Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

РГБ ОД

и ' - Ц с - ^

Перминова Ирина Васильевна

АНАЛИЗ, КЛАССИФИКАЦИЯ И ПРОГНОЗ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

02.00.02 -Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре органической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 20 декабря 2000 г года в 16 час. 10 мин в аудитории 344 на заседании Диссертационного совета Д.053.05.60 кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан 20 ноября 2000 г.

Учрный секретарь Диссертационного Совета

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН Тарасова Н.П.

доктор химических наук,

профессор

Шпигун O.A.

доктор химических наук,

профессор

Варшал Г.М.

Ведущая организация:

Российский Университет Дружбы Народов

кандидат химических наук

Г-Ы /"1 О f^l

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из интенсивно развивающихся направлений ювременной аналитической химии является анализ сложных органических матриц -гродуктов жизнедеятельности и распада живых организмов. Важным представителем аких объектов являются гуминовые вещества (от латинского "humus" - земля, почва). )ни составляют один из самых обширных резервуаров органического углерода, |бразуясь в результате распада отмерших организмов. Спецификой гуминовых веществ [вляется стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в 1езультате естественного отбора устойчивых структур. Как следствие, к Ьундаментальным свойствам гуминовых веществ относятся нестехиометричность остава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и юлидисперсность. Тем самым для них понятие молекулы трансформируется в шлекулярный ансамбль, каждый параметр которого описывается распределением. 1оэтому к ним неприменим и традиционный способ численного описания строения |рганических соединений, характеризующий количество атомов в молекуле, число и ипы связей между ними.

Отсутствие методологических подходов к анализу органических объектов тохастического характера и численному описанию их строения привело к тому, что [есмотря на двухсотлетнюю историю изучения, определение класса гуминовых еществ до сих пор базируется на способе извлечения из природных объектов гемноокрашенные, азотсодержащие высокомолекулярные соединения, извлекаемые одными растворами щелочей из почв и каустобиолитов: торфа, угля и др.), а их бщепринятая классификация - на процедуре фракционирования. Так, гуминовые ещества подразделяют на гумин (нерастворим во всем диапазоне рН), гуминовые ислоты (нерастворимы при рН < 2) и фулъвокислоты (растворимы во всем диапазоне Н). Последние два класса объединяют под общим названием гумусовые кислоты.

Указанная ситуация определяет актуальность постановки систематических . сследований по изучению строения гуминовых веществ, результаты которых могли ы служить основой для создания классификации по закономерностям их химического троения. Получение соответствующих данных возможно только на основании [етодологических подходов, которые бы учитывали специфику анализа объектов тохастического характера: отсутствие адекватных образцов сравнения и суммарный клад погрешности метода, процедуры выделения и естественной изменчивости сточника в воспроизводимость результатов анализа. Кроме того, необходима даптация методик к полидисперсности и гетерогенности объекта. Методологического боснования требует и численное описание строения гуминовых веществ, необходимое ля определения классификационных признаков и прогностического моделирования войств. Особо актуальным является предсказание макролигандных свойств гумусовых ислот, благодаря которым они играют важнейшую роль в процессах самоочищения

водных и почвенных экосистем, связывая как ионы тяжелых металлов, так 1 органические экотоксиканты. Умение предсказывать связывающие свойства гумусовы; кислот будет способствовать их направленному использованию в качеств! детоксицирующих агентов для рекультивации загрязненных сред.

Указанные подходы не могли сложиться в рамках предыдущего этапа развита: анализа гуминовых веществ - в исследованиях "от вещества", для которых мето; служил средством достижения другой главной цели - получения новых сведений ( веществе. Такая расстановка приоритетов была абсолютно оправданной в условия: весьма ограниченных знаний о природе объекта и способствовала их скорейшем; накоплению усилиями целой плеяды блестящих ученых - М. Шнитцера (Канада) Д.С. Орлова (Россия), М. Вильсона (Австралия), Р. Малколма и П. МакКарти (США) ] др. Однако постановка данных проблем весьма актуальна и полностью отвечав' потребностям современного этапа развития анализа гуминовых веществ, которьн знаменуется сменой парадигмы "анализ от вещества" на "анализ от метода (расширение сферы применения метода путем введения нового объекта). Это связано I существенно возросшим интересом к сложным многокомпонентным объектам а стороны химиков-аналитиков как следствие развития компьютерной техники сделавшего доступным широкое применение статистических методов дл: интерпретации результатов анализа сложных систем.

Цель настоящей работы состояла в разработке общей методологии анализ; гумусовых кислот и численного описания их строения, позволяющего определят: классификационные признаки таких объектов и моделировать их свойства. В работе были поставлены следующие основные задачи:

• создать представительную выборку препаратов гумусовых кислот с широки? разнообразием состава и свойств, адекватную стохастическому характеру объекта

• адаптировать существующие или разработать новые методики анализа дл: получения достоверных данных о составе гумусовых кислот при отсутствш адекватных образцов сравнения;

• определить элементный, структурно-групповой и молекулярно-массовый соста представительной выборки препаратов гумусовых кислот;

• разработать способы обработки данных для получения дескрипторов элементной: структурно-группового и молекулярно-массового состава гумусовых кислот;

• выявить дескрипторы состава, позволяющие классифицировать препарат! гумусовых кислот по происхождению и фракционному составу;

• количественно охарактеризовать связывающие и детоксицирующие свойств гумусовых кислот по отношению к различным классам экотоксикантов;

• разработать подходы к получению прогностических моделей "строение-свойство' позволяющие использовать весь комплекс полученных дескрипторов состава.

Научная новизна. На примере гумусовых кислот разработана методология яализа органических объектов стохастического характера и свертки полученной нформации, позволяющих определять классификационные признаки таких объектов прогнозировать их свойства.

Разработан подход к численному описанию строения органических объектов гохастического характера с помощью интегральных дескрипторов состава -рактуемого в самом широком смысле — элементного, структурно-группового и олекулярно-массового), отвечающих критериям фундаментальности, воспроизво-нмости и специфичности.

Определены дескрипторы состава, обладающие максимальной нскриминирующей способностью по априорным классификационным признакам источник происхождения" и "фракционный состав" для обширной выборки репаратов гумусовых кислот.

Разработан способ количественной характеристики детоксицирующих свойств /мусовых кислот с помощью констант детоксикации, основанный на применении энцепции комплексообразования/связывания для описания процессов детоксикации 1желых металлов и органических экотоксикантов гумусовыми кислотами.

Разработаны подходы к получению прогностических моделей "строение -войство" для органических объектов стохастического характера адекватные редложенному способу численного описания их строения с помощью широкого абора дескрипторов состава.

Практическая значимость работы. Разработан комплекс методик анализа /мусовых кислот, включающий в себя: определение элементного состава в расчете на ;зводную беззольную пробу; ПМР-определение функционального состава; условия элучения количественных |3С ЯМР спектров; гель-хроматографическое определение олекулярных масс. Комплекс данных методик может быть внедрен в практику Мораторий химико-аналитического профиля.

Создано оригинальное программное обеспечение Geltreat для обработки зоматографических и спектроскопических данных, позволяющее рассчитывать ирокий набор численных дескрипторов исходных распределений. Программа 1ботает на ПК под Windows, что обеспечивает возможность ее широкого пользования в исследовательской практике.

Создана обширная база данных по интегральным характеристикам состава 'мусовых кислот, включающая данные по содержаниям элементов, углерода и >дорода в составе структурных групп, средним молекулярным массам и эл «дисперсности, а также соответствующие описательные статистики для эедставительных выборок препаратов различного происхождения и фракционного >става.

Предложен способ определения Щ(П)-эквивалентной концентрации гумусов: кислот и адсорбционная методика определения констант устойчивости комплекс гумусовых кислот с Hg(II) с использованием конкурентного комплексообразования.

Получен широкий набор констант устойчивости комплексов с Hg(II), конста связывания и детоксикации ПАУ и атразина для представительных выборок препарат различного происхождения и фракционного состава, которые могут быть использова: для расчета форм существования экотоксикантов в природных водоемах и прогноза опасности.

Получены прогностические модели "строение - связывающие / детоксицируюш свойства гумусовых кислот" для Hg(II), ПАУ и атразина, которые могут бь: использованы для целевого поиска препаратов с максимальной связывающей детоксицирующей способностью по отношению к перечисленным экотоксикантам целях применения в качестве детоксицирующих агентов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы бы представлены на VII, VIII, IX и X конференциях Международного общества изучению гуминовых веществ (IHSS) в 1994 (Тринидад и Тобаго), 1996 (Вроцл Польша), 1998 (Аделаида, Австралия) и 2000 гг. (Тулуза, Франция), Симпозиуме IH "Humic substances in transport processes" (Анахайм, США, 1997), Международн конгрессе "Вода: экология и технология" (Москва, 1994), I Всемирном конгрессе XVIII Конференции Международного общества по химии и токсикологии окружаюш среды (SETАС) (Лиссабон, Португалия, 1993) и (Сан Франциско, США, 1997), IV и Конференциях Европейского Общества по токсикологии и химии окружающей сре, (SETAC-Europe) (Брюссель, Бельгия, 1994 и Лейпциг, ФРГ, 1999), Международн симпозиуме "Тяжелые металлы в окружающей среде" (Пущино, 1996), VII Европейск конференции по спектроскопии биологических молекул (Мадрид, Испания, 199 Международных симпозиумах "Refractory organic substances in the environment" (ROS I, Карлсруэ, 1997 и ROSE-II, Карлсруэ, ФРГ, 2000), XVI Всемирном конгрес почвоведов (Монпелье, Франция, 1998), XVI Менделеевском съезде по общей прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), X Международной конференц "Магнитный резонанс в химии и биологии" (Суздаль, 1998), XVII Международн симпозиуме по полиядерным ароматическим углеводородам (ISPAC) (Бордо, Франц: 1999), XXXI Международном конгрессе ИЮПАК (Берлин, ФРГ, 1999), II Europe Symposium "NMR in soil science" (Фрайзинг, ФРГ, 2000), NATO ASI "Environmenta acceptable pollution and réclamation endpoints" (Вышеград, Венгрия, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 статьи.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертаци состоял в формировании направления, активном участии во всех этапах исследован: постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации обсуждении экспериментальных данных.

Положения, выносимые на защиту:

Общая методология анализа гумусовых кислот и численного описания их строения в терминах интегральных дескрипторов состава.

Комплекс методик определения элементного, структурно-группового и молекулярно-массового состава гумусовых кислот.

Новые способы обработки данных (включая программное обеспечение) спектроскопических и хроматографических данных для расчета дескрипторов состава гумусовых кислот.

Результаты исследования строения гумусовых кислот методами элементного анализа, одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на ядрах 13С и 'Н и эксклюзионной хроматографии.

Результаты исследования связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к различным экотоксикантам с помощью физико-химических методов и биотестирования.

Результаты классификации гумусовых кислот по признакам "источник происхождения" и "фракционный состав".

Методические подходы к прогнозу связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот на основании дескрипторов состава и полученные прогностические модели.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 8 пав, заключения, основных выводов и списка литературы.

В первой главе дается критический анализ литературных данных по определению цементного, структурно-группового и молекулярно-массового состава гумусовых ислот и исследованию их связывающих и детоксицирующих свойств по отношению к азличным классам экотоксикантов, на основе которого сформулирован ряд ерешенных проблем анализа, классификации и прогноза свойств гумусовых кислот.

Вторая глава посвящена принципам формирования исследованной выборки репаратов гумусовых кислот. Описываются основные методы их выделения из риродных объектов. Приводится описание происхождения и фракционного состава спользованных в работе препаратов.

Третья глава посвящена определению элементного состава гумусовых кислот в асчете на беззольную безводную пробу, приводятся соответствующие результаты и их етрологические оценки.

Четвертая глава посвящена исследованию структурно-группового состава /мусовых кислот с помощью методов одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР а ядрах 'Н и |3С, титриметрии, ВЭЖХ и деструктивных методов анализа.

Пятая глава посвящена определению молекулярно-массового состава гумусовы: кислот методом эксклюзионной хроматографии и описанию способов расчет дескрипторов молекулярно-массового состава.

Шестая глава посвящена классификации гумусовых кислот по признакаг "источник происхождения" и "фракционный состав" на основании полученноп широко набора интегральных дескрипторов состава.

Седьмая глава посвящена исследованию связывающих и детоксицирующи: свойств гумусовых кислот по отношению к различным классам экотоксикантов н примере Н£(11), ПАУ и атразина.

Восьмая глава посвящена получению прогностических моделей "строение ■ свойство" на основании дескрипторов состава гумусовых кислот.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТА И ПРЕДМЕТА ИССЛЕДОВАНИЯ

Гумусовые кислоты относятся к органическим объектам стохастическоп характера наряду с такими классами соединений как нефти, лигнины, таннины хитозаны и др. По своей химической природе они представляют собо) рандомизованные полимеры ароматических оксиполикарбоновых кислот, в структур; которых также входят азотсодержащие и углеводные фрагменты (рис. 1). В сил; специфики строения, обусловленной наличием гидрофобного ароматического каркас; и богатой функциональными группами углеводно-пептидной периферии, гумусовы кислоты проявляют макролигандные свойства. Они образуют комплексы с ионам: металлов и вступают в донорно-акцепторные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия различными классами органических соединений. Указанные свойства определяю протекторные функции (термин введен Д.С. Орловым) гумусовых кислот в биосфере связывая экотоксиканты в комплексы, гумусовые кислоты снижают и: биодоступность. Данное обстоятельство позволяет рассматривать гумусовые кислоть как перспективный класс соединений для получения детоксицирующих агента: природного происхождения, которые могут быть использованы в целях рекультивацш водных и почвенных сред без опасности их вторичного загрязнения.

Однако их широкому практическому применению препятствует отсутстви прогностических моделей "строение - свойство", которые бы обеспечили возможност целевого поиска гумусовых кислот с высокой детоксицирующей способностью. Эп связано, в свою очередь, с отсутствием обоснованных подходов к численном; описанию строения гумусовых кислот. Для этой цели используют результать различных методов анализа и способы обработки данных, однако систематически исследования по данной проблеме практически отсутствуют.

ис. 1. Гипотетический структурный фрагмент гумусовых кислот (К1етЬетре1, 1970).

В представленной работе в качестве подхода, отвечающего стохастической рироде объекта, предложено численное описание строения гумусовых кислот с омощыо интегральных дескрипторов состава, характеризующих три ерархических уровня структурной организации органических объектов: элементный, рагментный и молекулярный. В качестве интегральных (характеризующих вещество целом) дескрипторов состава рассматривали: для элементного уровня - процентное эдержание основных элементов — С, Н, N. О, Б и их атомные соотношения, для рагментного уровня - процентное содержание С и Н (от общего содержания С и Н в гществе) в составе основных структурных групп, для молекулярного уровня - средние олекулярные массы и их отношения (полидисперсности).

Использование интегральных дескрипторов состава для описания всего азнообразия парциальных структур молекулярного ансамбля гумусовых кислот имело елью обеспечить фундаментальность (общность) характеризуемого признака и эспроизводилмсть соответствующего параметра, а использование их комплекса -овысить уровень специфичности описания структуры в терминах состава. Расчету казанных дескрипторов предшествовал этап оптимизации соответствующих <спериментальных методик анализа гумусовых кислот, верификации полученных анных с использованием независимых методов и свертка информации. Применимость ассчитанных дескрипторов для решения задач классификации и прогнозирования зойств показала справедливость использованного методологического подхода к олучению и численному описанию информации о строении гумусовых кислот, что озволило выдвинуть тезис о возможности его распространения на все органические эъекты стохастического характера.

2. ФОРМИРОВАНИЕ ВЫБОРКИ ПРЕПАРАТОВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

Принцип формирования рабочей выборки препаратов был ориентирован н выявление взаимосвязи между строением и свойствами гумусовых кислот. Поэтому пр создании каждой выборки стремились к охвату максимального диапазон изменчивости строения и свойств гумусовых кислот за счет включения препарате различного происхождения (уголь, торф, почва, природные воды) и фракционног состава (нефракционированная смесь гуминовых и фульвокислот - ГФК, фракци гуминовых кислот - ГК и фульвокислот - ФК). Принимая во внимание стохастически характер объекта, нижний предел размера выборки устанавливали на уровне 2 препаратов. При этом для повышения прогностической способности получаемы моделей каждую подвыборку составляли не менее, чем из шести препаратов (сходны источник происхождения и/или фракционный состав). Всего в работе был использовано около ста препаратов. При этом выделение гумусовых кислот из все источников, за исключением угля, было проведено студентами, аспирантами сотрудниками рабочей группы согласно стандартным методикам.

Для экстракции гумусовых кислот из торфа и почв использовали 0.1 М NaOI Торфа предварительно дебитумировали, а черноземы - декальцировали. Гумусовь: кислоты природных вод выделяли с использованием смол Амберлит XAD-2 и XAD-8, ряде случаев - ДЭАЭ-целлюлозы. Фракционирование на ГК и ФК проводили путе подкисления щелочного экстракта до рН 1-2. Для получения ГК и ФК в Н-форме Г обессоливали диализом, а ФК и ГФК - на катионообменниках. В твердом вщ препараты выделяли лиофильным высушиванием или выпариванием.

В качестве основных источников происхождения гумусовых кислот использовал верховые и низинные торфа; почвы различной зональности (дерново-подзолисты серые лесные и черноземы) и вида использования (участки под лесом, пахотные огородные), природные воды (болотные и речные) и донные отложения пресноводны водоемов. Кроме того, в работе использовали коммерческие препараты ГК угля фракционированные препараты природных вод, любезно предоставленные Др G. Abb Braun (Университет Карлсруэ, ФРГ).

В шифры препаратов закладывали обозначение источника происхождет (eoflaA4qua, донные отложения/ДоИош sediments, уголь/Соа1, торф/Peat, почва/Soil) фракционного состава (ГФКIHF, ГК/НА, ФК/FA, растворенное органическое веществ и гумусовые кислоты почвенного раствора - РОВ/DOM и РГФК/DHF, соответственно

Всего в работе было использовано 106 препаратов гумусовых кислот, из них:

34 препарата торфа: 47 препаратов почв:

18 ГФК, 7 ГК, 7 ФК, 1 РОВ; 16 ГФК, 18 ГК, 9 ФК, 4 РГФК; 11 ГФК, 1 ГК, 2 ФК, 2 РОВ; 6 ГК; ЗГФК.

16 препаратов природных вод: 6 препаратов угля: 3 препарата донных отложений:

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА ПРЕПАРАТОВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

Под элементным составом гумусовых кислот понимают состав их органической тасти, в которую входят С, Н, N, О и S, при этом содержание N и S не превышает 15 % (масс). Однако в состав выделяемых препаратов входят и неорганические «шпоненты: зольные элементы (ионы металлов, оксиды кремния и алюминия) и гигроскопическая вода. Поэтому в общем виде бругго-формулу гумусовых кислот ложно записать как:

QH/^O^M, (А12Оз), (Si02)„ (II20)„,

де М - ионы металлов, х, у, z,p,q,l,m,n-стехиометрические коэффициенты.

Указанные факторы - большое различие в абсолютных содержаниях элементов органической части и наличие неорганических компонентов - создают основные методические трудности при проведении элементного анализа препаратов гумусовых <ислот, которые будут обсуждены ниже.

3.1. Определение элементного состава гумусовых кислот в расчете на безводную

беззольную пробу

Воспроизводимость определения элементов в препаратах гумусовых кислот оценивали по результатам внутри- и межлабораторных опытов, в которых принимали участие три лаборатории - Химфака МГУ, Института высокомолекулярных юединений РАН (ИВС) и Технического университета Карлсруэ, ФРГ (ТУК)*. В (онтрольную выборку при проведении межлабораторного опыта по определению CHN шночали 13 препаратов с зольностью от 1 до 20 %. Определение CHN и О выполняли летодом автоматического полумикроанализа, S - по методу Шенигера (МГУ). Общее удержание зольных форм элементов (зольность) определяли по методу сожжения 850°С, 40 мин) (МГУ). Гигроскопическую воду определяли по методу обратного мбора веса (пробу высушивали в вакууме при 40°С, 24 ч) (ТУК).

Для результатов по определению С средние внутрилабораторные юспроизводимости (srJ,a6, %) составляли: 1.9 (МГУ), 0.9 (ТУК) и 1.7 (ИВС); средняя лежлабораторная воспроизводимость (srMCiKJ,a6, %) составляла 2.4. Для определения Н :оответствующие sr"a6 (%) составляли: 3.8, 1.6 и 2.5, 5гмсжлаб - 7.1%; для N sr"a6 (%) ¡оставляли: 4.6, 4.6 и 5.5, 8гмсжлаб - 19.7%. Для остальных данных внутрилабораторные ;г составили: О - 2.0 %, S - 9.3 %, зольность (Ash) - 7.4 %, влажность (Н20) - 3.8 %.

Сопоставимость данных по CHN характеризовали попарно по t-критерию: для С и Ч она была удовлетворительной для всех трех лабораторий, для Н сопоставимыми 5ыли данные ИВС и ТУК, тогда как между данными МГУ и двумя другими сериями иблюдались статистически значимые различия.

Как показывают приведенные результаты, самой высокой воспроизводимостью сарактеризовались данные по С и О. Низкая воспроизводимость данных по N и S

* Все анализы в ТУК были выполнены автором данной работы.

обусловлена отсутствием адекватных образцов сравнения для определения со держан и этих элементов на уровне 0.1-5%. Довольно большой разброс и ограниченна сопоставимость данных по содержанию Н связаны с существенным влияние! атмосферной влажности на результаты его определения из-за присутствия в проб гигроскопической воды на уровне 7-10%. Поэтому при сопоставлении данных п содержанию Н их необходимо корректировать на влажность пробы. Принимая В' внимание колебания атмосферной влажности, определение Н и Н20 целесообразн проводить в один день.

Использование для прямого определения О двух разных образцов сравнения • ацетанилида и сульфаниловой кислоты - показало систематическое занижени результатов, рассчитанных по ацетанилиду, на 14 % (отн.). Для оценки адекватност] использованных образцов сравнения было проведено сопоставление с данными п содержанию кислорода, рассчитанным по разности (масса безводной беззолыюй проб! за вычетом СН^). Оказалось, что данные, рассчитанные по разности, гораздо ближе найденным по сульфаниловой кислоте. Это позволяет сделать вывод о неприменимосп ацетанилида в качестве образца сравнения для определения О в гумусовых кислотах ] целесообразности использования образцов сравнения с содержанием О на уровне 20 30 %, что соответствует таковому в гумусовых кислотах.

Определение содержания гигроскопической воды в 33 препаратах гумусовы: кислот показало, что весь диапазон изменчивости указанной величины составляет 6 12 %, а среднее по выборке составляет 8 %. При этом максимальная влажность (10 12 %), как правило, наблюдается для высокозольных препаратов. Столь высоко содержание гигроскопической воды требует обязательной корректировки данных н влажность пробы, однако ее определение весьма редко входит в используемые схем( элементного анализа гумусовых кислот. Для решения данной проблемы нам] предложено использовать найденное для представительной выборки препарато среднее значение 8 % при отсутствии экспериментальных данных по влажности.

Высокий разброс данных по зольности, по-видимому, связан с неоптималыюсты использованного регламента сожжения пробы. Возможное недоопределение углерода высокозольных препаратах из-за образования термостойких карбонатов щелочны металлов оценивали, корректируя результаты прямого определения С на зольност препаратов (с учетом влажности пробы) и определяя коэффициент корреляции межд значениями С и зольности. Соответствующее значение г (для выборки из 7 препаратов) составило 0.39, что говорит о весьма слабой корреляции межд корректированными значениями С и зольностью. Это указывает на корректност общепринятой процедуры расчета содержания элементов на беззольную пробу пуш использования величины общей зольности без учета форм зольных элементов.

Дополнительным подтверждением этому являются результаты по определенш возможного компонентного состава золы гумусовых кислот, выполненного для 4 препаратов гумусовых кислот. Его проводили на основании АЭС-ИСП данных

юдержании зольных элементов в растворе гумусовых кислот известной концентрации, юторые использовали для расчета общей зольности, делая предположение о форме олыюго элемента на основании его химических свойств. При этом содержание :арбонатов щелочных металлов рассчитывали с учетом реакции с кислотными оксидами I без. Сопоставление данных показало наличие тесной корреляции между »ассчитанными и экспериментальными величинами (г = 0.92), при этом лучшее юответствие (близость тангенса угла наклона единице) наблюдалось для значений >бщей зольности, рассчитанных с учетом разложения карбонатов.

Полученные данные использовали для расчета содержания элементов в безводной ¡еззольной пробе гумусовых кислот. Для этого массу исходного препарата осматривали как состоящую из суммы органической (СНЫОБ - беззольная безводная [роба) и неорганической части (вода и зольные элементы). Затем содержания элементов, ходящих в органическую часть, корректировали на суммарное содержание золы и игроскопической воды. При этом необходимо было учесть, что в условиях втоматического микроанализа Н и О гигроскопической воды определяются вместе с рганической частью, поэтому данные по их содержанию сначала корректировали на лажность. При определении О по разности коррекция на влажность не нужна. Математически описанную процедуру можно записать как:

ля С, N,5: X = Х'1'г х100% (1а), для О и Н: х Х^-Х,,,, х100% (16) 100-А5Ь-Н20 с» 100-А5Ь-Н20

де Хдр- данные прямых, а Хсогг - скорректированных определений (% масс.).

Тогда О можно определить по разности как:

Од = 100 - Ссопт - Нсогт - Ысогт — Бсогг (2)

Проверку правильности суммы всех определений, используемых при расчете

лементного состава беззольной, безводной пробы гумусовых кислот, проводили для абора препаратов, содержание О в которых определяли прямым методом. В данном лучае после выполнения всех коррекций сумма СЮЮБ, зольности и воды должна оставлять 100 %. Полученные результаты показали, что вычитание О воды приводит в реднем к занижению результатов анализа, - среднее суммы определений составляет 5 %. Исключение этой процедуры дает завышенные результаты - 104 %. Это говорит о екорректности учета влияния гигроскопической воды на результаты прямого пределения О путем вычитания О воды, найденной для условий атмосферной лажности. По-видимому, часть слабо связанной воды теряется при продувке нализатора горячим газом. Как следует из наших данных, она может составлять 500 % от исходного содержания воды в пробе. В целом, полученный результат может видетельствовать о близости всех остальных определений истинным содержаниям 'НЫ8, золы и гигроскопической воды в препаратах гумусовых кислот.

3.2. Анализ данных по элементному составу препаратов гумусовых кислот Найденные содержания элементов (% масс), усредненные по подвыборкам репаратов гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава, и их

дисперсии приведены в табл. 1. Наблюдается закономерное изменение содержат элементов по препаратам с заданными признаками: возрастание содержания С снижение О в ряду: воды < почвы < торф < уголь и при переходе от ФК к ГК.

Таблица

Оценка среднего (х) и дисперсии (в2) содержания элементов (% масс., на беззольную безводную пробу) для препаратов гумусовых кислот, сгруппированных по

происхождению и фракционному составу

Препараты С Н N О

X 52 X 52 X Б2 X 52

ГФК торфа (п= 16) 55.2 4.9 4.2 0.1 2.1 0.4 36.8 6.8

ГК торфа (п=10) 56.7 5.3 4.3 0.1 2.3 0.3 35.7 7.6

ФК торфа (п=8) 51.6 7.3 3.8 0.4 1.1 0.4 42.5 6.9

ГФК почв (п=6) 51.1 3.6 4.0 0.9 3.2 0.7 38.3 35.7

ГК почв (п=14) 57.3 15.9 4.0 0.7 4.7 0.6 33.2 21.5

ФК почв (п=12) 52.8 7.0 4.0 0.1 3.6 1.1 38.6 8.7

ГК углей (п=6) 63.7 20.4 3.5 0.9 1.1 0.2 30.6 19.9

ГФК вод (п=9) 49.9 24.3 4.3 0.1 1.3 0.6 41.4 36.7

Все (п=81) 54.8 22.6 4.1 0.4 2.6 2.1 36.9 25.9

Полученные результаты указывают на перспективность использования данных г элементному составу для классификации гумусовых кислот. При этом в качест! дескрипторов элементного состава наиболее целесообразно использовать содержат СНЫО и атомные соотношения Н/С, О/С, С/Ы.

Таким образом, впервые методически обоснован необходимый компле: определений и способ обработки экспериментальных данных для расчета содержат элементного состава гумусовых кислот в расчете на беззольную безводную пробу, нерешенным проблемам следует отнести прямое определение кислорода в связи мешающим влиянием гигроскопической воды. Получен обширный массив данных г элементному составу гумусовых кислот различного происхождения и фракционно: состава - дескрипторов базисного уровня структурной организации гумусовых кислот.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНО-ГРУППОВОГО СОСТАВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

При определении структурно-группового состава гумусовых кислот в качест: основной задачи рассматривали установление набора структурных фрагменто полностью описывающих распределение структурообразующих элементов - углерода водорода - в структуре гумусовых кислот, содержание которых поддавалось б количественному определению. Оптимальным методом для решения указанной зада1 является одномерная спектроскопия ЯМР на ядрах 'н и 13С. Ее ограниченнь возможности в плане надежного отнесения сигналов в сложных спектрах идентификации парциальных структур, в которые входят структурные фрагмент: компенсировали с помощью метода двумерной спектроскопии ЯМР.

4.1. Одномерная спектроскопия ЯМР 13С гумусовых кислот

Типичный 13С ЯМР спектр гумусовых кислот (на примере ГК верхового торфа) риведен на рис. 2а. Для сопоставления приведен также и ПМР спектр (рис. 26).

Оба спектра характеризуются широкими полосами поглощения, обусловленными ерекрыванием большого количества сигналов. Ввиду сильного перекрывания, тнесение сигналов возможно только "поинтервально" - согласно положению езонансов атомов со сходным химическим окружением, как это показано в табл. 2.

Таблица 1

Отнесения в ПМР- и 13С ЯМР-спектрах гумусовых кислот (0.1 М №СШ)

Фрагмент Интервал, м.д. Описание

ПМР 13С ЯМР

:н-н,с 0.5-1.95 5-50 С, Н-замещенные алифатические фрагменты

х-СН 1.95-3.1 алифатические фрагменты в а-положении к электроотр. группе или ароматическому кольцу

:н3-о 3.1-4.7 50-58 метоксильные фрагменты

:н2-о,ы 58-64 О-, М- замещенные алифатические фрагменты ("карбогидратные")

:н-о,ы 64-90

э-сн-о.к 4.7-6.0 90-108 алифатические фрагменты, дважды замещенные гетероатомами ("аномерные")

\г-Н,С 6.0-10.0 108-145 Н-, С-замещенные ароматические фрагменты

- 145-165 0,1^-замещенные ароматические фрагменты

:оо-н,с - 165-187 карбоксильные группы и их производные

>0 - 187-220 кетонные и хинонные группы

Величины интегралов по указанным интервалам, сумма которых равна полному птегралу спектра, могут быть использованы как интегральные дескрипторы груктурно-группового состава, если они пропорциональны содержанию атомов в эответствующих фрагментах. Из-за различия времен релаксации ядер С разного типа

пропорциональность величины интеграла количеству атомов С в 13С ЯМР спектр достигается только при его регистрации в количественных условиях. Для этог необходимо (1) использование времени задержки между импульсами (Та), достаточно: для полной релаксации третичных и четвертичных ядер углерода, и (2) устранен! ядерного эффекта Оверхаузера.

В тоже время систематические исследования по определению времен релаксаци гумусовых кислот отсутствуют, а приводимые в литературе величины Та дг регистрации спектров гумусовых кислот варьируют от 0.5 до 10 с. Поэтому для выбор оптимального Та был проведен эксперимент на 12 препаратах гумусовых кислс различного происхождения. Для каждого из них регистрировали 5 спектров со времене задержки от 1 до 8 с, для всех спектральных областей (табл. 2) рассчитывали отношен! парциального интеграла к таковому в спектре с Та = 1 с и строили зависимое! полученных отношений от Та. Было установлено, что указанные зависимости выходил на плато при Та = 4 с. Это означает, что в данных условиях достигается полнг релаксация всех ядер С. В связи с изложенным все спектры 13С ЯМР регистрировали пр Та = 4 с. Для устранения ядерного эффекта Оверхаузера на период Та выключая развязку от протонов.

Интегрирование полученных в указанных условиях спектров проводил поинтервально (табл. 2). Найденные величины парциальных интегралов, эквивалентнь доле атомов С с данным химическим окружением от суммы всех атомов С в препарат представляли собой интегральные дескрипторы структурно-группового состава. Дг оценки воспроизводимости полученных величин проводили повторное раствореш пробы, регистрацию спектра и его интегрирование с использованием 5 фазировани Интегралы спектральной интенсивности для семи из указанных в табл. 2 диапазоне характеризовались хорошей воспроизводимость (^ = 6 %), тогда как для карбонильных ацетальных фрагментов она была существенно хуже (в, = 23%).

В выбранных количественных условиях были зарегистрированы и обработан |3С ЯМР спектры 67 препаратов гумусовых кислот. Полученные результаты усреднях по подвыборкам сходного происхождения и фракционного состава, оценки средних дисперсий приведены в табл. 3. Наиболее принципиальные различия структурт группового состава препаратов проявляются в соотношении ароматических углеводных фрагментов. При этом весьма отчетливо выделяются классы наибож ароматических ГК угля, ГК чернозема и обогащенных углеводными фрагментами Ф торфа, также довольно хорошо группируются ГФК торфа и ФК почв.

Таким образом, в результате выполненного исследования установлены услош регистрации количественных 13С ЯМР спектров гумусовых кислот. Получен обширнь массив данных (67 препаратов) по структурно-групповому составу гумусовых кисл< различного происхождения и фракционного состава.

Таблица 3

Оценки средних (х) и дисперсий (б2) содержания углерода (% от общего С) в составе основных структурных фрагментов гумусовых кислот в препаратах, сгруппированных по источнику происхождения и фракционному составу (по данным спектроскопии ЯМР 13С)

Препараты С=0 СОО СдгО сАг СНО сн2о СН30 сн„ ЕСдг

X 82 X з2 X з2 X з2 X з2 X з2 X з2 X з2 X з2

ГФК торфа (п=15) 3.0 3.1 14.8 3.8 12.2 12.2 30.0 18.0 12.8 20.0 2.8 1.1 3.1 0.7 17.5 3.5 42.2 37.1

ГК торфа (п=8) 3.0 1.5 13.6 9.3 11.1 28.2 32.4 15.8 10.9 14.2 2.5 0.6 4.1 1.4 19.8 19.3 43.5 65.5

ФК торфа (п=6) 2.6 1.2 13.1 11.3 7.8 4.1 24.9 8.1 21.1 45.0 3.3 1.6 2.5 1.1 18.6 26.1 32.7 16.8

ГФК почв (п=5) 2.0 1.3 14.5 13.5 9.4 16.3 33.6 32.3 9.9 8.3 2.7 0.5 3.8 5.8 20.0 53.5 43.1 21.7

ГКпочв (п=16) 2.2 0.7 16.3 2.4 10.6 4.0 33.6 56.2 9.0 4.8 2.2 0.5 4.7 0.9 18.7 17.2 44.2 63.7

ФК почв (п=4) 3.1 0.7 20.1 4.4 9.4 7.6 24.1 15.0 11.5 5.8 2.5 0.2 4.1 0.2 22.5 12.6 33.4 39.1

ГК углей (п=5) 2.0 1.4 16.3 1.3 15.8 17.1 45.9 31.6 1.8 8.4 0.6 0.2 2.7 4.6 13.3 51.7 61.8 47.2

Все (п=58) 2.6 1.6 15.4 7.7 11.1 14.1 32.0 55.6 11.1 33.3 2.4 1.1 3.7 2.0 18.4 21.9 43.1 90.4

-о

Таблица 4

Оценки средних (X ) и дисперсий (в2) содержания водорода (% от общего Н) в составе основных структурных фрагментов гумусовых кислот в препаратах, сгруппированных по источнику происхождения и фракционному составу (по данным спектроскопии ПМР)

Препараты СООН АгОН АгН А1ЮН СНО А1Ш ХНАг* ХНсагЬ

X з2 X з2 X з2 X з2 X з2 X 52 X з2 X 52

ГФК торфа (п=13) 8.8 1.7 8.1 7.2 13.2 11.1 8.5 9.9 32.6 9.1 29.2 13.1 0.2 0.002 0.4 0.001

ГК торфа (п=8) 7.3 2.8 10.9 11.6 14.8 4.8 4.3 9.1 32.1 21.0 31.0 3.7 0.2 0.001 0.4 0.001

ФК торфа (п=7) 8.9 3.1 5.7 5.2 12.0 5.7 8.6 19.6 36.6 22.6 27.4 56.3 0.2 0.001 0.5 0.006

ГК почв (п=6) 7.8 5.4 7.7 2.7 13.7 11.9 8.7 39.5 26.8 12.6 35.2 11.0 0.2 0.002 0.4 0.001

ФК почв (п=5) 10.0 11.0 4.8 6.7 9.4 11.3 8.2 3.2 29.8 22.7 37.8 13.2 0.1 0.002 0.4 0.002

Все (п=39) 8.5 4.2 7.7 10.3 12.9 10.6 7.6 16.5 32.0 '23.2 31.3 28.8 0.2 0.002 0.4 0.004

*ЕНАг = АгН/(АгН+НСО+А1кН); **£НСагь = НСО/(АгН+НСО+А1кН)

4.2. Одномерная спектроскопия ПМР гумусовых кислот

Водород является следующим по значимости структурообразующим элементом гумусовых кислот после углерода. Поэтому определение интегральных характеристик его распределения между фрагментами структуры гумусовых кислот могло бы существенно расширить и дополнить набор 13СЯМР дескрипторов структурно-группового состава. Для спектроскопии ПМР не существует проблемы регистрации количественных спектров. Основными препятствием для получения информации с содержании атомов Н с данным химическим окружением в процентах от общего и* содержания в препарате из ПМР спектра гумусовых кислот является, во-первых, трудность регистрации разделенных сигналов подвижных ОН-протонон функциональных групп (СООН, ArOH, AlkOH); во-вторых, определение вклада остаточных протонов дейтерорастворителя в величину общего интеграла спектра ПМР. Поэтому на момент постановки данных исследований использование спектроскопии ПМР для анализа гумусовых кислот ограничивалось, в основном, определением распределения водорода углеродного скелета.

Разработку ПМР методики определения Н в составе скелетных фрагментов (C-I1 протоны) и функциональных групп (ОН-протоны) основывали на трех базисных предпосылках: (1) о возможности регистрации разделенных сигналов подвижных протонов в ПМР спектре гумусовых кислот в условиях медленного (в шкале времени ЯМР) обмена, (2) о возможности полного сдвига сигналов ОН-протонов в область слабого поля путем создания условий ускоренного обмена (кислотный катализ), и (3) об отсутствии H-D обмена скелетных протонов в условиях ускоренного обмена.

В случае справедливости этих предпосылок можно предложить следующую схем) совместного определения подвижных и скелетных протонов:

(1) создать условия медленного обмена путем использования апротонногс растворителя ДМСО-di и получить спектр гумусовых кислот, где сигналы СООН, ArOIl и AlkOH протонов разделены;

(2) создать условия ускоренного обмена путем добавления CF3COOD и получит! спектр, в котором сигналы ОН-протонов сдвинуты в область слабого поля, а в областях перекрывания АгОН+АгО и AlkOH+AlkO теперь находятся только скелетные протоны;

(3) путем сопоставления полученных спектров оценить соотношение (ArOH+ArO)/ArO и (AlkOH+AlkO)/AlkO протонов в растворе гумусовых кислот;

(4) определить величину общего интеграла протонов гумусовых кислот путей регистрации третьего спектра этого же препарата в дейтерорастворителе, остаточные протоны которого имеют существенно различный химедвиг (например, NaOD/DiO), и определить соотношение интеграла области протонов гумусовых кислот, закрываемой сигналом ДМСО-ёб, к интегралу этой области, обусловленной только протонами гумусовых кислот.

Реализация указанной схемы потребовала применения вакуумной техники для 1риготовления растворов гумусовых кислот в безводном ДМСО-(16 в отсутствие сонтакта с атмосферной влагой. Гигроскопическую воду из препаратов удаляли ггкачиванием в глубоком вакууме в течение 6 ч. Полученные спектры гумусовых кислот i ДМСО-d« и ДМСО-ds с добавкой CF3COOD приведены на рис. 3. В первом спектре >тчетливо виден сигнал СООН в области 10-12 м.д., что говорит о достижении в мстворе условий медленного обмена. Характер изменения спектра при добавлении IF3COOD указывает на сдвиг подвижных протонов в область слабого поля в результате ускорения обмена. Однако до проведения количественных расчетов необходимо было удостовериться в полноте сдвига и отсутствии в H/D обмена скелетных протонов. Для 1той цели были проведены эксперименты по сдвигу с модельными соединениями и на ^итерированном образце гумусовых кислот, которые подтвердили полноту сдвига юдвижных протонов при добавлении CF3COOD и отсутствии H/D обмена для СН-

фотонов.

—. 1 1 1 1 1 ■ 1 1 1 ■ 1 1—1 1 1 1 1 1 1 1—1 1 1 1 1 1 1 ■ 1 1 . 1—1

16 14 12 10 8 6 4 2 ррт 'ис. 3. Спектры ПМР препарата ФК торфа: а) ДМСО-сЦ, б) ДМСО-с16 с добавкой

:г3сооо.

Совместная обработка полученных спектров позволяет определить соотношения ^гОН/АгН и А1ЮН/СНО, а спектров в ДМСОА и Ыа0Э/020 (рис. 36) - а-СН/Ндмсо- С юмощью полученных соотношений учитывали вклад растворителя в интеграл умусовых кислот и рассчитывали полное распределение водорода, входящего в состав [репарата гумусовых кислот, между функциональными группами и скелетными фрагментами: СООН, АгОН, АгН, А1ЮН, СНО, а-СН, СН. Это позволяет решить [оставленную задачу и использовать указанные данные в качестве интегральных (ескрипторов структурно-группового состава гумусовых кислот.

Описанная выше методика была использована для характеристики распределения одорода в структуре 40 препаратов гумусовых кислот. Полученные результаты среднены по выборкам препаратов различного происхождения и фракционного состава [ приведены в табл. 3. Заметны закономерные изменения в структуре гумусовых кислот I зависимости от их фракционного состава и происхождения. Так, в ГК угля и чернозема

подавляющая доля водорода принадлежат ароматическим фрагментам скелета, тогда кап в ГФК вод их содержание минимально, что наряду с высокой окисленностью указывает на глубокую степень деградации ароматического каркаса. Максимальное содержание углеводных протонов характерно для ФК верховых торфов. Специфичность полученные дескрипторов указывает на перспективность их использования для классификации I прогноза свойств гумусовых кислот.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов впервые разработан; ПМР-методика определения протонов в составе скелетных фрагментов у функциональных групп, применение которой позволило существенно расширить набор интегральных дескрипторов структурно-группового состава гумусовых кислот. Получег обширный массив данных (для 40 препаратов) по распределению водорода в структуре гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава. Правильное^ определения кислотных групп по предложенной методике была проверена путек сопоставления полученных результатов с данными независимого титриметрическогс метода.

4.3. Определение кислотных групп гумусовых кислот методами титриметрии

Кривые титрования гумусовых кислот не имеют выраженной точки перегиба Поэтому традиционно для определения кислотных групп гумусовых кислот используют методы заместительного и обратного титрования. Для этой цели проводят реакции ( ацетатом кальция и гидроксидом бария, в результате которых образуют« нерастворимые гуматы кальция и бария. По количеству выделившейся уксусной кислоть определяют содержание карбоксильных групп (Са-ацетатная методика), а обратньм титрования избытка Ва(ОП)2 определяют сумму карбоксильных и фенольных групг (баритовая методика).

Выбор условий анализа, обеспечивающих правильность данных по карбоксильно? и общей кислотности гумусовых кислот, показал, что они достигаются при: (Г определении точки эквивалентности по экспериментальной кривой титрования уксусно! кислоты, вытесненной из Са(ОАс)2, (2) использовании соотношений реагент/субстрат 35-40 ммоль/г ГФК для Ва(ОН)2; 250-400 ммоль/г ГФК - Са(ОАс)2. По баритовоГ методике было проанализировано 8, по Са-ацетатной - 16 препаратов гумусовых кислот Полученные результаты приведены в табл. 5 и 6, соответственно.

В последние годы все большее применение находят и методы прямогс потенциометрического титрования, что связано с развитием компьютерной техники I методов математического моделирования. Для интерпретации кривой титрованш гумусовых кислот использовали модель непрерывного рК спектра с решение\ интегрального уравнения кривой титрования методом аппроксимации. Разработку компьютерного обеспечения осуществили доц. А. В. Гармаш (каф. аналит. химии) I А. В. Кудрявцев. Алгоритм расчета основан на численном решении относительно ц

(мольная доля групп с константой диссоциации К;) системы уравнений вида (3), записанных для каждой точки кривой титрования:

а=-

[Н+]-[ОН]

(У0 + Ут) + -

стУт

К,

(3)

К, +[Н + ]

где а - степень диссоциации поликислоты; с0 и Уо - концентрация и начальный объем титруемого раствора; ст и Ут - концентрация и добавленный объем титранта.

Набор значений рК от 1 до 12 с шагом 1 был задан априори, так как более высокое разрешение приводит к неустойчивости решения. Метод был протестирован на смесях низкомолекулярных электролитов и полиэлектролитах известного состава. В целом наблюдалась хорошая воспроизводимость рК-спектров для параллельных титрований гумусовых кислот (рис. 4).

рК

О 2 4 6 8 10 12 Рис. 4. рК-спектры гумусовых кислот (на примере ГФК торфа), рассчитанные из трех параллельных титрований ^ - мольная доля групп с данным значением рК).

В рК-спектрах практически всех исследованных препаратов гумусовых кислот наблюдался минимум при рК = 8, что позволяло отнести пики с рК < 8 к карбоксильным, а с рК > 8 - к фенольным группам. Содержание карбоксильных и фенольных групп рассчитывали, суммируя доли всех кислотных групп, входящих в указанные интервалы. Полученные результаты приведены в табл. 5 и 6.

Для сопоставления с результатами титриметрических определений, из данных ПМР рассчитывали карбоксильную и, по аналогии, общую кислотность гумусовых кислот (ммоль/г) как СООЩПМР, %)хН(эл. ан., ммоль/г). Результаты приведены в табл. 5 и 6.

Таблица 5

Общая кислотность препаратов гумусовых кислот по данным титриметрических методов

Препарат Общая кислотность, ммоль/г Препарат Общая кислотность, ммоль/г

Ва* рК* ПМР" Ва* рК' ПМР"

РНР-Т5Н94 10+1 5.1 ±0.3 5.9+0.9 РНР-ТНН94 7.9+0.4 6.0+0.1 6.6±1.0

РНР-Т6Н94 7.0±0.6 3.6±0.1 8.7+1.3 РНР-ТТЬ94 9.4+0.3 5.0+0.3 7.1 ±1.0

РНР-Т7Н94 8.2±0.6 5.0±0.3 8.4+1.2 8НР-Со94 7.2+0.4 5.8+0.3 7.311.3

РНР-Т10Ь94 9±1 8.7±0.4 7.8+1.1 АНР-11МХ2 10.9+0.6 9.95+0.4 7.011.1

* п = 3, " пять фазирований,? = 0.95.

Таблица

Карбоксильная кислотность препаратов гумусовых кислот по данным титриметрически:

методов и ПМР спектроскопии

Препарат ммоль СООН/г Препарат ммоль СООН/г

Са(АсО)2 рК-спектр* ПМР** Са(АсО)2 ПМР

РНР-Т5Н94 3.1±0.3 3.0±0.2 3.6±0.5 РНР-ТЗЬ98 410.3 4.4+0.7

РНР-Т6Н94 3.1±0.1 2.7±0.2 4.4±0.7 РНР-Т4Н98 3.510.3 4.310.6

РНР-Т7Н94 2.9±0.1 3.0±0.3 4.4+0.7 РНР-Т5Н98 4.610.4 2.710.4

РНР-Т10Ь94 3.1 ±0.2 7.0±0.5 3.5+0.5 РНР-Т6Н98 3.910.3 3.710.6

РНР-ТНН94 4.0±0.2 4.0±0.2 3.2±0.5 РНА-ТЗЬ98 4.210.3 4.710.7

РНР-ТТЬ94 4.0±0.4 4.1±0.2 3.410.5 РНА-Т4Н98 2.810.2 3.010.5

8НР-Со94 3.9±0.3 3.9±0.2 4.910.7 РНА-Т5Н98 2.810.2 3.110.5

АНР-1ШХ2 7.6±0.6 7.7±0.8 5.310.8 РНА-Т6Н98 3.210.3 2.610.4

*п = 3, ** пять фазирований, Р = 0.95.

Общее содержание кислотных групп в исследованных образцах ГФК торфа, вод : почв лежит в пределах 6-11 ммоль/г, карбоксильная кислотность составляет 3-5 ммоль/г что соответствует диапазонам приводимых в литературе величин. Сравнени полученных результатов показало, что для общей кислотности данные, получаемые и рК-спектров, при Р = 0.95 значимо отличаются от остальных. Вероятно, это связано присущим рК-спектроскопии ограничением - невозможностью определения кислотны групп с рК >11. В тоже время для карбоксильной кислотности все методы даю сопоставимые результаты. Сравнение результатов ПМР с данными независимы методов позволяет сделать вывод о правильности предложенной ПМР-методики.

4.4. Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР

В представленной работе выполнено первое систематическое исследовани структуры гумусовых кислот с помощью комплекса методов корреляционной двумерно: спектроскопии ЯМР в гетероядерном ('Н, 13С) и гомоядерном ('Н, 'Н) варианта* Существенный вклад в его постановку внес Др. Херткорн (Институт Экологическо] Химии, ОБР, ФРГ). Подробно результаты этого крупного блока исследований приведен! в диссертации, в автореферате хотелось бы отметить принципиально нову! информацию, которая углубляет понимание структурной организации гумусовых кисло и дает возможность перейти от атомов и фрагментов к уровню парциальных структур реально присутствующих в гумусовых кислотах.

Использование комплекса гомо- и гетероядерных импульсных последовательносте позволило установить ряд структурных признаков, специфичных для источник происхождения или фракционного состава гумусовых кислот. Так, установлен близость углеводных структур, входящих в состав ГК и ФК сходного происхождения,: существенное их различие для гумусовых кислот из разных источников. В частности установлена гораздо большая степень трансформации углеводного комплекса пизинног

торфа по сравнению с верховым (отсутствие и присутствие аномерных корреляций в ШС^С спектре, соответственно (рис. 2в)). Впервые сделано отнесение сигналов дезоксисахаров и аминосахаров в ШС?С спектре ГК торфа, которые отсутствуют в ФК. Показаны принципиальные различия в составе незамещенной алифатической части ФК и ГК. В спектрах ГК найдены кросс-пики полиметиленовых цепочек и терпеноидных изолированных метальных групп, отсутствующие в ФК. В спектрах ФК почв, в отличие от ФК торфа, найдены кросс-пики как аминосахаров, так и аминокислот. Полученная информация позволяет глубже понять специфику строения гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава.

Таким образом, проведенное исследование позволило определить набор интегральных дескрипторов структурно-группового состава, включающий 9 |3С ЯМР и 6 ПМР дескрипторов. При этом информация о полном распределении водорода в структуре гумусовых кислот получена впервые благодаря применению разработанной ПМР-методики. К числу нерешенных проблем относится прямое определение времен релаксации ядер углерода. Отдельной задачей является разработка новых алгоритмов извлечения количественной информации из сложных ЯМР-спектров гумусовых кислот.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО СОСТАВА ИССЛЕДОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

Молекулярная масса (ММ) — важнейшая характеристика, относящаяся к молекулярному уровню структурной организации. Ввиду полидисперсности гумусовых кислот, оптимальным методом определения их ММ состава является эксюнозионная хроматография, позволяющая получать информацию о полной кривой молекулярно-массового распределения (ММР). Этот метод используется для анализа гумусовых кислот с 1963 г. Однако вплоть до постановки настоящих исследований не были решены такие базисные методические вопросы как устранение неэксклюзионных эффектов и выбор адекватных образцов сравнения. Как результат, приводимые в литературе оценки ММ гумусовых кислот варьируют от сотен до миллионов Дальтон. В связи с изложенным, назрела настоятельная необходимость в систематическом исследовании ограничений и возможностей метода в применении к объекту, обладающему целым рядом специфических свойств, которые могут приводить к появлению неэксклюзионных эффектов и сложности интерпретации экспериментальных данных.

5.1. Выбор оптимальных условий анализа и образца сравнения

Граничные условия для выбора оптимальной гель-хроматографической системы задаются следующими специфическими свойствами гумусовых кислот: гидрофильность - необходимость использовать гидрофильные гели и водные среды ввиду ограниченной растворимости в органических растворителях; наличие ионогенных кислотных групп -склонность к рН-зависимым электростатическим взаимодействиям с матрицей геля; высокая полидисперсность - необходим гель с широким диапазоном фракционирования; нерегулярность строения - гетерогенность свойств макромолекул с различной ММ -

необходимость двойного детектирования массы вещества и свойства; переменны? состав - необходимость выбора адекватных образцов сравнения.

Гель-хроматографический анализ гумусовых кислот проводили нг хроматографической системе, созданной в Университете Карлсруэ (ФРГ) на кафедр« проф. Ф. Фриммеля. Часть специфических свойств объекта была учтена разработчиками система оснащена двумя последовательно соединенными детекторами спектрофотометрическим (УФ) и проточным детектором органического углерода (Сор,' (Graentzel, Германия). Был определен тип гидрофильного геля, обладающего высоко? механической прочностью - Toyopearl-HW-40S, и выбрана подвижная фаза - 0.028 № фосфатный буфер (рН 6.8), обеспечивающая устранение электростатически? взаимодействий с гелем.

Однако целый ряд методических вопросов требовал дальнейшей оптимизации. Так автором настоящей работы было установлено, что диапазоны фракционирования геле? Toyopearl-HW-50S и -55S более оптимальны для анализа гумусовых кислот. Кроме того с помощью анализа индивидуальных органических кислот была убедительнс продемонстрирована артефактная природа солевого пика, появляющегося при анализ« пробы гумусовых кислот, неуравновешенной с подвижной фазой. Предложи усовершенствованный способ обработке данных по гель-хроматографическом) фракционированию гумусовых кислот.

В его основу легли результаты целого комплекса исследований по теоретическом) обоснованию выбора адекватного образца сравнения для определения ММ гумусовы> кислот. Для этой цели было изучено эксклюзионное поведение обширного рядг модельных соединений с известной структурой и ММ, в том числе - пять наборо! полимеров-гомологов (неионогенные вещества и полиэлектролиты). Они включали i себя полидекстраны (ПД), полиэтиленгликоли (ПЭГ), полиакрилаты (ПА) полиметакрилаты (ПМА) и полистиросульфонаты (ПСС) натрия. Калибровочные кривы« по указанным наборам полимеров приведены на рис. 5. Их сопоставление нагляднс показывает действие электростатических факторов, которое возрастает по мер« увеличения удельного содержания кислотных групп в аналите. Введение допущения с близости эксклюзионного поведения неионогенных аналитов (ПЭГ и ПД) к идеальному позволило предложить в качестве оценки неэксклюзионного эффекта величину AKj. Ere численное значение рассчитывается как отклонение Kj аналита, вступающего i специфические взаимодействия с гелем, от такового для аналита с идентичной ММ i отсутствие неэксклюзионных эффектов. Соответствующее выражение имеет вид:

дк„ = к°-к7 (4;

где AKj - неэксклюзионный эффект, К/хр - экспериментально определяемый Kj, Kj° -идеальный Kd, определяемый по калибровочной зависимости ПД или ПЭГ.

Величина ДК<1 является функцией структуры аналита, которая определяет его взаимодействия с матрицей геля. Эффект сверхэксклюзии приводит к положительным значеням ДК^, а эффект специфической адсорбции — к отрицательным.

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Рис. 5. Калибровочные зависимости для геля Toyoperl HW 50S, полученные по наборам различных полимеров-гомологов (полные названия см. в тексте).

Для установления количественной взаимосвязи между структурой аналита и величиной ДКа для 80 низкомолекулярных модельных соединений (алифатические и ароматические карбоновые кислоты, аминокислоты, спирты и т.д.) рассчитывали ДК^ и описывали их структуру в виде элементного и структурно-группового состава. Полученные значения AK¿ использовали для установления корреляционных соотношений "структура - свойство". Наилучшее соотношение (г = 0.96) приведено ииже:

ДК<1 = 0.21 - 1.24хОАЮН/0 - 0.18хС/0 + 0.35х0соон/0 - 0.47x(N+S)/C + 0.07хС/Н (5) Полученное соотношение оказалось хорошо применимым для полиэлектролитов с низкой удельной кислотностью (ПСС), которая характерна и для гумусовых кислот. Для расчета AKj гумусовых кислот использовали средние (по выборке из 81) препарата величины атомных соотношений О/С, Н/С и (N+S)/C (1.8, 1.1 и 0.03, соответственно), Оагон/О и Осоон/О принимали равными 0.1 и 0.5. Величина рассчитанного ДКа оказалась элизка к нулю (-0.0022). Это дает основания полагать, что в выбранных условиях «еэксклюзионные эффекты практически скомпенсированы, поэтому адекватными эбразцами сравнения являются неионогенные ПД или ПЭГ. Принимая во внимание тип информации гумусовых кислот в водном растворе, использование ПД более предпочтительно. В дальнейшем расчет всех ММ характеристик гумусовых кислот [фоводили с использованием калибровочной зависимости по ПД.

5.2. Определение молекулярно-массового состава гумусовых кислот Типичная кривая элюирования гумусовых кислот (на примере ФК почв) показана ia рис. 6а. Все хроматограммы характеризовались мономодальным распределением. В качестве образцов сравнения использовали ПД с ММ от 0.83 до 43.5 КДа и моно- и элигосахариды.

С£ ш 0.8

а) т

о 0.6

0

Молекулярная масса, кДа

Рис. 6. Кривая элюирования (а) и соответствующее ММР (б) гумусовых кислот (ФКпочв). Условия: гель Тоуореаг1 Н\У-50Б, колонка: 2x25 см, элюент - 0.028 М фосфатный буфер, рН 6.8, скорость элюирования - 1 мл/мин, образец сравнения - ПД.

Для обработки гель-хроматографических данных использовали оригинальную программу "Оекгеа1", разработанную А. В. Кудрявцевым. Она позволяет проводить первичную обработку кривых элюирования, рассчитывать калибровочную зависимость, ММР и расширенный набор численных дескрипторов распределений: средние ММ (М„, Мк, М2), полидисперсности (Л/„/А/п, Мг/Мк), статистические моменты и квантили. Путем совместной обработки данных УФ- и Сорг-детекторов впервые было рассчитано распределение массовых коэффициентов поглощения гумусовых кислот £* (мг С/(лхсм)) по ММ. Среднее £* использовали в качестве интегрального дескриптора свойств гумусовых кислот для классификации и прогноза.

Кривая ММР гумусовых кислот на примере ФК почв приведена на рис. 66. Анализ выборки из 27 препаратов показал, что форма и положение максимума хроматограмм и кривых ММР существенно зависит как от фракционного состава (ГК и ФК почв), так и источника происхождения (ГФК торфа и вод). Результаты статистической обработки полученных интегральных дескрипторов ММ состава: Мк, М„, Мр, MJMn, а также с* для исследованных препаратов гумусовых кислот приведены в табл. 7. Весь диапазон изменения Мк исследованных препаратов составил от 6 до 22.6 КДа, а МД/„ - от 1.9 до 6.8. При этом по величине М„ препараты располагались в следующий ряд: ГФК вод < ФК почв < ГК почв < ГФК торфа, а по полидисперсности: ФК < ГК < ГФК. Данные по М„ и MJMn характеризуются хорошей воспроизводимостью (эг = 7 %).

На основании известных ММР было рассчитано распределение £* по ММ гумусовых кислот. Диапазон изменения б* в пределах фракций одного препарата не превышал порядка. В целом для всех препаратов в диапазоне от 1 КДа до соответствующего М„ наблюдалось монотонное возрастание е*. Параметры полученного распределения е* по ММ включали в расширенный набор дескрипторов ММ состава, куда входили также параметры кривых элюирования в шкале Ка и ММР. Этот набор был в дальнейшем использован для классификационного анализа.

Таблица 7

Оценки среднего и дисперсии характеристик ММР и е* препаратов гумусовых кислот, сгруппированных по происхождению и фракционному составу

Препараты м„ м„ Мр мш/м„ Е*

КДа л/(мг Схем)

X в2 X 82 X 52 X 52 X 82

ГФК торфа (п=8) 5.0 1.7x102 18.5 3.1 х105 24.1 2.3хЮ3 3.7 0.1 0.064 0.5x10'4

ГК почв (п=8) 6.2 7.3x102 17.3 5.4х107 16.9 5.6х104 2.9 0.2 0.089 2.0x10"4

ФК почв (п=7) 5.4 1.7x102 12.9 1.3х104 12.1 б.ЗхЮ3 2.4 0.03 0.055 0.8x10"4

ГФК вод (п=5) 3.7 4.2х102 9.8 1.1х104 7.5 5.8х102 2.6 0.2 0.039 0.3x10-4

Все (п=27) 5.4 2.2х102 15.8 2.3х104 16.7 5.1 х 104 3.0 0.4 0.063 0.4x10"*

Таким образом, в результате выполненного комплекса исследований разработано методическое обеспечение для гель-хроматографического анализа гумусовых кислот: определен перечень требований к хроматографической системе для компенсации неэксклюзионных эффектов, обоснован выбор образца сравнения, предложен способ и средство (программа) интерпретации получаемых данных. Впервые исследовано распределение массовых коэффициентов поглощения гумусовых кислот по ММ.

6. КЛАССИФИКАЦИЯ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ И ФРАКЦИОННОМУ СОСТАВУ 6.1. Характеристика массива данных

Комплексный внализ гумусовых кислот с применением описанных методов позволил охарактеризовать три иерархических уровня их структурной организации -элементного, фрагментного и молекулярного - в терминах состава. Полученный набор инегральных дескрипторов включал содержания элементов (% масс) и их атомные соотношения, содержание С и Н в составе структурных групп в процентах от общего С и Н, соответственно, средние ММ и их отношения. Кроме того, в него входили значения е* - интегрального дескриптора свойств.

Первичная классификация препаратов с использованием дескрипторов элементного и структурно-группового уровня (рис. 7) отчетливо показала тенденцию к образованию кластеров в соответствии с источником происхождения и фракционным составом гумусовых кислот. Это позволило сформулировать задачу классификационного анализа как установление принадлежности препарата к классам по источнику происхождения (вода, почва, торф, уголь), фракционному составу (ГК, ФК, ГФК) и по более детализированному признаку - источник и состав. Задачу классификации по химическому строению не ставили из-за весьма ограниченного пересечения выборок препаратов, проанализированных каждым методом. Они включали 30 (эксклюзионная хроматография - ЭХ), 40 (ПМР), 60 (13С ЯМР) и 80 (элементный анализ - ЭЛАН) препаратов. Данными ЭЛАН были охарактеризованы все препараты всех выборок. Поэтому классификацию проводили как по наборам дескрипторов одного уровня

1.4 1.2 1

0.8 0.6 0.4 0.2

И/С_

ГК и ФК ГГ1, Л почв, ГК и ГФК торфа

ГК угля и, чернозема

РОВ торфа и ^од, ФК почв, р-ра

О

ФК торфа

О/С

0.4 0.3 0.2 0.1 0

0 0.2 ^СсагЬ

0.4

0.6

0.8

ФК торфа

ГФК -торфа

ФК почв

ГК ГР и Л почв ГК торфа

ГК черноземов ГКугля

■СТ.. Т^>Сдг

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

ЕНсагЬ

ГФК и ФК верх, [торфов

верх, и ФК V) низ. торфов

ГФК вод

ГФК и ГК низ. торфов

ГК угля и ГК черноземов £Наг

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Рис. 7. Распределение препаратов по соотношению основных элементов — С, Н, О (а) и суммарному содержанию С и Н в составе основных фрагментов (ароматических и углеводных) углеродного скелета гумусовых кислот - диаграммы (б) и (в), соответственно.

(полученные одним методом), так и по смешанным наборам дескрипторов разных уровней (больше, чем один метод): ЭЛАН+ЭХ, ЭЛАН+ПМР, ЭЛАН+13С ЯМР, г*+ЭХ и ЭЛАН+ЭХ+5*.

В связи с проведением классификационного анализа целесообразно было ответить на фундаментальный вопрос о возможности получения препаратов гумусовых кислот с воспроизводимыми свойствами при их повторном выделении из сходного источника. Для этого оценивали воспроизводимость атомных соотношений препаратов, выделенных из сходных источников по стандартным методикам в разные годы (рис. 8).

Рис. 8. Атомные соотношения препаратов гумусовых кислот, выделенных из сходных источников в разные годы (п = 3, Р = 0.95).

Как видно, для большинства препаратов наблюдается довольно хорошая сходимость данных. Максимальный разброс характерен для Н, на результаты определения которого большое влияние оказывает атмосферная влажность, тогда как для С и для N результаты разных лет хорошо согласуются между собой. Подобные результаты были получены и для данных 13С ЯМР по распределению углерода. Поэтому следующий этап работы был посвящен непосредственно классификации гумусовых кислот с точки зрения источника их происхождения и фракционного состава. 6.2. Классификация с использованием наборов интегральных дескрипторов состава

Ввиду отсутствия априорных сведений о характере связи между принадлежностью препарата к определенному классу и значениями его интегральных дескрипторов состава, для классификации использовали методы линейного дискриминантного анализа (ЛДА), К-ближайших соседей (КБС) и нейронных сетей. Достоинство ЛДА -возможность вероятностных оценок полученной классификации, недостаток -неприменимость при наличии границ сложных форм между классами. В последнем случае хорошо работает метод КБС, однако он не предусматривает вероятностных

оценок классификации. Метод нейронных сетей применим для самых сложных форм границ между классами, но имеет ограничение по работе с малыми массивами данных.

Классификация препаратов по наборам дескрипторов одного уровня (ЭЛАН, ЭХ, ПМР и |3СЯМР) с использованием методов ЛДА и КБС ни в одном случае не дала 100% правильных отнесений. Расчеты по смешанным наборам дескрипторов показали гораздо более высокую дискриминирующую способность (табл. 8). Так, использование наборов ЭЛАН+ЭХ и ЭЛАН+ЭХ+г* позволило достичь 100% правильных классификаций как по источнику происхождения, так и по фракционному составу с применением ЛДА и КБС. Для более детальной классификация по признаку "источник и фракционный состав" также было получено 100 % правильных отнесений (рис. 9), что говорит о высокой дискриминирующей способности используемого набора дескрипторов. Следует отметить, что и остальные смешанные наборы дескрипторов обеспечивали высокий процент правильных классификаций по всем трем признакам.

Таблица 8

Результаты классификации препаратов гумусовых кислот по трем категориям

методами ЛДА и КБС

Источник Фракционный состав Источник и состав

Наборы данных общее количество правильно классифицированных препаратов, %

ЛДА КБС ЛДА КБС ЛДА КБС

ЭЛАН+'3С ЯМР 94 98 88 83 94 71

ЭЛАН+ПМР 97 94 97 73 94 72

ЭЛАН+ЭХ 100 100 100 100 100 100

ЭХ+£ 96 100 96 100 100 100

ЭЛАН+ЭХ+с 100 100 100 100 100 100

Анализ значимости дескрипторов, входящих в лучшие дискриминирующие функции ЛДА, и частота их встречаемости позволили сделать вывод о максимальной дискриминирующей способности N. Мр, £*, М«,/М„, СНсо- Анализ частоты встречаемости дескрипторов в наилучших классификациях методом КБС позволяет выделить весьма сходный ряд параметров: N. С, Мр, М«,/Мп, Сено-

Таким образом, оба метода показали высокую дискриминирующую способность смешанных наборов дескрипторов разного уровня. Самым мощным из наборов дескрипторов одного уровня является набор дескрипторов ММ состава.

Применение нейронных сетей для наилучшего из смешанных наборов дескрипторов - ЭЛАН+ЭХ+г* - показало, что в этом случае достаточно 4 нейронов и 13 синапсов для полной классификации 27 препаратов по объединенному признаку -источник и фракционный состав. Это свидетельствует о высокой достоверности классификационного правила, получаемого с использованием указанного набора дескрипторов. Анализ значимости дескрипторов еще раз подтвердил максимальную дискриминирующую способность содержания N. М„/М„ и Мр.

Дискриминантная функция 1

Рис. 9. Классификация препаратов гумусовых кислот по источникам и фракционному составу методом ЛДА на основе набора дескрипторов "ЭЛАН+ЭХ".

Таким образом, классификационный анализ показал, что смешанные наборы дескрипторов разных уровней обладают гораздо более высокой дискриминирующей способностью по выбранным классам. Это подтверждает справедливость выбранного в нашей работе подхода к повышению информативности численного описания структуры с помощью дескрипторов состава за счет использования комплекса дескрипторов, отвечающих разным уровням структурной организации органических соединений.

6.3. Классификация с использованием расширенного набора дескрипторов молекулярно-массового состава

Для выяснения принципиальной возможности проведения классификации на основании дескрипторов одного уровня набор интегральных дескрипторов ММ состава, показавший самую высокую дискриминирующую способность, был существенно расширен за счет характеристик трех видов распределений - кривой элюирования в шкале Kd, ММР и е* по ММ, которые включали в себя начальные и центральные моменты, скошенности, эксцессы, квантили и интегралы. Для их расчета использовали программу Geltreat. В связи с весьма ограниченными размерами выборки препаратов -27, прибегали к искусственному приему ее увеличения, рассматривая каждую повторность как новый препарат того же класса. Допустимость использования такого приема обосновывали тем, что дисперсия внутри повторностей одного препарата несущественно отличалась от общей дисперсии повторностей внутри класса.

Полученная описанным способом выборка содержала 116 препаратов: ГФК вод (31) и торфа (35), ФК почв (32) и ГК почв (18), что позволило провести классификацию с контрольной выборкой, разделив исходную случайным образом на обучающую и контрольную. Для классификации использовали метод КБС, реализованный алгоритм которого предусматривал кросс-валидацию полученных классификаций (автор - A.B. Кудрявцев). Качество классификации оценивали величинами Q: процент правильных классификаций для обучающей (Qü6y4) и контрольной выборки (Qk0l[lp). Все дескрипторы

нормировали на стандартное отклонение по всей обучающей выборке образцов и масштабировали с помощью дисперсионных весов.

В качестве дескрипторов использовали не только исходные параметры, но и их комбинации: произведения, отношения, обратные величины. Количество параметров для исходных дескрипторов ограничивали 4, а для комбинированных - двумя. Для создания расширенного набора, включающего в себя дескрипторы всех трех распределений, проводили отбор дескрипторов, характеризующихся максимальной частотой встречаемости в лучших классификациях по каждому отдельному набору.

Классификацию по методу КБС проводили с точки зрения детализированного признака - "источник и фракционный состав". Классифицирующая способность наборов дескрипторов каждого из ЭХ-распределений увеличивалась в ряду ММР < Ка < е*, достигая максимума для е*: С?оСу,, = 0.99 и <Зконтр = 0.82. Использование расширенного набора дескрипторов позволило существенно улучшить качество классификаций по контрольной выборке: (ЗоСуч = 0.99 и РК0Нтр = 0.92 для варианта "4 исходных параметра" и <Зобуч = 1.0 и (Зконтр = 0.92 для варианта "2 комбинированных дескриптора". Наилучшая классификация приведена на рис. 10.

см |б

15

о. ^

О Л ф 4

ч

?3

|1

юО г

5

ГФК вод ^— о* ;

/ ♦ (> . ♦ со«« / У

«о ГФК торфа

ФК почв £ д □Ч □ а)

, , , 1 к. почв

1 2 3

Комбинированный дескриптор 1

Рис. 10. Наилучшая классификация гумусовых кислот методом КБС по происхождению и фракционному составу для расширенного набора ММ дескрипторов.

Полученные результаты показали возможность решения задач классификации гумусовых кислот с помощью дескрипторов молекулярного уровня - ММ состава.

Проведенный комплекс исследований позволил решить задачу классификации гумусовых кислот по источнику происхождения и фракционному составу. Тем самым показана применимость использованного подхода к численному описанию строения гумусовых кислот с помощью интегральных дескрипторов состава для решения задач классификации гумусовых кислот. Наиболее эффективным оказалось использование смешанных наборов интегральных дескрипторов разных уровней, а из дескрипторов одного уровня - ММ состава.

л 2

7. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАЮЩИХ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩИХ СВОЙСТВ

ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ

Задача следующего этапа исследований состояла в получении количественных характеристик связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к различным классам экотоксикантов (на примере ПАУ и атразина),

которые могли быть использованы как признаки прогнозируемых свойств. Для ее решения применяли хорошо разработанный методический подход - описание процессов связывания/комплексообразования гумусовых кислот с экотоксикантами с помощью соответствующих констант связывания и устойчивости комплексов. Распространяя указанный подход для описания процесса детоксикации, оказалось возможным охарактеризовать детоксицирующие свойства гумусовых кислот с помощью констант детоксикации. Для определения констант связывания и устойчивости комплексов с различными экотоксикантами использовали соответствующие физико-химические методы, константы детоксикации определяли методом биотестирования.

7.1. Определение констант устойчивости комплексов гумусовых кислот с 1^(11)

Для преодоления основной проблемы определения констант устойчивости комплексов гумусовых кислот с тяжелыми металлами - неизвестной стехиометрии взаимодействия - разработаны разные методические подходы. Одним из наиболее адекватных стохастической природе объекта является использование концепции металл-эквивалентной концентрации, что позволяет свести стехиометрию к соотношению 1:1. Для применения данной концепции к описанию взаимодействия гумусовых кислот с 118(11) вводили понятие ртуть-связывающего центра (РСЦ). Под РСЦ понимали комбинацию фрагментов молекулы гумусовых кислот, участвующих в связывании одного атома ртути. Тогда реакция описывается константой равновесия:

№-рсц]

рсц~[н82+мрсц2"] (6)

где Крсц - кажущаяся константа устойчивости гуматов ртути, [РСЦ] - ^-эквивалентная концентрация гумусовых кислот, ммоль Н^л.

Такое представление константы позволяет перейти к размерности констант устойчивости комплексов Н§(11) по первой ступени (л/моль Нц). Это дает возможность сопоставлять получаемые величины с константами для низкомолекулярных лигандов.

Для исследования комплексообразующих свойств гумусовых кислот по отношению к ^(Н) использовали выборку из 24 препаратов различного происхождения и фракционного состава, которая включала в себя: 2 РОВ вод, 5 ГФК вод, 3 ГФК донных этложений, 2 ГК угля, 6 ГФК торфа, 3 ГК почв и 3 ГФК почв.

Содержание РСЦ в препаратах гумусовых кислот определяли в предположении, что эно эквивалентно содержанию Н§(Н) в насыщенном гумате ртути (все РСЦ заполнены). Исследование условий образования гуматов Нд(Н) методом адсорбционных изотерм юказало, что насыщение гуматов Щ(И) достигается при соотношении

Hg:r<t>K > 0.01 моль/г при рН 2.9-3.4. Анализируя гуматы на содержание Hg(II) (методом ААСХП) определяли содержание РСЦ в расчете на г органического вещества (ОВ) (табл. 9). Большинство препаратов гумусовых кислот характеризовалось близким содержанием РСЦ - в среднем 2.5 ммоль/г ОВ.

Крсц определяли адсорбционным методом с использованием конкурентного комплексообразования. Для этого проводили адсорбционные эксперименты на полиэтиленовых поверхностях в среде 0.0025 М гидрокарбонатного буфера (рН 7) при CHg(ii) = 50, 100, 150, 200 и 250 нМ, вводя различные концентрации гумусовых кислот (040 мг ОВ/л). Из полученных изотерм адсорбции рассчитывали условную (при постоянной концентрации лиганда) константу лигандного обмена К[А](РСЦ/А), где А -конкурирующий лиганд. Величину K[A](IIgA) оценивали аналогично К[А](РСЦ/А) из адсорбционных экспериментов с бромидом, константа которого с Hg(II) известна. Значение K[Aj(HgA) составило 4.9x108, что позволило идентифицировать адсорбированную форму как Hg(OH)2. Подставляя его в выражение для константы лигандного обмена, рассчитывали КРСц:

К„(РСЦ/А) = ](7)

Полученные значения логарифмировали и усредняли (табл. 9).

Таблица 9

Содержание РСЦ и условные константы устойчивости гуматов Hg(II) (п = 3, Р = 0.95)

Препарат РСЦ, ммоль/г ОВ IgKpcu Препарат РСЦ, ммоль/г ОВ lgKpcLl

РОВ природных вод ГФК торфа

ADOM-SMu4 3.7+0.7 13.710.3 PHF-T494 2.210.4 14.110.2

ADOM-SMu8 2.610.4 14.110.2 PHF-T594 2.110.4 14.310.1

ГФК природных вод PHF-T694 2.510.2 14.010.2

AHF-MMU7 4.210.8 14.6+0.4 PHF-TH94 2.110.2 14.210.3

AHF-RND11 2.710.3 13.710.1 PHF-TMu4 2.410.5 14.210.3

AHF-RND14 5.910.6 13.510.1 PHF-TT94 2.810.5 14.2+0.3

AHF-SSH1 . 2.710.4 13.910.2 ГК почв

AHF-SMu8 3.510.6 13.810.1 SHA-Gw94 1.010.5 14.710.2

ГФК донных отложений SHA-Pw94 1.0+0.1 14.510.2

BHF-RLuh 3.210.4 14.410.2 SHA-PwN 2.0101 14.610.2

BHF-RND13 2.9+0.4 14.010.3 ГФК почв

BHF-SMu2 2.4+0.4 14.510.2 SHF-Co94 2.710.3 14.2+0.2

ГК углей SHF-TMul2 1.810.2 14.9+0.4

CHA-AGK 4.310.9 14.410.2 SHF-PMu9 1.910.2 14.210.2

CHA-ALD 2.610.1 14.010.2

По величине ^КрСц большинство групп препаратов близки друг к другу. Сопоставление полученных данных с опубликованными в литературе в пересчете на

[РСЦ] для I = 0 показало, что они лежат в диапазоне величин, найденных другими авторами: от 10.2 до 17, который, однако, исключительно широк из-за различия в экспериментальных подходах к решению указанной задачи.

7.2. Определение констант связывания органических экотоксикантов гумусовыми кислотами Изучение связывающих свойств гумусовых кислот различного происхождения по отношению к ПАУ проводили на примере пирена (Ру), флуорантена (РН) и антрацена (Ап). Выбор углеводородов был обусловлен различием их физико-химических свойств. Из-за неизвестной стехиометрии взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ для описания этого процесса обычно используют константу сорбции, что позволяет оперировать массовой концентрацией гумусовых кислот (Сгфк)- Соответствующее выражение для константы приведено ниже:

Кос (»)

а оГФК

где ^ - константа связывания ПАУ в расчете на массовую концентрацию гумусовых кислот (кг С/л); а - доля несвязанного ПАУ.

Для определения Кос использовали метод тушения флуоресценции в предположении, что квантовый выход флуоресценции аддуктов ПАУ-ГФК равен нулю. Это позволяет определять а без предварительного разделения связанных и несвязанных форм ПАУ как соотношение интенсивности флуоресценции ПАУ в присутствии и этсутствие гумусовых кислот. Определение К<,с проводили при следующих условиях: Спау = 5х10~7, 6.4х10~7 и 1.7х10~7 М для Ру, Рк и Ап, соответственно, СГФК - от 0.5 до 7x10^ кг С/л, рН 5.5 (дистиллированная вода), время взаимодействия - 15 минут. Выборка препаратов включала 26 образцов: 7 ГФК и 1 РОВ торфа; 7 ГК, 5 ФК и 1 ГФК почв; 4 ГФК вод и 1 ГК угля. Рассчитанные значения констант приведены в табл. 10.

Полученные значения Кос лежат в диапазоне (0.13-2.5)х105, (0.2-1.7)х105 и (0.12-1.0)х105 л/кг С для Ру, Рк и Ап, соответственно, что хорошо согласуется с данными, приводимыми в литературе. Наиболее высокие значения Кос наблюдаются для более гидрофобных Ру и Ш (^Ко„, ~ 5.2). Для менее гидрофобного Ап не было обнаружено гушения флуоресценции в присутствии ГФК вод и ФК почв: соответствующие зднетанты оказались ниже минимально определяемой величины Кос (0.1х105 л/кг С), найденной по 35-критерию. По величине Кос все препараты можно расположить в :ледующий ряд:

ГК угля = ГК чернозема > ГК Л и Пд почв, ГФК торфов » ГФК вод > ФК почв Таким образом, проведенное исследование показало, что сродство гумусовых шелот выше к наиболее гидрофобным ПАУ. При этом максимальное сродство 1аблюдается для гумусовых кислот, обогащенных ароматическими фрагментами - ГК гтля и чернозема. Получена обширная база данных по константам связывания ПАУ,

которая может быть использована для установления корреляционных соотношений строение - свойства, а также для расчета форм существования ПАУ в водных средах.

Таблица 1С

Константы связывания модельных ПАУ гумусовыми кислотами различного _происхождения и фракционного состава (п = 7, Р = 0.95)_

Препарат К«х10~5, л/кг С Препарат КосХЮ 5, л/кгС

Ру РН Ап Ру РН Ап

ГК и ФК почв ГФК торфа

8НА-Р\у94 1.0±0.1 0.810.1 <0.1 РНР-Т1Н94 1.210.2 0.910.2 0.1210.05

8НА-Р\УЫ 1.3+0.1 0.810.1 0.510.1 РНР-Т4Н94 1.410.1 0.910.1 0.2210.05

8НА-Рр94 1.2+0.2 0.810.1 0.5+0.1 РНР-Т5Н94 0.810.2 0.610.2 0.1610.03

8НА^94 0.7±0.1 0.510.1 <0.1 РНР-Т6Н94 0.710.1 0.710.1 0.2510.07

8НА-0\У94 1.4+0.5 0.910.2 0.510.2 РНР-Т7Н94 1.710.1 1.110.2 0.610.2

8НА-Ор94 1.8+0.2 1.210.1 0.710.1 РНР-ТН94 1.410.2 0.910.2 0.510.1

8НА-Ст94 2.210.2 1.310.2 1.010.1 РНР-ТТЬ94 1.010.2 0.810.1 <0.1

8НА-аУ94 2.410.3 1.610.3 1.010.4 ГФК природных вод

8РА^94 0.1310.08 <0.1 <0.1 АНР-ИМС <0.1 <0.1 <0.1

8РА-Рр94 <0.1 <0.1 <0.1 АНР-ЯМХ 0.710.1 0.510.1 <0.1

8РА^94 <0.1 <0.1 <0.1 АНР-ЯШЗ 0.410.1 0.210.1 <0.1

8РА-0\У94 0.510.1 0.310.1 <0.1 АНР-ЗБЫ 1.210.2 0.910.2 <0.1

8РА-аУ94 1.110.2 0.710.1 <0.1 РОВ торфа и ГК угля

ГФК почв РООМ-ТН <0.1 <0.1 <0.1

8НР-Со94 1.010.1 0.610.1 0.510.1 СНА-А1ЛЭ 2.3+0.3 1.8+0.2 1.0+0.2

Изучение взаимодействия гумусовых кислот с гербицидами проводили на примере атразина - персистентного гербицида класса симм-триазинов. Выборка гумусовых кислот состояла в основном из препаратов почв, так как проблема загрязнения гербицидами наиболее актуальна для почв. Для расширения диапазона свойств были включены и другие препараты. Всего в выборку вошло 16 препаратов: 8 ГК, 3 ФК и 1 ГФК почв; 1 ГФК, 1 ГК и 1 РОВ торфа, 1 ГК угля.

Определение константы связывания атразина гумусовыми кислотами основывай на той же теоретической концепции, что и для ПАУ, рассчитывая ее как констант) сорбции. Отличался только метод определения доли несвязанного атразина I присутствии гумусовых кислот. Для этой цели сначала проводили разделение связанно! и несвязанной форм с помощью ультрафильтрации (использовали мембранный фильтр ( пределом пропускания 1000 Да), а затем определяли концентрацию несвязанной формь в фильтрате методом ОФ-ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием (X = 22С нм). Эксперименты проводили при следующих условиях: СА= 1x10~5 М; СГфК=(1.5-6.5)х10"4 кг С/л; рН 5.5; время взаимодействия - 24 часа. Полученные значения К0(

даны в табл. 11. Они оказались почти на три порядка ниже, чем для ПАУ. При этом сродство препаратов к атразину изменялось весьма сходным образом, как и для ПАУ. Так, наибольшие К0с наблюдались для ГК угля, наименьшие - для ОВ водного экстракта торфа. Среди препаратов почв наименьшие Кос были получены для ФК, наибольшие - для ГК черноземов.

Таблица 11

Константы связывания (К0с) и детоксикации (Кос°) атразина гумусовыми кислотами

(п = 9, Р = 0.95)

Препарат Кос, л/кг С Кос0, л/кг С Препарат Кос, л/кг С Кос", л/кг С

ГФК торфа ГК почв

РНР-Т494 380+20 (8.9+1.4)х105 8НА-Р\У94 380+20 (1.2±0.3)х105

РНР-ТН94 300+20 (5.7±0.9)х105 SHA-Pw9б 280+20 (5.6±0.7)х105

РНР-ТТ94 - (1.3+0.2)х106 8НА-Рр94 - (1.4+0.4)х105

РОВ торфа 8НА-Рр96 180+10 (5.5+0.7)х105

РБОМ-ТН 87±5 (5.8±0.8)х105 8НА-Ре94 400+30 (1.0+0.2)х104

РООМ-ТТ - (4.5±0.7)х105 SHA-Gw94 580+40 (2.0±0.3)х105

ФК и ГФК почв 5НА-0\У96 380±30 (1.4±0.2)х105

5РА-Р\У96 190+10 (5.0+0.7)х104 БНА-Ст94 450±30 (2.9+0.4)х105

5РА-Рр96 110+7 (5.0±0.8)х104 5НА-аУ94 400+20 (3.7±0.6)х105

5РА-Ре94 - (1.4±0.2)х105 ГФК почвенного раствора

8РА-Ре9б 280+20 (6.0±0.8)х104 БОНР-Ри-Эб - (2.1±0.3)х106

8РА-0\У94 - (5.3±0.8)х105 ЗОНР-Рр96 - (1.8+0.2)х106

5НР-Со94 440+30 (7.1± 1.1)х105 50НР-Ре96 - (1.9±0.2)х106

ГК углей ГФК природных вод

СНА-АвК 580+30 (7.4+1.1)х105 Аот-амхг - (2.9±0.5)х105

Характер найденных закономерностей указывает на то, что наиболее вероятным механизмом взаимодействия гумусовых кислот как с ПАУ, так и атразином является гидрофобное связывание. Об этом свидетельствует возрастание констант по мере возрастания 1§К<,Ш органического соединения. Кроме того, и в ряду препаратов максимальное сродство к ПАУ и атразину наблюдается для ГК угля и черноземов, в структуру которых вносят наибольший вклад ароматические фрагменты, что способствует большей гидрофобности данных препаратов.

Таким образом, в результате проведенного комплекса исследований удалось получить представительный блок данных по константам устойчивости комплексов гумусовых кислот с и константам связывания ПАУ и атразина. Убедительно

показано, что связывающие свойства гумусовых кислот весьма существенно варьируют в ряду исследованных препаратов.

7.3. Определение коистант детоксикации экотоксикантов гумусовыми кислотами

Для количественного описания процесса детоксикации его рассматривали с позиций универсальной концепции комплексообразования/связывания, вводя допущение, что токсичность (Т) обусловлена только свободной формой экотоксиканта, а связанная с гумусовыми кислотами - нетоксична и небиодоступна. Тогда относительное уменьшение токсичности (эффект детоксикации - D) экотоксиканта (ЭТ) при введении гумусовых кислот будет эквивалентна доле экотоксиканта (а), связавшегося с гумусовыми кислотами. В этом случае зависимость D от концентрации гумусовых кислот может быть описана с помощью константы детоксикации (Кос°):

D = Тэт 'Тэт>гок => D = 1 -а = Сгфк *К°с (9)

Тэт 1 + Сгфк хКос

Условиями выполнимости данного выражения является (1) линейность зависимости отклика биотеста от концентрации свободной формы экотоксиканта в растворе; (2) зависимость величины D только от единственного фактора - концентрации свободной формы экотоксиканта. Так как гумусовые кислоты могут оказывать собственное воздействие на тест-объект, то его необходимо было учесть при расчетах D. Для этого вводили допущение об аддитивности действия экотоксиканта и гумусовых кислот на тест-объект, токсичность экотоксиканта в отсутствие и присутствии гумусовых кислот рассчитывали как, соответственно:

R0 - R-эт _ R-гфк ~ КГФК+ЭТ пт

ЭТ — 5 И ЭТ+ГФК р UUJ

IS-0 ^-ГФК

где Ro - тест-отклик в контроле без ЭТ и гумусовых кислот; R3t - тест-отклик в присутствии ЭТ; Ягфк - тест-отклик в присутствии гумусовых кислот без ЭТ; RroK+эт ~ тест-отклик в присутствии ЭТ и гумусовых кислот.

Использование приведенных выражений для расчета эффекта детоксикации позволяет исключить влияние стимулирующего действия гумусовых кислот на тест-объект. Как следствие, в этом случае экспериментальная зависимость D от Сгфк может быть использована для расчета константы детоксикации по выражению (9).

Hg(II). Поскольку токсичность Hg(II) зависит от ее формы существования, в качестве токсиканта была выбрана наиболее токсичная форма - HgC^. Тест-объектом служила водоросль Chlorella pyrenoidosa, в качестве тест-функции использовали показатель фотосинтетической активности водоросли. В качестве рабочей выбирали концентрацию HgCl2 0.8 мкМ, которая вызывала 100%-ное угнетение фотосинтеза водоросли. Концентрации гумусовых кислот составляли 5-25 мг/л, что характерно для поверхностных вод.

Предполагали, что токсичность хлорида ртути снижается за счет его превращения в нетоксичный гумат. Тогда детоксикация определяется константой лигандного обмена Крсц/с1- Для ее нахождения принимали во внимание, что как хлорид-ионы, так и PCL] находятся в растворе в большом избытке по сравнению с Hg(II). [HgCl2] определяли непосредственно из диапазона токсичности HgCl2 (который оказался нелинейным), а

[11цРСЦ] - из уравненеиия материального баланса (считая, что Hg(II) распределена между HgCb и гуматом). Домножая ее на константу устойчивости HgCb, получали выражение для константы устойчивости гумата или константы детоксикации Hg(II) гумусовыми кислотами:

Крсц° = КрсЦС! х KIlgC12 (11)

Полученные значения корректировали по уравнению Дэвиса на ионную силу среды для биотестирования (0.019 М, корректирующий фактор - 0.49).

Из данных по биоаккумуляции Hg(II) в биомассе водорослей в присутствии хлоридов рассчитывали константу бионакопления КРСцВ. Для этой цели определяли распределение Ilg(II) в системе раствор - биомасса водорослей в присутствии гумусовых кислот. КрсцВ рассчитывали, полагая, что накопление Hg(II) в биомассе водорослей, как и в случае токсического эффекта, определяется только [HgCb]. Как показали эксперименты, данная зависимость линейна, то есть для расчета КРсцВ можно использовать уравнение (9), из которого находится величина КрСЦ/С1/[СП2. Из нее находят константу лигандного обмена (принимая [СП = Cef и пересчитывают ее в КРСцВ по уравнению (11) как для КрсцВ.

Полученные значения констант (табл. 12) хорошо согласовались с величиной Крсц, причем между ними наблюдалась значимая корреляция (г = 0.67 при п = 22). Это является подтверждением того, что основным механизмом детоксикации Hg(II) является связывание в гуматы, которые не поглощаются водорослью.

Таблица 12

Константы детоксикации (Крсц0) и бионакопления (Крсцв) Hg(II) гумусовыми

Препарат lgKpcu lgKpcu" Препарат lgKpcu" lgKpcu"

РОВ природных вод ГФК торфа

ADOM-SMu4 13.8+0.1 14.1 ±0.2 PHF-T494 14.310.1 14.310.5

ADOM-SMu8 14.2+0.1 14.0+0.3 PHF-T594 1411 14.510.1

ГФК природных вод PHF-T694 13.510.2 14.310.2

AHF-MMu7 - 14.2+0.1 PHF-TH94 13.8+0.5 14.310.1

AHF-RND11 - 13.5±0.6 PHF-TMu4 14.010.1 14.410.1

AHF-RND14 13.7+0.2 13.9±0.3 PHF-TT94 1313 1312

AHF-SSH1 - 14.0410.05 ГК почв

AHF-SMu8 13.80+0.04 13.6+0.7 SHA-Gw94 14.410.2 14.6410.08

ГФК донных отложений SHA-Pw94 14.310.3 14.910.3

BHF-RLuh 13+6 14.3+0.5 SHA-PwN - 14.110.5

BHF-RND13 13.9+0.5 14.4+0.4 ГФК почв

BHF-SMu2 14.4+0.3 14.610.4 SHF-C094 13.810.1 14.310.2

ГК углей SHF-TMul2 14.010.1 15.310.1

CHA-AGK 13.9+0.1 14.0+0.4 SHF-PMu9 1412 14.810.4

CHA-ALD 13.4+0.2 14.110.4

ПАУ. Для исследования детоксицирующих свойств гумусовых кислот пс отношению к ПАУ в качестве тест-объекта использовали Daphnia magna, тест-отклико\ служила активность питания. Рабочие концентрации ПАУ, вызывающие 50% сниженш тест-отклика, составили (5, 7 и 1.7)х10"7 М для Ру, Fit и An, соответственно Концентрацию гумусовых кислот изменяли в диапазоне 1-25 мг С/л. Значенш полученных констант детоксикации приведены в табл. 13.

Таблица 1;

Константы детоксикации (KocD) ПАУ гумусовыми кислотами (п = 5, Р = 0.95)

Препарат КоДю^л/кгС Препарат Кос Dxl0"5, л/кг С

Ру Fit An Ру Fit An

ГК и ФК почв ГФК торфа

SHA-Pw94 4+1.4 5+1.3 6+2.4 PHF-T1H94 4±1.1 3+1.2 -

SHA-PwN 4±1.2 7±3.4 6+1.9 PHF-T4H94 3.7+0.6 5±1 1+0.5

SHA-Pp94 3.0±0.8 4±1.5 4±1.3 PHF-T5H94 2±0.8 4.4±2.5 1.2+0.2

SHA-Pg94 2.1 ±0.5 2.1±0.2 2±0.6 PHF-T6H94 3.6±0.6 3±0.8 2±0.6

SHA-Gw94 4+1.3 4+2.2 4+1.1 PHF-T7H94 4±2.6 6.0±0.3 -

SHA-Gp94 4.0±0.8 5+0.8 4+1.2 PHF-TH94 4±1.7 4+0.8 1.8±0.5

SHA-Cm94 6+3.1 8±4.8 6±2.4 PHF-TTL94 4±2.7 4±1 0.3+0.1

SHA-CtV94 5+1.6 6±3.5 6+2.5 ГФК природных вод

SFA-Pw94 <0.3 <0.3 <0.3 AHF-RMC 3±1.1 2±0.5 <0.3

SFA-Pp94 <0.3 <0.3 <0.3 AHF-RMX 1.1 ±0.3 0.4±0.1 <0.3

SFA-Pg94 <0.3 <0.3 <0.3 AHF-RND3 1.9+0.5 2.5±0.5 <0.3

SFA-Gw94 <0.3 <0.3 <0.3 AHF-SShl 1.9+0.7 2+0.6 <0.3

SFA-CtV94 3.0±0.8 2.2+0.6 <0.3 ГК угля

ГФК почв CHA-ALD 6±3.4 6±2.8 5+1.3

SHF-Co94 3.610.6 3.4±0.4 2±0.5 CHA-AGK. 6±0.6 5±0.8 -

По величине К0с° превышали соответствующие Кос- Однако между ним! наблюдалась довольно высокая корреляция: г = 0.86, 0.85 и 0.77 (п = 26) для Ру, Fit и An соответственно. Это говорит о том, что детоксикация ПАУ гумусовыми кислотам! обусловлена, в основном, процессами химического связывания, приводящего i образованию нетоксичных аддуктов ПАУ-ГФК.

Атразин. Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот проводили ( использованием в качестве тест-объекта водоросли Chlorella vulgaris. Тест-откликои служил показатель фотосинтетической активности водоросли Fv/Fm, при расчел которого учитывали собственную флуоресценцию гумусовых кислот. Рабоча) концентрация атразина, вызывающая 25 % снижение фотосинтетической активности составила 6.7x10~7 М. Концентрация гумусовых кислот составила (0.6-5)х10~4 кг С/л Полученные результаты приведены в табл. 11.

Сравнение полученных величин К0с° и К0с (табл. 11) показало их несоответствие как по абсолютным величинам, так и по характеру изменчивости. Так, значения Кос в среднем на два-три порядка превышали значения Кос. при этом коэффициент корреляции между ними составил 0.12. Это свидетельствует о том, что химическое связывание не является основным механизмом детоксикация атразина гумусовыми кислотами. Она обусловлена, по-видимому, их стимулирующим действием на исследуемый тест-объект, что косвенно подтверждается наличием тесной корреляции между Кос13 и содержанием в гумусовых кислотах низкомолекулярной фракции (<5 КДа, предела проницаемости мембран). Сходное действие гумусовых кислот неоднократно отмечалось для высших растений, но механизм его практически не исследован. Существенный прогресс в этой области может быть достигнут с помощью установления зависимостей "строение - физиологическая активность гумусовых кислот".

Таким образом, в результате выполненного комплекса экспериментов систематически исследованы связывающие и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к 1^(11), ПАУ и атразину для обширной выборки гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава. Единый методологический подход для оценки связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот в рамках концепции связывания/комплексообразования использован впервые. В результате сформирован массив признаков свойств - констант связывания, устойчивости комплексов и детоксикации, что позволило перейти к завершающему этапу работы -получению прогностических моделей "строение - свойство".

8. ПРОГНОЗ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕСКРИПТОРОВ СОСТАВА

Создание прогностических моделей "строение - свойство" может служить теоретическим базисом для разработки системы скрининга гумусовых кислот, основанного на определении их состава. Это позволит осуществлять целевой поиск

препаратов, обладающих максимальными связывающими и/или детоксицирующими

свойствами по отношению к различным экотоксикантам, не проводя экспериментов по

связыванию или детоксикации. Появление таких моделей способствовало бы расширению сферы применения природного гуминового сырья (уголь, торф, сапропель) в целях рекультивации загрязненных сред, а также явилось бы необходимой предпосылкой для разработки лекарственных препаратов на основе гуминовых веществ.

Спецификой полученного в работе массива данных является высокая размерность матрицы дескрипторов состава (число столбцов > 20) и сравнимое с ней число препаратов в выборке (16-26 в зависимости от количества констант связывания). Создание прогностических моделей с использованием таких массивов данных требует применения методов, позволяющих снизить размерность матрицы независимых переменных - дескрипторов состава.

Для этой цели использовали метод множественной регрессии (МР), ввод) ограничение на количество членов в уравнении регрессии и предусматривая выбо( оптимальных дескрипторов путем их автоматического перебора (автор алгоритма I программы - А. В. Кудрявцев), и методы многокомпонентного анализа - регрессии ш главных компонентах (РГК) и дробного метода наименьших квадратов (ДМНК). Об; метода позволяют снизить размерность матрицы исходных данных, разлагая ее ш компоненты, не снижая количество дескрипторов. В методе РГК разложение исходно? матрицы проводят только с учетом ее внутренней структуры. В методе ДМНЬ осуществляется совместное разложение как матрицы дескрипторов, так I прогнозируемых свойств. Это повышает надежность получаемой прогностическо? модели. В дальнейшей работе использовали все три метода. Для выбора числа значимы; компонент использовали метод кросс-валидации. Качество модели оценивали ( помощью параметров - И2 и С?2, характеризующих, соответственно, описательную ! прогностическую способность (т.е. относительное количество объясненной I предсказанной дисперсии; в идеальном случае обе эти величины равны 1; (} рассчитывается в ходе кросс-валидации).

8.1. Корреляционный анализ дескрипторов состава и признаков свойств Расчет прогностических моделей предваряли оценкой наличия корреляционныз зависимостей между дескрипторами состава, набор которых для всех выборок бьи стандартным и включал все три уровня дескрипторов (за исключением ПАУ, где иабо[ дескрипторов был расширен за счет £*), и прогнозируемыми свойствами - константам! связывания и детоксикации Г^(Н), ПАУ (Ру, Ш, Ап) и атразина гумусовыми кислотами.

Корреляционный анализ показал, что тесные корреляционные зависимости межд; ^Крсц и индивидуальными дескрипторами состава отсутствуют. Для Кос и К°ос ПА^ наблюдалось наличие корреляции с дескрипторами состава - прямыми и косвенным! показателями содержания ароматических фрагментов в составе гумусовых кислот (Сд, Н/С, £*). Усредненные значения г по всем трем ПАУ для указанных дескрипторов 1 порядке их перечисления составили для К0с> 0.85, 0.82 и 0.65. Данные зависимосп имеют очевидный физический смысл, свидетельствуя о ведущей роли гидрофобньи взаимодействий в процессах связывания и детоксикации ПАУ гумусовыми кислотами Наиболее тесная корреляция между К0с и содержанием СЛг была установлена и дл: атразина (г = 0.91), что может трактоваться как проявление сходного с ПАУ механизм! связывания - гидрофобного. Однако в отличие от ПАУ, указанная корреляция для К°0| атразина отсутствовала, что свидетельствует о различии механизмов связывания 1 детоксикации атразина.

8.2 Прогностические модели множественной регрессии Результаты расчета лучших полиномов по методу МР для различных наборо! использованных дескрипторов приведены в табл. 14. Полиномы с 3-4 слагаемым! (исходные дескрипторы), как правило, предсказывают лучше, чем с двум)

комбинированными дескрипторами (произведения и отношения исходных дескрипторов). Увеличение числа дескрипторов в наборе приводит к улучшению качества модели: максимальные (}2 наблюдаются для смешанного набора дескрипторов всех трех уровней. Из исследованных свойств наиболее удовлетворительные результаты получены для Кос и Кос° всех трех ПАУ и для Кос° атразина. Примеры уравнений лучших регрессий приведены в табл. 14. Как видно, использование метода МР позволило выявить вид зависимости между Кос° атразина и ММ характеристиками гумусовых кислот. Удалось также описать зависимости КРСц от дескрипторов состава.

Таблица 14

Наилучшие прогностические модели МР с тремя исходными параметрами

Токсикант Полином <3 Л2

Нё(И) ^Крсц = 13.5 - 6010 / СЬ + 5.40хСлгО + 0.106 х СНО ^Кгсц13 = 10.7 + 146 / Сл, - 26.3 х С + 0.000140 х (325 №сцв = 14.1 - 0.552 / Е - 20.6 х С + 2.77 х 10"5 х М2 0.79 0.59 0.65 0.89 0.75 0.80

Ру Кос = 170000 - 10240 / СНО - 48100 х Н + 836000 х Сл, Кос0 = 0.172 + 1900 / 025 - 2100 / М„ +0.345 / (Н/С) 0.85 0.83 0.89 0.85

Атразин Кос = 513 - 1620 х АгО + 0.0196 х Мг- 134 х М„/М„ Кос" = - 34600 + 579000 / (Н/С) - 242 х ()2! + 71.3 х СЬ 0.90 0.57 0.94 0.76

Е - эксцесс ММР, С? - квантили ММР.

Анализ качества моделей, полученных для выборок препаратов разного размера позволил обнаружить завышение Я2 и (}2 при использовании малых выборок, что может указывать на случайность подбора дескрипторов в моделях. Данное предположение проверяли с помощью численного эксперимента путем последовательного исключения препаратов из выборки случайным образом. Результаты показали, что при п < 15 значения Я2 и С}2 начинают резко возрастать. Это позволяет сделать вывод о том, что для адекватного построения прогностической модели МР на основании данных аналогичного качества размер выборки должен быть не менее 20 препаратов.

8.3. Прогностические модели, полученные методами многокомпонентного анализа Для расчета использовали наборы данных, включающие индивидуальные дескрипторы и их комбинации. Прогностическая способность полученных моделей оказалась значительно хуже (С?2 = 0.3-0.6), чем моделей МР. Для объяснения этого факта проводили анализ главных компонент, которые выделяли с помощью указанных методов из исходной матрицы дескрипторов. Число компонент, используемых для прогноза по методу РГК, составляло от 2 до 9, по методу ДМНК оно, как правило, не превышало 2.

Рассмотрение пяти первых РГК компонент для выборки из 19 препаратов, использованных при изучении связывания ПАУ, позволило сделать следующие заключения. Первая компонента преимущественно описывает совместный вклад ароматических и углеводных фрагментов в структуру гумусовых кислот, а также их

полидисперсность (максимальные вклады имеют САг, СНО, СНгО, М»/М„, М2/М„) Вторая компонента определяется в основном ММ характеристиками и частично -составом углеводной части гумусовых кислот. Третья компонента описывает N и О/С четвертая - содержание карбонилов, пятая - алифатического незамещенного углерода Аналогичный анализ первых двух РГК компонент для выборок "Н§(11)" и "атразин' показал их существенное сходство с описанными выше для выборки "ПАУ". Этс позволяет сделать важный вывод об адекватности использованного принципа формирования выборок для установления зависимостей "строение - свойство", который предусматривал задание максимального различия препаратов по строению путек: включения в выборку препаратов различного происхождения и фракционного состава.

В отличие от метода РГК, ДМНК-компоненты содержат информацию с взаимосвязи дескрипторов и прогнозируемых свойств. Сопоставление первых ДМНК-компонент, полученных для одной выборки препаратов, но двух разных констант - Кос и Кос°. показало, что в случае ПАУ выделяемые компоненты оказались практически идентичны, что согласуется с наличием тесной корреляции между Кос и Кос" для ПАУ В тоже время в случае атразина наблюдалось принципиальное различие между первыми компонентами. Для Кос она была весьма сходна с таковой для ПАУ, тогда как для К0сС явно превалировали дескрипторы ММ состава. В случае Нц(П) для всех трех набороЕ данных (Крсц, КРСц°, КрсцВ) наблюдалось хорошее совпадение первых компонент. При этом они существенно отличались от таковых для ПАУ и атразина. Проведенный анализ ДМНК-компонент показывает его полезность для выявления характера взаимосвязи между прогнозируемыми свойствами и дескрипторами, обеспечивая дополнительны? источник информации о физической сущности исследуемых процессов.

Таблица 1!

Характеристики прогностической и описательной способности моделей (С?2 и Я2),

рассчитанных по методами ДМНК и РГК

Токсикант св-во ДМНК РГК

Р2 Я2 Число дескрип. Число компонент д2 Я2 Число дескрип. Число компонент

Нё(И) lgKpc.ii 0.98 1.00 14 11 0.80 0.89 5 4

№н8с 0.38 0.52 8 1 0.39 0.44 4 2

0.24 0.60 7 2 0.30 0.41 7 4

Ру Кос 0.86 0.94 9 4 0.86 0.93 8 6

Кос° 0.78 0.85 4 2 0.80 0.82 12 3

№ Кос 0.85 0.92 8 3 0.86 0.92 7 6

Кос 0.50 0.61 2 1 0.53 0.61 11 3

Ап Кос 0.58 0.66 2 2 0.58 0.65 8 3

Кос 0.84 0.89 12 2 0.82 0.85 14 4

Атразин Кос 0.83 0.90 4 1 0.86 0.92 5 4

Кос 0.57 0.73 9 2 0.60 0.71 15 5

В тоже время анализ компонент показал, что многие дескрипторы входят во все <омпоненты с малыми коэффициентами. Это может свидетельствовать об избыточности исходного набора, что приводит к информационному шуму. По-видимому, данной тричиной обусловлены и низкие значения С?2, полученные для РГК- и ДМНК-моделей. Указанную проблему решали путем пошагового исключения дескрипторов. Характеристики лучших моделей приведены в табл. 15.

Введение описанной процедуры позволило существенно улучшить качество рассчитываемых РГК- и ДМНК-моделей, хотя в среднем оно оставалось хуже, чем для МР-моделей. Анализ частоты встречаемости дескрипторов, вошедших в 22 лучшие модели, позволил выявить наибольшую значимость дескрипторов углеводной части, юлидисперсности, содержания Н и N. Полученный ряд дескрипторов весьма близок найденному ранее из результатов классификаций.

Таким образом, проведенный комплекс исследований позволил разработать методические подходы к прогнозированию свойств гумусовых кислот с использованием эбширного набора дескрипторов состава. Получен набор прогностических моделей 'строение - связывающие/детоксицирующие свойства" гумусовых кислот по отношению к ПАУ, атразину и 1^(11). Тем самым дан утвердительный ответ о юзможности прогноза свойств органических объектов стохастического характера при «пользовании интегральных дескрипторов состава для численного описания их отроения.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана общая методология анализа гумусовых кислот и численного описания из строения в терминах состава (трактуемого в самом широком смысле - элементного структурно-группового, молекулярно-массового) с помощью дескрипторов удовлетворяющих критериям фундаментальности, воспроизводимости I специфичности. Выдвинут тезис о возможности распространить предпоженньп методологический подход на все органические объекты стохастического характера.

2. Разработано методическое обеспечение для определения элементного, структурно группового и молекулярно-массового состава гумусовых кислот, вюночающе« комплекс соответствующих методик, а также способов и средств (программно« обеспечения) свертки полученной информации для расчета дескрипторов состава. Ь числу авторских разработок принадлежат способ определения элементного состава I расчете на беззольную безводную пробу, выбор количественных условш регистрации 13С ЯМР спектров, ПМР-методика совместного определения водород: скелетных фрагментов и функциональных групп, методика гель хроматографического определения молекулярных масс, включая теоретическо« обоснование выбора образца сравнения, программное обеспечение для обработм гель-хроматографических и спектроскопических данных, позволяющее рассчитыват! дескрипторы состава.

3. На основании систематических исследований, выполненных в рамках единоп методологического подхода, заложена фактологическая основа для разработю классификации гумусовых кислот по закономерностям их химического строения I виде обширного массива дескрипторов элементного, структурно-группового I молекулярно-массового состава, сформированного для представительной выборк! гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава.

4. Решена задача классификации гумусовых кислот по источнику происхождения I фракционному составу с использованием интегральных дескрипторов состава описывающих элементный, фрагментный и молекулярный уровни структурно! организации гумусовых кислот и выявлены дескрипторы состава, обладающш максимальной дискриминирующей способностью по указанным признакам.

5. На основании применения концепции комплексообразования/связывания для описания процессов детоксикации тяжелых металлов и органических экотоксикантов гумусовыми кислотами предложен способ количественной оценки детоксицирующих свойств гумусовых кислот с помощью констант детоксикации.

6. На основании систематических исследований по определению констант устойчивости комплексов (связывания) гумусовых кислот с Н§(11), ПАУ и атразином с использованием аналитических методов и биотестирования сделан вывод о комплексообразовании (связывании) как основном механизме детоксикации ^(Н) и ПАУ гумусовыми кислотами и о принципиально иной природе их детоксицирующего действия по отношению к атразину.

7. Разработаны методические подходы к прогностическому моделированию связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к различным экотоксикантам на основании дескрипторов состава, в рамках которых обоснованы требования к минимальному размеру выборки препаратов, определен наиболее эффективный метод регрессионного анализа, разработано соответствующее программное обеспечение.

Основное содержание работы изложено в статьях:

1. Kudryavtsev A.V., Perminova I.V., Petrosyan V.S. Size-exclusion chromatography descriptors of humic substances. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 407. N 1-2. P. 193-202.

2. Гармаш A.B., Данченко H.H., Перминова И.В. Модель взаимодейстия гумусовы> кислот с ацетатом кальция. 2. Модель комплесообразования. // Вестник МГУ, сер. 't .Химия. 2000. Т. 41. С. 109-115.

3. Жилин Д.М., Перминова И.В., Петросян B.C. Экспресс-методика определения ртутг (II) в присутствии гумусовых кислот. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. С 214-215.

4. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Коннов Д.В., Петросян В.С Количественное определение обменных и скелетных протонов гумусовых кислот < помощью спектроскопии ПМР. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. С. 375380.

5. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Петросян B.C. 2000. Выбор времени задержки импульса для количественной 13С ЯМР спектроскопии гумусовы? кислот. II Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. С. 39-42.

6. Kulikova N.A., Perminova I.V., Lebedeva G.F. Binding constants of humic substances tc atrazine and their relationship to the structure. // Proceedings of the 10th Internationa Meeting of the International Humic Substances Society (IHSS-10), 24-28 July 2000 Toulouse, France, 2000. P. 112-115.

7. Perminova I.V., Kudryavtsev A.V., Frimmel F.H., Abbt-Braun G., Hesse S., Petrosyan V.S Classification of humic substances by the origin on the basis of size exclusior chromatographic descriptors. // Proceedings of the Symposium on the refractory humit substances in the environment (ROSE-II). 1-3 August 2000, Karlsruhe, Germany, 2000 P.28-32.

8. Steinberg C.E.W., Haitzer M., Brueggemann R., Perminova I.V., Yashchenko N.Yu. Petrosyan V.S. Towards a quantitative structure activity relationship (QSAR) of dissolve( humic substances as detoxifying agents in freshwaters. // Int. Rev. Hydrobiol. 2000. V.85 P.253-266.

9. Данченко H.H., Гармаш A.B., Перминова И.В. Моделирование взаимодействш гумусовых кислот с ацетатом кальция: модель ионного обмена. Вестник МГУ, сер. 2 Химия. 1999. Т. 40. С. 183-187.

10. Ященко Н.Ю., Перминова И.В., Петросян B.C., Филиппова Е.М., Фадеев В.В Взаимодействие гумусовых кислот с полиядерными ароматическим! углеводородами: влияние рН и ионной силы. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1999 Т.40. С.188-193.

И. Perminova I.V. Size-exclusion chromatography of humic substances: complexities of dati interpretation attributable to non-size exclusion effects. // Soil Sci. 1999. V.164. N 11 P.834-840.

2. Perminova I.V., Grechishcheva N.Yu., Petrosyan V.S. Relationships between structure and binding affinity of humic substances for polycyclic aromatic hydrocarbons: relevance of molecular descriptors. // Environ. Sci. Technol. 1999. V.33. P.3781-3787.

3. Schmitt-Kopplin Ph., Hertkorn N., Freitag D., Kettrup A., Garmash A.V., Kudryavtsev A.V., Perminova I.V., Petrosyan V.S. Mobility distribution of synthetic and natural polyelectrolytes with capillary zone electrophoresis. // J. AOAC International. 1999. V. 82. P.1594-1603.

i Данченко H.H., Перминова И.В., Гармаш A.B., Кудрявцев А.В. Определение карбоксильной кислотности гумусовых кислот титриметрическими методами. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1998. Т. 39. N 2. С. 127-131.

5. Anisimova М.А., Kulikova N.A., Lebedeva G.F., Perminova I.V. Detoxifying ability of soils and extracted from them humic acids in relation to atrazine. // Proceedings of the 3rd World Congress of the International Soil Science Society. 28-30 August, Montpellie, France, 1998. P. 17-23.

5. Perminova I.V., Frimmel F.H., Kovalevskii D.V., Abbt-Braun G., Kudryavtsev A.V., Hesse S. Depelopment of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances. //Wat. Res. 1998. V.32. P.872-881.

7. Данченко H.II., Перминова И.В., Капланова Т.Г., Петросян B.C. Определение общего содержания гидроксильных групп в нефракционированных гумусовых кислотах. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1997. Т.38. N 2. С.112-114.

3. Куликова Н.А., Перминова И.В., Лебедева Г.Ф., Маторин Д.Н. Влияние органического вещества водной и щелочной вытяжек торфа на фотосинтез растений. // Вестник МГУ, сер. 16 .Биология. 1997. N 2. С.36-41.

Филиппова О.И., Лебедева Г.Ф., Перминова И.В. Взаимосвязь химического состава торфа и его детоксицирующих свойств по отношению к хлорсулфурону. // Вестник МГУ, сер. 17. Почвоведение. 1997. N 4. С.37-41.

). Perminova I.V., Frimmel F., Kovalevsky D.V., Abbt-Braun G., Kudryavtsev A.V., Hesse S. Depelopment of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances. // Water Research. 1998. V. 32. P.872-881.

I. Жилин Д.М., Перминова И.В., Петросян B.C. Исследование взаимодействия гумусовых кислот со ртутыо(Н). // Экологическая химия. 1996. Т.5. N 2. С.131-137.

I. Perminova I.V., Kovalevsky D.V., Yashchenko N.Yu., Danchenko N.N., Kudryavtsev A.V., Zhilin D.M., Petrosyan V.S., Kulikova N.A., Philippova O.I., Lebedeva G.F. Humic substances as natural detoxicants. // Humic substances and organic matter in soil and water environments: characterization, transformations and interactions. Eds.: C.E. Clapp, M.H.B. Hayes, N. Senesi, S.M. Griffith. St. Paul, MN, USA, 1996. P.399-406.

S. Данченко H.H., Перминова И.В., Капланова Т.Г., Петросян B.C. Определение общей кислотности баритовым методом - условия применимости для анализа гумусовых кислот. // Экологическая химия. 1995. Т.4. N 4. С.313-317.

24. Перминова И.В., Ященко Н.Ю., Полынов В.А., Петросян B.C., Венедиктов П. Влияние фульвокислот на токсичность флуорантена и фенантрена в водной среде. Экологическая химия. 1995. Т. 4. N 3. С.234-238.

25. Перминова И.В., Данченко H.H., Ященко Н.Ю., Лебедева Г.Ф., Ковалевский Д. Куликова H.A., Филиппова О.И., Венедиктов П.С., Полынов В.А., Детоксикац тяжелых металлов, полиароматических углеводородов и пестицидов гумусовьи веществами в водах и почвах. // Материалы международного конгресса "Во; экология и технология", Москва., 6-9 сент. 1994. T.IV. С.1136-1143.

26. Perminova I.V., Petrosyan V.S. Marine humic acids in the organic carbon flux in t Bering/Chukchi Seas ecosystems. // Proceedings of the Conference on Carbon Cycling the Boreal Forests and Subarctic Ecosystems. OSU, Corvallis, September 9-13, 1991. E< T.Vinson andT. Kolchugina, 1993. EPA/MR-126546. P.37-42.

27. Першина И.В. Гуминовые кислоты. // Исследование экосистем Берингова Чукотского морей. Вып. 3, С-Петербург: Гидрометиоиздат, 1992. С. 637-641.

28. Pershina, I.V. Humic acids in the Bering and Chukchi Seas ecosystems. // P.A. Nagel (Ei Results of the Third Joint US-USSR Bering&Chukchi Seas Expedition (BERPA( Summer 1988. U.S. Fish and Wildlife Service, Washington, DC, 1992. P. 231-237.

29. Першина И.В., Вермул B.M., Поленова T.B., Иванова E.K. Исследован молекулярно-массового распределения и спектральных параметров фульвокисл природных вод. 1. Фракционирование фульвокислот методом гель-проникающ хроматографии. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1989. Т.30. С.176-182.

30. Першина И.В., Вермул В.М., Поленова Т.В., Иванова Е.К. Исследован молекулярно-массового распределения и спектральных параметров фульвокисл природных вод. 2. Фракционирование фульвокислот и определение коэффициен поглощения фракций. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1989. Т.30. С.277-281.

31. Першина И.В., Вермул В.М., Аброскин А.Г., Поленова Т.В., Иванова Е. Исследование молекулярно-массового распределения и спектральных параметр фульвокислот природных вод. 3. Влияние молекулярно-массового состава флуоресцентные свойства фульвокислот. // Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1989. Т.: С.368-372.

32. Першина* И.В., Попов Д.В., Иванова Е.К., Поленова Т.В. Газохроматографическ определение некоторых фосфорорганических пестицидов в водной среде присутствии фульвокислот. // Журн. аналит. химии. 1989. Т.44. С.1475-1479.

33. Першина И.В, Иванова Е.К. и др. Флуориметрический метод определен фульфокислот в морских водах. //Журн. аналит. химии. 1986. Т.41. С. 1256-1259.

34. Першина И.В., Иванова Е.К., Поленова Т.В. Стандартные образцы д флуориметрического определения фульвокислот. //Журн. аналит. химии. 1986. T.¿ С.2084-2087.

* В настоящее время автор поменяла фамилию Першина на Перминова.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ (ЛИТЕРАТУРНЫЕ ДАННЫЕ).

1.1 Элементный состав гумусовых кислот.

1.1.1 Элементный состав гумусовых кислот различного происхождения.

1.1.2 Методические аспекты элементного анализа гумусовых кислот.

1.2 Структурно-групповой состав гумусовых кислот.

1.2.1 Функциональный состав гумусовых кислот.

1.2.2 Методические аспекты титриметрического анализа гумусовых кислот.

1.2.3 Исследование структурно-группового состава углеродного скелета деструктивными методами анализа.

1.2.4 Исследование структурно-группового состава гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР.

1.3 Структурно-групповой состав гумусовых кислот различного происхождения по данным 13С ЯМР.

1.4 Проблемы количественной 13С ЯМР-спектроскопии гумусовых кислот.

1.5 Спектроскопия ПМР гумусовых кислот.

1.6 Молекулярно-массовый состав гумусовых кислот.

1.6.1 Исследование молекулярно-массового распределения гумусовых кислот методом эксклюзионной хроматографии.

1.6.2 Методические аспекты определения молекулярных масс гумусовых кислот методом эксклюзионной хроматографии.

1.7 Описание строения гумусовых кислот и проблемы классификации.

1.7.1 Использование блок-схем и структурных формул для описания строения гумусовых кислот.

1.7.2 Численное описание строения гумусовых кислот.

1.8 Комплексообразующие и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к тяжелым металлам.

1.8.1 Подходы к описанию стехиометрии взаимодействия гумусовых кислот с тяжелыми металлами.

1.8.2 Установление концентрации металлсвязывающих центров в растворах гумусовых кислот.

1.8.3 Влияние кислотной диссоциации ГФК и ионной силы раствора на константу устойчивости комплексов металл-ГФК.

1.8.4 Методы исследования комплексообразования гумусовых кислот с тяжелыми металлами.

1.8.5 Комплексообразование гумусовых кислот с Нд(Н).

1.8.6 Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к тяжелым металлам методом биотестирования.

1.9 Связывающие и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к органическим экотоксикантам.

1.9.1 Связывание органических экотоксикантов гумусовыми кислотами.

1.9.2 Методические аспекты определения констант связывания органических экотоксикантов гумусовыми кислотами.

1.9.3 Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к органическим экотоксикантам.

ГЛАВА 2.ФОРМИРОВАНИЕ ВЫБОРОК ПРЕПАРАТОВ

ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.

2.1 Выделение препаратов гумусовых кислот из природных объектов.

2.2 Описание использованных в работе препаратов.

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА

ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.

3.1 Определение элементного состава препаратов гумусовых кислот в расчете на беззольную безводную пробу

3.1.1 Определение СНЫ, Эй О.

3.1.2 Определение влажности.

3.1.3 Определение общей зольности и состава зольных элементов.

3.1.4 Схема обработки данных элементного анализа для расчета элементного состава гумусовых кислот.

3.2 Элементный состав препаратов гумусовых кислот, использованных в работе.

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНО-ГРУППОВОГО

СОСТАВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.

4.1 Одномерная спектроскопия ЯМР 13С и ПМР.

4.1.1 Качественная характеристика 13С ЯМР- и ПМР-спектров гумусовых кислот.

4.1.2 Выбор условий регистрации количественных 13С ЯМР-спектров гумусовых кислот.

4.1.3 Структурно-групповой состав исследованных препаратов гумусовых кислот по данным 13С ЯМР.

4.1.4 ПМР-определение водорода в составе скелетных фрагментов и функциональных групп гумусовых кислот.

4.1.5 Структурно-групповой состав исследованных препаратов гумусовых кислот по данным ПМР.

4.1.6 Определение кислотных групп гумусовых кислот титриметрическими методами. 140 V

4.1.7 Сопоставление результатов определения кислотных групп методами ПМР-спектроскопии и титриметрии.

4.1.8 Расчет фрагментного состава и его применение для характеристики закономерностей строения гумусовых кислот

4.2 Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР на ядрах Н и

4.2.1 Общая характеристика использованных в работе двумерных зомо- и гетероядерных ЯМР-экспериментов.

4.2.2 'Н. Н СО БУ-спектры.

4.2.3 'Н.'Н ТОСвУ спектры.

4.2.41Н,13С НБОС спектры.

4.2.5 Сравнительный анализ результатов двумерных ЯМРэкспериментов.

4.3 Определение структурно-группового состава негидролизуемой и гидролизуемой части гумусовых кислот.

4.3.1 Одномерная спектроскопия ЯМР 13С.

4.3.2 Двумерная спектроскопия ЯМР на ядрах 1Н и 13С.

4.3.3 Определение углеводного состава гидролизуемой части гумусовых кислот методом ВЭЖХ.

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО

СОСТАВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.

5.1 Выбор оптимальных условий анализа.

5.2 Обоснование выбора образца сравнения для определения молекулярных масс гумусовых кислот.

5.3 Характеристика молекулярно-массового состава исследованных препаратов гумусовых кислот.

ГЛАВА 6. КЛАССИФИКАЦИЯ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ ПО

ПРОИСХОЖДЕНИЮ И ФРАКЦИОННОМУ СОСТАВУ.

6.1 Характеристика полученного массива данных.

6.2 Классификация с использованием интегральных дескрипторов состава.

6.3 Классификация с использованием расширенного набора дескрипторов молекулярно-массового состава.

6.3.1 Классификация по методу К-ближайших соседей.

6.3.2 Классификация с использованием нейросетей.

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАЮЩИХ И

ДЕТОКСИЦИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.

7.1 Исследование комплексообразующих свойств гумусовых кислот по отношению к Нд(И).

7.1.1 Определение содержания ртуть-связывающих центров в гумусовых кислотах.

7.1.2 Определение кажущихся констант устойчивости комплексов гумусовых кислот с Нд(11).

7.2 Исследование связывающих свойств гумусовых кислот по отношению ПАУ и атразину.

7.2.1 Определение констант связывания гумусовых кислот с ПАУ.

7.2.2 Определение констант связывания пирена гидролизованными препаратами гумусовых кислот.

7.2.3 Зависимость констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами от рН и ионной силы среды.

7.2.4 Определение констант связывания гумусовых кислот с атразином.

7.3 Концепция константы детоксикации как количественной характеристики детоксицирующих свойств гумусовых кислот.

7.4 Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к Hg(ll).

7.4.1 Выбор условий биотестирования для изучения детоксикации

Hg(II) гумусовыми кислотами.

7.4.2 Определение констант детоксикации Hg(ll) гумусовыми кислотами.

7.5 Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к ПАУ.

7.5.1 Выбор условий биотестирования для изучения детоксикации ПАУ гумусовыми кислотами.

7.5.2 Определение констант детоксикации ПАУ гумусовыми кислотами.

7.5.3 Сравнение связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к ПАУ.

7.6 Исследование детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к атразину.

7.6.1 Выбор условий биотестирования для изучения детоксикации атразина гумусовыми кислотами.

7.6.2 Определение констант детоксикации атразина гумусовыми кислотами.

7.6.3 Сравнение связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к атразину.

ГЛАВА 8. ПРОГНОЗ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕСКРИПТОРОВ СОСТАВА.

8.1 Корреляционная взаимосвязь дескрипторов состава и прогнозируемых свойств.

8.2 Прогностические модели, полученные методом множественной регрессии.

8.3 Прогностические модели, полученные методами многокомпонентного анализа.

Одним из интенсивно развивающихся направлений современной аналитической химии является анализ сложных органических матриц -продуктов жизнедеятельности и распада живых организмов. Важным представителем таких объектов являются гуминовые вещества (от латинского "humus" - земля, почва). Они составляют один из самых обширных резервуаров органического углерода, образуясь в результате распада отмерших организмов. Спецификой гуминовых веществ является стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в результате естественного отбора устойчивых структур. Как следствие, к фундаментальным свойствам гуминовых веществ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. Тем самым для них понятие молекулы трансформируется в молекулярный ансамбль, каждый параметр которого описывается распределением. Поэтому к ним неприменим и традиционный способ численного описания строения органических соединений, характеризующий количество атомов в молекуле, число и типы связей между ними.

Отсутствие методологических подходов к анализу органических объектов стохастического характера и численному описанию их строения привело к тому, что несмотря на двухсотлетнюю историю изучения, определение класса гуминовых веществ до сих пор базируется на способе извлечения из природных объектов (темноокрашенные, азотсодержащие высокомолекулярные соединения, извлекаемые водными растворами щелочей из почв и каустобиолитов: торфа, угля и др.), а их общепринятая классификация - на процедуре фракционирования. Так, гуминовые вещества подразделяют на гумин (нерастворим во всем диапазоне рН), гуминовые кислоты (нерастворимы при рН<2) и фулъвокислоты (растворимы во всем диапазоне рН). Последние два класса объединяют под общим названием гумусовые кислоты.

Указанная ситуация определяет актуальность постановки систематических исследований по изучению строения гуминовых веществ, результаты которых могли бы служить основой для создания классификации по закономерностям их химического строения. Получение соответствующих данных возможно только на основании методологических подходов, которые бы учитывали специфику анализа объектов стохастического характера: отсутствие адекватных образцов сравнения и суммарный вклад, погрешности метода, процедуры выделения и естественной изменчивости источника в воспроизводимость результатов анализа. Кроме того, необходима адаптация методик к полидисперсности и гетерогенности объекта. Методологического обоснования требует и численное описание строения гуминовых веществ, необходимое для определения классификационных признаков и прогностического моделирования свойств. Особо актуальным является предсказание макролигандных свойств гумусовых кислот, благодаря которым они играют важнейшую роль в процессах самоочищения водных и почвенных экосистем, связывая как ионы тяжелых металлов, так и органические экотоксиканты. Умение предсказывать связывающие свойства гумусовых кислот будет способствовать их направленному использованию в качестве детоксицирующих агентов для рекультивации загрязненных сред.

Указанные подходы не могли сложиться в рамках предыдущего этапа развития анализа гуминовых веществ - в исследованиях "от вещества", для которых метод служил средством достижения другой главной цели получения новых сведений о веществе. Такая расстановка приоритетов была абсолютно оправданной в условиях весьма ограниченных знаний о природе объекта и способствовала их скорейшему накоплению усилиями целой плеяды блестящих ученых - М. Шнитцера (Канада), Д.С. Орлова (Россия), М. Вильсона (Австралия), Р. Малколма и П. МакКарти (США) и др. Однако постановка данных проблем весьма актуальна и полностью отвечает потребностям современного этапа развития анализа гуминовых веществ, который знаменуется сменой парадигмы "анализ от вещества" на "анализ от метода" (расширение сферы применения метода путем введения нового объекта). Это связано с существенно возросшим интересом к сложным многокомпонентным объектам со стороны химиков-аналитиков как следствие развития компьютерной техники, сделавшего доступным широкое применение статистических методов для интерпретации результатов анализа сложных систем.

Цель настоящей работы состояла в разработке общей методологии анализа гумусовых кислот и численного описания их строения, позволяющего определять классификационные признаки таких объектов и моделировать их свойства.

В работе были поставлены следующие основные задачи:

• создать представительную выборку препаратов гумусовых кислот с широким разнообразием состава и свойств, адекватную стохастическому характеру объекта;

• адаптировать существующие или разработать новые методики анализа для получения достоверных данных о составе гумусовых кислот при отсутствии адекватных образцов сравнения;

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана общая методология анализа гумусовых кислот и численного описания их строения в терминах состава (трактуемого в самом широком смысле - элементного, структурно-группового, молекулярно-массового) с помощью дескрипторов, удовлетворяющих критериям фундаментальности, воспроизводимости и специфичности. Выдвинут тезис о возможности распространить предложенный методологический подход на все органические объекты стохастического характера.

2. Разработано методическое обеспечение для определения элементного, структурно-группового и молекулярно-массового состава гумусовых кислот, включающее комплекс соответствующих методик, а также способов и средств (программное обеспечения) свертки полученной информации для расчета дескрипторов состава. К числу авторских разработок принадлежат способ определения элементного состава в расчете на беззольную безводную пробу, выбор количественных условий регистрации 13С ЯМР спектров, ПМР-методика совместного определения водорода скелетных фрагментов и функциональных групп, теоретическое обоснование выбора полидекстранов в качестве образца сравнения для определения молекулярных масс, программное обеспечение для обработки гель-хроматографических и спектроскопических данных, позволяющее рассчитывать дескрипторы состава.

3. На основании систематических исследований, выполненных в рамках единого методологического подхода, заложена фактологическая основа для разработки классификации гумусовых кислот по закономерностям их химического строения в виде обширного массива дескрипторов элементного, структурно-группового и молекулярно-массового состава, сформированного для представительной выборки гумусовых кислот различного происхождения и фракционного состава.

4. Решена задача классификации гумусовых кислот по источнику происхождения и фракционному составу путем использования интегральных дескрипторов состава, описывающих элементный, фрагментный и молекулярный уровни структурной организации органических объектов и выявлены дескрипторы состава, обладающие максимальной дискриминирующей способностью по указанным признакам.

299

5. На основании применения концепции комплексообразования/связывания для описания процессов детоксикации тяжелых металлов и органических экотоксикантов гумусовыми кислотами предложен способ количественной оценки детоксицирующих свойств гумусовых кислот с помощью констант детоксикации.

6. На основании систематических исследований по определению констант устойчивости комплексов (связывания) гумусовых кислот с Н§(П), ПАУ и атразином с использованием аналитических методов и биотестирования сделан вывод о комплексообразовании (связывании) как основном механизме детоксикации Щ(П) и ПАУ гумусовыми кислотами и о принципиально иной природе их детоксицирующего действия по отношению к атразину.

7. Разработаны методические подходы к прогностическому моделированию связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к различным экотоксикантам на основании дескрипторов состава, в рамках которых обоснованы требования к минимальному размеру выборки препаратов, определен наиболее эффективный метод регрессионного анализа, разработано соответствующее программное обеспечение.

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

Автор выражает самую глубокую и искреннюю признательность своим ученикам, соратникам и единомышленникам, чей труд и вдохновение легли в основу этой работы: H.A. Куликовой и A.B. Кудрявцеву, взявшим на себя титанический труд по подготовке диссертации к печати; Д.В. Ковалевскому и Д.М. Жилину, принявшим активное участие в обсуждении и рецензирование глав диссертации, а также Н.Ю. Гречищевой, H.H. Данченко и М.А. Анисимовой. Самая глубокая признательность B.C. Петросяну - за постоянный интерес к работе и дарованную свободу творчества; A.B. Гармашу и А.Б. Пермину - за неоценимый вклад в формирование теоретического фундамента данной тематики; Г.Ф. Лебедевой - за радость совместного творчества и взаимопонимание; Д-Н. Маторину, П.В. Бенедиктову, В.В. Фадееву, Е.М. Филипповой и A.A. Понизовскому - за многолетнее плодотворное сотрудничество; Ф. Фриммелю, Г.Аббт-Браун и С. Хессе - за сотрудничество и помощь в работе; Ю.А. Устынюку - за несгибаемую поддержку "супрамолекулярной химии"; Г.Н. Коваль - за дружбу и неоценимую помощь в создании базы данных по литературе; Норберту Херткорну и Филиппу Шмитт-Копплину - за дружбу, сотрудничество и преданность общей научной идее; В.М. Бограду, нашему доброму гению, - за живое и деятельное участие в практическом осуществлении наших мечтаний; Е.К. Ивановой, Т.В. Поленовой и С.М. Черняку, моим первым научным руководителям, за науку о гумусовых кислотах; Е.Д. Гопиус, C.B. Пономареву, П.И. Демьянову, Л.Г. Сагиновой, И.Д. Ильиной — моим коллегам, за искренний интерес к нашей работе; Матвею Юдову, Володе Холодову, Ане Царьковй, Грише Филонову и Тане Беловой, моим студентам и аспирантам, - за неустанный труд; моим друзьям, родным и близким - за веру, помощь и долготерпение, а также всем, кто своим советом, интересом и дружеским участием способствовал воплощению данной работы.

Глубочайшая и искренняя благодарность академику Ю.А. Золотову, позволившему вовлечь себя в дискуссию о гумусовых кислотах.

Автор выражает также признательность организациям, оказавшим финансовую поддержку при выполнении данной работы:

Российскому Фонду Фундаментальных Исследований (гранты №96-0449838 и №98-03-33186а); Фонду Сороса (гранты NBN000 и NBN300); DAAD (грант 1996 г. на участие в 30 Международном Семинаре при Университете Карлсруэ, ФРГ), INTAS (грант INTAS-1997 №1129); BMBF (грант RUS-143/97),

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вьшолненный комплекс исследований по анализу, классификации и прогнозу свойств гумусовых кислот позволил продемонстрировать масштабность и нетривиальность проблем, возникающих при применении количественных подходов к описанию строения и свойств объектов стохастического характера.

В своей работе в поисках способа численного описания строения гумусовых кислот мы остановились на комплексе интегральных (характеризующих вещество в целом) дескрипторов состава, отвечающих трем иерархическим уровням структурной организации органических соединений: элементному, фрагментному и молекулярному. При этом использование интегральных дескрипторов состава преследовало цель обеспечить фундаментальность (общность) характеризуемого признака и воспроизводимость соответствующего параметра, а их комплекса -повысить уровень специфичности описания строения в терминах состава. Предполагалось, что определяя такие дескрипторы с помощью соответствующих методов анализа, удастся решать задачи классификации и прогноза свойств гумусовых кислот.

Реализации данного подхода на практике предшествовало формирование представительной выборки препаратов с широким разнообразием строения и свойств. Для данной выборки необходимо было провести комплекс определений элементного, структурно-группового и молекулярно-массового состава в условиях, обеспечивающих достоверность информации о распределении интегрального признака как части от целого (содержание элементов от общей массы препарата, содержание углерода или водорода в основных фрагментах от общего). Предстояло также количественно охарактеризовать свойства, наиболее актуальные с позиций практической значимости получаемых прогностических моделей, что обусловило выбор связывающих и детоксицирующих свойств.

Получение необходимой аналитической информации потребовало привлечения широкого спектра физико-химических методов. Комплексный анализ гумусовых кислот в рамках единого методологического подхода (требование интегральности к получаемым дескрипторам) и с использованием представительной выборки препаратов позволил осуществить верификацию данных о составе гумусовых кислот, получаемых разными методами. В результате был выявлен целый ряд нерешенных методических проблем, обусловленных стохастическим характером объекта, что потребовало существенной модификации существующих или создания новых методик анализа. Получению количественных характеристик связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот также предшествовал этап выбора и оптимизации соответствующих методик. Применение концепции связывания/комплексообразования для описания процесса детоксикации экотоксикантов гумусовыми кислотами позволило использовать единый интерпретационньгй аппарат - расчет констант связывания и детоксикации -для оценки связывающих и детоксицирующих свойств гумусовых кислот.

Применение созданного массива интегральных дескрипторов оказалось весьма эффективным для решения задач классификации гумусовых кислот по происхождению и фракционному составу. При этом максимальной дискриминирующей способностью обладали комплексы дескрипторов разных уровней структурной организации (элементного и молекулярного, элементного и фрагментного), тогда как среди дескрипторов одного уровня самой высокой дискриминирующей способностью обладали дескрипторы молекулярно-массового состава. Полученные результаты позволили продемонстрировать эффективность предложенного подхода к численному описанию строения гумусовых кислот для решения задач классификации по происхождению и фракционному составу.

Однако вскрылись его существенные ограничения при использовании для прогностического моделирования свойств. Это может быть обусловлено отсутствием тесной взаимосвязи между дескрипторами состава и прогнозируемыми свойствами, а также существенным влиянием экспериментальных погрешностей на определяемые значения дескрипторов и прогнозируемых свойств. Данные факторы приводят к снижению прогностической способности рассчитываемых моделей. Поэтому необходимо

298

1. Аммосова Я.М., Балаганская Е.Д.//Почвоведение. 1991. Т. 7, С. 29-39.

2. Анисимова М.А, Перминова И.В., Лебедева Г.Ф.//Почвоведение. 1998. Т. 9. С. 1079-1084.

3. Беленький Б.Г., Виленчик Л.З. Хроматография полимеров. М.: Химия, 1978. 343 с.

4. Бобырь Л.Ф./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск: Изд-во ДСХИ, 1980. Т. 7. С.54-63.

5. Бугаевский A.A. и Холин Ю.В.//Вестник Харьковского Университета. Харьков. ХГУ. 1989. Т. 340, С. 85.

6. Булгакова М.П., Приходько Л.А.//Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск: Изд-во ДСХИ, 1983. Т. 9. С. 15-18.

7. Варшал Г.М., Бугаевский A.A., Холин Ю.В.//Химия и технология воды. 1990. Т. 12. № п. С. 979-986.

8. Варшал Г.М., Буачидзе Н.С.//Ж. аналит. химии. 1983. Т. 38. № 12. С. 2155-2167.

9. Варшал Г.М., Велюханова Т.К., Кощеева И.Я./Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. С. 97-116.

10. Варшал Г.М., Велюханова Т.К., Сироткина И.С.//Гидрохим. материалы. 1973. Т. 59. С. 143-151.

11. Варшал Г.М., Инцкирвели Л.Н., Сироткина И.С., Колосов И.В.//Геохимия. 1975. Т. 10. С. 1581-1584.

12. Варшал Г.М., Махарадзе Г.А., Велюханова Т.К, Супаташвили Г.Д. /Химический анализ морских осадков. М.: Наука, 1980. С. 168-175.

13. Варшал Г.М., Кощеева И.Я., Сироткина И.С.//Геохимия. 1979. Т. 4. С. 598-607.

14. Вишнякова О.В., Егорова P.A., Чимитдоржиева Г.Д./II съезд почвоведов (С-Петербург, 1996). Тез. докл. Т. 1. С. 150-151.

15. Гармаш A.B., Данченко H.H., Перминова И.В.// Вестник МГУ. Сер. 2 Химия. 2000. Т. 41. С. 109-115.

16. Гончарова Т.О., Кужекова Н.И., Титькова E.H., Капоин В.Т.//Гидрохим. материалы. Т. 48. С. 103-111.

17. Горбань А.Н. Обучение нейронных сетей. М.:ParaGraph, 1990. 160 с.

18. Горбань А.Н., Россиев Д.А. Нейронные сети на персональном компьютере. Новосибирск:Наука, 1996. 276 с.

19. Григорьева Е.А., Кухаренко Т.А./Методы анализа и контроля производства в химической промышленности. М:Накуа, 1968. Т. 13, С. 10.

20. Данченко H.H. Функциональный состав гумусовых кислот, определение и взаимосвязь с реакционной способностью. Дисс. канд. хим. наук. М.:МГУ, 1997. 138 с.

21. Данченко H.H., Перминова И.В., Капланова Т.Г., Петросян B.C.//. Экологическая химия. 1995. Т. 4. № 4. С. 313-317.

22. Данченко H.H., Перминова И.В., Гармаш A.B., Кудрявцев А.В.//Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1998. Т. 39. № 2. С. 127-131.

23. Данченко H.H., Гармаш A.B., Перминова И.В.// Вестник МГУ/ Сер. 2 Химия/ 1999. Т. 40. С. 183-187.

24. Дмитриев Е.А. Математическая статистика в почвоведении. М.:МГУ, 1995. 320 с.

25. Драгунов С.С.//Труды почв. инст. им. Докучаева. 1951. Т. 38. С. 86-98.

26. Едигарова И.А., Красюков В.Н., Лапин И. А., Никаноров А.М.//Водн. рес. 1989. №4. С. 122-129.

27. Жилин Д.М., Перминова И.В.//Природа. 2000. №11. С. 43-50.

28. Жилин Д.М., Перминова И.В., Петросян В.С.//Ж. экологич. химии. 1996. Т. 5. №2. С.131-137.

29. Жилин Д.М., Перминова И.В., Петросян В.С.//Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41 № 3. С. 214-215.

30. Захаренко В.А.//Гербициды. М. Агрономия, 1990. 238 с.

31. Зырин Н.Г., Обуховская Т.Д.//Агрохимия. 1980. Т7. С. 126-138.

32. Зырин Н.Г., Овчинникова М.Ф., Орлов Д.С.//Агрохимия. 1964. Т.4. С. 168-172.

33. Карпухин А.И., Фокин А.Д./Особенности почвенных процессов дерново-подзолистых почв. М.:Наука. 1977. С. 102-114.

34. Кауричев И.С., Карпухин А.И., Степанова Л.П./Особенности почвенных процессов дерново-подзолистых почв. М.:Наука, 1977. С. 5-21.

35. Кирсо У.Э., Стом Д.П., Белых Л.И., Ирха Н.И. Превращение канцерогенных веществ в гидросфере. Таллин: Валгус, 1988. 214 с.

36. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Коннов Д.В., Петросян B.C.// Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 40. С. 375-380.

37. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Петросян B.C. //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. С. 39-42.

38. Когут Б.М. Трансформация гумусового состояния черноземов при их сельскохозяйственном использовании. Автореф. дисс. докт. с.-х. наук. М., 1996.

39. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф.//Труды Тюменского СХИ. 1970. Т. 14. С. 131.

40. Коршун М. О. и Гельман Н.Э./Новые методы элементного анализа. М -Л.:Госхимиздат, 1949. С. 19-25.

41. Кулик А.Ф., Горовая А.И./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск: Изд-во ДСХИ, 1980. Т. 7. С. 151-158.

42. Куликова Н.А., Перминова И.В., Лебедева Г.Ф., Маторин Д.Н.//Вестник МГУ, сер. 16. Биология. 1997. №2. С. 36-41.

43. Кумок В.Н. Закономерности в устойчивости координационных соединений в растворах. Томск: Изд-во Томского Ун-та, 1977. 229с.

44. Кухаренко Т.А./ Гуминовые вещества в биосфере. М.:Наука, 1993. С. 28-35.

45. Кухаренко Т.А.//Ж. аналит. химии. 1948. Т. 3. С. 181-185.

46. Кухаренко Т.А., Бороздина Л.А.//Коллоидн. Ж. 1949 Т. 11 № 4. С. 244-250.

47. Кухаренко Т.А.//Ж. аналит. химии, 1948, Т. 3. № 3, С. 181-185.

48. Кухаренко Т.А.//Химия тверд, топл. 1937. Т. 8. №. 9. С. 803-813.

49. Кухаренко Т.А.//Химия тверд, топл. 1937. Т. 8. №. 12. С. 1064-1072.

50. Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса природного органического сырья и продуктов его переработки. Дисс. докт. хим. наук. Иркутск: ИГУ, 1997. 267с.

51. Лапин И.А., Красюков В.Н.//Водн. рес. 1991. Т 3. С. 195-199.

52. Лебедева Г.Ф. Экологические аспекты применения гербицидов. М.: МГУ, 1990. 208 с.

53. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Л.:Гидрометеоиздат, 1986. 268 с.

54. Логинов Л.Ф. и Комиссаров И.Д.// Гуминовые препараты. Тюменский с-х ин-т. Научные труды. 1971. Т. 14. С. 266.

55. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.:Химия, 1989. 448 с.

56. Махарадзе Г.А., Варшал Г.М., Супаташвили Г.Д.//Сообщ. АН Груз. ССР. 1982. Т. 106. №3. С. 517-520.

57. Методы количественного органического элементного микроанализа. /Под ред. Гельман Н.Э. М.:Химия, 1987. 225 с.

58. Михайленко В.И., Михальчук В.В.//Ж. прикл. спектр. 1987. Т 46. № 4. С. 535-543.

59. Назарова А.В.//Науч. труды Ленингр. с-х ин-та. 1978. Т. 354. С. 35-42.

60. Овчинникова М.Ф. Химия гербицидов в почве. М.: МГУ, 1987. 109 с.

61. Онуфриенок И.П.,Солодовникова Р.С.//Труды Томск, ун-та. 1961. Т. 170. С. 163-169.

62. Орлов Д. С./Гуминовые вещества в биосфере. М.:Наука, 1993. С. 16-27.

63. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.:МГУ, 1990. 325 с.

64. Орлов Д.С., Гришина Jl.А. Практикум по химии гумуса. М.:МГУ, 1981. С. 119-126.

65. Орлов Д.С., Садовникова Л.К., Саврова А.Л.//Докл. РАН, сер. "Геохимия". 1995. Т. 345. №4. С. 1-3.

66. Орлов Д.С. Химия почв. М.:МГУ, 1992. 259 с.

67. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.:Мир, 1972. 510 с.

68. Перминова И.В., Данченко H.H., Ященко Н.Ю., Ковалевский Д.В., Куликова H.A., Жилин Д.М., Лебедева Г.Ф., Филиппова О.М./Вода: экология и технология. Материалы междунар. конгр. (Москва, 1994). Т.4, С. 1136-1143.

69. Перминова И.В., Ященко Н.Ю., Полынов В.А., Маторин Д.Н., Петросян В.С.//Ж. экологии, химии. 1995. Т. 4. № 3. С. 234-238.

70. Першина И.В., Вермул В.М., Поленова Т.В., Иванова Е.К.//Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1989. Т. 30. С. 176-182.

71. Першина И.В., Вермул В.М., Поленова Т.В. и Иванова Е.К.// Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1989. Т. 30. С. 277-281.

72. Полынов В.А. Разработка и примененние флуоресцентных методов биотестирования токсичности природных и сточных вод. Дисс. канд. биол. наук, М.:МГУ, 1992.

73. Потапов В.М., Татаринчик С.Н. Органическая химия. М.:Химия, 1976. С. 381.

74. Приходько Л.А., Горовая А.И., Глоба М.П., Кулик А.Ф./Гуминовыеisудобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск. Изд-во ДСХИ, 1968. Т. 7. С. 243-245.

75. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. Л.:Химия, 1977. 325 с.

76. Рузавин Г.И. Методология научного исследования. М.: ЮНИТИ-ДАНА, 1999. 317 с.

77. Сиггиа С., Ханна Дж.Г. Количественный органический анализ по функциональным группам. М.:Химия, 1983. С. 132-135.

78. Сироткина И.С., Варшал Г.М., Лурье Ю.Ю., Степанова Н.П.//Ж. аналит. химии. 1974. Т. 29. № 8. С. 1626-1632.

79. Сироткина И.С., Загудаева Н.С., Варшал Г.М.//Гидрохим. материалы, 1973. №57. С. 153-163.

80. Скуг Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. Т. 1. М.:Мир, 1979. С. 425-432.

81. Смирнов М.Б., Крапивин A.M. /Методы исследования состава органических соединений нефти и битумоидов. 1985. С. 138-181.

82. Соколов М.С., Галиулин Р.В. Микробиологическое самоочищение почвы от пестицидов. М.Наука, 1987. 137 с.

83. Справочник помощника санитарного врача и помощника эпидемиолога. М.: Медицина, 1990. 590 с.

84. Степанова И.К., Комов В.Т.//Экология. 1996. Т. 3. С. 198-202.

85. Стадников Г.Л., Сысков К.И., Ушакова А.А.//Химия тверд, топл. 1934. Т. 7. №6. С. 581-589.

86. Сысков К.И., Кухаренко Т.А.//Зав. лаб. 1947. Т. 13. № 1. С. 25-28.

87. Сысков К.И.//Химия тверд, топл. 1936. Т. 7. № 6. С. 566-574.

88. Ткаченко Л.К., Филиппова Т.В., Горовая А.И./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск: Изд-во ДСХИ, 1977. Т. 6. С. 31-45.

89. Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров. М.'Химия, 1965. С. 25.

90. Фокин А.Д, Бобырь Л.Ф., Епишина Л.Е./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1975. Т. 5. С. 115-117.

91. Фокин А.Д., Карпухин А.И.//Изв. ТСХА. 1972. Т. 132. № 1. С. 19-21.

92. Фритц Дж., Шенк Г. Количественный анализ. М.:Мир, 1978. 227 с.

93. Христева Л.А., Горовая А.И. A.c. 460037 СССР, 1974.

94. Христева Л.А., Старостин А.Н., Улитина В.П./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1968. Т. 3. С. 136-142.

95. Христева Л.А./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1962. Т. 2. С. 123-129.

96. Христева Л.А./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1968. Т. 3. С. 13-27.

97. Христева Л.А./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1973. Т. 4. С. 5-23.

98. Христева Л.А./Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск:Изд-во ДСХИ, 1977. Т. 6, С. 25-27.

99. Христева Л.А.//Труды почв, ин-та им. В.В.Докучаева АН СССР. 1951. Т. 38. С. 108-184.

100. Цуканова В.М., Тихомолова К.П.//Колл. Ж. 1996. Т.58. №5. С.705-712.

101. Ященко Н.Ю, Перминова И.В., Петросян B.C., Филиппова Е.М., Фадеев В.В.//Вестник МГУ, сер. 2. Химия. 1999 Т. 40. С. 188-193.

102. Abbt-Braun G., Schmiedel U., Frimmel F.H.//Vom Wasser. 1990. Bd. 75. S. 59-73.

103. Ahard F.//Grell's Chem. Ann. 1786. Bd. 2. S. 391.

104. Aiken G.R. and Gillam А.Н./ Humic Substances II. In search of structure. NY:John Wiley&Sons, 1989. P. 516-543.

105. Allard В., Arsénié I.//Water, Air and Soil Pollut. 1991. V. 56. P. 457-464.

106. Ashley J.T.F.//Chemosphere. 1996. V. 33, No. 11, P. 2175-2187.

107. Bakhus D.A., Gschwend P.M.//Environ. Sei. Techno!. 1990. V. 24. P. 1214-1223.

108. Barton D.H.R., Schnitzer M.//Nature. 1963. V. 198. No. 4876. P. 217-218.

109. Bender M.E., Matson W.R., Jordan S.A.//Environ. Sei. Technol. 1970. V. 4. No. 6. P. 520.

110. Benedetti M.F., Riemsdijk W.H., Koopal Luuk K.//Geochim. Cosmocim. Acta. 1996. V. 60. No. 14. P. 2503-2513.

111. Berg C.M.G., Kramer J.R.//Anal. Chim. Acta. 1979. V. 106. P. 113-120.

112. Beyer L.//Z. Pflanzenernaehr. Bodenk. 1996. B. 159. S. 527-539.

113. Black M.C., McCarthy J.F.//Environ. Toxicol. Chem. 1988. V. 7. P. 593-600.

114. Bollag, J.-M., K. Mayers//Sci. Total Environ. 1992. V. 117/118. P. 357-366.

115. Bonn B.A., Fish W.//Environ. Sei. Technol. 1991. V. 25. P. 232.

116. Bowles E.C., Antweiler R.C., MacCarthy P./Humic substances in the Suwannee River, Georgia: interactions, properties and proposed structures. U.S. Geological Survey Water-Supply Paper. P. 90

117. Bresnahan W.T., Grant C.L., Weber J.H.//Anal. Chem. 1978. V. 50. No. 12. P. 1675-1679.

118. Brooks J.D., Sternhell S.//Austr. J. Appl. Sei. 1957. V. 8. P. 206-221.

119. Brown D.C., Flagg E.W. //J. Environ. Qual. 1981. V. 10. P. 382-386.

120. Buchwalter D.B., Linder G., Curtis L.R.//Environ. Toxicol. Chem. 1996. V. 15. No. 4. P. 568-573.

121. Buddras J., Burba P., Herzog H., Lambert J.//Anal. Chem. 1998. P. 628-631.

122. Buffle J., Delodoey M.D., Haerdi L.//Anal. Chim. Acta. 1978. V. 101. P. 339344.

123. Carlberg G.E., Martinsen K.//Sci. Total Environ. 1982. V. 25. P. 245-254.

124. Carter C.W., Suffet I.H.//Environ. Sei. Technol. 1982. V. 16. P. 735-740.

125. Celis R., Cornejo J., Hermosin M.C., Koskinen W.C.//Soil Sei. Soc. Amer. J. 1997. V. 61. P. 436-443.

126. Chaney K., Swift R.S.//J. Soil Sei. 1984. V. 35. P. 223-230.

127. Chen S., Inskeep, W.P., Williams S.A., Callis P.R.//Environ. Sei. Technol. 1994. V. 28. P. 1582-1588.

128. Cheshire M.V. Nature and origin of carbohydrates in soils. London: Academic press, 1970. 323 p.

129. Chin Yu.-P., Gschwend P.M.//Environ. Sei. Technol. 1992. V. 26. P. 16211626.

130. Chin Yu.-P., Aiken G., and O'Loughlin E.//Environ. Sei. Technol. 1994. V. 28. P. 1853-1858.

131. Chiou C.T., Kile D.E., Brinton T.I., Malcolm R.L.//Environ. Sei. Technol. 1987. V. 21. P. 1231-1234.

132. Chiou C.T., Malcolm R.L., Brinton T.I., Kile D.E.//Environ. Sei. Technol. 1986. V. 20. P. 502-508.

133. Choudhry G.G., Webster, G.R.B.//Toxicol. Environ. Chem. 1989. V. 23. P. 227-242.

134. Clar E. Polycyclic Hydrocarbons. London and New York: Academic Press, 1964. 442 p.

135. Clark F.E. and Tan K.H.//S01. Biol. Biochem. 1969. V. 1. P. 75.

136. Conte P., Piccolo A., Van Lagen B.//Geoderma. 1997. V. 80. P. 327-338.

137. Cook R.L., Langford C.H.//Environ. Sei. Technol. 1998. V. 32. P. 719-725.

138. Danielsen K.M., Chin Y.P., Buterbaugh J.S.//Environ. Sei. Technol. 1995. V. 29. P. 2162-2165.

139. Davis J.A.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1982. V. 46. P. 2381-2393.

140. De Nobili M., Contin M./Humic substances in the global environment and implications on human health. Elsevier, 1994. P. 263.

141. De Nobili M., Gjessing E., Sequi P.// Humic substances II. In search of structure. NY:John Wiley&Sons, 1989. P. 562-591.

142. Dell'Agnola G., Ferrari G., Maggioni A.//Ric. Sei. Part 2. 1964. V. 4. P. 347352.

143. Devitt E.C., Weisner M.R.//Environ. Sei. Technol. 1998. V. 32. P. 232-237.

144. Doerffel K. Statistik in der analytischen Chemie. Leipzig: Deutscher Verlag fuer Grundstoffindustrie GmbH, 1990. 258 S.

145. DubinP., Straus U.//J. Phys. Chem. 1970. V. 74. P. 2842-2851.

146. Earl W.L., Wershaw R.L., Thorn K.A.//J. Magn. Res. 1987. V. 74. P. 264274.

147. Eberle S.H., Feuerstein W.//Naturwissenschaften. 1979. B. 66. S. 572-573.

148. Engebretson R.R., Wandruszka R.V.//Environ. Sei. Technol. 1994. V. 28. P. 1934-1941.

149. Ephraim J.H., Boren H., Arsenie I.//Sci. Total Environ. 1989. V. 81/82. P. 615-624.

150. Ephraim J.H., Boren H., Arsenie I.//Sci. Total Environ. 1991 V. 102. P. 115119.

151. Ephraim J.H., Marinsky J.A.//Anal. Chim. Acta, 1990. V. 232. P. 171-180.

152. Ernst R.R.//Adv. Magn. Res. 1966. V. 2. P. 1-35.

153. Fan W.M., Higashi R.M., Lane A.N.//Environ. Sei. Technol. 2000. V. 34. P. 1636-1646.

154. Feibeck G.TV/Soil Sei. 1971. V. 111. No. l.P. 42.

155. Fisher, N.S., D. Frood.//Mar. Biol. 1980. V. 59. P. 85-93.

156. Freeman R., Pachler K.G.R., La Mar G.N.//J. Chem Phys. 1971. V. 55. No. 9. P. 4586-4593.

157. Friinmel F.H., Gremm, T„ Huber S.A.//Sci. Total Environ, 1992. V. 117/118. P. 197-206.

158. Frimmel F. H., Hopp W., Quentin K.-E. Z.//Wasser Abwasser-Forsch. 1985. B. 18. S. 259-262.

159. Frund R, Haider K., Ludemann, H.-D.//Z. Pflanzenemaehr. Bodenk. 1994. B. 157. S. 29-35.

160. Frund R., Guggenberger G., Haider K.//Z. Pflanzenemaehr. Bodenk. 1994. B. 157. S. 175-186.

161. Frund R., Ludemann H.-D.//Sci. Total Environ. 1989. V. 81/82. P. 157-168.

162. Fukushima M., Tanaka S., Hasebe K., Taga M., Nakamura H.//Anal. Chim. Acta. 1995. V. 302. P. 365-373.

163. Gachrer R., Davis J.S., Mares A.//Environ. Sei. Technol. 1978. V. 12. No. 13. P. 14-16.

164. Gamble D.S.//Can. J. Chem. 1972. V. 50. P. 2680-2686.

165. Gamble D.S., Schnitzer M./ Trace metals and metal organic interaction in natural waters. Ch. 9. 1973. P. 265-302.

166. Gamble D.S., Khan S.U.//Can. J. Chem. 1988. V. 66. P. 2605-2617.

167. Gamble D.S., Schnitzer M„ Hoffman I.//Can. J. Chem. 1970. V. 48. P. 31973204.

168. Gamble D.S., Underdown A.W.//Anal.Chem. 1980. V. 52. P. 1901-1908.

169. Gauthier T.D., Seitz W.R., Grant C.L.//Environ. Sei. Technol. 1987. V. 21. P. 243-248.

170. Gauthier T.D., Shane E.G., Guerin W.F.//Environ. Sei. Technol. 1986. V. 20. P. 1162-1166.

171. Genevini P.L., Saxxhi G.A., Borio D.// Humic substances in the global environment and implications on human health. Elsevier, 1994. P. 263.

172. GhassemiM., Christman R.F.//Limnol. Oceanogr. 1968. V. 13. P. 583-587.

173. Giesy, J.P., A. Newell, G.J. Leversee.//Sci. Total. Environ. 1983. V. 28. P. 2336.

174. Gillam A.H., Riley J.P.//Anal. Chim. Acta. 1982. V. 141. P. 287-299.

175. Gjessing E.T.//Schweiz. Z. Hydrol. 1973. B. 35. No. 2. S. 286-294.

176. Gjessing E.T.//Arch. Hydrobiol. 1981. V. 91. No 2. P. 144-149.

177. Grainer L.K., Lafrance P., Campbell G.C.//Chemosphere. 1999. V. 38. P. 335-350.

178. Grasset L., Ambles A.//Org. Geochem. 1998. V. 29. No 4. P. 881-891.

179. Grover R., Hance R.J. J .//Soil Sei. 1970. V. 109. P. 136-138.

180. Guna S., Jaffe P.R., Peters C.A.//Envnon. Sei. Technol. 1998. V. 32. P. 23172324.

181. Guy R.D., Chackrabarti C.L.//Can. J. Chem. 1976. V. 54. P. 2600-2611.

182. Haitzer M., Hoess S., Transpurger W., Steinberg C.//Environ. Toxicol. Chem. 1999. (in Press).

183. Harvey G.R., Boran D. A, Tokar J.M.//Mar. Chem. 1983. V. 12. P. 119-132.

184. Hasset J.P., Milicic E.//Environ. Sei. Technol. 1985. V. 19. P. 638-643.

185. Hatcher P.G.//Org. Geochem. 1987. V. 11. P. 31-39.

186. Hayashi Т., Nagai T.//Soil Sei. Plant Nutr. 1962. V. 8. No 4. P. 22.

187. Heiden R.W., Aikens D.A.//Anal. Chem. 1983. V. 55. P. 2327-2332.

188. Herbert B.E., Bortsch M„ Novak, J.M.//Environ. Sei. Technol. 1993. V. 27. P. 398-403.

189. Herbes S.E .//Wat. Res. 1977. V. 11. P. 493-496.

190. Hertkorn, N., Schmitt-Kopplin Ph., Perminova I.V., Kovalevski D.V., Kettrup A./Two dimensional NMR spectroscopy of humic substances. In: Proceedings of the 9th Meeting of the International Humic Substances Society (IHSS-9), Adelaida. 2000.(в печати).

191. Herzog H., Burba P., Buddrus J. //Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V. 354. No 3. P. 375-377.

192. Hesketh N„ Jones M.N., Tipping E.//Anal. Chim. Acta. 1996. V. 327. No 3. P. 191-201.

193. Hoult D.I., Chen C.N., Eden H., Eden M.//J. Magn. Res. 1983. V. 51. No 1. P. 110-117.

194. Huber W.//Microchim. Acta. 1959. V. 5. P. 751-755.

195. Huffman E.W.D., Stuber Jr. H. A.//Humic substances in soil, sediment and water. N.Y.: Jolm Wiley & Sons, 1985. P. 433-445.

196. Humic substances in the Suwamiee River, Georgia: interactions, properties, and proposed structures. Averett R.C., Leenheer J.A., McKnight D.M., and Thorn K.A. (Eds.) U.S. 1994. Geological Survey Water-Supply Paper, 237 p.

197. Ishiwatari R.//Chem. Geol. 1973. V. 12. P. 113-126.

198. Ishiwatari R, Hamana H., Machihara T.//Wat. Res. 1980. V. 14. P. 12571262.

199. Johnsen S., Gribbestad I.S.//Sci. Total Environ. 1991. V. 107. P. 99-108.

200. Johnsen S.//Sci. Total Environ. 1987. V. 67. P. 269-278.

201. Kanitskaya L.V., Ivanova N.V., Gorokhova V.G., Babkin V.A.//Chem. Sustainable Develop. 1996. V. 4. P. 275-280.

202. Karickhoff S.W., Brown D.S., Scott T.A.//Wat. Res. 1979. V. 3. P. 241-248.

203. Katchalsky A., Gillis G.//Rec. Trav. Chim. 1950. V. 69. P. 192-208.

204. Katchalsky A., Shavit N., Eisenberg H.//J. Polymer Set. 1954. V. 13. P. 69-78.

205. Khan S.U.//Soil Sci. 1970. V. 109. No 4. P. 227-228.

206. Khan S.U.//Soil Sci. 1971. V. 112. P. 401-408.

207. Khan S.U.//J. Environ. Sci. Health. Sec. B. 1980. V. 15. P. 1071-1020.

208. Kinchesh P, Powlson D.S., Randall E.W.//European J. Soil Sci. 1995. V. 46. P. 125-138.

209. K1 einhempel D.//Albrecht-Thaer-Archiv. 1970. B. 14. No 1. S. 3-14.

210. Knight S.A.//Chem. Ind. 1967. V. 45. P. 1920-1923.

211. Knulst J.C., Boershke R.C., Loemo S.//Environ. Sci. Technol. 1998. V. 32. No 1. P. 8-12.

212. Kopinke F.-D., Lebelt A.G.I./ Refractory Organic Substances in the Environment (Rose, Karlsruhe, 1997). Proc. Symp. P. 53-55.

213. Kopinke, F.D.; Porschmann, J.; Stottmeister, U.//Environ. Sci. Technol. 1995. V. 29. P. 941-950.

214. Krosshavn M., Bjorgum J.O., Krane J., Steinnes E. J.//Soil Sci. 1990. V. 41. P. 371-377.

215. Kudryavtsev A.V., Perminova I.V., Petrosyan V.S.//Anal. Chim. Acta. 2000. V. 407. No. 1-2. P. 193-202.

216. Kukkonen J., Oikari A.//Sci. Tot. Environ. 1987. V. 62. P. 399-402.

217. Kukkonen J., Oikari A.//Wat. Res. 1991. V. 25. P. 455-463.

218. Kukkonen J., Pellinen J.//Sci. Total Environ. 1994. V. 152. P. 19-29.

219. Kulikova N.A., Perminova I.V., Lebedeva G.F./Proceedings of the 10th IHSS, 24-28 July, Toulouse, France. P. 112-115.

220. KumadaK. Chemistry of soil organic matter. Tokyo, 1988. 253 p.

221. Kumke M.U., Lohmannsroben H.-G., Roch TV/Analyst. 1994. V. 119. P. 991-1001.

222. Kuwatsuka S., Tsutsuki K., Kumada K.//Soil Sci. Plant Nutr. 1978. V. 24. P. 337-347.

223. Landram P.F, Reinhold M.D, Nihart S.R, Eadie B.J.//Environ. Toxicol. Chem. 1985. V. 4. P. 459-467.

224. Landram P.F, Sheila R.N, Eadie B.J, Herche L.R.//Environ. Toxicol. Chem. 1987. V. 6. P. 11-20.

225. Landram P.F., Dupuis W.S. and Kukkonen J.//Environ. Toxic. Chem. 1994. V. 13. P. 1769-1780.

226. Landram P.F., Nihart S.R., Eadie B.J. Gardner W.S.//Environ. Sci. Technol. 1984. V. 18. P. 187-192.

227. Landram P.F., M.D. Reinhold, S.R. Nihart, B.J. Eadie.//Environ. Toxicol. Chem. 1983. V. 4. P. 459-467.

228. Lee M.L., Novotny M.V., Bartle K.D. Analytical Chemistry of Polycyclic Aromatic Compounds. London:Academic Press, 1981. 462 p.

229. Leuenberger B., Schindler P.//Anal.Chem. 1986. V. 58. P. 1471-1474.

230. Leversee G.J., Landrum J.P., Fannin T.//Can. J. Fish. Aquat. Sei. 1983. V. 40. P. 63-69.

231. Levy G.C., Komorovsky R.A.//J. Amer. Chem. Soc. 1974. V. 96. No 3. P. 678-681.

232. Lobartini J.C., Tan K.H.//Soil Sei. Soc. Amer. J. 1988. V. 52. P. 125-130.

233. Lowe L.E.//Sci. Total Environ. 1992. V. 113. P. 133-145.

234. Luoma, S.N.//Sci. Total Environ. 1983. V. 28. P. 1-22.

235. MacCarthy P., Mark H.B. Jr./The biological implication of metals in the environment (Hanford, Washington, 1975). Proc. 15th Annual Life Sciences Symp. P. 197-212.

236. MacCarthy P., Mark H.B.//Soil Soc. Amer. J. 1976. V. 40. P. 275.

237. Malcolm R.L., MacCarthy P.//Environ Sei. Technol. 1986. V. 20. P. 904-911.

238. Malcolm R.L./Humic substances in soil and crop science. N.Y.:John Willey&Sons, 1990. P. 1-7.

239. Mannio J., Verta, M., Kortelainen P., Rekolainen S.//Publ. Wat. Res. Inst. Nat. Board Waters, Finland. 1986. V. 65. P. 32-43.

240. Mantoura R.F.C., Riley J. P.//Anal. Chim. Acta. 1975. V. 78. P. 97-106.

241. Mantoura R.F.S., Dickson A., Riley J.P.//Est. Coast. Mar. Sei. 1978. V. 6. P. 387-408.

242. Marinsky J.A., Ephraim J.//Environ. Sei. Technol. 1986. V. 20. P. 349-354.

243. Marinsky J.A., Wolf A., Bunzl K.//Talanta. 1980. V. 27. P. 461-468.

244. Martin F., Dubach P., Menta N. C.//Z. Pflanzehernaehr Bodenk. 1963. B. 103. S. 27-32.

245. Martin J.P.,Waksman S.A.//Soil Sei. 1941. V. 52. P. 381-394.

246. Maraya K.A., Risebrough R.W., Home A.J.//Environ. Toxic. Chem. 1997. V. 16. P. 1087-1097.

247. Masini J.C.//Anal. Chim. Acta. 1993. V. 283. P. 803-810.

248. Mason R.P., Reinfelder J.R., Morel F.M.M.//Environ. Sei. Technol. 1996. V. 30. P. 1835-1845.

249. Matthiessen A.//Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V. 354. P. 747-749.

250. McCarthy J.F.//Arch. Environ. Contain. Toxicol. 1983. V. 12. P. 559-568.

251. McCarthy J.F., Jimenez B.D.//Environ. Sei. Technol. 1985. V. 19. P. 1072-1076.

252. McCarthy J.F., Jimenez B.D., Barbee T.//Aquat. Toxicol. 1985. V. 7. P. 1524.

253. McCarthy J.F., Roberson L.E., Bunis L.W.//Chemosphere. 1989. V. 19. P. 1911-1920.

254. McCarthy J.F., S.M. Barteil.//ASTM STP 1988. Philadelphia: American Society for Testing and Materials, 1988. P. 3-16.

255. McCarthy J.F., B.D. Jimenez.//Environ. Toxicol. Chem. 1985. V. 4. P. 511-521.

256. Means J.C., Wijayaratne R.D.//S01I Sei. 1977. V. 215. P. 968-970.

257. Moers M.E.C. Occurence and Fate of Carbohydrates in Recent and Acient Sediments from Different Environments of Deposition. Dissertation, Techn. Univ. Delft, 1989.

258. Mopper K., Schultz C.A., Chevolot L.//Environ. Sei. Technol. 1992. V. 26. P. 133-138.

259. Morehead N.R., Eadie B.J., Lake B., Landrum P.//Chemosphere. 1986. V. 15. P. 403-412.

260. Mona M.J., Corapcioglu M.O., Wadruszka R.M.A., Marshall D.B.//Soil Sei. Amer. J. 1990. V. 54. P. 1283-1288.

261. Nam K., Chung N., Alexander M.//Environ. Sei. Technol. 1998. V. 32. P. 3785-3788.

262. Neff J.M. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the aquatic environment. London: Applied Sei. Pub. LTD, 1979. 266 p.

263. Nehls I., Wagenknecht W., Philipp B., Stscherbina D.//Prog. Polym. Sei. 1994. V. 19. P. 29-78.

264. Newman R.H., Tate K.R., Barron P.F., Wilson M.A.//J. Soil Sei. 1980. V. 31. P. 623-631.

265. Nilsson A., Hakanson L.//Hydrobiol. 1992. V. 235/236. P. 675-683.

266. NMR of Humic Substances and Coal Techniques, Problems and Solutions. Chelsea: Lewis Publishers, 236 p.

267. Noggle J.H., Schirmer R.E. The nuclear Overhauser effect. NY:Academic Press, 1971. 259 p.

268. Norwood D.L./ Humic substances and their role in the environment. John Wiley & Sons, 1988. P. 133-148.

269. Ogner G.//Soil Sei. 1970. V. 110. No 2. P. 86.

270. Oh Y. K.//Nippon suiscinukkaishi. 1986. V. 52. No 9. P. 1653 (Ch.Ab., 105:220407).

271. Oikari A., Kukkonen J., Virtonen V.//Sci. Total Environ, 1992. V. 117/118. P. 367-377.

272. Oris J.T., Hall A.T., Tylka J.D.//Environ. Toxicol. Chem. 1990. V. 9. P. 575-583.

273. Pandeya S.B.//Geoderma. 1993. V. 58. P. 219-231.

274. Pang S., Zhao K.//Huanjing Huaxue. 1983. V. 2. No 1. P. 49 (Ch. Ab. 99:58482u).

275. Paolis F., Kukkonen J.//Chemosphere. 1997. V. 34. P. 1693-1704.

276. Parsons J.W./ Humic substances II. In search of structure, N.Y.:John Wiley&Sons, 1989. P. 99-120.

277. Pattersson C., Arsenie I., Ephraim J.P.//Sci. Total Environ. 1989. V. 81/82. P. 287-296.

278. Pauli F.W. Soil fertility. London, 1967. 221 p.

279. Paxeus N. Studies on aquatic humic substances, Ph.D. thesis, University of Goeteborg, Sweden, 1985. P. 51-57.

280. Paxeus N., Wedborg M.//Analit. Chim. Acta. 1985. V. 169. P. 87-98.

281. Pearson G.A.//J. Magn. Res. 1977. V. 27. No 2. P. 265-272.

282. Perdue E.M.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1984. V. 48. P. 1435-1442.

283. Perdue E.M.// Humic substances in soil, sediment and water. N.Y.: John Willey & Sons, 1985. P. 493-525.

284. Perdue E.M., Reuter J.H., Ghosal M.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1980. V. 44. P. 1841-1851.

285. Perdue E.M., Reuter J.H., Parrish R. S.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1984. V. 48. P. 1257-1263.

286. Perdue E.M.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1978. V. 42. P. 1351-1358.

287. Perminova I. V.//Soil Sei. 1999. V. 164. No 11. P. 834-840.

288. Perminova I.V., Grechishcheva N.Yu., Kovalevskii D.V., V.S. Petrosyan //Environ. Sei. Technol. 2000. In press.

289. Perminova I.V., Grechishcheva N.Yu., Petrosyan V.S.//Environ. Sei. Technol. 1999. V. 33. P. 3781-3787.

290. Perminova I.V., Frimmel F., Kovalevskii D.V., Abbt-Braun G., Kudryavtsev A.V., Hesse S.//Wat. Res. 1998. V. 32. P. 872-881.

291. Perminova I.V., Kudryavtsev A.V., Frimmel F. Hesse S./ Refractory Organic Substances in the Environment (Rose, Karlsruhe, 2000). Proc. Symp. P. 28-32.

292. Perminova I.V., Yashchenko N.Yu., Petrosyan V.S./ Humic Substances and Transport Processes (Anaheim, California, 1997). Proc. IHSS Symp. Chapter 14. Publ. SSSA, IHSS, and ASA. 2000. In press.

293. Piccolo A./The role of humic substances in the ecosystems and in environmental processes. Wroclaw:IHSS-Polish Society of Humic Substances,1997. P. 19-35.

294. Piccolo A., Mirabella A.//Sci. Total Environ. 1987. V. 62. P. 39-46.

295. Piccolo A., Camici L.//Int. J. Environ. Anal. Chem. 1990. V. 41. P. 65-69.

296. Piccolo A., S. Nardi, and G. Concheri.//European J. Soil Sei. 1996. V. 47. P. 319-328.

297. Pinheiro J.P., Mota A.M., Simoes Goncalves M.L.//Anal. Chim. Acta. 1994. V. 284. P. 525-537.

298. Piotrowicz S.R., Harvey G.R., Boran D.A.//Mar. Chem. 1984. V. 14. P. 333337.

299. Pommeiy J., Imbenotte M., Erb F.//Environ. Pollut. (Ser. B), 1985. V. 9. P. 127-136.

300. Posner A.M.//Nature. 1963. V. 198. P. 1161-1163.

301. Preston C.M., Blackwell B.A.//Soil Sei. 1985. V. 139. No 1. P. 88-96.

302. Preston C.M., Schnitzer M.//J.Soil Sei. 1987. V. 38. P. 667-678.

303. Ramamoorthy S., Blumhagen K.//Can. J. Fish. Aquat. Sei. 1984. V. 41. P. 750-756.

304. Rashid M.A.//Chem. Geol. 1974. V. 13. P. 115-123.

305. Rashid M.A. Geochemistry of marine humic compounds. Oxford: SpringerVerlag, 1985. 243 p.

306. Ricart M., Villaescusa I., Torre F.//React. Funct. Polym. 1996. V. 28. P. 159-165.

307. RiccaG., Severini F.//Geoderma. 1993. V. 58. P. 233-244.

308. Rice J.A., MacCarthy P.//Org. Geochem. 1991. V. 17. No 5. P. 635-648.

309. Right J.R., Schnitzer M.//Trans. 7th Intern. Congr. Soil Sei. 1960. V. 2. P. 120-123.

310. Rise G., Sulbu B.//Sci. Total Environ. 1989. V. 81/82. P. 137-142

311. Roemelt P.M., Seitz W.R.//Environ. Sei. Technol. 1982. V. 16. P. 613-616.

312. Ruggiero P., Interesse F.S., Sciacovelli 0.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1979. V. 43. P. 1771-1775.

313. Ruggiero P., Sciacovelli O., Testini C., Interesse F.S.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1978. V. 42. P. 411-416.

314. Ryan D.K., Weber J.H.//Environ. Sei. Tech., 1982. V. 16. P. 866-872.

315. Saar R. A., Weber J. H.//Can. J. Chem. 1979. V. 57. No 11. P. 1263-1268.

316. Sapek A.//Rocz. Glebozn. 1970. V. 21. No 2. P. 429.

317. Sapek A.//Rocz. Glebozn. 1973. V. 24. P. 519-527.

318. Savant A., Pandey G.S.//J. Inst. Chemists (India), 1995. V. 67. No 1. P. 16-17.

319. Sawert A.//GIT Fachz. Lab. 1992. V. 9. P. 875-881.

320. Schmitt P., Kettrup A., Freitag D., Garrison A.W.//Fresenius J. Anal. Chem. 1996. V. 354. P. 915-920.

321. Schmitt-Kopplin, P., Hertkorn, N. Schulten, H.-R., Kettrup, A.//Environ. Sei. Technol. 1998. V. 32. P. 2531-2541.

322. Schnitzer M., Gupta U.C.//Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1965. V. 29. P. 274277.

323. Schnitzer M., Preston C.M.//Plant and Soil. 1983. V. 75. P. 201-211.

324. Schnitzer M., Preston C.M.//Soil Sei. Soc. Amer. J. 1986. V. 50. P. 326-331.

325. Schnitzer M., Desjardins J.G.//Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1962. V. 26. P. 362368.

326. Schnitzer M., Desjardins J.G.//Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1970. V. 34. P. 7779.

327. Schnitzer M., Gupta U.C.//Soil Sei. Soc. Amer. Proc., 1964. V. 28. P. 374377.

328. Schnitzer M., Hansen E.H.//Soil Sei. 1970. V. 109. No 6. P. 333-340.

329. Schnitzer M., Khan S.U./Humic substances in the environment. N.Y.:Marcel Decker, 1972. P. 12-17.

330. Schnitzer M.//Soil Sei. 1974. V. 117. No 2. P. 94-101.

331. Schubert J.//J. Phys. Chem. 1952. V. 56. P. 113-118.

332. Schubert J., Richter J. W.//J. Amer. Chem. Soc. 1948. V. 70. P. 4259-4268.

333. Schubert J., Rüssel E. R., Myers L. S.//J. Biol. Chem. 1950. V.185. P. 387398.

334. SchultenH.-R., Schnitzer M.//Naturwissenschaften, 1993. V. 80. P. 29-30.

335. Schulten H.-R.//J. Anal. Appl. Pyrolysis. 1993. V. 25. P. 97-122.

336. Schulten H.-R./ Humic Substances in the Global Environment and Implications on Human Health. Elsevier, 1994. P. 43-56.

337. SDCB (Stability constant data base), IUP AC, 1996.

338. Senesi N.//Anal. Chim. Acta. 1990. V. 232. P. 51-75.

339. Servos M.R., Muir D.C.G., Webster G.R.B.//Aquat. Toxicol. 1989. V. 14. P. 169 184.

340. Shin H. S., Moon H.//Soil Sei. 1996. V. 161. No 4. P. 250-256.

341. Shlautman M.A., Morgan J.J.//Environ. Sei. Technol. 1993. V. 27. P. 25232532.

342. Shoolery J.N. Progress in NMR spectroscopy. NY: A Wiley Interscience. 1977. 331 p.

343. Simms H.S.//J. Amer. Chem. Soc., 1926. V. 48. P. 1231-1261.

344. Simonin S.A., Gloss S.P., Driscoll C.T./Mercury pollution. Lewis Publishers, 1994. P. 457-472.

345. Simpson A.J., Boersma R.E., Kingeiy W.L./Application of NMR spectroscopy for studies of the molecular compositions of humic substances. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 1997. P. 46-62.

346. Sips R.//J. Chem. Phys. 1948. V. 16. P. 490-498.

347. Skjemstad J.O., Frost R.L., Barron P.F.//Austr. J. Soil Res. 1983. V. 21. P. 539-541.

348. Skogerboe R.K., Wilson S.A.//Anal. Chem. 1981. V. 53. P. 228-232.

349. Sochtig H./Humic substances: their structure and function in biosphere. Wageningen:PUDOC, 1972. P. 321-335.

350. Solbrig-Lebuhn H.//Zuckerind, 1992. B. 117. S. 979-983.

351. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C.//Anal. Chem. 1983. V. 55. P. 782-787.

352. Steelink C., Wershaw R.L, Thorn K.A., Wilson M.A./ Humic Substances II. In search of structure. N.Y.: John Wiley&Sons, 1989. P. 281-310.

353. Steelink C./Huinic substances in soil, sediment and water. N.Y.: John Wiley & Sons, 1985. P. 457-475.

354. Steelink, C., Wershaw, R.L., Thorn, K.A., Wilson, M.A./ Humic Substances II. In Search of structure. N.Y.:John Wiley&Sons P. 281-308.

355. Steinberg C.E.W., Haitzer M., Braeggemann R., Perminova I.V., Grechishcheva N.Yu.//Int. Rev. Hydrobiol. 2000. V. 85. P. 253-266.

356. Stevenson F.J., Butler I.H.A. Organic geochemistry. N.Y.:John Willey & Sons, 1969. 534 p.

357. Stevenson F.J./ Humic substances in soil, sediment and water.N.Y.: John Wiley & Sons, 1985. P. 13-52.

358. Stevenson F.J., Goh K. M.//Soil Sci. 1972. V. 113. No 5. P. 334-345.

359. Stevenson F.J. Humus chemistry, genesis, composition, reactions. N.Y.:John Wiley&Sons, 1982. 443 p.

360. Stevenson I. L., Schnitzer M.//Soil Sci. 1982. V. 133. No 3. P. 179-185.

361. Stewart A.J./Synthetic Fossil Fuel Technologies. Boston: Butterworth publ., 1984. P. 505-521.

362. Strohal P., Huljev D./ Nuclear Technics in Environ mental Pollution. (Salzburg, 1970). Proc. Symp. Vienna:IAEA, 1970. P. 439-446.

363. Stuermer D. H., Payne J. R.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1976. V. 40. P. 1109-1114.

364. Stuermer D.H., Peters K.E., Kaplan I.R.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1978. V. 42. P. 989-997.

365. Suffet I.H., MacCarthy P. Aquatic humic substances: influence on fate and treatment of pollutants. American Chemical Society, Advances in Chemistry Series, 1989. 254 p.

366. Swan R.L., Eschenroeder A. /Fate of chemicals in the environment. Washington: Amer. Chem. Soc., 1983. Ser. 225. P. 228.

367. Swift R.S./ Humic Substances II. In Search of Structure. N.Y.:John Wiley&Sons, 1989. P. 468-495.

368. Takamutsu T., Yoshida TV/Soil Sci. 1978. V. 125. No 6. P. 377-386

369. Tan K.H., Leonard R.A., Bertrand A.R., Wilkinson S.R.//Soil. Sci. Amer. Proc. 1971. V. 35. P. 265-269.

370. Tao Sh.//Sci. Total Environ. 1992. V. 117/118. P. 139-144.

371. Tate R.L.//Adv. Microbial. Ecol., 1980. V. 4. P. 169-201.

372. Thakur A.K., Munson P.J., Hunston D.L., Rodbard D.//Anal. Biochem., 1980. V. 103. P. 240-254.

373. Thurman E.M. Organic geochemistry of natural waters. Dordrecht: Martinus Nijhof/Dr. W. Junk Publishers, 1985. 451 p.

374. Traina S.J., Spontak D.A., Logan T.J.//J. Environ. Qual. 1988. V. 19. P. 221-227.

375. Triay I.R., Rundberg R.S.//J. Phys. Chem.1987. V. 91. P. 5269-5275.

376. Truitt R.E., Weber J.H.//Anal. Chem. 1981. V. 53. P. 337-342.

377. Turner D.R., Varney M.S., Whitfield M. et al.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1986. V. 50. No 2. P. 289-297.

378. Van Den Hoop M.A.G.T., Van Leeuwen H.P., Cleven R.F.M.J.//Anal. Chim. Acta. 1990. V. 232. P. 141-148.

379. Vamey M., Mantoura R.F.C., Whitfield M./Trace metals in sea water (Sicily, 1981). Proc. NATO Conf. P. 751-772.

380. Visser S.A.//Environ. Sei. Technol. 1983. V. 17. No 7. P. 412-417.

381. Voice T.C., Weber W.J.//Wat. Res. 1983. V. 17. P. 1433-1441.

382. Vymazal J.//Hydrobiol. 1984. V. 119. P. 171-179.

383. Wang C.X., Yediler A., Kettrup A.//Chemosphere, 1995. V. 30. P. 501-510.

384. Wang Z.-D., Gamble D.S., Langford C.H.//Anal. Chim. Acta. 1990. V. 232. P. 181-188.

385. Wang Z.-D., Gamble D.S., Landford C.H.//Anal. Chim. Acta. 1991. V. 244. P. 135-143i

386. Weber J.// Humic substances and their role in the environment. N.Y.:John Wiley & Sons, 1988. P. 165-178.

387. Weinstein J.E., Oris J.T.//Environ. Toxicol. Chem. 1999. V. 18. P. 2087-2094.

388. Wershaw R.L., Mikita M.A., Steelink C.//Environ.Sci.Technol. 1981. V. 15. No 12. P. 1461-1463.

389. Wershaw R.L./Humic substances in soil, sediment and water. Chapter 22. N.Y.: John Wiley & Sons, 1985. P. 123-153.

390. Wilcke W., Zech W.//Z. Pflanzenemaehr. Bodenk., 1997. B. 160. S. 573-579.

391. Wilson M. A., Gillam A. H., Collin P. J.//Chem. Geol. 1983. V. 60. No 3-4. P. 181-201.

392. Wilson M. A., Philip R. P., Gillam A. H., Tate R. R.//Geochim. Cosmochim. Acta. 1983. V. 47. P. 497-502:

393. WilsonM.A., Goh K.M.//J. Soil Sei. 1983. V. 34. P. 305-313.

394. Wilson M.A., Collin P.J., Tate K.R.//J. Soil Sei. 1983. V. 34. P. 297-304.

395. Wilson M.A., Heng S., Goh K.M., Pugmire R.J., Grant D.M.//J. Soil Sei. 1983. V. 34. P. 83-97.318

396. Wilson M.A., Pugmire R.J., Grant D.M.//Org. Geochem. 1983. V. 5. No 3 P. 121-129.

397. Wilson M.A., Vassallo A.M., Perdue E.M., Reuter J.H.//Anal. Chem. 1987 V. 59. P. 551-558.

398. Wilson M.A./ Humic substances in soil and crop sciences: selected readings P. MacCarthy (Eds.). Madison, USA, 1990. P. 221-260.

399. Wilson M.A./Humic substances. Oxford: Pergamon Press, 1987. P. 182-216.

400. Winner R.W.//Aquat. Toxicol. 1984. V. 5. P. 267-274.

401. Winner R.W.//Wat. Res. 1985. V. 19. No 4. P. 449-455.

402. Wit J.C.M. Proton and metal ion binding to humic substances. Ph.D. thesis. Wageningen Agricultural University, The Netherlands, 1996.

403. Wright J.R., Schnitzer M.//Nature. 1959. V. 184. No 4697. P. 1462-1463.

404. Yin Yu., Allen H.A., Huang C.P., Sanders P.F.//Anal. Chim. Acta. 1997 V. 341. P. 73-82.

405. Yonebayashi K., Hattori TV/Soil Sei. Plant Nutr. 1989. V. 35. P. 383-392.

406. Ziechman W. Huminstoffe. Probleme, Methoden, Ergebnisse. Weinheim: Chemie, 1980. 480 S.

407. Zhilin D.M., Perminova I.V., Petrosyan V.S./8th Meeting of IHSS (Wroclaw, 1996). Abstracts. P. 259.319