ческого определения их антиоксидантной активности.

Практическая значимость:

• Разработан метод исследования радиационно-химической стабильности ряда флавоноидов с использованием обращённо-фазовой ВЭЖХ. Метод может использоваться для прогнозирования поведения флавоноидов в биологических системах, а также при выборе оптимальных фенольных антиокси-дантов в медицине, биотехнологии и винодельческой промышленности.

• Заложены основы в разработку методики экспрессного выявления фальсификатов и оценки возраста коньяков с использованием амперометри-ческого определения их антиоксидантной активности.

На защиту выносятся следующие положения:

• сопоставление радиопротекторных и антиоксидантных свойств ряда красных и белых вин с их составом;

• изучение методом обращённо-фазовой ВЭЖХ радиационно-химической стабильности флавоноидов;

• изучение методом обращённо-фазовой ВЭЖХ продуктов радиацион-но-химических превращений ФС в винах.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи, из них 2 статьи в рекомендованных ВАК научных журналах, и 11 тезисов докладов.

Основные результаты диссертации изложены в публикациях и доложены на научно-практической конференции "Интеграция- фундаментальных и прикладных исследований — основа развития современных аграрно-пищевых технологий" (Углич, 5-6 сентября 2007 г.); симпозиуме "Биотехнология" (Москва, 11-15 марта 2008 г.); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва — Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.); конференции молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2008" (Москва, 11-12 ноября 2008 г.); Всероссийской конференции "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.); VII Международном Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 19-23 октября 2009 г.); Московской конференции-конкурсе молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2009" (Москва, 1 ноября — 4 декабря 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции "Хроматография — народному хозяйству" (Дзержинск, 19-23 апреля 2010 г.); V конференции молодых учёных, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН "Физикохимия-2010" (Москва, 1-30 ноября 2010 г.).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Андриевская Д.В., Песчанская В.А., Рейтблат Б.Б., Урусова JI.M., Рё-вина A.A., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Научно-практическая конференция "Интеграция фундаментальных и прикладных исследований — основа развития современных аграрно-пищевых технологий" (Углич, 5-6 сентября 2007 г.) Тезисы. Углич. 2007. с. 22-24

2.0ганесянц JI.A., Песчанская В.А., Рёвина A.A., Андриевская Д.В., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Симпозиум "Биотехнология" (Москва, 11-15 марта 2008 г.). Тезисы. Москва. 2008.

3.Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A., Андриевская Д.В., Урусова JI.M. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва - Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.) Тезисы. Москва — Клязьма. 2008. с. 168 (получена грамота)

4. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A., Фенин A.A. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хромато-масс-спектромерия" (Москва -Клязьма, 14-18 апреля 2008 г.) Тезисы. Москва — Клязьма. 2008. с. 169

5.Кочетова М.В., Ларионов О.Г., Ульянова Е.В. Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ. // Сорбционные и хро-матографические процессы. 2008. Т.8 №4 С.658-667

6.Ульянова Е.В., Ларионов О.Г. Конференция молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2008" (Москва, 11-12 ноября 2008 г.). Тезисы. Москва. 2008. с. 43 (получена премия им. члена-корреспондента РАН К.В. Чмутова)

7.Яшин А .Я., Федина П.А., Рёвина A.A., Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Белякова Л.Д. Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.) Тезисы. Самара. 2009. с. 242

8. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Антропова И.Г., Фенин A.A., Тимони-на O.K. Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии." (Самара, 6-10 июля 2009 г.) Тезисы. Самара. 2009. с. 213

9.Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A. VII Международный Симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 19-23 октября 2009 г.) Тезисы. Москва. 2009. с. 263

10. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A. Московская конференция-конкурс молодых учёных, аспирантов и студентов "Физикохимия-2009" (Москва, 1 ноября - 4 декабря 2009 г.). Тезисы. Москва. 2009. с. 88

12. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A., Андриевская Д.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании антиоксидант-ных свойств вин. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10 №4 С.522-532

13. Ульянова Е.В., Ларионов О.Г., Рёвина A.A., Андриевская Д.В., Фенин A.A. V конференция молодых учёных, аспирантов и студентов ИФХЭ

РАН "Физикохимия-2010" (Москва, 1-30 ноября 2010 г.). Тезисы. Москва. 2010. с. 14 (заняла III место)

14. Оганесянц JI.A., Андриевская Д.В., Песчанская В.А., Урусова JI.M., Рёвина A.A., Ульянова Е.В., Фенин A.A. Влияние различных сроков хранения на биологическую ценность вин. // Виноделие и виноградарство. 2010. №6 С.11-14

Заключение диссертации по теме "Физическая химия"

Выводы

1. Установлено, что наибольшей радиопротекторной активностью в отношении дрожжей 8. сегеу1з1ае среди исследованных флавоноидов обладают гесперидин, (+)катехин и нарингин, наименьшей — нарингенин, пиноцем-брин и акацетин. Радиопротекторное действие было установлено практически для всех образцов красных вин первого года хранения. Белые вина, а также вина третьего года хранения не обладали радиопротекторным действием.

3. Для индивидуальных фенольных соединений наблюдается следующая закономерность: вещества, обладающие низкой антиоксидантной активностью, проявляют наименьшую, радиационную лабильность по данным ВЭЖХ.

4. Если рассматривать вина из одного сорта винограда, то за время хранения и в процессе радиолиза в тех из них, которые обладали более высоким значением антиоксидантной активности (чилийские вина), по данным ВЭЖХ произошли более значительные изменения концентраций фенольных соединений, чем в других (французские вина).

5. Методом ВЭЖХ показано, что в результате воздействия радиолиза в винах третьего года хранения произошли менее значительные изменения содержания фенольных соединений по сравнению с молодыми винами, т.е. в последних фенольные соединения являются более радиационно-лабильными.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ульянова, Екатерина Владимировна, Москва

1. Prior R.L., Cao G. 1. vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods. // Free Rad. Biology & Medicine. 1999. V.27. N. 11/12. P. 1173-1181.

2. Никифорова Т.Е., Козлов B.A., Багровская H.A., Родионова М.В. Сорб-ционная очистка вин. // Химия растительного сырья. 2007. N.1 С.69-73.

3. Sun В., Spranger I., Yang J., Leandro C., Guo L., Canario S., Zhao Y., Wu C. Red wine phenolic complexes and their in vitro antioxidant activuty. // J. Agr. Food Chem. 2009 V.57. 8623-8627.

4. Shu-Ping Wang, Kuo-Jun Huang Determination of flavonoids by highperformance liquid chromatography and capillary electrophoresis. // J. Chromatog. A 2003. V.1032. P.273-279.

5. Kerem Z., Bravdo В., Shoseyov O., Tugendhaft Y. Rapid liquid chromatog-raphy-ultraviolet determination of organic acids and phenolic compounds in red wine and must. // J. Chromatog. A 2004. V.1032. P.211-215.

6. Rodrigo R., Rivera G. Renal damage mediated by oxidative stress: a hypothesis of protective effects of red wines. // Free Rad. Biology & Medicine. 2002. V.33. N.3. P. 409-422.

7. Robert M. Hackman, John A. Polagruto, Qin Yan Zhu, Buxiang Sun, Hajime Fujii, Carl L. Keen. Flavanols: digestion, absorption and bioactivity. // Phytochem Rev. 2008. V.7. P. 195-208.

8. Giovanelly G., Brenna O.V. Oxidative stability of red wine stored in package with different oxygen permeatability. // Eur Food Res Technol. 2007. V.226. P.169-179.

9. Эмануэль Н.М. Биофизические аспекты действия физических и химических факторов на живые организмы. Защитные свойства антиоксидантов. // Биофизика. 1984. Т.29. N.4. С.706-719.

10. Moreno-Arribas M.V., Polo M.C. (eds.) Wine Chemistry and Biochemistry. New York: Springer Science + Business Media. 2009. 465 p.

11. Багиян JI.B. Изменение химического состава виноградных вин при криообработке. //Известия вузов. Пищевая технология. 2009. N.4. С. 30-32

12. Исламов М.Н., Исмаилов Т.А., Кишковский З.Н. Исследование возможности применения электродиализа для биологической стабилизации виноградных вин- и соков. // Современные проблемы науки и образования. 2007. N.6. www.rae.ru

13. Узун Л.Н., Христюк В.Т. Изменение содержания' фенольных веществ виноматериала в результате обработки мезги электромагнитным полем. // Известия вузов. Пищевая технология. 2003. N.5-6. С. 44-45.

14. Cantos Е., Espin J.C., Fernandez M.J., Oliva J., Tomas-Barberan F.A. Post-harvest UV-c-irradiated grapes as a potential source for producing stilbene-enriched red wines. // J. Agr. Food Ghem. 2003. V.51. P.1208-1214.

15. Bors W., Michel C. Antioxidant capacity of flavanols and gallate esters: puis radiollysis studies. // Free Rad. Biology & Medicine. 1999. V.27. N. 11/12 P.1413-1426.

16. Mahal H.S., Mukherjee T. Scavenging of reactive oxygen radicals by resvera-trol: antioxidant effect. // Res. Chem. Intermed. 2006. V. 32. N.l. P.59-71.

17. Зенкевич И.Г., Ещенко А.Ю., Макарова C.B., Утсаль В.А. Продукты окисления кверцетина кислородом воздуха при комнатной температуре и их идентификация. // Растительные ресурсы. 2007. Т. 43. N. 2. С. 111-124.

18. Pietta P. Flavonoids as antioxidant. // J. Nat. Prod. 2000. V. 63. P. 1035-1042.

19. Areias F.M., Rego A.C., Oliveira C.R., Seabra R.M. Antioxidant effect of flavonoids after ascorbate/Fe2+-induced oxidative stress in cultured retinal cells. // Biochemical Pharmocology. 2001. V. 62. P. 111-118.

20. Stasko A., Liptakova M., Malic F., Misik V. Free radical scavenging activities of white and red wines: an EPR spin« trapping study. // Appl. Magn. Reson. 2002. V.22. P. 101-113.

21. Andrew C. Clark The production of yellow pigments from (+)-catexin and dyhydroxyfumaric acid in a model wine system. // Eur Food Res Technol. 2008. V.226. P.925-931.

22. Beer D., Joubert E., Marais J., Manley M. Untravelling the total antioxidant capacity of pinotage wines: countribution of phenolic compounds. // J. Agr. Food Chem. 2006. V.54. P.2897-2905.

23. Rivero-Perez M.D., Muniz P., Gonzalez-Sanjose M.L. Countribution of an-thocyanin fraction to the antioxidant properties of wine. // Food and Chemical Toxicology. 2008. V.46, N.8, P.2815-2822.\

24. Talcott S.T., Lee J. Ellagic acid and flavonoids antioxidant content of muscadine wine and juice. // J. Agr. Food Chem. 2002. V.50. P.3186-3192.

25. Stasko A., Polovka M., Brezova V., Biskupic S., Malic F. Tocay wines as scavengers of free radicals (an EPR study). // Food Chemistry. V.96. N.2. P. 185196.

26. Frankel E.N., Waterhouhouse A.L. Teissedre P.L. Principal phenolic phyto-chemicals in selected California wines and their antioxidant activity in inhibiting oxidation of human low density lipoproteins. // J. Agr. Food Chem. 1995. V.43. N.4. P.890-894.

27. Pellegrini N., Simonetti P^, Gardana C., Brenna O., Brighenti F., Pietta P. Polyphenol Content and Total, Antioxidant Activity of Vini Novelly (Young Red Wines). // J. Agr. Food Chem. 2000. V.48. P.732-735.

28. Gorjanovic S.Z., Novakovic M.M., Potkonjak N.I., Suznjevic D.Z. Antioxidant activity of wines determined by polarographic assay based on hydrogen peroxide scavenge. //J. Agr. Food Chem. 2010. V.58. P.4626-4631.

29. Лапин A.A., Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Бердник И.В., Кочева Л.С., Мусин Р.З., Магдеев И.М. Антиоксидантные свойства продуктов растительного происхождения. // Химия растительного сырья. 2007. N. 2 С.79-83.

30. Нбпег К., Cervellaty R, Neddens С. Measurements of the in vitro antioxidant activity of German white wines using a novel method. // Eur Food Res Technol. 2002. V.214. P.356-360.

31. Mannino S., Brenna O., Buratti S., Cosio M.S. A new method for the evaluation of the antioxidant power of wines. // Electroanalysis. 1998. V.10. N.13. P.908-912.

32. Dapkevicius A., Van Beek T.A., Niederlander H.A.G. Evaluation and com-prasion of two improved techniques for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography eluates. // J. Chromatog. A 2001. V.912. P.73-82.

33. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection. // Talanta. 2000. V.51. P.709-716.

34. Rong Tsao, Raymond Yang Optimization of a new mobile phase to know the complex and real polyphenolic composition: towards a total phenolic index using high-performance liquid chromatography. // J. Chromatog. A 2003. V.1018. P.29-40.

35. Mulero J., Pardo F., Zafrilla P. Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant activity in conventional and organic red.wines during storage. // Eur Food Res Technol. 2009. V.229: P. 807-812.

36. Sherma J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. // J. Chromatog. A 2000. V.880. P.129-147.

37. Cacciola F., Jandera P., Mondello L. Comparison of high-temperature gradient heart-cutting and comorehensive LC-LC systems for the separation of phenolic antioxidants. // Chromatographia. 2007. V.66. P.661-667.

38. Ivanova V., Dornyei A., Márke L., Vojnoski B., Stafilov T., Stefova M., Kilár F. Polyphenolic content of Vranec wines produced by different vinification conditions. // Food Chemistry. 2011. V. 124. N. 1. P. 316-325.

39. Seruga M., Novak I., Jakobek L. Determination of polyphenols content and antioxidant activity of some red wines by differential1 pulse voltammetry, HPLC and spectrophotometric methods. // Food Chemistry. 2011. V. 124. N. 3. P. 1208-1216.

40. Vinkovic Vrcek I., Bojic M., Zuntar I., Mendas G., Medic-Saric M. Phenol content, antioxidant activity and metal composition of Croatian wines deriving from organically and conventionally grown grapes. // Food Chemistry. 2011. V. 124. N. l.P. 354-361.

41. Hernades-Borges J., Borges-Miquel'T., Gonzalez-Hernandez G., Rodriguez-Delgado M.A. Rapid separation of antioxidants in food, samples by coelectroosmo-tic CE. // Chromatographia. 2005. V.62. P.271-276.

42. Fernandez de Simon B., Peres-Ilzarbe J., Hernandez T., Gomes-Cordoves C., Estrella I. HPLC study of the efficiency of extraction- of phenolic compounds. // Chromatographia. 1990. V.30. N.l-2. P.35-37.

43. Revilla E., Alonso E., Estrella M.I. Analysis of flavonol aglycones in wine extracts by high performance liquid chromatography. // Chromatographia. 1986. V.22. N.l-6. P.157-159.

44. Rio Segade S., Soto Vazquez E., Vazquez Rodriguez E.I., Rego Martinez J.F. Influence of training system on chromatics and phenolic composition in red wines. // Eur Food Res Technol. 2009. V.229. P.763-770.

45. Kelebek H., Canbas A., Selli S. HPLC-DAD-MS analysis of anthocyanins in rose wine made from cv. Óküzgózü Grapes, and effect of maceration time on an-thocyanin content. // Chromatographia. 2007. V.66. P.207-212.

46. Карцова Л.А., Алексеева А.В. Хроматографические и электрофоретиче-ские методы определения полифенольных соединений. // ЖАХ. 2008. Т.63. N.11. С. 1126-1136.

47. A. De Villiers, F. Lynen, A. Crouch, P. Sandra Development of a Solid-Phase Extraction Procedure for the Simultaneous Determination of polyphenols, Organic Acids and Sugars in Wine. // Chromatographia. 2004. V.59. P.403-409.

48. Presta M.A., Bruyneel В., Zanella R., Kool J., Krabbe J.G., Lingeman H. Determination of flavonoids and resveratrol in wine by turbulent-flow chromatogra-phy-LC-MS. // Chromatographia. 2009. V.69. P.S167-S173.

49. Careri M., Corradini C., Elviri L., Nicoletti I., Zagnoni I. Direct HPLC analysis of quercetin and trans-resveratrol in red wine, grape and winemaking byproducts. //J. Agr. Food Chem. 2003. V.51. P:5226-5231.

50. Tinttunen S., Lehtonen P. Distinguishing organic wines from normal wines on the basis of concentrations of phenolic compounds and spectral data. // Eur Food Res Technol. 2001. V.212. P.390-394.

51. Carando S., Teissedre P.L., Cabanis J.C. HPLC coupled with fluorescence detection for the determination of procyanidins in white wines. // Chromatographia, 1999, V.50, N.3/4, P.253-254.

52. Tsanova-Savova S., Ribarova F. Free and conjugated myricetin, quercetin, andkaempferol in bulgarian red wines. // Journal of food composition1 and analysis. 2002. V.15. P.639-645.

53. Taróla A.M., Giannetti V. Detemination by LC of polyphenols in italian red wine. Chromatographia. 2007. V.65. P.367-371.

54. Rodrigues-Delgado M.A., Malonova S., Peres J.P., Borges T., Garsia Monte-longo F.J. Separation of phenolic compounds by high-performance liquid chromatography with absorbance and fluorimetric detection. // J. Chromatog. A 2001. V.912. P.249-257.

55. Darias-Martin J.J., Andres-Lacueva C., Diaz-Romero C., Lamuela-Raventos R.M. Phenolic profile in varietal white wines made in the Canary islands. // Eur Food Res Technol. 2008. V.226: P.871-876.

56. Alcalde-Eon C., Escribano-Bailon M.T., Santos-Buelga C., Rivas-Gouzalo J.C. Changes in the detailed pigment composition of red wine during maturity and ageing. // Analytica Chimica Acta. 2006. V.563. P.238-254.

57. Repolles C., Herrero-Martinez J.M., Rafos C. Analysis of prominent flavon-oids aglycones by high-performance liquid chromatography using a monolithic type columns. //J. Chromatog. A 2006. V.1131. P.51-57.

58. Cacciola F., Jandera P., Hajdu Z., Cesla P., Mondello L. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography with parallel gradients for separation of phenolic and flavone antioxidants. // J. Chromatog. A 2007. V.l 149. P.73-87.

59. Harnly J.M., Bhagwat S., Lin L.-Z. Profiling methods for the determination of phenolic compounds in foods and dietary supplements. // Anal Bional Chem. 2007. V. 389. P.47-61.

60. Czyzowska A., Pogorzelski E. Changes to polyphenols in the process of must and wines from blackcurrants and cherries. Part 1. Total polyphenols and phenolic acids. // Eur. Food Res. technol. 2002. V.214. P. 148.

61. Guadalupe Z., Soldevilla A., Saenz-Navajas M.-P., Ayestaran B. Analysis of polymeric phenolics in red wines using different techniques combined with, gel permeation chromatography fractionation. // J. Chromatog. A 2006. V. 1112. P. 112-120.

62. Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Boas L., Bronze M.R. Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in Portugal. // Analytica Chimica Acta. 2006. V. 563. P. 84-92.

63. He J., Santos-Buelga C., Mateus N., de Freitas V. Isolation andquantification of oligomeric pyranoanthocyanin-flavanol- pigments from'red wines by combination of column chromatographic techniques. // Jt Chromatog. A 2006. V. 1134. P. 215225.

64. Pellegrini N., Simonetti P., Garana C. et al. Poliphenol content and total antioxidant activity of Vini Novelli (Young Red Wines). // J. Agr. Food Chem. Chemistry. 2000; V.48. P.732-735.

65. Netzel M., Strass G., Bitsch I., Könitz R., Christmann M., Bitsch R. Effect of grape processing on selected antioxidant phenolics in red wine. // J. Food Eng., 2003, V.56, P. 223-228.

66. Li Z., Panl Q., Jina Z., Mua L., Duan C. Comparison on phenolic compounds in Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon wines from five wine-growing regions in China. // Food Chemistry. 2011. V. 125. N. 1. P. 77-83.

67. Fernandez-Pachon M.S., Villaño D., Garcia-Parrilla M.C., Troncoso A.M. Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenols composition. // Analytica Chimica Acta. 2004. V.513. P.l 13-118.

68. Ghiselli A., Serafini M., Natella F., Scaccini C. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. // Free Rad. Biology & Medicine. 2000. V.29. N.l 1. P. 1106-1114.

69. Савчук C.A., Власов B.H., Апполонова C.A., Арбузов В.Н., Веденин А.Н., Мезинов А.Б., Григорьян Б.Р. Применение хроматографии и спектрометрии для идентификации подлинности спиртных напитков. // ЖАХ. 2001. T.56.N.3.C. 246-264.

70. Савчук С.А., Нужный В.П. Химический состав и потенциальная токсичность образцов легальной и нелегальной алкогольной продукции. // Наркология. 2006. N.7. С.67-76.

71. Савчук С.А., Колесов Г.М. О правильности хроматографического определения эфиров фталевых кислот, как показателя фальсификации коньяков и коньячных спиртов. // ЖАХ. 2007. Т.62. N.8. С.845-857.

72. Вязьмина H.A., Савчук С.А. Исследование примесного состава этилового спирта и продуктов его ректификации. // Партнеры и Конкуренты. 2002. N.2. С. 30-40.

73. Вязьмина H.A., Савчук С.А. Применение методов газовой хроматографии для идентификации происхождения спирта. // ЖАХ. 2002. Т.57. N.8. С.813-819.i127

74. Савчук С.А., Власов В.Н. Идентификация винодельческой продукции методами высокоэффективной хроматографии и спектрометрии. // Виноград и вино России. 2000. N.5. С.5-13.

75. Савчук С.А. Контроль качества и идентификация подлинности коньяков хроматографическими методами. // Методы оценки соответствия. 2006. N.9. С.30-37.

76. Нужный В.П. Савчук С.А., Каюмов Р.И. Химико-токсикологическое исследование крепких алкогольных напитков домашнего изготовления (Самогон из разных регионов России). // Наркология. 2002. N.5. С.43-48.

77. Нужный В.П., Савчук С.А., Тюрин И.А., Белов С.К. Проблема денатурирующих добавок к этиловому спирту в связи с исследованием образцов нелегальной алкогольной продукции. // Токсикологический вестник. 2004. N.3. С.7-12.

78. Скурихин И.М. Химия коньяка и бренди. Ml: ДеЛи Принт. 2005. С.167

79. Савчук С.А., Колесов Г.М. Хроматографические методы в контроле качества коньяков и коньячных спиртов. // ЖАХ. 2005. Т. 60. N. 8. С. 848-868.

80. Соболев Э.М., Оселедцева И.В. Идентификация подлинности и уровня качества коньячной продукции. // Известия вузов. Пищевая технология. 2005. N.5-6. С. 98-101.

81. Методы технохимического контроля в виноделии. Под ред. Гержиковой В.Г. Симферополь: Таврида, 2002 г. - 260 с.

82. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И. Антиоксиданты в красном вине и их определение амперометрическим методом// Виноделие и виноградарство. 2007. N.6. С.22-23.

83. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Экспериментальная техника и методы. М.: Наука, 1985 г.

84. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001 Точность (правильность и прецизионность методов и результатов измерения)

85. Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В., Филиппов А.А., Селеменев В.Ф., Приданцев А.А. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж.: Водолей. 2004. 528 с.

86. Аббас А.М:, Бандюкова В.А., Пищков Ю.Г., Никитина Г.К., Ващенко Т.Н., Гаврилин М.В. Полифенолы и полисахариды чашелистиков Habiscus Sa-dariffa L. // Растительные ресурсы. 1993. Т. 29. N. 2. С. 31-40.

87. Запромётов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 1993. 272 с.

88. Wang S.-P., Fu M.-D., Wang M:-H. Separation mechanism and determination of flavanones with capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography. // J. Chromatog. A 2007. V. 1164. P. 306-312.

89. Ульянова E.B.,. Ларионов О.Г., Рёвина А.А., Андриевская Д.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании антиоксидантных свойств вин. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10. N. 4. С. 522-532.

90. Ревина А.А. Полифункциональная радиопротекторная активность природных пигментов флавоноидов. // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. / Сб. научн. трудов. Москва. 2003. Вып. 9. С. 197-208.

91. Гродзинский Д.М., Гудков И.Н. Защита растений от лучевого поражения. М.: Атомиздат. 1973. 232 с.

92. Запромётов М.Н. Биохимия катехинов. М.: Наука. 1964. 295 с.

93. Лысиков В.Н., Луцик Т.К., Ревина А.А. Промежуточные продукты радиолиза антоциана как антимутагенный фактор. // Известия АН МССР. сер. биологич. и химич. наук. Кишинев. 1986. Т. 5. С. 29-33.

94. Ревина A.A. Радиационно-химическое моделирование быстропроте-кающих процессов с участием промежуточных кислородсодержащих реакционных центров в различных системах.// Автореф. диссертации, д.х.н. Москва. ИХФ РАН. 1995.

95. Кочетова М.В., Ларионов О.Г., Ульянова Е.В. Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8. N. 4. С. 658-667.

96. Автор выражает благодарность в подготовке работы:

97. Научному руководителю, д.х.н., профессору Ларионову О.Г. (ИФХЭ РАН, Москва)д.х.н., профессору Ревиной A.A. (ИФХЭ РАН, Москва) к.т.н. Андриевской Д.В. (ГУ ВНИИ ПБ и ВП, Москва) Фенину A.A. (РХТУ им. Д.И. Менделеева)