Антиидиотипические моноклональные антитела к N-ацетилглюкозаминил-бета(1-4)-N-ацетилмурамоилаланин-D-изоглутамину: получение и характеристика тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА н Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАРЕЕВА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ МОНОКПОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К М-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИНИЛ-Р(1-4)^-АЦЕТИЛМУРАМОИЛ-АЛАНИЛ-О-ИЗОГЛУТАМИНУ : ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

Специальность 02.00.10-Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных вещесге

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель-

кандидат химических наук В.А.Несмеянов

Официальные оппоненты:-доктор химических наук Н.В.Бовин кандидат медицинских наук В.Л.Юрин

Ведущая организация- Институт биотехнологии АО "Биотехнология"

Защита состоится 22 февраля 1995 г. в 10 часов на заседании специализированного совета ' Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии т М.М.Шемякина и Б.А.Овчинникова РАН, по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и С.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 22 января 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

-1-

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Мурамилдипептид (МБР) является минимальной структурой клеточной стенки бактерий,способной заменять микобактериальный компонент в полном адъюванте Фрейнда. ЮР и его дисахаридсодержащие аналога- глюкозаминилмурамоил-дипептида,отличающиеся наличием остатка М-ацетилглюкозамина-проявляют адъювантную активность,стимулируют неспецифическую резистентность к бактериальным и вирусным инфекциям,обладают сомногенным действием.

Мурамилпептида (МП) являются перспективными лекарственными препаратами, компонентами искусственных вакцин. Ряд МП проходит II-III стадию, клинических испытаний как противоопухолевые и противоинфекционные средства, стимуляторы гемопоэ-за. Несмотря на это, молекулярный механизм их биологической активности остается невыясненным.

Большинство данных указывает на рецепторный механизм действия МП. Основными их мишенями являются клетки макрофа-гального ряда, хотя наличие специфических сайтов связывания МП было показано также для активированных B-клеток, Т-хелпе-ров и мембран мозга крысы. Иггектся данные о наличии сайтов связывания МП как на поверхнсс?л^ так и внутри клеток-мишеней.

Число клеточных рецепторов Ш невелико, кр-оме того они обладают относительно низкой аффинностью к своему лиганду, что осложняет их выделение и изучение. Полезным инструментом для исследования рецепторов МП могли бы стать моноклональные антитела (МА), однако их получение с использованием традиционных подходов трудноосуществимо в силу отсутствия в настоящее время препаратов рецептора,которые можно било бы использовать в качестве антигена для иммунизации ¡¡сивотных и последующего скрининга антител.

В настоящее время все большее распространение получает альтернативный подход, основанный на получении антиидиотипи- • ческих антител (анти-Id AT) к соответствующему биологически активному лиганду.Поскольку антитела (AT) к биологически активным лигандам могут имитировать связывающий сайт соответс-

твуюцего клеточного рецептора, то они способны индуцировать выработку анти-Ш АТ, несущих "внутренний образ" лиганда и поэтому специфичных к этому рецептору.

Бесспорным преимуществом подобного подхода является то, что он не требует предварительного выделения изучаемого рецептора. Это особенно ва:шо в случае получения АТ к ранее неизученным рецепторам, таким,например, как мурамилпептид-свя-зываедю молекулы.

С целью использования датюго подхода для исследования рецептора мурамлллептидэв нами было предпринято получение атаяпдаоткпзческпх мсвоклональных антител (енти-1а МА) к Н-ацетяг.-июоакяипл- р (1 -4 )-К-пцетплмурамоил-алакил-В-изоглу-тамипу (С'ШР).

Цель рабсти.Основной задачей настоящей работы являлось получение пюрцдоы, продуцирувдш: аяти-Тй МА к СШ)Р, и выявление среди последних т.к. АТ2р, несудаз. внутренний образ ОКВР и способ-иг;; взаимодействовать с К.ШР-рецепторами клеток-мше-нзй.В соответствии с бтим работа подразделялась на следующие этапы:

1) получение и характеристика МА,специфически взаимодействующих с йКБР;

2) получение анти-Ш МА к СТДЗР и исследование их иммунохими-ческих свойств;

3) изучение биологических свойств полученных анти-Ш МА и выявление среди них АТ, несущих внутренний образ йШР;

4) исследование взаимодействия этих анти-Ш МА с СШР-связы-вающими молекулами клеток-мишеней.

Научная, новизна и практическая значимость работы. В результате работы впервые получен клон гибридных клеток (Е6/1.2), продуцирующий высокоаффинное моноклональное антитело к агор. Проведена биохимическая и иммунохимическая характеристика МА Еб/1.2. На основе МА Е6/1.2 разработан иммуноферментный конкурентный метод определения МИ)Р, обладающий рядом преимуществ по сравнению с описанными в литературе физико-химическими системами определения мурамилпептидов. Впервые получены гибридомы, продуцирующие анти-1й МА к мурамилпептиду. Прове-

дена биохимическая и иммунохимическая характеристика этих антител. Показано,что три клона гибридных клеток продуцируют антиидиотипические моноклональные антитела, несущие внутренний образ GMDP и распознающие рецепторы GMDP у клеток-мишеней, причем два антитела способны имитировать адъювантное действие GMDP in Yivo. Продемонстрировано взаимодействие ан-тиидиотипического антитела С5/Р8 с GMDP-связывагацими белками лизата клеток линии WEHI-3.

Аппробации работы и публикации.Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на Международном симпозиуме по структуре и функциям регуляторных полипептидов (Москва,1992). По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов.экспериментальной части,выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 210 наименований. Работа содержи 20 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение моноклональшх антител к N-ацетилглшоз-аминил-ß(1-4)-Н-ацетилмурамоил-аланил-Б-изоглутамину и их

характеристика^

Важным шагом при получении анти-Id МА, несущих внутренний образ какого-либо лиганда и обладающих антирецепторной активностью, является получение антилигандных АТ1, по своей специфичности напоминающих рецептор этого лиганда (Рис.1).

Поскольку GMDP является гаптеном.то для индукции специфичных к нему АТ1 требовалось иммунизировать животных конъю-гатами гликопептида с белками-носителями.Причем было необходимо выбрать такой метод синтеза конъюгатов, при кототором область гликопептида, участвующая в связывании с клеточным рецептором, оставалась бы ненарушенной и была доступна для взаимодействия с АТ1.

Рецептор

Рис.1.Схема имитации антилигандными АТ1 и антиидиотипичесними АТ2(3 соответственно клеточного рецептора и (Зиологического

лиганда.

Для GMDP оптимальный тип связи с носителем- пептидная связь между 7-карбоксильной группой остатка D-изоглутамина и первичными аминогруппами носителя, поскольку именно этот тип связи характерен для клеточных стенок бактерий,где D-изоглу-тамин чаще всего связан через 7-карбоксильную группу с а-аминогруппой D-мезодиаминопимелиновой кислоты или лизином. Вакно также то обстоятельство,что МП в составе таких коныо-гатов не утрачивают своих биологических свойств.

Исходя из этих соображений мы синтезировали с помощью водорастворимого карбодиимида (EDC) конъюгат GMDP с овальбу-mhhom(GMDP-OVA) по схеме,представленной на рис.2.Аналогичным образом в лаборатории химии пептидов ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН были получены конъюгаты GMDP с метилированным бычьим сывороточным альбумином(GMDP-MeBSA) и разветвленным синтетическим полимером polyt(D,L-Ala)nLys](GMDP-AL).

Мышей BALB/c четырехкратно иммунизировали коныогатом

GlcNAcI /31-4)MurNAc ch2oh ch20h

COOH

EDC,

nh2 - (?)

ch2oh

но' но

сн2он жас nhac

h3c-

,CO-NH- @

о c0n'h2

Рис.2.Схема синтеза конъюгатов GÍÍDP с носителя?.!!!. (?) -высокомолекулярный носитель (HeBSA, OVA или AL).

GHDP-KeBSA (внутркбршипно, по 100 г,п;г конъюгата на «кшь) по следующей схеме: 3 шгъекции в полном адъюванте ФреПнда с интервалом в 1 месяц,и последняя- 3 месяца спустя в физиологическом растворе. Через неделю после четвертой штьекшш скво-ротки кыаей были проверены с помощью прямого твердофазного !@А lía наличие антител к С'ШР.

Для этого серийные двукратага разведения кгаукноЛ или контрольной сыворотки инкубировали с GМОР-ЛЬ или ацилирозан-ным производным poly[ (D,L-Ala)nIor3l (Дс-ЛЬ) .сорбированном в лунках SS-луночного микроплпнлета,затем планпет инкубировали с AT кролика против иммуноглобулинов мыши,конъюгировптш:.гл с пероксидазой хрена.В качестве субстрата использовали ортофз-нилендиамин.Конъюгат GMDP-AL брали вместо GMDP-MeBSA с тем, чтобы исключить из рассмотрения AT к носителю- HeBSA, а Ас-

сн

АЪ служил контролем неспецифической сорбции АТ на poly[(D,L-Ala)nlysl.B качестве контрольной использовали сыворотку этих же мышей, взятую до начала иммунизации.

Результаты показали,что в то время как иммунная сыворотка давала хорошо детектируемое связывание с GMDP-AL вплоть до разведения 1:25000,заметной активностью по отношению к Ac-AL она не обладала.Контрольная сыворотка не давала существенного фона при тестируемых разведениях ни с GMDP-AL,hh с Ac-AL. Эти результаты свидетельствовали о наличии АТ к GMDP в сыворотках иммунизированных мышей,т.е. конъюгат GMDP-MeBSA индуцировал иммунный ответ к GMDP.

Бустирование животных проводили через 3 недели после последней иммунизации в течение 3-х последовательных- дней (по 100 мкг GMDP-MeBSA на инъекцию, внутрибршинно, в физиологическом растворе).На 4-е сутки иммунные спленоциты гибридизо-вали с клетками миеломной линии SP2/0-Ag14 в соотношении 5:1 по стандартной методике.По данным ИФА титр специфчных к GMDP АТ в сыворотке мыши перед слиянием составлял 1:250СЮ. Отбор положительных клонов .проводили на 10-14-е сутки с помощью прямого твердофазного ИФА, описанного выше. В качестве антигена использовали GMDP-OVA, а отрицательным контролем слуки-ли лунки с адсорбированным при той же концентрации овальбу-мином (OVA).

В результате анализа было отобрано 7 первичных культур, уровень активности которых в 10-20 раз превышал контроль.Однако, некоторые из них оказались нестабильными и утратили активность после замораживания в жидком азоте.Другие клоны,как выяснилось при дальнейших исследованиях, продуцировали АТ на смешанную антигенную детерминанту, образованную молекулой GMDP и молекулой белка-носителя. После двухкратного клонирования методом лимитирующих разведений был выделен стабильный клон Е6/1.2, продуцирующий МА к GMDP.

С целью наработки препаративных количеств МА гибридные клетки вводили внутрибршинно мышам линии BALB/c, получившим за 2 недели до этого инъекцию пристана.Рост опухоли в асцит-ной форме наблюдался у 80% животных.Концентрация МА в асцит-

ной жидкости составила 5-6 мг/мл.а в культуральном суперна-танте-до 100 мкг/мл. Продукция иммуноглобулинов In vitro на указанном уровне сохранялась в течение 20 пассажей за 2 месяца непрерывного культивирования и не нарушалась при размораживании гибридного клона после консервации его в жидком азоте.

MA EG/1.2 выделяли из клеточного супернатанта и асцит-ной жидкости с помощью аффинной хроматографии на колонке BrCN-активированной Сефарозы 4В с иммобилизованным GMDP-Lys.

Полученные препараты МА Е6/1.2 проверяли на активность в твердофазном ИФА, чистоту оценивали с помощью SDS-электро-фореза в 10% полиакриламидном геле.При использовании описанного способа очистки МА полностью сохраняли GMDP-связывающую активность, а чистота препаратов составляла 90-95% (Рис.3).

Рис.3. Электрофоретическое разделение MA Е6/1.2 в 10% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях.1-аффин-но-очищенное MA Е6/1.2. 2-калибровочная смесь белков для электрофореза: фосфорилаза b (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоангидраза (30 кДа), трипсин (20,1 кДа),лактальбумин (14,4 кДа). Гель окрашен Кумасси ярко-голубым R-250.

С помощью твердофазного ИФА с использованием коммерческих антисывороток против субклассов, иммуноглобулинов мыши было показано, что MA Е6/1.2 принадлежит к классу G,подклассу 1 и несет легкую цепь ае-типа. Константа связывания этого МА с конъюгатом GMDP-0VA, определенная по методу Beatty et al. (1986), оказалась равной 2"109М~1, т.е. МА Е6/1.2 было вы сокоаффинным.

С целью проверки специфичности полученного МА к GMDP с

-94 kD -A3

—30

Ш -20

•esaasg^S»» — 1Д 1 2.

помощью твердофазного конкурентного ИФА было исследовано ин-гибирование связывания МА Е6/1.2 с коныогатом СМБР-АЬ в присутствии ИШР или его производных. В лунки микропланшета с сорбированным в них ЯЛЗР-АЬ вносили равные объемы препарата конкурирующего агента.взятого в'серийных двукратных разведениях, и МА Е6/1.2 в разведении, дающем 50-70% связывания от максимального в прямом твердофазном МФА. Затем ■ микропланшет инкубировали с АТ кролика против иммуноглобулинов мыши.конъ-югированными с пероксидазой хрена. Степень ингибирозания (1,%) определяли по формуле лг,-.41

' - - - - - - I--х 1 оо,-

А0

где Ао и А1-соответственно оптическое поглощение образца при 492 ил без ингибитора и с ингибитором.

По графикам зависимости степени ингибирования от разведения конкурирующего агента рассчитывали концентрацию каждого производного, дающего 50% ингиб1фования в условиях проведения ошта (С150^, рис.4).Оказалось, что для ИЛ)Р,ИШР-Ъуз и ЬЪ-СКВР значения С150„ очень близки (7,3; 7,6 и 8,6 мкМ соответственно), в то время как для дисахарида С1с11Ас-МигЫАс примерно в 100 раз выше (768 мкМ),_а для МБР, • дипептида А1а-Б-Ю1п, Ы-ацетилглюкозамина и Н-ацетилмурамовой кислоты не наблюдалось никакого специфического дозозависшого конкурентного ингибирования вплоть до концентрации 1000 мкМ.

Получешше результаты позволили сделать вывод о том,что для распознавания гликопептида МА Е6/1.2 требуется наличие остатка Я-ацетилглюкозамина,поскольку не наблюдается никакого ингибирования связывания этого МА с СМБР-АЪ в присутствии МОР.Причем необходимо наличие именно дисахаридного фрагмента ИсКАс-МщШс.так как ни П-ацетилглюкозамин,ни И-ацетилмура-мовая кислота поотдельности не оказывали заметного конкурентного действия.При отсутствии пептидной части в молекуле антигена сродство МА Е6/1.2 к нему падало примерно в 100 раз, что говорило о том,что аминокислотные остатки вносили значительный вклад в связывание СМБР с этим МА. В то же время за-

Рис.4. Конкурентное ингибирование взаимодействия MA Е6/1.2 с конъюгатом GMDP-АЪ в присутствии GMDP ("), LL-GMDP (+), МБР (□) или GlcNAc-MurNAc (*).

юоо

Концентрация конкурирующего агента (м*М)

мена остатка D-iGln на L-изомер практически не влияла на сродство MA Е6/1.2 к антигену, т.е. относительная конфигурация остатка iGln оказалась,в данном случае, не столь уж важна. Как можно было ожидать, введение с-концевого остатка лизина не влияло на узнавание антигена MA Е6/1.2.

Достаточно трудно было провести сравнение связывающих свойств полученных нами MA Е6/1.2 со свойствами гипотетических рецепторов МП из-за отсутствия данных по прямому связыванию различных аналогов МП с клетками-мишенями.Однако сравнение результатов опытов по конкурентному ингибированию связывания GMDP с АТ1 в присутствии аналогов GMDP с данными,полученными Сумарокой с соавт.(1991) по влиянию этих же конкурирующих агентов на взаимодействие GMDP с внутриклеточными GMDP-связывакхцими молекулами клеток миеломоноцитарной линии WEHI-3, указывало на сходство связывающих характеристик МА Е6/1.2.И вышеуказанных клеточных рецепторов.Это свойство МА

Е6/1.2,наряду с его высокой аффинностью и специфичностью по отношению к ИИР,свидетельствовало о перспективности использования данного МА для получении анти-Ш МА,несущих внутренний образ гликопептида, и обладающих соответствующей антире-цепторной активностью.

В связи с началом применения лекарственной формы СШР в клинике для профилактики септических осложнений при сложных хирургических вмешательствах, лечения хронических легочных инфекций и др. возникла необходимость разработки тест-системы для определения содержания этого гликопептида в различных биологических пробах.

Нами был разработан твердофазный ишуноферментный метод определения ИГОР с использованием МА Е6/1.2,принцип которого заключается в конкуренции между сорбированным на твердой фазе конъюгатом СМБР-АЬ и свободным С.МОР образца за йШР-свя-зывающие центры ГЛА Еб/1.2, находящегося в растворе.

Предложенная система позволяет обнаружить 100 нг/мл ИШР и в 3-500 раз превосходит по чувствительности большинство физико-химических методов,используемых в настоящее время для этой же цели, таких, например, как колориметрический тест, аминокислотный анализ или комплексный метод, включающий га-зо-жидкостную хроматографию и масс-спектрометрию.

2. Получение антиидиотипических моноклональных антител к СМБР и их иммунохимическая характеристика.

При получении анти-Id МА к GMDP мы остановили свой выбор на методике многократной иммунизации мышей ВАЪВ/с Fab-фрагментами МА Е6/1.2, конъюгированными с белком-носителем.

С целью получения Fab-фрэгментов (Fab Еб/1.2) препарат МА Еб/1.2, очищенного на аффинной колонке с иммобилизованным GMDP-Lys,подвергали обработке папаином.Очистку Fab Еб/1.2 из папаинового гидролизата проводили с помощью анионнообменной хроматографии на DEAE-носителе в линейном градиенте NaCl от О до 0,5 М. Собранные фракции проверяли с помощью прямого твердофазного ИФА на способность взаимодействовать с GMDP-

АЪ, а также подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих и невос-станаьливающих условиях.

Основная масса белка сошла с колонки FPLC Mono Q 5/5 при прскызке стартовым буфером (пик I, рис.5). Этому яз пику соответствовал максимум активности при тестировании на вгитао-действие с GMDP-AL. Данные электрофореза свидетельствовали о том, что пик I представляет собой ' гс.-догтлыЗ препарат Fab Е6/1.2 (Рис.6).

Конъюгат РаЪ Кб/1.2 о метилированным Сычьим сывороточным

2,0-

10.5

ïi:

tcij;

И lit

__rr^U-

0 5 "0 15 20"

объем эгюата (мл! Рис:. 5.Получен;:е РаЪ-нфрагментов MA ÏS/1 Ионообменная 7-ро:"атог'оа''; VI m-паиноього птдролнзет:: MA EG/1 .2 :;a 7PVI

'■!оло Q

Фрагцин, ъззн'.'о.ззпе :иие о (ГФР-О'/А р црямо:.! тве-рд'.'-'разнем МСЛ.

- 94kD -57

-30 -20

згого

lo-

Рпо, 0'"ектрс.T'"pj'r:r:oci'?;.1.

получ'^пгнх нее;«; ~

".'-13'О.": 7.гс; 'З'ЗЗГЗ"' 1 3 i 373Т.-

глл.2, :.< h

п::::з 1 -У'■".*>, ; п ■з- crip^r;:;: ззиз II (:-рЗ'Зз~ f/""; ) ,рзздпзз;:зз.:з соств'?': з гз'/ззз в гоост.зн.зз.¡нрзкзззх.( 1 il 2) и гзвос-стояяш.'тзаг.дос (-1 и 5) уплогаях; 3-калнбрсг.очиая скэсь белков для электрофореза.

альбумином(Fab Е6/1.2-MeBSA) был синтезирован с помощью EDC. Проверка конъюгата с помощью прямого твердофазного ИФА показала, что Fab-фрагшнты в составе конъюгата не утратили способности взаимодействовать с GMDP. Это обстоятельство было для нас чрезвычайно важным,поскольку оно доказывало сохранение нативности структуры GMDP-связывающего сайта МА Е6/1.2.

Поскольку работа по получению анти-Id МА в сингенной системе исключала возможность использования в твердофазном ИФА конъюгатов антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена в качестве детектирующих АТ.то для тестирования иммунных мышиных сывороток и гибридомных супэрнатантов мы выбрали биотин-стрептавидиновую систему.

Мышей ВАЪВ/с пятикратно иммунизировали смесью конъюгата Fab Еб/1.2-MeBSA с полным или неполным адъювантом Фрейнда путем внутрибрюшинных инъекций. Спустя 3 недели после пятой инъекции животных бустировали в течение 3-х последующих дней тем ке конъюгатом,вводя его внутрибрюшинно в физиологическом растворе. На 4-е сутки иммунные спленоциты гибридизовали с клетками миеломной линии SP2/0-Ag14.

Положительные клоны отбирали на 10-14 сут по способности продуцируемых ими АТ, сорбированных в лунках микропланшета, взаимодействовать с оиотинилированными Fab-фрагментами МА Е6/1.2(РаЬ Еб/1.2-В) в прямом твердофазном ИФА.Отрицательным; контролем служили лунки с сорбированным в них культурзльным супернатантом от миеломной линии SP2/0-Ag14. Данный тест позволил выявить 42 анти-Id клона,специфичных к антигенным детерминантам вариабельной области МА EG/1.2,уровень активнос--......... в 0-12 раз превышал контроль.

Анти-Iü АТ подразделяются в зависимости от локализации идиотопа (к которому они специфичны) на молекуле иммуноглобулина на следующие виды: 1 )АТ2а- узнающие идиотопы, локализованные на каркасных участках вариабельных областей;2)АТ27-узнающие паратопассоциированные идиотопы; 3) АТ2(3- антипара-тошше.или гомотела, несущие внутренний образ эпитопа антигена внутри своего паратола;4) АТ2е- так называемые эпитела, связывающиеся с идиотопом молекулы АТ1, а также с эпитопом

самого антигена.Из определения еледует,что, АТ27 и АТ2(3 способны конкурировать с лигандом за связывание с АТ1, а АТ2а-нет.

Для выявления анти-Id гибридомных клонов, продуцирующих МА на паратопассоциированные детерминанты 1АА Е6/1.2, культу-ральные супернатанты от них проверяли на способность ннгиби-ровать взаимодействие Tab Еб/1.2-В с GMDP-OVA,сорбированным на мккропланшете, в конкурентном твердофазном ИФА.

Результаты конкурентного анализа показали,что из 42 исходных клонов только 7 продуцировали АТ2,специфичные к пара-тспассоциированным детерминантам молекулы MA Е6/1.2. Кривые ингибирования взаимодействия Pab Еб/1.2-Б с GMDP-OVA в присутствии этих сеют анти-Id МА представлены на рис.7.

I.»

ЮОр

Рис.7.Ингибирование взаимодействия бИОТИБШПфО-ванных РаЬ-фрагмектов МА Еб/1.2 с GMDP-OVA при добавлен™ антиидкотипи-ческих моноклональных антител к GMDP: E1 Q), С5 О, СЮ (А), ЕЭ О, В4 (X), Еб (Д), D3 (ф).

После двукратного клонирования методом лимитирующих разведений по результатам прямого и конкурентного ИФА были выделены 8 наиболее активных субклонов, продуцирующих анти-Id МА,специфичные к паратопассоциированным детерминантам молекулы МА Еб/1.2 (См.таблицу 1).Следует отметить,что гибридомы C5/F3 и C5/F8 являлись субклонами одного исходного клона С5.

Анти-Id МА нарабатывали в асцитах и выделяли из асцитной жидкости с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммо-

билизовгнннм МА Е6/1.2 или с помощью каприловой кислоты. Полученные препараты проверяли на активность в прямом и конкурентном твердофазном ИФЛ, чистоту оценивали с помощью БКЗ-злэктрсфзр&за в 10% полиакриламвдном геле.При использовании сбопх способов очистки анти-Ш МА полностью сохраняли активность, а чистота препаратов составляла 80-55%.

С помощью твердофазного ИФЛ с использованием коммерческих зптисыворстск против субклассов иммуноглобулинов мыши были определены классы и субклассы анти-Ш МА к вЖР, для некоторых из них по методу (Веаиу,1986) была определена константа связывания с МА Е6/1.2. Результаты представлены в таблице 1. Все исследованные знтк-Ш !>!А имеля легкую цепь ае-типа.

Таблица !. йкмунехякическке свойства антн-16. МА к СМБР.

Шифр клопа Субкласс Кокстакта связывания с биотини-Ентпте.л лроггпныма Fab Еб/1.2, М"'

ь- 36 т :

05/ ГЗ X¿ál21 í,7-1 O8

С5/Т8 1,2"10S

С10-'Р9 l£.13 K/O

D3/G4 E/O

ib 52 : :G1 5,5"10T

. i;.:- H/O 2,7"íO7

V ; • п I,.;.-1

Пр:;- nr-xiqraíos а^яш'зочпцэяшх антк-Ы \!.1 ка cao--;абаазна аа..-ас?аааааъ а нрдаам 'ггардсггазнем ПаА с GfíDr-

;.:.,са::С;!аааа:нтнм на покрали,чт; таким cloílct--

гам ссазаала едтг.-Хй У А. СЮ-ТЭ. На осноьакгм того, что данное анаа:-1а !/.-'• аангааадаан азк с бп?т;пп'.лпр0ьин*1ы\:п Fab Е5'1.2, так и с анааг-ке;,;- нонаагата?.; 0М1!?-А1.,-снс било oí-

пазанс а ал;:а ' .Га, или эа;ааа.а.

;!:.:с-г;с:=ся да:пн:е не позволяли определить, каккз уа ас-тавзткся ~ алокзв вырабатывали ¿T26, несущие ьнухрекн;:^ образ GMT?. Вследствие этого возникла ябсбходгкйость ггроззд=1С1Л

исследований биологических свойств полученных нами анти-Id МА к GMDP.

3 Поиск антиидиотшшческих моноклональных антител, несущих внутренний образ GMDP.

3.1. Индукция анти-анти-Ш ответа.

Одним из методов классификации анти-1й АТ является исследование свойств индуцированных ими анти-анти-Ш АТ (АТЗ), поскольку АТ2р,в силу своей способности имитировать исходный антиген, способны при введении знтотным вызывать образование антигенспецифичных АТЗ с иным,чем у АТ1 идиотипом.

Для индукции анти-анти-Ш гуморального ответа самок мышей Р1(СВАх С57ВЬ/6) пятикратно иммунизировали препаратами анти-Ш МА к ЯШР в дозе 10мкг/мышь с интервалом в 2 недели. Первые две инъекции проводили в неполном адъюванте Фрейнда.а остальные- в фосфатно-солевом буфере,рН 7,4 (ФСБ).Спустя еще неделю иммунные сыворотки исследовали на наличке АТЗ, специфичных к ИШР.с помощью прямого и конкурентного тзердофззно-

Рис.8.Конкурентное инги-бирование взаимодействия сывороток мышей Р1(СБА х C57BL/6), иммунизированных антиидиотипическим моноклональным антителом В4/В6 (X), C5/F3 (П), C5/F8 О, C10/F9lA),D3/G4((», Е1/В2 ©),E6/F2 ^),либо Е9/С2 О)» с конъюгатом GMDP-AL в присутствии свободного GMDP.

Несмотря на то,что практически все иммунные сыворотки в той или иной степени взаимодействовали с конъюгатом GMDP-AL, специфическое дозозависимое ингибирование в присутствии свободного GMDP наблюдалось только в случае сывороток мышей.иммунизированных препаратами анти-Id МА С5/РЗ, C5/F8 или Е1/В2 (Рис.8),причем в этих трех случаях специфическое дозозависимое ингибирование в присутствии свободного GMDP наблюдалось для 100% иммунных сывороток.

Таким образом было показано,что из восьми анти-Id МА к GMDP только МА C5/F3,C5/F8 и Е1/В2 обладали способностью индуцировать образование GMDP-специфичных АТЗ у животных,отличающихся по аллотипу от мышей линии BALB/c. Следовательно, только они могли нести внутренний образ GMDP.

3.2. Исследование адъювантных свойств анти-Id МА к GMDP.

Наиболее веским доказательством принадлежности анти-Id AT к виду AT2ß является их способность имитировать биологические эффекты исходного лиганда.

GMDP обладает таким ценным качеством как способность повышать гуморальный ответ к белковым и корпускулярным антигенам.В частности, известно,что при совместном введении GMDP и овальбумина(ОУА) и последующем введении OVA без GMDP на 28-е сутки наблюдается заметное повышение титра AT к OVA.

Мы исследовали адъювантные свойства полученных анти-Id МА к GMDP по их. способности повышать гуморальный ответ к этому же белковому антигену. Для этого каждую из 8 групп самок мышей BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно смесью 25 мкг OVA с различными дозами какого-либо анти-Id МА к GMDP в физиологическом растворе.Группы мышей, служившие положительным контролем,получали инъекцию смеси 25 мкг OVA с различными дозами GMDP,а группа животных,выполнявшая роль отрицательного контроля- инъекцию 25 мкг OVA в физиологическом растворе без какого-либо адыованта.На 14 и 28 сутки всех животных иммунизировали внутрибрюшинно препаратом OVA в физиологическом растворе в дозе 12,5 мкг/мышь.Через неделю после третьей инъекции сравнивали титр специфичных к OVA AT в сыворотках

мшей с помощью прямого твердофазного ИФА.

Из представленных на рис.9 данных видно,что одновременное введение OVA с различными дозами анти-Id МА C5/F3 или C5/F8 вызывало увеличение титра AT к OVA соответственно в 3,7-11 раз (у 80-100% мышей) и 2-9 раз (у 87% мышей), причем четко выявлялся дозозависимый характер эффекта. Величина индекса стимуляции (N) при совместном введении OVA с любыми другими анти-Id МА к G1IDP была значительно более низкой (не превышала-2 для максимальной исследованной дозы) и не зависела от количества введенных анти-Id МА.

Рис.9.Адъювантное действие антиидиотипичес-ких монсклональных антител к GMDP. Индекс стимуляции (N) равен отношению титра антисыворотки Тк, получен-, ной при введении OVA без адъюванта, к титру антисыворотки Т ,полученной с использованием определенней дозы антиидиотипических антител или GIÍDP:N=TK/T

Проведенные исследования позволили заключить,что гибри-домные клоны C5/F3 и С5/Р8 продуцировали анти-Id МА, относящиеся к виду AT2ß, несущие внутренний образ GJíDP. Они имитировали биологическое действие GMDP In vivo при индукции гуморального ответа на OVA, исходя из чего можно было предположить, что указанные анти-Id МА будут обладать способностью взаимодействовать с активными центрами клеточных рецепторов мурамилпептидов.

Следует отметить интересные свойства анти-Id МА Е1/В2,

Лэээ ахыванта ^Га 1 txt/ш! ÜZ] 5 цкг/ил _j Ю «кг/к.л

ГП '00 ихг/ыл

обладающего способностью вызывать GMDP-специфичный ответ, но не проявляющего адъювантного действия в тесте in vivo.На основании имеющихся данных его нельзя было отнести однозначно ни к АТ2р,ни к АТ27, и нельзя было исключить ситуацию, при которой данное анти-Id МА играло бы роль антагониста интересующего нас рецептора,т.е. оно взаимодействовало бы .с GMDP-связывающими молекулами клеток-мишеней,будучи,тем не менее, неспособным запускать цепь дальнейших событий, необходимых для реализации биологического эффекта'.

3.3 Исследование взаимодействия анти-Id МА с GMDP-связываю-щими молекулами клеток-мишеней.

Поскольку основными мишенями МП являются клетки макро-фагального ряда,мы использовали в работе клетки миеломоноци-тарной линии WEHI-3, галеицие две популяции внутриклеточных сайтов связывания GMDP с константами диссоциации лиганд-ре-цапторного комплекса равными 21 и 540 нМ (Sumaroka,1991).Общее число сайтов, специфически связывающих GMDP, составляло около 30000 на одну клетку.

Исследования взаимодействия-меченых флюоресцеинизотио-цианатом(FITC) анти-Id МА к GMDP с фиксированными формальдегидом и перфорированными ß-сктилглюкозидом клетками линии VTEHI-3, проведенные с помощью метода поляризации флуоресценции Котовой О.В. и Литвиновым И.С.(неопубликованные данные), показали, что анти-Id МА C5/F3, C5/F8 и Е1/В2, равно как и кзнъюгат GMDP-FITC, взаимодействовали с внутриклеточными GMDP-связывающими участками клеток-мишеней.Причем для каждого из вышеперечисленных анти-Id МА, как и для самого GMDP, существовало по две популяции сайтов связывания.различающихся по константе диссоциации лиганд-рецепторного комплекса.

Эксперименты по конкурентному ингибированию показали,что добавление возрастающих количеств анти-Id МА C5/F3.C5/F8 или Е1/В2 к суспензии перфорированных клеток,обработанных конъю-гатом GMDP-FITC,приводило к постепенному уменьшению связывания последнего с GMDP-рецепторами клеток линии WEHI-3.

Эти результаты доказывали тот факт, что GMDP и анти-Id

MA C5/F3.C5/F8 и Е1/В2 взаимодействовали с одними и теми же внутриклеточными сайтами клеток-мишеней. Таким образом полученные данные подтвердили правильность ранее сделанного вывода о принадлежности анти-Id МА C5/F3 и C5/F8 к виду AT2ß,a также позволили отнести к этой категории и анти-Id МА Е1/В2. Результаты исследования биологических свойств анти-Id МА к GMDP суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Биологические свойства анти-Id МА к GMDP.

Шифр Индукция GMDP- Адъювантное Взаимодействие Вид АТ2

клона специфичных АТЗ действие с внутриклеточными GMDP-связы-вающими сайтам! клеток WEH1-3

В4/В6 - 1

C5/F3 + + + ß

C5/F8 + + + 0

С1 0/F9 - - £

D3/G4 - - 7

Е1 /В2 + - + ß

E6/F2 - - 7

Е9/С2 - - "Г

С целью определения того,насколько полученные нами AT2ß пригодны для дальнейшего изучения рецепторов GMDP, совместно с Т.Н.Головиной, было проведено исследование взаимодействия анти-Id МА C5/F8 с белками клеток-мишеней. Для этого клетки' линии WEHI-3 подвергали осмотическому шоку в буфере,содержащем СаС12 и фенилметилсульфснилфторид, и путем ультрацентрифугирования выделяли мембранную фракцию,которую подвергали SDS-электрофорезу в восстанавливающих условиях. Разделенные белки переносили далее на нитроцеллюлозную мембрану, и полученные реплики обрабатывала последовательно препаратом анти-Id МА C5/F8, конъюгатом AT кролика против иммуноглобулинов

Рис.Ю.Иммуноблоттинг лизата клеток линии ÏÏEHI-3. А-обработка антиидиотшшческим MA С5/Р8(слева); то же в присутствии свободного GMDP (справа).В- обработка MA 1ЖВ-1 без GMDP(слева) и в присутствии свободного GMDP(справа).Обе реплики затем обрабатывали коныогатом кроличьих AT против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена.

мыши с пероксидазой хрена,а затем проявляли с помощью смеша-ного хромогенного субстрата.

Проявление нитроцеллюлозных реплик позволило выявить связывание НА С5/Р8 с белковыми полосами 180, 45,32-34 и менее 30 кДа (Рис.1 OA,слева). На контрольной мембране,окрашенной индифферентными MA того же субкласса, связывание с зыше-

?мянутымя белковыми полосами отсутствовало (Рис.1 OB,сло-ъъ . Специфичность связывания подтверждалась также данными ингибиторного анализа: в том случае, когда обработку C5/F8 проводили б присутствии GMDP,никакого связывания с вышеупомянутыми белковыми полосами не наблюдалось (Рис.1 OA,справа). Таким образом полученные результаты свидетельствовали о том, что антп-IcL Î.LA. C5/F3 специфически распознавало СШР-связыва-ксие молекулы клеток липки WEHI-3, и хорошо коррелировали с данны:д1 других исследователей. Так Головина с соавт.'(в печати) идентифицировали с помощью метода фотоаффиш-юго мечения 0,:ЗР-связыва:-хие белки с молекулярными массами 32-34,38 и 43 :-:Дз в препаратах мембранных фракций лизировзнных перитоне-альшх макрофагов мыши и клеток лгали ТГЕН1-3- Помимо этого работами французских исследователей (Tenu, 1989) было показано, что Щ)Р специфически взаимодействовал с полипептидом 4045 к£а альвеолярных макрофагов ьиви. Однако,связывание МП с вдсоксмзлекуляршаз: белками ранее никем не отмечалось,поэтому вопрос о принадлежности белкз 180 кДа к рецепторам ш требует дальнейшего исследования.

г 7T7W1 ТГГ7_ W^»

С4_> 67_t>

43.

->

-21-ВЫВОДЫ

1. Впервые получен клон гибридных клеток.продуцирующий высокоаффинное моноклональное антитело, взаимодействующее с N-ацетилглюкозаминил-р(1-4)^-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглу-тамином (GMDP). Проведена биохимическая и иммуноХимичеекая характеристика этого антитела.

2.Впервые получены гибридомы,продуцирующие антиидиотипичес-кие моноклональные антитела к GMDP.Проведена биохимическая и иммунохимическая характеристика антиидиотипических антител.

3.Показано,что три клона гибридных клеток продуцируют антии-диотипические антитела вида (3, несущие внутренний образ GMDP и распознающие GMDP-рецепторы клеток-мишеней,причем два антитела способны имитировать адъювантное действие GMDP In vivo.

4.Продемонстрировано взаимодействие антиидиотипического антитела C5/F8 с GMDP-связывающими белками лизата клеток линии WEHI-3.

Основные результаты диссертационной работы " изложены в - следующих публикациях:

1.Мареева Т.Ю..Котова 0.В.,Макаров Е.А..Андронова Т.М.,Несмеянов В.А. "Получение и характеристика моноклональных антител к Н-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-Ы-ацетилмурамоил-аланил-Б-изоглутамину".Биоорганичеекая 'химия.1993.т.19.N5.стр.555-561

2. Mareeva T.Yu..Kotova O.V..Lltvinov I.S..Nesmeyanov У.А. Interaction antl-ldlotypic antibodies with muramyl peptide-bindlng sites. //Symposium "Structure and function of regulatory polipeptides", Moscow,1992, Abstracts, p.32.

3. Mareeva T.Yu..Kotova 0.;V..Golovina T.N..Nesmeyanov V.A. "Production and characterization of monoclonal antl-idioty-pic antibodies to muramylpeptide", FEBS Letters,1994,v.356. p.13-16.