Анализ фотодинамики белковых комплексов тилакоидных мембран при помощи масс-спектрометрии высокого разрешения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

4844845 На правах рукописи

Галецкий Дмитрий Николаевич

АНАЛИЗ ФОТОДИНАМИКИ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН ПРИ ПОМОЩИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2011

2 8 АПР 2011

4844845

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Николаев Евгений Николаевич Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кузьмин Владимир Александрович доктор химических наук, профессор Сидоров Лев Николаевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится 18 мая 2011 г. в 14:00 на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан 15 апреля 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01, канд. хим. наук

Мазалецкая Л.И.

Актуальность темы

Физико-химический процесс поглощения и преобразования энергии света в химическую энергию органических веществ, фотосшггез, осуществляется в хлоропластах зелёных растений и некоторых бактерий и представляет собой совокупность фотофизических, фотохимических и химических реакций. У фотосинтезирующих организмов фотохимические процессы световой стадии фотосинтеза локализованы в энергопреобразующих тилакоидных мембранах. Фотоактивные пигментно-белковые комплексы, интегрированные в липидной мембране, и компоненты электротрапепортной цепи взаимодействуя друг с другом образуют высокоорганизованную и структурированную систему.

Фотосинтезирующис аппараты высших растений способны приспосабливаться, в том числе к освещённости. Изучение совокупности количественных и качественных изменений в тилакоидных мембранах, связанных с адаптацией к внешним условиям, играет решающую роль в понимании экологических аспектов фотосинтеза. Особый интерес вызывает воздействие света высокой интенсивности на функционирование фотосинтезирующих аппаратов. Во время светового стресса угроза необратимого окисления и разрушения является главной опасностью. В этих условиях активируются фотозащитные механизмы, ведущую роль в которых играют взаимодействующие с пигментами белки, которые становятся главными объектами исследований.

Высокая степень организации тилакоидных мембран и большое число компонентов фотосинтезирующих комплексов значительно ограничивают применение как методов структурного анализа функциональных единиц, так и высокоспецифичных методов детектирования входящих в их состав белков. Для изучения таких систем одним из важнейших инструментов становится масс-спектрометрия высокого разрешения. Сочетание масс-спекгрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) с такими методами ионизации биомакромолекул, как ионизация при электрораспылении (ESI, electrospray ionization) и лазерная десорбция/ионизация из матрицы (MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization), а также с современными аналитическими методами разделения, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография

(HPLC, high-performance liquid chromatography) и электрофорез, даёт возможность исследовать такую сложную систему, как тилакоидные мембраны, на молекулярном уровне.

Представленный в работе материал посвящен применению масс-спектрометрии ИЦР ПФ для системного анализа совокупности структурных форм белков, составляющих фотосинтезирующие комплексы, а также исследованию фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в тилакоидных мембранах хлоропластов в условиях светового стресса. Особое внимание уделено фотодинамическим процессам в фотосистеме И, осуществляющей окисление воды с образованием молекулярного кислорода, протонов и электронов и наиболее подверженной разрушительному воздействию различного рода радикалов и активных форм кислорода.

Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-13306-RT_ofi и 0S-04-00725-a), программ Министерства образования к науки Российской Федерации (14.740.11.0755, и 16.740.11.0369) и Немецкого научно-исследовательского сообщества (Deutsche Forschungsgemeinschaft, ADS2/1-3 I.A.).

Цели и задачи работы

Главной целью работы была разработка физико-химических методов анализа совокупности белковых компонентов фотосинтезирующнх комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения и их практическая реализация для исследования динамических процессов в фотосинтезирующнх аппаратов растений в условиях светового стресса. Дм её выполнения требовалось разработать методики анализа и оценить их погрешности, найти белки и модификации белков, являющиеся бкомаркерами изучаемых процессов, и с их помощью охарактеризовать изменения в пигментно-белковых комплексах под действием светового стресса. В работе были поставлены и решены следующие задачи: (1) подобрать условия пробоподготовки, разделения и масс-спектрометрического анализа с использованием методов ионизации MALDI и ESI, обеспечивающие идентификацию и сравнительный анализ белков в динамическом

диапазоне концентраций 1000 и более; (2) провести прогсомный анализ фотосинтезирующих мембран хлоропластов растений до и после светового стресса и выявить среди идентифицированных белков и их модифицированных форм светозавнсимые; (3) разработать методику разделения функционально активных пигментно-белковых комплексов тилакоидов и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа входящих в их состав белков; (4) изучить фотохимические реакции белков в тилакоидных мембранах растений и их влияние на динамические процессы в фотосинтезирующих аппаратах.

Научная новизна

Реализован ряд методик, основанных на масс-спектрометрическом анализе и позволяющих проводить мониторинг белков фотосинтезирующих комплексов в широком динамическом диапазоне концентраций. Методика, сочетающая разделение функционально активных неденатурированных белковых комплексов гель-электрофорезом с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом продуктов их протеолиза в геле, впервые применена для описания фотодинамических процессов в тилакоидных комплексах. На основе хромато-масс-спектров высокого разрешения для соответствующих ионов построены профили распределения для 30 хлорофилл-связывающих белков в пигментно-белковых комплексах растений, адаптированных к условиям низкой освещённости и подвергнутых световому стрессу, и с та помощью выявлены функциональные особенности редких белков.

По результатам протеомного анализа с применением масс-спектрометрии высокого разрешения идентифицированы 278 продуктов нитрирования и окисления аминокислотных остатков тилакоидных белков. Впервые показало, что основным типом фотоокислительных модификаций в фотосинтезирующих аппаратах являются нитрирование тирозина и триптофана и окисление триптофана. С помощью хромато-масс-спектрометрии определены связанные со световых стрессом изменения в уровнях модификаций для 7 фосфорилированных и 23 нитрированных аминокислотных остатков хлорофилл-связывающих белков как в общем белковом составе, так и в составе отдельных субкомплексов, комплексов и суперкомплексов.

Физико-химическими методами изучены неизвестные ранее механизмы адаптации фотосистемы II к условиям освещённости: дифференциальное фосфсрилирование антенны, регулирующее как диссоциацию антенны, так и мономерюацию повреждённых димеров и суперкомплексов, нитрирование белка реакционного центра, приводящее к распаду комплексов и суперкомплексов фотосистемы, а также противоположная фоторегуляция фосфорилирования и нитрирования в мономерах, димерах и суперкомплексах.

Практическая значимость

Разработанные методики сравнительного анализа белковой композиции фотосинтезирующих комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения могут быть применены при анализе динамических изменений в различных оргаиеллах.

Новый подход к изучению функциональной роли белков путём сравнения профилей их распределения между комплексами, построенных на основе хромато-масс-спехтров высокого разрешения, с распределением всех других родственных белков, реализованный в данной работе для хлорофилл-связывающих белков, может быть использован для решения подобных задач в будущем.

Полученные данные по идентифицированным белкам и модификациям, распределению редких, фосфорилировакных и нитрированных белков расширяют современные представления о фотоокислительньк механизмах в хлоропластах, процессах акклимации, фотоингибирования и реорганизации фотосинтезирующих комплексов.

Личный вклад автора

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участи автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований и выполнении экспериментов. Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, часть работ одновременно выполнялась автором в Университете Констанц (Германия) в период с 2006 по 2011 год.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих Российских и международных конференциях: минисимпознум «Фотохимия, оптическая спектрометрия, сенсорика», Рицлерн, Кляйнвальсерталь, Австрия, 2006; 8-я Европейская конференция по ИЦР масс-спектрометрии и Российско-Немецкий семинар, Москва, 2007; 30-й Европейский пептидный симпозиум, Хельсинки, Финляндия, 2008; 9-я Европейская конференция по ИЦР масс-спсктрометрии, Лозанна, Швейцария, 2010; 4-я Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные аспекты масс-спектрометрии и её аналитические применения», Звенигород, 2010; 10-я ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-Вузы «Биохимическая физика», Москва, 2010; 1-я международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 2010; 44-я конференция Немецкого общества масс-спектрометрии, Дортмунд, Германия, 2011.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ: 3 статьи в рецензируемых научных журналах (1 статья входит в перечень журналов, рекомендованных ВАК) и 9 публикаций тезисов в сборниках трудов научных конференций.

Структура н объем диссертации

Работа изложена на 135 страницах, содержит 32 рисунка, 12 таблиц (3 из них приведены в приложении) и список литературы из 173 наименований. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений.

Основное содержание работы

Первая глава является литературным обзором, в котором даётся краткое описание белковых комплексов тилакоидов - объектов, исследуемых в работе, вводится понятие светового стресса и рассказывается о его влиянии на фотосинтез, приведён обзор процессов, связанных с адаптацией растений к условиям

5

освещённости и защитой от светового стресса. Кроме того, дискутируются трудности и ограничения традиционных методов исследования тилакоидных комплексов, обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ИЦР ПФ для исследования данной системы, рассмотрены вопросы, касающиеся точности измерения масс, разрешающей способности и динамического диапазона, описаны способы анализа модификаций белков, связанных с действием различного рода радикалов и активных форм кислорода и/или выполняющих фотозащитные и фоторегулируюшие функции.

Структурным компонентом внутренних мембран хлоропластов является тилакоидная мембранная система, окружённая внутренней гомогенной средой, стромой. В мембранах тилакоидов локализованы пигменты и другие компоненты, связанные с поглощением и использованием энергии света, биохимические системы синтеза и превращения углеводов функционируют в строме хлоропластов. В состав тилакоидных мембран хлоропластов входят четыре многокомпонентных белковых комплекса, среди которых особый интерес вызывает фотосистема II, в которой происходит катализируемый светом процесс разложения воды с образованием протонов, электронов и выделением молекулярного кислорода. Начальной стадией фотосинтеза является поглощение света молекулами пигментов, входящих в состав светособирающих или антенных комплексов, и передача энергии возбуждённого состояния на реакционные центры. Ассоциированные в липидной мембране светособирающие комплексы состоят из белков, хлорофиллов и каротеноидов, и характеризуются высокой степенью организации. Важнейшая роль светособирающих белков состоит в регуляции фотосинтеза и в обеспечении фотозащитной функции.

Световой стресс приводит к повреждению и ингибирозанию реакционных центров фотосистем с последующим распадом входящих в их состав белков, причём фотосистема П в большей степени подвержена разрушению, чем другие фотосинтезирующие комплексы. Удаление повреждённых реакционных центров сопровождается уменьшением общего количества хлорофилла и реорганизацией антенны. Все эти процессы регулируются обратимым фосфорилированием некоторых белков антенны и реакционных центров. Светозависимое

фосфорилирование аминокослотцых остатков треонина является одним из важнейших модификаций в тилакоидных мембранах. Увеличение интенсивности света приводит к усилению миграции белков между стромой и граном, которое связано прежде всего с обратимым фосфорилированием N-концевых аминокислотных остатков треонина некоторых белков антенны и реакционных центров фотосистем при участии киназ и фосфатаз. Кроме того, в условиях стресса активируется синтез ряда белков, родственных белкам свстособирающих комплексов, содержащих трансмембрашгые спирали с аминокислотными остатками, связывающими хлорофилл, что служит дополнительным регулятором процессов акклимации.

Применение масс-спектрометрических методов высокого разрешения в протсомном анализе позволяет проводить достоверную идентификацию белков. Однако, высокоточное измерение массы пептида само по себе не всегда является условием идентификации, в некоторых случаях необходима дополнительная информация, которая может быть получена в результате фрагментации. Для анализа редких и модифицированных белков требуются комбинированные системы, сочетающие хроматографическое разделение, получение масс-спектров высокого разрешения для ионов пептидов и высокоскоростной анализ их фрагментов. Масс-спектрометрический анализ фосфатных групп в белках обычно проводят после выделения фосфопептидов с помощью металло-аффшшых методов, что значительно увеличивает предел обнаружения.

Во второй главе описаны различные подходы к анализу светособирающих комплексов тилакоидных мембран с использованием градиентного центрифугирования для выделения белковых комплексов, и гель-электрофореза для разделения белков. Были опробованы комбинации одно- и двумерного гель-электрофореза для разделения с методами ESI и MALDI для анализа белков и модификаций в них. Наилучшие результаты были получены при сочетании одномерного полиакриламидного гель-электрофореза в присутствии додсцилсульфата натрия (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis) с MALDI и ИЦР ПФ. При анализе был использован ионный источник Apollo И, имеющий лазер с возможностью точной регулировки

поперечного сечения луча, а также эффективную систему транспорта ионов. Сочетание высокой разрешающей способности и точности измерения масс с максимально широким динамическим диапазоном, позволяющим детектировать сигналы высокой и низкой интенсивности было следствием оптимизации числа измеряемых ионов путём варьирования энергии лазера, поперечного сечения лазерного луча, числа лазерных импульсов при создании пакета ионов и количества единичных спектров, используемых для создания результирующего масс-спектра.

Оптимальное качество пробоподготовки, достигнутое при обессоливании пробы и высушивания на поверхности АпсЬогСЫр, обеспечило не только измерение в широком (более 1000) динамическом диапазоне, но и привело к хорошей воспроизводимости спектров и минимальному различию в интенсивности сигналов спектров проб до и после светового стресса, что стало основой для сравнительного анализа. Точность измерения масс составляла в большинстве случаев не более ±3 ррт, что дало возможность проводить идентификацию про значении относительной погрешности 5 ррт.

Сравнительный анализ проведён с использованием абсолютных значений интенсивности сигналов идентифицированных пептидов в образцах до (ЬЬ) и после (ТК.) светового стресса. Из 79 идентифицированных белков выявлено 21 светозависимых. По результатам анализа описан ряд процессов, связанных с адаптацией к интенсивности света. Это увеличение под действием светового стресса во фракции светособирающих комплексов количества трёх белков фотосистемы II (РБВС, РБВВ и НСР136) и трёх белков фотосистемы I (РЗАЬ, ОНР1 и ОНР2), указывающее на возможную реорганизацию обеих фотосистем. Кроме того, был подтверждён индуцированный световым стрессом синтез белков ЕЫР1 и Е1ЛР2 (см. рис. 1.), а также локализация данных белков в составе светособирающих комплексов фотосистемы И.

Масс-спектр на рис. 1. показывает почти идентичный профиль сигнала и его интенсивность для пептида белка РЕТС (аминокислотные остатки 107-120) для образцов различной освещённости.

"Г20ЫАГ35РАРЕК9' (ЕЫР1)

1503.7682

1476.5 1477.0 1477.5 1478.0 1478.5 1479.0 . 1479.5 14ЙО.О

1507.7926 1476.7460

АТРР

1228.6294

Р5АО тс (11з-«41|

122-229) /

919.1340 /

Р$ЛО 113ЭЛ41| 1277.6495

ж

......................Л1|и1ЩЦ||.

1460 1490 1500 1510

АТРР

РЕТС (120-135)

[111*2 09) 2063.0341 1042.9763

........(.1

18Э0 2000 2200 т/1

Рис. 1. Идентификация индуцированных световым стрессом белков Е1ЛР1 и ЕЬ!Р2 в фракции градиента сахарозы после 8Б5-РАСЕ (продукты трипсинолиза полосы 15-19 кДа). Пептиды белков Е1ЛР1 и ЕЫР2 детектированы в спектре МЛЫЭТ после светового стресса (НЬ) и отсутствуют в условиях низкой освещенности (IX) обозначен пунктирной линией. На спектре показаны пептиды, относящиеся к четырем идентифицированным белкам тилакоидных комплексов.

Пептиды белков ELIP1 (84-97) и ELIP2 (86-99), имеющие почти идентичную последовательность аминокислотных остатков, детектированы только в образце после светового стресса. Высокая разрешающая способность и точность измерения масс позволяют исключить мешающие сигналы из рассмотрения. Данный спектр показывает возможность использования профилей сигналов высокоразрешающих спектров для сравнительного анализа.

Третья глава посвящена протеомному анализу белков тклакоидных мембран. Предложенная методика состояла из одномерного гель-электрофореза белков и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов их протеолгоа трипсином. Анализ пептидов включал в себя разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, определения их молекулярной массы в ячейке ИЦР, фрагментацию ионов выбранных пептидов в линейной квадрупольной ловушке с последующим установлением их аминокислотной последовательности. В применяемом при выполнении данной работы гибридном масс-спектрометре LTQ-FT (Thermo Finnigan) реализована концепция быстрой и одновременной записи масс-спектров высокого разрешения для пептидов и спектров низкого разрешения для их фрагментов в зависимости от числа компонентов и количества измеряемых ионов. Для повышения точности измерения масс в ячейке ИЦР была использована процедура внутренней калибровки каждою спектра, что привело к уменьшению погрешности определения массы до 3 ррт в динамическом диапазоне более 1000. Количественный анализ был проведён с использованием хроматограмм ионов идентифицированных пептидов, для построения хроматограмм было использовано значение m/z иона ±5 ррт. Высокая разрешающая способность масс спектра ИЦР позволяет не только точно измерять массу пептида, но значительно снижает влияние мешающих сигналов при построении хроматограмм ионов.

Возможность точной идентификации последовательности пептидов широком динамическом диапазоне в сочетании со сравнительно высокой разрешающей способностью хроматографическсго анализа и предварительным разделением белков характеризует высокую эффективность применяемой методики.

А

ABl

Щ

3S <0 45 50 Time (min)

у;

390.3

У>

319.3

ь,

431.2

668.4

у;

505.4

у;

941.5

щ

у;

1008.5

1202,5 >« 1331.fi

ь»

1257.5

Ь- Ь„

<™-7 1587.7

1600 irJz

Рис. 2. Идентификация белка LHCA6 по одному пептиду в результате хромато-масс-спектрометрического анализа белковой полосы 23-27 кДа после протеолиза трипсином. А: хроматограмма; Б: усреднённый масс-спектр при времени удерживания 45.5-45.6 мин; С: фрагментация иона m/z 881.4155 и идентификация последовательности соответствующего пептида. Ион m/z 872 соответствует отщеплению Н20.

Идентифицированы все известные хлорофшш-связывающие белки, относящиеся к реакционным центрам и светособирающим комплексам фотосистем, включая редко встречающиеся и не обнаруженные до этого масс-спекгрометрическими методами LHCA5 и LHCA6. Кроме того, были найдены 4 редких светоиндуцированных белка семейства ELIP (ELIP1 ELIP2, ОНР1 и SEP3.1). Идентификация белка LHCA6 (также известного как LHCA2*!. ORF AtlgI9150), существование которого является спорным, показана на рис. 2. В данном случае идентификация белка в продуктах трипсинолиза наиболее интенсивной полосы геля 23-27 кДа была проведена по одному уникальному пептиду.

Одним из главных преимуществ применяемого на данном этапе работы хромато-масс-спектрометрического метода явилась возможность идентифицировать модифицированные пептиды, не применяя при этом дополнительных методов выделения и детектирования. Учитывая, что анализ фосфопептидов после металло-аффинного обогащения с одной стороны увеличивает предел обнаружения, а с другой - затрудняет количественную интерпретацию, в данной работе обогащения фосфопептидов не проводилось. Увеличение пределов обнаружения модифицированных аминокислотных остатков достигнуто за счёт оптимизации хромато-масс-спектрометрического анализа. Идентификация всех известных типов модификаций проводилась с помощью «Mascot error tolerant database searching», В числе найденных модификаций фосфорилирование, нитрирование и окисление аминокислотных остатков.

Анализ уровней фосфорилирования 8 аминокислотных остатков белков фотосистемы II показал, что световой стресс приводит к фосфорилированию Thr-112 и Thr-114 белка LIICB4.1 и дефосфорилированию Thr-38 и Thr-37 белков LHCB1 и LHCB4.2, соответственно. При этом , фосфорилирование Thr-112 и Thr-114 LHCB4.1 под действием светового стресса сопровождается фосфорилированием белков PSBA, PSBD и PSBC центра фотосистемы П. Представляется вероятным, что фосфорилирование белков LHCB1 и LHCB4.2 связано с перераспределением антенны между фотосистемами, а

фосфорилирование ШСВ4.1 - с реорганизацией реакционных центров фотосистемы II.

Идентифицировано 126 аминокислотных остатков нитротирозина и 12 нитротриптофана в 164 нитропептидах, при этом в 9 пептидах были идентифицированы по две нитрогруппы. Из них 33 и 47 - в фотосистемах I и II, соответственно, 20 - в комплексе цитохрома Ь67/ и 30 - в АТРазном комплексе. Таким образом, впервые показано, что нитрирование тирозина и триптофана является наиболее часто встречающимся типом модификаций в фотосинтезирующих комплексах. Кроме того, обнаружено 140 продуктов окисления аминокислотных остатков, прежде всего триптофана. В фотосистеме II найдено 59 продуктов окисления триптофана, в фотосистеме I - 29, в комплексах цитохрома Ьб7/и АТРазы - соответственно 7 и 2.

В большинстве случаев удалось раздельно охарактеризовать пептиды имеющие одинаковую последовательность и содержащие нитрогруппу на разных аминокислотных остатках. Хроматографическое разделение и масс-спектрометрическая идентификация таких пептидов, относящихся к белку Р5ВК кислород-выделяющего комплекса, показана на рис. 3. Два пептида, отличающиеся по времени удерживания на 0.14 мин, разделены хроматографически, а расположение нитрогрупп в обоих случаях точно определено по масс-спектрам продуктов фрагментации однозарядных ионов.

Значительное увеличение уровней нитрирования тирозина и нитрирования и окисления триптофана под воздействием светового стресса установлено для белков Р8ВА, РБВО и РБВЕ реакционного центра фотосистемы II, а также для белка РБВВ центральной антенны и белков РЭВО и РБВЯ кислород-выделяющего комплекса. Данные результаты свидетельствуют, что именно эти модификации напрямую связаны с повреждениями в фотосистеме II, вызванными воздействием светового стресса. Кроме того, отмечено снижение уровнен нитрирования аминокислотных остатков тирозина и триптофана и окисления триптофана белков внешней антенны с увеличением интенсивности света, показывающее увеличение скорости синтеза новых и распада повреждённых белков в условиях сильной освещённости.

У,

310 2

У. -18

292.2

Ь,

-J-r

Ь4

422.2

У.

bj 409.2 3232 I I

+T-H-L

ь,

5В5.2

Г

400

JgUuOi

ь, \ ь-

Ъ.О \ I I

J__ U.1 .

У.

511.3

У.

454.3

ь,

685.2

G X G V У К *

m/z = 731.332-731.340

1 I I \ I Г1 ГТ~^Г-Т 1

37.39 37.53

G Y G V У К

37.0 37.5 380 Time («ninj

Рис. 3. Идентификация двух нитрированных аминокислотных остатков (Туг-75 и Туг-78) в пептиде (74-79) белка PSBR. Показаны спектры продуктов фрагментации однозарядных ионов нитропепгидов (сверху) и хроматограмма для ионов m/z 731.336 (±5 ppm).

Четвёртая глава посвящена исследованию процессов миграции белков между комплексами и реорганизации пигментно-белковых комплексов под действием светового стресса. Для разделения белковых комплексов был использован полиакриламидный гель-электрофорез в неденатурирующих условиях (ВЫ-РАОЕ, Шие-па^уе-РАОЕ). По результатам хромато-масс-спектрометрический анализа продуктов протеолиза пигментно-белковых комплексов построены профили распределения белков и установлен состав комплексов. Схематический обзор методики, включающей в себя элементы из предыдущих исследований белкового состава тилакоидов, приведён на рис. 4.

На рис. 5 показаны электрофореграммы ВМ-РАвЕ тилакоидных мембран, с обозначенными на них пигментно-белковыми комплексами. Пять белковых полос в диапазоне ММ между 100 и 1200 кДа содержат пигментно-белковые комплексы фотосистем.

Рис. 4. Схема анализа фотодинамихи пигментно-белковых комплексов в тилахоидных мембранах с учётом использования результатов анализа тилакоидных белков

Белковые полосы î и 2 включают в себя неассоциированные часта фртосистемы II (PSII) и свободные популяции антенны (LHCII и LHCI). Полоса 3 состоит из мономерного центра и антенны PSII, полоса 4 содержит фотосистему I (PSI) и димеры PSII, а полоса 5 состоит из суперкомплексов PSI-LHCI и PSII-LHCII.

Построены профили распределения хлерофилл-связывающих белков для растений, адаптированных в различных условиях освещённости. Показано, что белки внешней антенны LHCB3 и LHCB5 более тесно связаны с центром фотосистемы II чем белки LHCB1-2, а белки LHCAl-З сильнее ассоциированы с фотосистемой I, чем редкие белки LHCA5 и ОНР2.

Рис. 5. Элекгрофореграммы ВЫ-РАОЕ тилакоидных мембран растений, выросших в нормальных условиях (ЬЬ), и растений, подвергшихся световому стрсссу (НЬ). Гели были разделены на полоски, белки были подвергнуты протеолизу трипсином, а полученные пептиды -хромато-масс-спектрометрическому анализу. Полоски содержащие значительные количества хлорофилл-связывающих белков пронумерованы. Модель иллюстрирующая разделение пигментно-белковых комплексов показана справа. Нумерация комплексов совпадает с нумерацией полос в геле. Отмечены активные фотосинтезирующие комплексы.

Подтверждены предположения, что ЬНСА5 участвует в акклимации фотосистемы I к изменениям в качестве и количестве света, а ОНР2 и, возможно, ОНР1 - в перераспределении энергии возбуждения между фотосистемами. Белки ЦНСВ4, ЬНСВб и РБВБ содержатся в больших количествах, а белки ЕЫР1 и Е1ЛР2 накапливаются в суперкомплексах фотосистемы II в условиях светового стресса, что подтверждает существующие представления об участии данных белков в регуляции потоков энергии возбуждения и перевода её в теплоту.

Кроме того, на основе полученных данных описан ряд процессов, связанных с деградацией и реорганизацией реакционных центров фотосистемы II. Наблюдаемые изменения в целом сводятся к вызванному стрессом дисбалансу между разрушением повреждённых реакционных центров и синтезом новых.

Определены уровни фосфорилирования для 7 аминокислотных остатков треонина и уровни нитрирования для 23 аминокислотных остатков тирозина в пигментно-белковых комплексах. Выявлена противоположная регуляция

фосфорилирования белков антенны фотосистемы II под действием светового стресса. Уровни фосфорилирования ТЪг-Ш и ТЬг-114 белка ЬНСВ4.1 увеличиваются, а Т1и-37 белка ШСВ4.2 уменьшаются в функционально акгивных комплексах.

Дта аминокислотных остатков белков антенны 1,НСА4, ЬНСВ1, 1Л-1СВ5, ЬНСВб и белка реакционного центра фотосистемы II Р5ВЛ характерны наивысшие значения уровня нитрирования в неассоциированных субкомплексах в условиях светового стресса, что связано с возможной ролью нитрирования данных аминокислотных остатков в диссоциации комплексов и суперкомплексов, содержащих нитрированные белки.

Уровень нитрирования Туг-262, расположенного в белке Р8ВА в месте присоединения акцептора электронов пластохинона 0?.- значительно уменьшается в функционально активных комплексах и суперкомплексах и значительно увеличивается в неассоциированных субкомплексах в условиях светового стресса (рис. 6.). Это показывает ключевую роль нитрирования Туг-262 в повреждении и распаде фотосистемы II в процессе её оборота.

СРвВА

ШЯ56А Рпдаопо ЕРЗВАЖо

1 2 3 4 5

Полоса В^-РАеЕ

ПРЭВА

ЕЗР58А №ийрга ЭР5ВА№о

3

1 2 3 4 5

Полоса вЧ-РАОС

Рис. 6. Распределение фосфорилированных и нитрированных белков РБВА между полосами 1-5 ЕШ-РАОЕ в условиях IX (А) и НЬ (Б). Показана вся популяция Р5ВА (белым) в сравнении с популяциями, содержащими фосфорилированный ТЬг-2 (голубым) и нитрированный Туг-262 (красным). Количество белка было нормализовано к суммарной интенсивности соответствующих пептидов, и эта величина была принята за 100%.

РЭН-ШСИ .

суперкомплексы 1

(^осфоркпн^ов^йР1 ' |

——--—-4» , _ !

Нитрирование '

+-*■ !

яЭ№

* и

Распад Синтез

Рис. 7. Рабочая модель динамики нитрированных и фосфорилированных комплексов Р5Н. Фосфорилирование связано с мономеризацией димеров РЯИ и суперкомплексов РБН-ЬНСИ и миграцией мономеров из участков граны к участкам стромы. Дефосфорилирование мономеров в строме предшествует их диссоциации и распаду поврежденных белков. Нитрирование белков в димерах РБП и суперкомплексах РЗИ-ЬНСП вызывает их диссоциацию и приводит к накоплению субкомплексов в строме.

Сравнение уровней фосфорилирования и нитрирования показывает противоположную регуляцию двух данных типов модификаций в функционально активных комплексах фотосистемы II (см. рис. 6.). Низкие уровни фосфорилирования и высокие уровни нитрирования характерны для низкой освещённости, высокие уровни фосфорилирования и низкие уровни нитрирования - для светового стресса. Таким образом, нитрирование в фотосинтезирующих комплексах может приводить к их ингибированию и распаду, а светозависимое обратимое фосфорилирование способно регулировать оборот белков и реорганизацию пигментно-белковых комплексов (см. схему на рис. 7.). В случае белка Р8ВА, разгруппировка тилакоидной мембраны, вызванная как отрывом акцептора электронов (2В от нитрированного Р8ВА, так и увеличением уровня

фосфорилирования реакционного центра, может быть причиной ускоренного

оборота фотосистемы II в условиях светового стресса.

Результаты работы и выводы

1. Исследована перспектива применения масс-спектрометрии высокого разрешения для анализа изменений в белковой композиции светособирающих (антенных) пигментно-белковых комплексов. Оценена погрешность сравнительного анализа профилей интенсивности сигналов масс-спектроз в широком динамическом диапазоне концентраций белков.

2. Определены количественные изменения в белковом составе светособирающих комплексов, вызванные воздействием светового стресса на растения, и выявлен ряд процессов, связанных с адаптацией антенны к интенсивности света.

3. Реализована хромато-масс-спекгрометрическая методика для определения уровней модификации аминокислотных остатков белков, позволяющая осуществлять комплексный мониторинг таких фотохимических процессов в тилакоидных мембранах хлоропластов, как фосфорилирование, нитрирование и окисление.

4. Исследованы фотохимические реакции белков в тилакоидных мембранах и впервые показано, что основными типами фотоокислительных реакций белков в фотосинтезирующих аппаратах являются нитрирование тирозина и триптофана и окисление триптофана.

5. Разработан метод анализа реорганизационных процессов в фотосинтезирующих аппаратах на основе гель-электрофореза в неденатурирующих условиях для разделения белковых комплексов с последующим хромато-масс-спектрометрическим детектированием продуктов протеолиза входящих в их состав белков. Предложенная методика основана на сравнении профилей распределения популяций белков среди фотосинтезирующих комплексов.

6. Проведено комплексное исследование фотофизических и фотохимических процессов, относящихся к реорганизации фотосинтезирующих аппаратов в условиях светового стресса. Выявлены функциональные особенности ряда редких и светозависимых белков. Показана ключевая роль нитрирования белков

19

в распаде комплексов и регуляторная функция фосфорилирования при распаде повреждённых фотосинтезиругощих комплексов, замены и последующей ассоциации белков в функциональный комплекс.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Popov I. A., Nikolaev E. N., Adamska I. MS-based studies on photosystem II light acclimation and repair cycle // 44. Diskussionstagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Dortmund, Germany, 2011, p. 91

2. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Kharybin O. N., Popov I. A., Adamska I., Nikolaev E. N. Light stress photodynamics of chlorophyll-binding proteins in Arabidopsis thaliana thylakoid membranes revealed by high-resolution mass spectrometric studies. Биоорганическая химия, 2011,37(1), с. 119-134

3. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Popov I. A., Nikolaev E. N., Adamska I. Mass spectrometric characterization of photooxidative protein modifications in Arabidopsis thaliana thylakoid membranes. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2011,25(1), p. 184-190

4. Галецкий Д. H., Кононихин А. С., Попов И. А., Николаев Е. Н. Светозависимые модификации фотосинтезирующих белков и их количественный анализ при помощи масс-спектрометрии //1 международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 2010, с. 40

5. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Popov I. A., Adamska I., Nikolaev E. N. Mass spectrometric characterization of protein nitration in photosynthetic complexes of Arabidopsis thaliana II 10-я ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-Вузы «Биохимическая физика», Москва, 2010, с. 47

6. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A S., Popov I. A., Adamska I., Nikolaev E. N. Stress management: protein turnover in photosynthetic complexes // 4-я Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные аспекты масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010, с. 144

7. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Popov I. A., Nikolaev E. N.. Adamska I. Differential profiling of early light-induced protein family members in photosynthetic complexes И 9th European FTMS Workshop, Lausanne, Switzerland, 2010, p. 80

8. Galetskiy, D., Lohscheider J. N., Kononikhin A. S., Popov I. A., Nikolaev E. N., Adamska I. Protein modifications in photosynthetic apparatus related to light and oxidative stress // 9th European FTMS Workshop, Lausanne, Switzerland, 2010, p. 81

9. Galetskiy D., Susnea I., Reiser V., Adamska I., Przybylski M Structure and dynamics of photosystem II light-harvesting complex revealed by high-resolution FTICR mass spectrometric proteome analysis, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2008,19, p. 1004-1013.

10. Galetskiy D., Susnea I., Reiser V., Adamska I., Przybylski M. Structure and dynamics of photosystem II light - harvesting complex revealed by high-resolution FTICR mass spectrometric proteome analysis // 30th European peptide symposium, Helsinki, Finland, 2008, p. 180-181

11. Susnea I., Galetskiy D., Reiser V., Adamska I., Przybylski M. Elucidation of structure and dynamics of photosystem П light - harvesting complex assemblies in Arabidopsis thaliana by high-resolution FTICR mass spectrometry // 8th European FTMS conference and Russian-German workshop, Moscow, Russia, 2007, p. 31

12. Galetskiy D., Susnea I., Reiser V., Rojas M., Adamska I., Przybylski M. High-resolution functional proteomics of antenna systems in green plants. // Minisymposium "Photochemie Optische Spektrometrie Sensorik", Riezlem, Kleinwalsertal, Austria, 2006, p. 13

Подписано в печать:

31.03.2011

Заказ Л'» 5321 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

Глава 1. Исследуемые объекты и методы их анализа.

1.1. Пигментно-белковые комплексы тилакоидных мембран хлоропластов.

1.1.1. Структура тилакоидных мембран.

1.1.2. Фотосистемы I и II.

1.1.3. Светособирающие комплексы.

1.2. Световой стресс и адаптация к нему тилакоидов.

1.2.1. Световой стресс и фотоингибирование.

1.2.2. Механизмы защиты от светового стресса.

1.2.3. Фотодинамика фосфорилирования белков фотосистем.

1.2.4. Протеомный анализ фотодинамики тилакоидных комплексов.

1.3. Масс-спектрометрия высокого разрешения в протеомном анализе.

1.3.1. Роль масс-спектрометрии в анализе протеомов.

1.3.2. Разрешающая способность и точность измерения масс.

1.3.3. Масс-спектрометрия ИЦР ПФ.

1.3.4. Анализ модифицированных белков.

Глава 2. Анализ белков светособирагощих комплексов.

2.1. Методика проведения эксперимента.

2.1.1. Создание светового стресса.

2.1.2. Фракционирование тилакоидных мембран и извлечение светособирающих комплексов.

2.1.3. Использование методов гель-электрофореза для разделения белков.

2.1.4. Масс-спектрометрический анализ и идентификация белков.

2.2. Идентификация белков, разделённых двумерным гель-электрофорезом.

2.2.1. Применение ионизации методом электроспрей.

2.2.2. Масс-спектрометрический анализ с использованием метода ионизации МА1Л)1.

2.2.3. Изменения в белковом составе антенны по данным двумерного гель-электрофореза.

2.3. Анализ белков после одномерного гель-электрофореза.

2.3.1. Идентификации сложных белковых композиций.

2.3.2. Сравнительный анализ белков в композиции.

2.3.3. Обзор вызванных световым стрессом изменений в светособирающих комплексах.

Глава 3. Фотодинамика протеома тилакоидных мембран.

3.1. Протеомный анализ тилакоидных мембран.

3.1.1. Оптимизация методов пробоподготовки и разделения.

3.1.2. Хромато-масс-спектрометрический анализ.

3.1.3. Редкие и светоиндуцированные белки.

3.2. Фотодинамика фосфорилирования хлорофилл-связывающих белков.

3.2.1. Идентификация фосфорилированных белков.

3.2.2. Фотодинамика фосфорилирования белков фотосистемы II.

3.3. Нитрирование и другие фото окислительные модификации.

3.3.1. Нитрирование.

3.3.2. Окислительные модификации триптофана.

3.3.3. Фотодинамика нитрирования тирозина и окисления триптофана.

Глава 4. Реорганизация фотосинтезирующих комплексов.

4.1. Разделение и анализ пигментно-белковых комплексов.

4.1.1. Общая стратегия эксперимента.

4.1.2. Особенности хромато-масс-спектрометрического анализа и идентификации белков.

4.2. Редкие хлорофилл-связывагощие белки в структуре фотосистем.

4.2.1. Состав пигментно-белковых комплексов.

4.2.2. Локализация редких хлорофилл-связывающих белков.

4.2.3. Диссоциация комплексов фотосистем.

4.2.4. Общая характеристика фотодинамических процессов в фотосистемах.

4.3. Роль фосфорилирования и нитрирования в реорганизации комплексов.

4.3.1. Уровни регуляции фотофосфорилирования в комплексах фотосистемы II.

4.3.2. Роль нитрирования в распаде фотосинтезирующих комплексов.

4.3.3. Взаимное влияние фосфорилирования и нитрирования.

Физико-химический процесс поглощения и преобразования энергии света в химическую энергию органических веществ, фотосинтез, осуществляется в хлоропластах зелёных растений и некоторых бактерий и представляет собой совокупность фото физических, фотохимических и химических реакций. Фотосинтез возник более трёх миллиардов лет назад, когда цианобактерии выработали способность под действием света разлагать воду с образованием протонов, электронов и, в качестве побочного продукта, молекулярного кислорода. У фотосинтезирующих организмов фотохимические процессы световой стадии фотосинтеза локализованы в энергопреобразующих тилакоидных мембранах. В начальной фазе фотосинтеза солнечная энергия собирается двумя пигментно-белковыми комплексами, фотосистемой II и фотосистемой I, которые инициируют движение электронов, осуществляемое посредством другого мембранного комплекса — цитохрома b6f и приводящее к синтезу восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) и аденозинтрифосфата (АТР).

В настоящее время человечество в поисках энергии все больше обращается к солнцу и уже сделало значительные шаги в эффективном использовании энергии солнечного света. Использующие фотосинтез организмы, в отличие от нас, уже обладают «огромным опытом». Их фотосинтезирующие аппараты, созданные за миллионы лет эволюции, представляют собой «молекулярные машины», осуществляющие и регулирующие процессы поглощения и преобразования энергии с эффективностью и надёжностью, не достижимой для сделанных человеческой цивилизацией технических средств. Эволюция фотосинтезирующих организмов происходила в результате беспощадной борьбы, победу в которой приносило лучшее сочетание высокой эффективности использования солнечного света, позволяющей быстро расти и развиваться, с умением выживать, когда солнечного света становится слишком много, а воды - слишком мало.

Изучение совокупности количественных и качественных изменений в тилакоидных мембранах, связанных с адаптацией к внешним условиям, играет решающую роль в понимании экологических аспектов фотосинтеза. Особый интерес вызывает воздействие света высокой интенсивности на функционирование фотосинтезирующих аппаратов. Во время светового стресса угроза необратимого окисления и разрушения является главной опасностью. В этих условиях активируются фотозащитные механизмы, ведущую роль в которых играют взаимодействующие с пигментами белки, которые становятся главными объектами исследований.

Совместное применение высокоэффективных методов разделения, детектирования и структурного анализа является ключевым при исследовании таких сравнительно сложных биологических объектов, как фотосинтезирующие мембраны . Методы рентгеноструктурного анализа успешно применяются для исследования структурных особенностей пигментно-белковых комплексов и межмолекулярных взаимодействий их компонентов. Однако, с повышением сложности анализируемых систем, вследствие интеграции белков в мембране, высокой степени организации макромолекулярных структур и увеличения числа компонентов комплекса, применение данных методов становится проблематичным. Высокоспецифичные методы детектирования, в свою очередь, не могут быть использованы для полной характеристики исследуемого объекта.

Современная масс-спектрометрия становится одним из важнейших инструментов при анализе сложных биологических систем. При помощи современных методов ионизации вещества, основанных на электрораспылении (ESI, electrospray ionization), а также на лазерной десорбции/ионизации из матрицы (MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization), появилась возможность переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать пептиды, белки, углеводы, липиды и другие биомолекулы. Применение методов высокого разрешения и высокой точности при измерении масс, таких как масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ), позволяет однозначно идентифицировать даже многокомпонентные смеси. В связи с исследованиями многообразия молекулярных и структурных единиц, возникла целая серия концепций, таких как протеомика, гликомика и липидомика. При этом, основной акцент делается не столько на характеристике молекулярного состава, сколько на изучении межмолекулярных взаимодействий, связи количественных и качественных изменений в структуре отдельных молекул с функциональными изменениями всего объекта или его частей. Так протеомика призвана не только определить наличие и функции всех белков в клетке, но также исследовать многообразие структурных модификаций и межбелковые взаимодействия [1].

Сочетание масс-спектрометрии высокого разрешения с современными аналитическими методами разделения, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC, high-performance liquid chromatography) и электрофорез, даёт возможность исследовать такую сложную систему, как тилакоидные мембраны, на молекулярном уровне. Количественный анализ на основе масс-спектрометрических методов позволяет увидеть весь спектр наблюдаемых процессов, а не только ту его часть, которая интересует исследователя. Поэтому, применение масс-спектрометрии в анализе биологических систем означает не только резкое увеличение объёма полученной информации, но и фактически сопровождается сменой парадигмы, что требует изменений в самом подходе к исследовательской работе как на стадии планирования эксперимента, так и в процессе обработки его результатов.

Представленный в работе материал посвящен применению масс-спектрометрии ИЦР ПФ для системного анализа совокупности структурных форм белков, составляющих фотосинтезирующие комплексы, а также исследованию фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в тилакоидных мембранах хлоропластов в условиях светового стресса. Особое внимание уделено фотодинамическим процессам в фотосистеме II, осуществляющей окисление воды с образованием молекулярного кислорода, протонов и электронов и наиболее подверженной разрушительному воздействию различного рода радикалов и активных форм кислорода.

Цели и задачи работы

Главной целью работы была разработка физико-химических методов анализа совокупности белковых компонентов фотосинтезирующих комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения и их практическая реализация для исследования динамических процессов в фотосинтезирующих аппаратов растений в условиях светового стресса. Для её выполнения требовалось разработать методики анализа и оценить их погрешности, найти белки и модификации белков, являющиеся биомаркерами изучаемых процессов, и с их помощью охарактеризовать изменения в пигментно-белковых комплексах под действием светового стресса. В работе были поставлены и решены следующие задачи: (1) подобрать условия пробоподготовки, разделения и масс-спектрометрического анализа с использованием методов ионизации MALDI и ESI, обеспечивающие идентификацию и сравнительный анализ белков в динамическом диапазоне концентраций 1000 и более; (2) провести протеомный анализ фотосинтезирующих мембран хлоропластов растений до и после светового стресса и выявить среди идентифицированных белков и их модифицированных форм светозависимые; (3) разработать методику разделения функционально активных пигментно-белковых комплексов тилакоидов и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа входящих в их состав белков; (4) изучить фотохимические реакции белков в тилакоидных мембранах растений и их влияние на динамические процессы в фотосинтезирующих аппаратах.

Научная новизна

Реализован ряд методик, основанных на масс-спектрометрическом анализе и позволяющих проводить мониторинг белков фотосинтезирующих комплексов в широком динамическом диапазоне концентраций. Методика, сочетающая разделение функционально активных неденатурированных белковых комплексов гель-электрофорезом с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом продуктов их протеолиза в геле, впервые применена для описания фотодинамических процессов в тилакоидных комплексах. На основе хромато-масс-спектров высокого разрешения для соответствующих ионов построены профили распределения для 30 хлорофилл-связывающих белков в пигментно-белковых комплексах растений, адаптированных к условиям низкой освещённости и подвергнутых световому стрессу, и с их помощью выявлены функциональные особенности редких белков.

По результатам протеомного анализа с применением масс-спектрометрии высокого разрешения идентифицированы 278 продуктов нитрирования и окисления аминокислотных остатков тилакоидных белков. Впервые показано, что основным типом фотоокислительных модификаций в фотосинтезирующих аппаратах являются нитрирование тирозина и триптофана и окисление триптофана. С помощью хромато-масс-спектрометрии определены связанные со световых стрессом изменения в уровнях модификаций для 7 фосфорилированных и 23 нитрированных аминокислотных остатков хлорофилл-связывающих белков как в общем белковом составе, так и в составе отдельных субкомплексов, комплексов и суперкомплексов.

Физико-химическими методами изучены неизвестные ранее механизмы адаптации фотосистемы II к условиям освещённости: дифференциальное фосфорилирование антенны, регулирующее как диссоциацию антенны, так и мономеризацию повреждённых димеров и суперкомплексов, нитрирование белка реакционного центра, приводящее к распаду комплексов и суперкомплексов фотосистемы, а также противоположная фоторегуляция фосфорилирования и нитрирования в мономерах, димерах и суперкомплексах.

Практическая значимость

Разработанные методики сравнительного анализа белковой композиции фотосинтезирующих комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения могут быть применены при анализе динамических изменений в различных органеллах.

Новый подход к изучению функциональной роли белков путём сравнения профилей их распределения между комплексами, построенных на основе хромато-масс-спектров высокого разрешения, с распределением всех других родственных белков, реализованный в данной работе для хлорофилл-связывающих белков, может быть использован для решения подобных задач в будущем.

Полученные данные по идентифицированным белкам и модификациям, распределению редких, фосфорилированных и нитрированных белков расширяют современные представления о фотоокислительных механизмах в хлоропластах, процессах акклимации, фотоингибирования и реорганизации фотосинтезирующих комплексов.

Структура диссертации

Первая глава является литературным обзором, в котором даётся краткое описание белковых комплексов тилакоидов — объектов, исследуемых в работе, вводится понятие светового стресса и рассказывается о его влиянии на фотосинтез, приведён обзор процессов, связанных с адаптацией растений к условиям освещённости и защитой от светового стресса. Кроме того, дискутируются трудности и ограничения традиционных методов исследования тилакоидных комплексов, обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ИЦР ПФ для исследования данной системы, рассмотрены вопросы, касающиеся точности измерения масс, разрешающей способности и динамического диапазона, описаны способы анализа модификаций белков, связанных с действием различного рода радикалов и активных форм кислорода и/или выполняющих фотозащитные и фоторегулирующие функции.

Во второй главе описаны различные подходы к анализу светособирающих комплексов тилакоидных мембран с использованием методов градиентного центрифугирования для выделения белковых комплексов, одно- и двумерного гель-электрофореза для разделения белков. Были опробованы комбинации одно- и двумерного гель-электрофореза для разделения с методами ESI и MALDI для анализа белков и модификаций в них. Сравнительный анализ проведён с использованием абсолютных значений интенсивности сигналов идентифицированных пептидов в образцах до и после светового стресса. По результатам анализа описан ряд процессов, связанных с адаптацией к интенсивности света.

Третья глава посвящена протеомному анализу белков тилакоидных мембран. Предложенная методика состояла из одномерного гель-электрофореза белков и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов их протеолиза трипсином. Анализ пептидов включал в себя разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, определения их молекулярной массы в ячейке ИЦР, фрагментацию ионов выбранных пептидов в линейной квадрупольной ловушке с последующим установлением их аминокислотной последовательности. Разработанная методика применена для анализа редких и модифицированных белков. Выявлены светозависимые белки и модификации.

В четвёртой главе описывается методика разделения и анализа фотосиптезирующих комплексов тилакоидов, состоящая из Blue native гель-электрофореза и хромато-масс-спектрометрии. Анализ пигментно-белковых комплексов был основан на построении профилей распределения входящих в их состав белков на основе хромато-масс-спектров высокого разрешения. С помощью разработанной методики проведено комплексное исследование функциональных особенностей редких хлорофилл-связывающих белков, а также роли нитрирования и фосфорилирования белков в фотоингибировании и ремонтном цикле фотосистемы II.

Выводы

1. Исследована перспектива применения масс-спектрометрии высокого разрешения для анализа изменений в белковой композиции светособирающих (антенных) пигментно-белковых комплексов. Оценена погрешность сравнительного анализа профилей интенсивности сигналов масс-спектров в широком динамическом диапазоне концентраций белков.

2. Определены количественные изменения в белковом составе светособирающих комплексов, вызванные воздействием светового стресса на растения, и выявлен ряд процессов, связанных с адаптацией антенны к интенсивности света.

3. Реализована хромато-масс-спектрометрическая методика для определения уровней модификации аминокислотных остатков белков, позволяющая осуществлять комплексный мониторинг таких фотохимических процессов в тилакоидных мембранах хлоропластов, как фосфорилирование, нитрирование и окисление.

4. Исследованы фотохимические реакции белков в тилакоидных мембранах и впервые показано, что основными типами фотоокислительных реакций белков в фото синтезирующих аппаратах являются нитрирование тирозина и триптофана и окисление триптофана.

5. Разработан метод анализа реорганизационных процессов в фотосинтезирующих аппаратах на основе гель-электрофореза в неденатурирующих условиях для разделения белковых комплексов с последующим хромато-масс-спектрометрическим детектированием продуктов протеолиза входящих в их состав белков. Предложенная методика основана на сравнении профилей распределения популяций белков среди фотосинтезирующих комплексов.

6. Проведено комплексное исследование фотофизических и фотохимических процессов, относящихся к реорганизации фотосинтезирующих аппаратов в условиях светового стресса. Выявлены функциональные особенности ряда редких и светозависимых белков. Показана ключевая роль нитрирования белков в распаде комплексов и регуляторная функция фосфорилирования при распаде повреждённых фотосинтезирующих комплексов, замены и последующей ассоциации белков в функциональный комплекс.

Заключение

Главной целью данной работы явилось систематическое изучение воздействия светового стресса на процессы реорганизации в фотосистемах I и II с применением масс-спектрометрических методов высокого разрешения для анализа многообразия белков, модификаций в белках и их роли в реорганизации комплексов.

Содержанием первого этапа исследований было применение различных подходов к анализу светособирающих комплексов тилакоидных мембран, выделенных центрифугированием в градиенте сахарозы. Были опробованы комбинации одно- и двумерного гель-электрофореза для разделения с методами ESI и MALDI для анализа белков и модификаций в них. Наилучшие результаты были получены при сочетании одномерного гель-электрофореза с MALDI и ИЦР ПФ. При анализе был использован ионный источник Apollo II, имеющий лазер с возможностью точной регулировки поперечного сечения луча, а также эффективную систему транспорта ионов. Сочетание высокой разрешающей способности и точности измерения масс с максимально широким динамическим диапазоном, позволяющим детектировать сигналы высокой и низкой интенсивности было следствием оптимизации числа измеряемых ионов путём варьирования энергии лазера, поперечного сечения лазерного луча, числа лазерных импульсов при создании пакета ионов и количества единичных спектров, используемых для создания результирующего масс-спектра.

Оптимальное качество пробоподготовки, достигнутое при обессоливании пробы и высушивания на поверхности AnchorChip, обеспечило не только измерение в широком (более 1000) динамическом диапазоне, но и привело к хорошей воспроизводимости спектров и минимальному различию в интенсивности сигналов спектров проб до и после светового стресса, что стало основой для сравнительного анализа. Точность измерения масс составляла в большинстве случаев не более ±3 ррт, что дало возможность проводить идентификацию про значении относительной погрешности 5 ррт.

Сравнительный анализ проведён с использованием абсолютных значений интенсивности сигналов идентифицированных пептидов в образцах до (LL) и после (HL) светового стресса. Из 79 идентифицированных белков выявлено 21 светозависимых. По результатам анализа описан ряд процессов, связанных с адаптацией

108 к интенсивности света. Это увеличение под действием светового стресса во фракции светособирающих комплексов количества трёх белков фотосистемы II (PSBC, PSBB и HCF136) и трёх белков фотосистемы I (PSAL, ОНР1 и ОНР2), указывающее на возможную реорганизацию обеих фотосистем. Кроме того, был подтверждён индуцированный световым стрессом синтез белков ELIP1 и ELIP2 (см. рис. 1.), а также локализация данных белков в составе светособирающих комплексов фотосистемы II.

Следующий этап исследований включал в себя разработку методики сравнительного анализа белков тилакоидных мембран для определения изменений как в белковом составе, так и связанных с модификациями боковых цепей белков. Предложенная методика состояла из одномерного гель-электрофореза белков и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов их протеолиза трипсином. Анализ пептидов включал в себя разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, определения их молекулярной массы в ячейке ИЦР, фрагментацию ионов выбранных пептидов в линейной квадрупольной ловушке с последующим установлением их аминокислотной последовательности. В применяемом при выполнении данной работы гибридном масс-спектрометре LTQ-FT (Thermo Finnigan) реализована концепция быстрой и одновременной записи масс-спектров высокого разрешения для пептидов и спектров низкого разрешения для их фрагментов в зависимости от числа компонентов и количества измеряемых ионов. Для повышения точности измерения масс в ячейке ИЦР была использована процедура внутренней калибровки каждого спектра, что привело к уменьшению погрешности определения массы до 3 ррт в динамическом диапазоне более 1000. Количественный анализ был проведён с использованием хроматограмм ионов идентифицированных пептидов, для построения хроматограмм было использовано значение m/z иона ±5 ррт. Высокая разрешающая способность масс спектра ИЦР позволяет не только точно измерять массу пептида, но значительно снижает влияние мешающих сигналов при построении хроматограмм ионов. Возможность точной идентификации последовательности пептидов широком динамическом диапазоне в сочетании со сравнительно высокой разрешающей способностью хроматографического анализа и предварительным разделением белков характеризует высокую эффективность применяемой методики.

Идентифицированы все известные хлорофилл-связывающие белки, относящиеся к реакционным центрам и светособирающим комплексам фотосистем, включая редко встречающиеся и не обнаруженные до этого масс-спектрометрическими методами LHCA5 и LHCA6. Кроме того, были найдены 4 редких светоиндуцированных белка семейства ELIP (ELIP1 ELIP2, ОНР1 и SEP3.1).

Одним из главных преимуществ применяемого на данном этапе работы хромато-масс-спектрометрического метода явилась возможность идентифицировать модифицированные пептиды, не приметая при этом дополнительных методов выделения и детектирования. Учитывая, что анализ фосфопептидов после металло-аффинного обогащения с одной стороны увеличивает предел обнаружения, а с другой -затрудняет количественную интерпретацию, в данной работе обогащения фосфопептидов не проводилось. Увеличение пределов обнаружения модифицированных аминокислотных остатков достигнуто за счёт оптимизации хромато-масс-спектрометрического анализа. Идентификация всех известных типов модификаций проводилась с помощью «Mascot error tolerant database searching». В числе найденных модификаций фосфорилирование, нитрирование и окисление аминокислотных остатков.

Анализ уровней фосфорилирования 8 аминокислотных остатков белков фотосистемы II показал, что световой стресс приводит к фосфорилированию Thr-112 и Thr-114 белка LHCB4.1 и дефосфорилированию Thr-38 и Thr-37 белков LHCB1 и LHCB4.2, соответственно. При этом , фосфорилирование Thr-112 и Thr-114 LHCB4.1 под действием светового стресса сопровождается фосфорилированием белков PSBA, PSBD и PSBC центра фотосистемы II. Представляется вероятным, что фосфорилирование белков LHCB1 и LHCB4.2 связано с перераспределением антенны между фотосистемами , а фосфорилирование LHCB4.1 - с реорганизацией реакционных центров фотосистемы II.

Идентифицировано 126 аминокислотных остатков нитротирозина и 12 нитротриптофана в 164 нитропептидах, при этом в 9 пептидах были идентифицированы по две нитрогруппы. Из них 33 и 47 - в фотосистемах I и II, соответственно, 20 - в комплексе цитохрома Ьб/f и 30 - в АТРазном комплексе. Таким образом, впервые показано, что нитрирование тирозина и триптофана является наиболее часто встречающимся типом модификаций в фото синтезирующих комплексах. Кроме того, обнаружено 140 продуктов окисления аминокислотных остатков, прежде всего триптофана. В фотосистеме II найдено 59 продуктов окисления триптофана, в фотосистеме I - 29, в комплексах цитохрома b(/f и АТРазы - соответственно 7 и 2.

Значительное увеличение уровней нитрирования тирозина и нитрирования и окисления триптофана под воздействием светового стресса установлено для белков PSBA, PSBD и PSBE реакционного центра фотосистемы II, а также для белка PSBB центральной антенны и белков PSBO и PSBR кислород-выделяющего комплекса. Данные результаты свидетельствуют, что именно эти модификации напрямую связаны с повреждениями в фотосистеме II, вызванными воздействием светового стресса. Кроме того, отмечено снижение уровней нитрирования аминокислотных остатков тирозина и триптофана и окисления триптофана белков внешней антенны с увеличением интенсивности света, показывающее увеличение скорости синтеза новых и распада повреждённых белков в условиях сильной освещённости.

Заключительный этап работы был посвящён исследованию процессов миграции белков между комплексами и реорганизации пигментно-белковых комплексов под действием светового стресса. Для разделения белковых комплексов был использован Blue-native полиакриламидный гель-электрофорез. Построены профили распределения хлорофилл-связывающих белков для растений, адаптированных в различных условиях освещённости.

Показано, что белки внешней антенны LHCB3 и LHCB5 более тесно связаны с центром фотосистемы II чем белки LHCB1-2, а белки LHCA1-3 сильнее ассоциированы с фотосистемой I, чем редкие белки LHCA5 и ОНР2. Подтверждены предположения, что LFICA5 участвует в акклимации фотосистемы I к изменениям в качестве и количестве света, а ОНР2 и, возможно, ОНР1 - в перераспределении энергии возбуждения между фотосистемами. Белки LHCB4, LHCB6 и PSBS содержатся в больших количествах, а белки ELIP1 и ELIP2 накапливаются в супер комплексах фотосистемы II в условиях светового стресса, что подтверждает существующие представления об участии данных белков в регуляции потоков энергии возбуждения и перевода её в теплоту. Кроме того, на основе полученных данных описан ряд процессов, связанных с деградацией и реорганизацией реакционных центров фотосистемы II. Наблюдаемые изменения в целом сводятся к вызванному стрессом дисбалансу между разрушением повреждённых реакционных центров и синтезом новых.

Определены уровни фосфорилирования для 7 аминокислотных остатков треонина и уровни нитрирования для 23 аминокислотных остатков тирозина в пигментно-белковых комплексах. Выявлена противоположная регуляция фосфорилирования белков антенны фотосистемы II под действием светового стресса. Уровни фосфорилирования ТЬг-112 и ТИг-114 белка ЬНСВ4.1 увеличиваются, а ТЪг-37 белка Ы-1СВ4.2 уменьшаются в функционально активных комплексах. Для аминокислотных остатков белков антенны ЬНСА4, ЬНСВ1, ЬНСВ5, ЬНСВб и белка реакционного центра фотосистемы II Р8ВА характерны наивысшие значения уровня нитрирования в неассоциированных субкомплексах в условиях светового стресса, что связано с возможной ролью нитрирования данных аминокислотных остатков в диссоциации комплексов и суперкомплексов, содержащих нитрированные белки. Уровень нитрирования Туг-262, расположенного в белке РБВА в месте присоединения акцептора электронов пластохинона С)в, значительно уменьшается в функционально активных комплексах и суперкомплексах и значительно увеличивается в неассоциированных субкомплексах в условиях светового стресса. Это показывает ключевую роль нитрирования Туг-262 в повреждении и распаде фотосистемы II в процессе её оборота.

Сравнение уровней фосфорилирования и нитрирования показывает противоположную регуляцию двух данных типов модификаций в функционально активных комплексах фотосистемы И. Низкие уровни фосфорилирования и высокие уровни нитрирования характерны для низкой освещённости, высокие уровни фосфорилирования и низкие уровни нитрирования - для светового стресса. Таким образом, нитрирование в фотосинтезирующих комплексах может приводить к их ингибированию и распаду, а светозависимое обратимое фосфорилирование способно регулировать оборот белков и реорганизацию пигментно-белковых комплексов. В случае белка РБВА, разгруппировка тилакоидной мембраны, вызванная как отрывом акцептора электронов СЬ от нитрированного РБВА, так и увеличением уровня фосфорилирования реакционного центра, может быть причиной ускоренного оборота фотосистемы II в условиях светового стресса.

1. Zhu H., Bilgin, M., Snyder, M., Proteomics, Annu Rev Biochem, 2003, 72, p. 783-812.

2. Dekker J.P., Boekema E.J., Supramolecular organization of thylakoid membrane proteins in green plants, Biochim. Biophys. Acta, 2005, 1706, p. 12-39.

3. Merchant S., Sawaya M.R., The light reactions: a guide to recent acquisitions for the picture gallery, Plant Cell, 2005, 17, p. 648-663.

4. Minagawa J., Takahashi Y., Structure, function and assembly of Photosystem II and its light-harvesting proteins, Photosynth. Res., 2004, 82, p. 241-263.

5. Jensen P.E., Bassi R., Boekema E.J., Dekker J.P., Jansson S., Leister D., Robinson C., Scheller II.V., Structure, function and regulation of plant photosystem I, Biochim. Biophys. Acta, 2007.

6. Boyer P.D., A perspective of the binding change mechanism for ATP synthesis, Faseb J, 1989,3, p. 2164-2178.

7. Ben-Shem A., Frolow F., Nelson N., Crystal structure of plant photosystem I, Nature, 2003,426, p. 630-635.

8. Scheller FI.V., Jensen P.E., Haldrup A., Lunde C., Knoetzel J., Role of subunits in eukaryotic Photosystem I, Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1507, p. 41-60.

9. Nelson N., Yocum C.F., Structure and function of photosystems I and II, Annu. Rev. Plant Biol., 2006, 57, p. 521-565.

10. Jones M.R., Fyfe P.K., Photosynthesis: a new step in oxygen evolution, Curr Biol, 2004, 14, p. R320-322.

11. Nixon P.J., Diner B.A., Analysis of water-oxidation mutants constructed in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, Biochem Soc Trans, 1994, 22, p. 338-343.

12. Svensson B., Etchebest C., Tuffery P., van Kan P., Smith J., Styring S., A model for the photosystem II reaction center core including the structure of the primary donor P680, Biochemistry, 1996, 35, p. 14486-14502.

13. Barber J., Photosystem two, Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1365, p. 269-277.

14. Sharma J., Panico M., Barber J., Morris H.R., Characterization of the low molecular weight photosystem II reaction center subunits and their light-induced modifications by mass spectrometry, J. Biol. Chem., 1997, 272, p. 3935-3943.

15. Standfuss J., Terwisscha van Scheltinga A.C., Lamborghini M., Kuhlbrandt W., Mechanisms of photoprotection and nonphotochemical quenching in pea light-harvesting complex at 2.5 A resolution, Embo J, 2005, 24, p. 919-928.

16. Kuhlbrandt W., Wang D.N., Fujiyoshi Y., Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography, Nature, 1994, 367, p. 614-621.

17. Liu Z., Yan H., Wang K., Kuang T., Zhang J., Gui L., An X., Chang W., Crystal structure of spinach major light-harvesting complex at 2.72 A resolution, Nature, 2004, 428, p. 287-292.

18. Dreyfuss B.W., Thornber J.P., Assembly of the Light-Harvesting Complexes (LHCs) of Photosystem II (Monomeric LHC lib Complexes Are Intermediates in the Formation of Oligomeric LHC lib Complexes), Plant Physiol, 1994, 106, p. 829-839.

19. Pascal A.A., Liu Z., Broess K., van Oort B., van Amerongen H., Wang C., Horton P., Robert B., Chang W., Ruban A., Molecular basis of photoprotection and control of photosynthetic light-harvesting, Nature, 2005, 436, p. 134-137.

20. Jansson S., A guide to the Lhc genes and their relatives in Arabidopsis/IT>, Trends Plant Sci, 1999, 4, p. 236-240.

21. Caffarri S., Croce R., Cattivelli L., Bassi R., A look within LHCII: differential analysis of the Lhcbl-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis, Biochemistry, 2004, 43, p. 9467-9476.

22. Klimmek F., Sjodin A., Noutsos C., Leister D., Jansson S., Abundantly and rarely expressed Lhc protein genes exhibit distinct regulation patterns in plants, Plant Physiol., 2006, 140, p. 793-804.

23. Lucinski R., Schmid V.H., Jansson S., Klimmek F., Lhca5 interaction with plant photosystem I, FEBS Lett., 2006, 580, p. 6485-6488.

24. Wientjes E., Oostergetel G.T., Jansson S., Boekema E.J., Croce R., The role of Lhca complexes in the supramolecular organization of higher plant photosystem I, J. Biol. Chem., 2009,284, p. 7803-7810.

25. Standfiiss J., Kuhlbrandt W., The three isoforms of the light-harvesting complex II: spectroscopic features, trimer formation, and functional roles, J Biol Chem, 2004, 279, p. 36884-36891.

26. Kirchhoff H., Tremmel I., Haase W., Kubitscheck U., Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement, Biochemistry, 2004, 43, p. 9204-9213.

27. Linnanto J., Martiskainen J., Lehtovuori V., Ihalainen J., Kananavicius R., Barbato R., Korppi-Tommola J., Excitation energy transfer in the LHC-II trimer: a model based on the new 2.72 A structure, Photosynth Res, 2006, 87, p. 267-279.

28. Hobe S., Forster R., Klingler J., Paulsen H., N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex, Biochemistry, 1995, 34, p. 10224-10228.

29. Kuttkat A., Hartmann A., Hobe S., Paulsen H., The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex, Eur J Biochem, 1996, 242, p. 288-292.

30. Jackowski G., Kacprzak K., Jansson S., Identification of Lhcbl/Lhcb2/Lhcb3 heterotrimers of the main light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex of Photosystem II (LHC II), Biochim Biophys Acta, 2001, 1504, p. 340-345.

31. Iwai M., Takahashi Y., Minagawa J., Molecular remodeling of photosystem II during state transitions in Chlamydomonas reinhardtii, Plant Cell, 2008, 20, p. 2177-2189.

32. Takahashi H., Iwai M., Takahashi Y., Minagawa J., Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii, Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103, p. 477-482.

33. Lambrev P.H., Varkonyi Z., Krumova S., Kovacs L., Miloslavina Y., Holzwarth A.R., Garab G., Importance of trimer-trimer interactions for the native state of the plant light-harvesting complex II, Biochim Biophys Acta, 2007.

34. Adamska I., Kruse E., Kloppstech K., Stable insertion of the early light-induced proteins into etioplast membranes requires chlorophyll a, J. Biol. Chem., 2001, 276, p. 85828587.

35. Heddad M., Noren H., Reiser V., Dunaeva M., Andersson B., Adamska I., Differential expression and localization of early light-induced proteins in Arabidopsis, Plant Physiol., 2006, 142, p. 75-87.

36. Funk C., Wiklund R., Schroder W.P., Jansson C., Dl1 centers are less efficient than normal photosystem II centers, FEBS Lett., 2001, 505, p. 113-117.

37. Montane M.H., Kloppstech K., The family of light-harvesting-related proteins (LHCs, ELIPs, HLIPs): was the harvesting of light their primary function?, Gene, 2000, 258, p. 1-8.

38. Grimm B., Kruse E., Kloppstech K., Transiently expressed early light-inducible thylakoid proteins share transmembrane domains with light-harvesting chlorophyll binding proteins, Plant Mol. Biol., 1989, 13, p. 583-593.

39. Fleddad M., Adamska I., Light stress-regulated two-helix proteins in Arabidopsis thaliana related to the chlorophyll a/b-binding gene family, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, p. 3741-3746.

40. Jansson S., Andersson J., Kim S.J., Jackowski G., An Arabidopsis thaliana protein homologous to cyanobacterial high-light-inducible proteins, Plant Mol. Biol., 2000, 42, p. 345351.

41. Andersson U., Heddad M., Adamska I., Light stress-induced one-helix protein of the chlorophyll a/b-binding family associated with photosystem I, Plant Physiol., 2003, 132, p. 811-820.

42. Nield J., Redding K., Hippler M., Remodeling of light-harvesting protein complexes in chlamydomonas in response to environmental changes, Eukaryot Cell, 2004, 3, p. 1370-1380.

43. Asada K., Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions, Plant Physiol, 2006, 141, p. 391-396.

44. Stadtman E.R., Protein oxidation and aging, Free. Radic. Res., 2006, 40, p. 1250-1258.

45. Horton P., Ruban A.V., Walters R.G., Regulation of Light Harvesting in Green Plants, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1996, 47, p. 655-684.

46. Johansson E., Olsson O., Nystrom T., Progression and specificity of protein oxidation in the life cycle of Arabidopsis thaliana, J Biol Chem, 2004, 279, p. 22204-22208.

47. Allen J.F., Protein phosphorylation in regulation of photosynthesis, Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1098, p. 275-335.

48. Lindahl M., Yang D.H., Andersson B., Regulatory proteolysis of the major light-harvesting chlorophyll a/b protein of photosystem II by a light-induced membrane-associated enzymic system, Eur J Biochem, 1995, 231, p. 503-509.

49. Niyogi K.K., Li X.P., Rosenberg V., Jung H.S., Is PsbS the site of non-photochemical . quenching in photosynthesis?, J. Exp. Bot., 2005, 56, p. 375-382.

50. Tang Y., Wen X., Lu Q., Yang Z., Cheng Z., Lu C., Heat stress induces an aggregation of the light-harvesting complex of photosystem II in spinach plants, Plant Physiol, 2007, 143, p. 629-638.

51. Wollman F.A., State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus, EMBO J., 2001, 20, p. 3623-3630.

52. Lunde C., Jensen P.E., Haldrup A., Knoetzel J., Scheller H.V., The PSI-H subunit of photosystem I is essential for state transitions in plant photosynthesis, Nature, 2000, 408, p. 613-615.

53. Aro E.M., Suorsa M., Rokka A., Allahverdiyeva Y., Paakkarinen V., Saleem A., Battchikova N., Rintamaki E., Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes, J Exp Bot, 2005, 56, p. 347-356.

54. Plucken H., Muller B., Grohmann D., Westhoff P., Eichacker L.A., The HCF136 protein is essential for assembly of the photosystem II reaction center in Arabidopsis thaliana, FEBS Lett., 2002, 532, p. 85-90.

55. Chow W.S., Kim E.H., Horton P., Anderson J.M., Granal stacking of thylakoid membranes in higher plant chloroplasts: the physicochemical forces at work and the functional consequences that ensue, Photochem. Photobiol. Sci., 2005, 4, p. 1081-1090.

56. Anderson J.M., Chow W.S., De Las Rivas J., Dynamic flexibility in the structure and function of photosystem II in higher plant thylakoid membranes: the grana enigma, Photosynth. Res., 2008, 98, p. 575-587.

57. Kargul J., Barber J., Photosynthetic acclimation: structural reorganisation of light harvesting antenna—role of redox-dependent phosphorylation of major and minor chlorophyll a/b binding proteins, FEBS J., 2008, 275, p. 1056-1068.

58. Chuartzman S.G., Nevo R., Shimoni E., Charuvi D., Kiss V., Ohad I., Brumfeld V., Reich Z., Thylakoid membrane remodeling during state transitions in Arabidopsis, Plant Cell, 2008, 20, p. 1029-1039.

59. Turkina M.V., Kargul J., Blanco-Rivero A., Villarejo A., Barber J., Vener A.V., Environmentally modulated phosphoproteome of photosynthetic membranes in the green alga Chlamydomonas reinhardtii, Mol. Cell. Proteomics, 2006, 5, p. 1412-1425.

60. Rolland N., Ferro M., Seigneurin-Berny D., Garin J., Douce R., Joyard J., Proteomics of chloroplast envelope membranes, Photosynth. Res., 2003, 78, p. 205-230.

61. Peltier J.B., Cai Y., Sun Q., Zabrouskov V., Giacomelli L., Rudella A., Ytterberg A.J., Rutschow H., van Wijk K.J., The oligomeric stromal proteome of Arabidopsis thaliana chloroplasts, Mol. Cell. Proteomics, 2006, 5, p. 114-133.

62. Peltier J.B., Ytterberg A.J., Sun Q., van Wijk K.J., New functions of the thylakoid membrane proteome of Arabidopsis thaliana revealed by a simple, fast, and versatile fractionation strategy, J. Biol. Chem., 2004, 279, p. 49367-49383.

63. Ferro M., Salvi D., Brugiere S., Miras S., Kowalski S., Louwagie M., Garin J., Joyard J., Rolland N., Proteomics of the chloroplast envelope membranes from Arabidopsis thaliana, Mol. Cell. Proteomics, 2003, 2, p. 325-345.

64. Zabrouskov V., Giacomelli L., van Wijk K.J., McLafferty F.W., A new approach for plant proteomics: characterization of chloroplast proteins of Arabidopsis thaliana by top-down mass spectrometry, Mol. Cell. Proteomics, 2003, 2, p. 1253-1260.

65. Heinemeyer J., Eubel H., Wehmhoner D., Jansch L., Braun H.P., Proteomic approach to characterize the supramolecular organization of photosystems in higher plants, Phytochemistry, 2004, 65, p. 1683-1692.

66. Reisinger V., Eichacker L.A., How to analyze protein complexes by 2D blue native SDS-PAGE, Proteomics, 2007, 7 Suppl 1, p. 6-16.

67. Wittig I., Braun H.P., Schagger H., Blue native PAGE, Nat. Protoc., 2006, 1, p. 418428.

68. Suorsa M., Regel R.E., Paakkarinen V., Battchikova N., Herrmann R.G., Aro E.M., Protein assembly of photosystem II and accumulation of subcomplexes in the absence of low molecular mass subunits PsbL and PsbJ, Eur J Biochem, 2004, 271, p. 96-107.

69. Ytterberg A.J., Peltier J.B., van Wijk K.J., Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes, Plant Physiol, 2006, 140, p. 984-997.

70. Hippler M., Klein J., Fink A., Allinger T., Hoerth P., Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii, Plant J, 2001, 28, p. 595-606.

71. Timperio A.M., Huber C.G., Zolla L., Separation and identification of the light harvesting proteins contained in grana and stroma thylakoid membrane fractions, J Chromatogr A, 2004, 1040, p. 73-81.

72. Timperio A.M., Zolla L., Investigation of the lateral light-induced migration of photosystem II light-harvesting proteins by nano-high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry, J Biol Chem, 2005, 280, p. 28858-28866.

73. Gomez S.M., Nishio J.N., Faull K.F., Whitelegge J.P., The chloroplast grana proteome defined by intact mass measurements from liquid chromatography mass spectrometry, Mol Cell Proteomics, 2002, 1, p. 46-59.

74. Vener A.Y., Harms A., Sussman M.R., Vierstra R.D., Mass spectrometric resolution of reversible protein phosphorylation in photosynthetic membranes of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem., 2001, 276, p. 6959-6966.

75. Hansson M., Vener A.V., Identification of three previously unknown in vivo protein phosphorylation sites in thylakoid membranes of Arabidopsis thaliana, Mol. Cell. Proteomics, 2003, 2, p. 550-559.

76. Aro E.M., Rokka A., Vener A.V., Determination of phosphoproteins in higher plant thylakoids, Methods Mol. Biol., 2004, 274, p. 271-285.

77. Mann M., Kelleher N.L., Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2008, 105, p. 18132-18138.

78. Liu T., Belov M.E., Jaitly N., Qian W.J., Smith R.D., Accurate mass measurements in proteomics, Chem Rev, 2007, 107, p. 3621-3653.

79. Aebersold R., Mann M., Mass spectrometry-based proteomics, Nature, 2003, 422, p. 198-207.

80. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J., Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting, Curr Biol, 1993, 3, p. 327-332.

81. Karas M., Gluckmann M., Schafer J., Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors, J Mass Spectrom, 2000, 35, p. 1-12.

82. Mann M., Wilm M., Electrospray mass spectrometry for protein characterization, Trends Biochem Sci, 1995, 20, p. 219-224.

83. Barrow M.P., Burkitt W.I., Derrick P.J., Principles of Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry and its application in structural biology, Analyst, 2005, 130, p. 18-28.

84. Yates J.R., 3rd, Database searching using mass spectrometry data, Electrophoresis, 1998, 19, p. 893-900.

85. Clauser K.R., Baker P., Burlingame A.L., Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching, Anal Chem, 1999, 71, p. 2871-2882.

86. Marshall A.G., Flendrickson C.L., Jackson G.S., Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer, Mass Spectrom Rev, 1998, 17, p. 1-35.

87. Amster I.J., Fourier transform mass spectrometry, J. Mass Spectrom., 1996, 31, p. 12251337.

88. Winger B.E., Campana J.E., Characterization of combinatorial peptide libraries by electrospray ionization Fourier transform mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1996, 10, p. 1811-1813.

89. Loo J.A., Loo R.R., Light K.J., Edmonds C.G., Smith R.D., Multiply charged negative ions by electrospray ionization of polypeptides and proteins, Anal Chem, 1992, 64, p. 81-88.

90. Castro J.A., Koster C., Wilkins C., Matrix-assisted laser desorption/ionization of highmass molecules by Fourier-trans form mass spectrometry, Rapid Commun Mass Spectrom, 1992, 6, p. 239-241.

91. Marshall A.G., Hendrickson C.L., Fourier Transform ion cyclotron resonance detection: principles and experimental configurations, International Journal of Mass Spectrometry, 2002, 215.

92. Guan S., Marshall A.G., Ion traps for fticrms: principles and design of geometric electric configurations, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 1995, 146/147, p. 261-296.

93. Masselon C., Tolmachev A.Y., Anderson G.A., Harkewicz R., Smith R.D., Mass measurement errors caused by 'local" frequency perturbations in FTICR mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2002, 13, p. 99-106.

94. Ledford E.B., Jr., Rempel D.L., Gross M.L., Space charge effects in Fourier transform mass spectrometry. Mass calibration, Anal Chem, 1984, 56, p. 2744-2748.

95. Wong R.L., Amster I.J., Sub part-per-million mass accuracy by using stepwise-external calibration in fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, p. 1681-1691.

96. Payne A.H., Glish G.L., Tandem mass spectrometry in quadrupole ion trap and ion cyclotron resonance mass spectrometers, Methods Enzymol., 2005, 402, p. 109-148.

97. Macek B., Mann M., Olsen J.V., Global and site-specific quantitative phosphoproteomics: principles and applications, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2009, 49, p. 199-221.

98. Takamoto K., Chance M.R., Radiolytic protein footprinting with mass spectrometry to probe the structure of macromolecular complexes, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2006, 35, p. 251-276.

99. Xu G., Chance M.R., Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting, Anal Chem, 2005, 77, p. 4549-4555.

100. Xu G., Chance M.R., Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting, Anal Chem, 2005, 77, p. 24372449.

101. Vogt W., Oxidation of methionyl residues in proteins: tools, targets, and reversal, Free Radic. Biol. Med., 1995, 18, p. 93-105.

102. Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 1976, 72, p. 248-254.

103. Chao C.C., Ma Y.S., Stadtman E.R., Modification of protein surface hydrophobicity and methionine oxidation by oxidative systems, Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94, p. 29692974.

104. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Gagliano N., Di Simplicio P., Colombo R., Milzani A., Methionine oxidation as a major cause of the functional impairment of oxidized actin, Free Radic Biol Med, 2002, 32, p. 927-937.

105. Kunz L., Zeidler U., Haegele K., Przybylski M., Stark G., Photodynamic and radiolytic inactivation of ion channels formed by gramicidin A: oxidation and fragmentation, Biochemistry, 1995, 34, p. 11895-11903.

106. Zybailov B., Rutschow PI., Friso G., Rudella A., Emanuelsson O., Sun Q., van Wijk K.J., Sorting signals, N-terminal modifications and abundance of the chloroplast proteome, PLoS One, 2008, 3, p. el994.

107. Boudreau E., Takahashi Y., Lemieux C., Turmel M., Rochaix J.D., The chloroplast ycf3 and ycf4 open reading frames of Chlamydomonas reinhardtii are required for the accumulation of the photosystem I complex, EMBO J., 1997, 16, p. 6095-6104.

108. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S., Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis, 1999, 20, p. 3551-3567.

109. Kersey P.J., Duarte J., Williams A., Karavidopoulou Y., Birney E., Apweiler R., The International Protein Index: an integrated database for proteomics experiments, Proteomics, 2004, 4, p. 1985-1988.

110. Zubarev R., Mann M., On the proper use of mass accuracy in proteomics, Mol. Cell. Proteomics, 2007, 6, p. 377-381.

111. Sugiyama N., Nakagami PI., Mochida K., Daudi A., Tomita M., Shirasu K., Ishihama Y., Large-scale phosphorylation mapping reveals the extent of tyrosine phosphorylation in Arabidopsis, Mol. Syst. Biol., 2008, 4, p. 193.

112. Tikkanen M., Grieco M., Kangasjarvi S., Aro E.M., Thylakoid protein phosphorylation in higher plant chloroplasts optimizes electron transfer under fluctuating light, Plant Physiol., 2010, 152, p. 723-735.

113. Tikkanen M., Piippo M., Suorsa M., Sirpio S., Mulo P., Vainonen J., Vener A.V., Allahverdiyeva Y., Aro E.M., State transitions revisited-a buffering system for dynamic low light acclimation of Arabidopsis, Plant Mol. Biol., 2006, 62, p. 779-793.

114. Tikkanen M., Nurmi M., Suorsa M., Danielsson R., Mamedov F., Styring S., Aro E.M., Phosphorylation-dependent regulation of excitation energy distribution between the two photosystems in higher plants, Biochim. Biophys. Acta, 2008, 1777, p. 425-432.

115. Tikkanen M., Nurmi M., Kangasjarvi S., Aro E.M., Core protein phosphorylation facilitates the repair of photodamaged photosystem II at high light, Biochim. Biophys. Acta, 2008, 1777, p. 1432-1437.

116. Beal M.F., Oxidatively modified proteins in aging and disease, Free Radic. Biol. Med., 2002, 32, p. 797-803.

117. Moller I.M., Jensen P.E., Hansson A., Oxidative modifications to cellular components in plants, Annu. Rev. Plant Biol., 2007, 58, p. 459-481.

118. Wormuth D., Heiber I., Shaikali J., Kandlbinder A., Baier M., Dietz K.J., Redox regulation and antioxidative defence in Arabidopsis leaves viewed from a systems biology perspective, J. Biotechnol., 2007, 129, p. 229-248.

119. Pospisil P., Production of reactive oxygen species by photosystem II, Biochim. Biophys. Acta, 2009, 1787, p. 1151-1160.

120. Corpas F.J., del Rio L.A., Barroso J.B., Need of biomarkers of nitrosative stress in plants, Trends Plant Sci., 2007, 12, p. 436-438.

121. Corpas F.J., Chaki M., Leterrier M., Barroso J.B., Protein tyrosine nitration: a new challenge in plants, Plant Signal. Behav., 2009, 4, p. 920-923.

122. Ischiropoulos H, Biological selectivity and functional aspects of protein tyrosine nitration, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 305, p. 776-783.

123. Radi R, Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2004, 101, p. 4003-4008.

124. Kissner R, Nauser T, Bugnon P, Lye P.G, Koppenol W.H, Formation and properties of peroxynitrite as studied by laser flash photolysis, high-pressure stopped-flow technique, and pulse radiolysis, Chem. Res. Toxicol., 1997, 10, p. 1285-1292.

125. Radi R, Peroxynitrite and reactive nitrogen species: the contribution of ABB in two decades of research, Arch. Biochem. Biophys, 2009, 484, p. 111-113.

126. Gonzalez-Perez S, Quijano C, Romero N, Melo T.B, Radi R, Arellano J.B, Peroxynitrite inhibits electron transport on the acceptor side of higher plant photosystem II, Arch. Biochem. Biophys, 2008, 473, p. 25-33.

127. Yamakura F, Ikeda K, Modification of tryptophan and tryptophan residues in proteins by reactive nitrogen species, Nitric Oxide, 2006, 14, p. 152-161.

128. Alvarez B, Radi R, Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins, Amino Acids, 2003, 25, p. 295-311.

129. Davies M.J., Truscott R.J., Photo-oxidation of proteins and its role in cataractogenesis, J. Photochem. Photobiol. B, 2001, 63, p. 114-125.

130. Bregere C., Rebrin I., Sohal R.S., Detection and characterization of in vivo nitration and oxidation of tryptophan residues in proteins, Methods Enzymol., 2008, 441, p. 339-349.

131. Guedes S., Vitorino R., Domingues R., Amado F., Domingues P., Oxidation of bovine serum albumin: identification of oxidation products and structural modifications, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2009, 23, p. 2307-2315.

132. Chen J., Bender S.L., Keough J.M., Barry B.A., Tryptophan as a probe of photosystem I electron transfer reactions: a UV resonance Raman study, J. Phys. Chem. B, 2009, 113, p. 11367-11370.

133. Rinalducci S., Campostrini N., Antonioli P., Righetti P.G., Roepstorff P., Zolla L., Formation of truncated proteins and high-molecular-mass aggregates upon soft illumination of photosynthetic proteins, J. Proteome Res., 2005, 4, p. 2327-2337.

134. Froelich J.M., Reid G.E., The origin and control of ex vivo oxidative peptide modifications prior to mass spectrometry analysis, Proteomics, 2008, 8, p. 1334-1345.

135. Aro E.M., Virgin I., Andersson B., Photoinhibition of Photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover, Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1143, p. 113-134.

136. Yamamoto Y., Quality control of photosystem II, Plant Cell Physiol., 2001, 42, p. 121128.

137. Yamamoto Y., Aminaka R., Yoshioka M., Khatoon M., Komayama K., Takenaka D., Yamashita A., Nijo N., Inagawa K., Morita N., Sasaki T., Quality control of photosystem II: impact of light and heat stresses, Photosynth. Res., 2008, 98, p. 589-608.

138. Lundin B., I-Iansson M., Schoefs B., Vener A.V., Spetea C., The Arabidopsis Psb02 protein regulates dephosphorylation and turnover of the photosystem II reaction centre D1 protein, Plant J., 2007, 49, p. 528-539.

139. Huesgen P.F., Schuhmann H., Adamska I., Deg/HtrA proteases as components of a network for photosystem II quality control in chloroplasts and cyanobacteria, Res. Microbiol., 2009, 160, p. 726-732.

140. Caffarri S., Kouril R., Kereiche S., Boekema E.J., Croce R., Functional architecture of higher plant photosystem II supercomplexes, EMBO J., 2009, 28, p. 3052-3063.

141. Li X.P., Bjorkman O., Shih C., Grossman A.R., Rosenquist M., Jansson S., Niyogi K.K., A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting, Nature, 2000, 403, p. 391-395.

142. Ganeteg U., Klimmek F., Jansson S., Lhca5~an LHC-type protein associated with photosystem I, Plant Mol. Biol., 2004, 54, p. 641-651.

143. Storf S., Stauber E.J., Hippler M., Schmid V.H., Proteomic analysis of the photosystem I light-harvesting antenna in tomato (Lycopersicon esculentum), Biochemistry, 2004, 43, p. 9214-9224.

144. Vener A.V., Environmentally modulated phosphorylation and dynamics of proteins in photosynthetic membranes, Biochim. Biophys. Acta, 2007, 1767, p. 449-457.