Структурно-функциональное исследование искусственного биокатализатора, полученного на основе антиидиотипического антитела тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Смирнов Иван Витальевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА, ПОЛУЧЕННОГО НА ОСНОВЕ АНТИИДИОТИПИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2008 ' ООЗ16789В

003167896

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: Член-корреспондент РАН, доктор химических

наук, профессор

Габибов Александр Габибович;

Кандидат биологических наук Пономаренко Наталья Александровна

Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН, доктор химических

наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич

Доктор химических наук, профессор, Румш Лев Давыдович

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится 20 мая 2008 года, в 17.00 на заседании Совета Д501.001.41 по химическим наукам при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.40, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 18 апреля 2008 года.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы.

Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем осуществляются при участии ферментов.

В последнее время с использованием методов генетической инженерии и направленной химической модификации в некоторых случаях удалось создать ферменты с измененной субстратной специфичностью. В ряду каталитически активных молекул особенное место занимают рибозимы - каталитические молекулы РНК и абзимы - каталитические антитела.

Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.

Создание каталитических антител с протеолитической функцией является весьма сложной задачей. Она оказывается практически невыполнимой с помощью подхода с использованием аналогов переходных состояний в качестве исходных гаптенов. Антительная матрица, специфически связывающаяся со структурой, мимикрирующей тетраэдр, эффективна в качестве биокатализатора эстеролиза, но не способна осуществить более сложные превращения, требующие эффективных конформациояных подстроек в комплексе биокатализатор - белковый субстрат.

Одним из способов создания протеолитических антител является получение антиидиотипических антител к протеазам, т.е. антител, направленных к области связывания антигена у антител, узнающих, в свою очередь, участок активного центра протеаз. Эффективность этого метода была ранее продемонстрирована на примерах получения каталитически активных

антиидиотипических антител к ацетилхолинэстеразе и Р-лакгамазе. Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».

Цель работы и основные задачи исследования

Основной целью работы было структурно-функциональное исследование антиидиотипического антитела 6В8-Е12, полученного к участку активного центра эндопротеиназы субтилизин Карлсберг.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать каталитическую активность антитела

2. Провести клонирование антиидиотипического антитела 6В8-Е12 и определить его первичную структуру.

3. Создать генетическую конструкцию для экспрессии антитела в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела, провести экспрессию рекомбинантного одноцепочечного антитела и определить его функциональную активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследования антиидиотипического антитела 6В8-Е12 к субтилизину Карлсберг показали, что данное антитело способно расщеплять эфирную связь, а также пептидную связь как в составе п-нитроанилидных производных пептидов, так и белков. Абзиматическая природа каталитической активности была доказана при помощи зимограммы. Специфичность взаимодействия идиотип-антиидиотип была определена методом поверхностного плазмонного резонанса. Ингибирование протеолитической активности абзима при действии классического ингибитора сериновых протеаз - фенилметилсульфонил фторида (РМБР) предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка. Эксперименты по определению специфичности протеолитического антитела показали общее

сходство со специфичностью «родительского антигена» субтилизина Карлсберг.

Клонирование идиотипического антитела 5-Н4 и антиидиотипического антитела 6В8-Е12 позволило определить нуклеотидную последовательность и предсказать первичную структуру изучаемых антител. Сравнительный анализ первичных структур «родительского антигена», субтилизина Карлсберг, и его каталитически активного антиидиотипа - антитела 6В8-Е12 - показал отсутствие каких-либо схожих мотивов в указанных последовательностях. Таким образом, их каталитическая функция закодирована в абсолютно разных последовательностях. Экспрессия рекомбинантного антиидиотипического антитела в виде одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным экспериментальным подходом, доказывающим принадлежность обнаруженной активности данному белковому продукту.

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию путей получения искусственных биокатализаторов. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методик индукции протеолитических антител, расщепляющих различные белковые субстраты. Разработанные методические подходы к анализу ферментативной активности протеолитических антител могут быть использованы для изучения различных природных каталитических антител.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на Международной Конференции Биокатализ 2005 (С.-Петербург - Кижи - Валаам, 2005), XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2006), XIX зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2007).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и

списка цитируемой литературы, включающего 142 ссылки. Диссертация изложена на 103 страницах и содержит 26 рисунков и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящее исследование проводилось в кооперации с коллегами из технологического университета Компьена (Франция). Ранее, в лаборатории инженерии ферментов этого института были получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитело 6В8-Е12. Данное антиидиотипическое антитело было получено при иммунизации мышей линии Balb/c идиотипическим антителом 5-Н4. Антитело 5-Н4, полученное, в свою очередь при иммунизации мышей линии Balb/c субтилизином Карлсберг, обладало способностью связываться с активным центром фермента и специфически ингибировало его протеолитическую активность. На первом этапе исследований методом иммуноферментного анализа (ELISA) было отобрано несколько десятков моноклональных антител, узнающих вариабельный фрагмент идиотипа 5-Н4. Далее, было высказано предположение, что антитела к идиотипу могут обладать протеолитической функцией. Таким образом, на следующей стадии гибридомные клоны, продуцирующие антитела, специфичные к 5-Н4, тестировали на наличие протеолитических абзимов. Очищенные антитела, выделенные из соответствующих клонов, были протестированы на способность гидролизовать хромогенные субстраты субтилизина sAAPFpNa и sGGLpNa. Из всей панели проанализированных клонов антитело 6В8-Е12 наиболее эффективно катализировало гидролиз обоих субстратов, поэтому оно и было выбрано для дальнейших исследований.

В нашу задачу входило проведение детального структурно-функционального исследования антиидиотипического антитела 6В8-Е12.

Исследование каталитической активности

антиидиотипического антитела 6В8-Е12.

Для изучения протеолитической активности антитела были предварительно очищены методами аффинной хроматографии с использованием протеин С-сефарозы и с использованием аффинного сорбента - иммобилизованных на сефарозе антител козы к иммуноглобулинам мыши, а также ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

1 I Субтшшшн Карлсберг 6В8-Е12

Субстрат I ^ 1 мин1 мМ мМ"'-мин' мин"' Кы \ ктт/Ки мМ | мМ~'-мин'

ААРРр^* ' (1Л=0Л5>104 0,20=0 03 (5 5±1.б>104 вОТ^а* | (4 32±0 63)' 102 0 26=0 05 (1 бб±0 .56)-103 к-нитрофешш ' | 24*4 5 145=0 34 17±6 9 ацетат 15±0.2 1.4±0.3 11±0 37 0.5±0.0б 3 2±0 5 0.2±0.04 16 2±3.7 2 б±0 7 б 2±3.1

Таб. 1. Кинетические параметры для реакций амидолиза и зетеролиза субтияизшюм Карлсберг и антителом 6В8-Е12 (* - данные получение ранее [Габибов А.Г. и др,

2002])

Полученные ранее данные по гидролизу низкомолекулярных субстратов вААРРрШ и зОСЬрЫа были дополнены результатами по эстеролизу и-нитрофенилацетата (Таб. 1).

Очевидно, что каталитическая эффективность (ккат/Км) в реакции с яААРРрШ и для субтилизина и для антитела выше, чем для реакции яООЬрЫа, что предполагает сходную субстратную специфичность между ферментом и антителом. Как видно из таблицы 1, в случае п-нитрофенилацетата каталитическая эффективность сравнима, что можно с одной стороны объяснить слабой эстеролитической активностью субтилизина, или, с другой стороны, тем, что измеряемая активность является фоновой для протеаз и обусловлена низкой энергией активации реакций эстеролиза.

Детекция протеолитической активности абзима проводилась при помощи метода, основанного на разгорании флуоресценции при протеолитическом расщеплении белка, избыточно меченного флуорофорной группой. Прохождение реакции детектировалось по разгоранию флуоресценции во времени по сравнению с контролем. В качестве модельной протеазы для определения чувствительности данного метода, и временных изменений сигнала в зависимости от количества субстрата и фермента использовался трипсин.

35

я 30 и

£ 25 о

§20 к

а 15

0 §•10

1 5

0

36 4: Время, ч

Было показано, что данным

методом можно достоверно

детектировать наличие 0.1 нг

трипсина в пробе. Изменение

сигнала при исчерпывающем

трипсинолизе составило для

БСА-ФИТЦ 235 отн. ед.

Протеолитическая активность

наблюдалась как в случае

полноразмерного антитела 6В8-

Е12, так и в случае его БаЬ-

фрагмента, в то время как

увеличение флуоресценции в

случае амидазного антитела

4Н7-НЗ, гидролизующего

яААРРрИа, сводилась к

фоновым значениям (Рис. 1).

Эндопротеиназная

активность антитела 6В8-Е12

уменьшалась при добавлении в Рис. 2. Иигибирование гидролиза антителом 6В8-Е12.

0,16 мкМ БСА-ФИТЦ инкубировали с 0,5 мкМ абзима в Реакционную смесь апротинина

отсутствии (♦) или в присутствии 1 мкМ апротинина (■) ц практически сводилась до или 10мкМРМ8Р(А).

Рис. 1. Гидролиз субстрата БСА-ФИТЦ полноразмерным антиидиотипическим антителом 6В8-Е12 (черный) и его РаЬ-фрагмеитом (серый). Антитело 4Н7-НЗ использовали в качестве отрицательного контроля.

фоновых значений при действии классического ингибитора сериновых протеаз - РМББ, что предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка (Рис. 2).

С целью доказательства абзиматической природы катализа был поставлен эксперимент по ингибированию протеолитического расщепления БСА-ФИТЦ в присутствии идиотипического антитела 5-Н4 (Рис. 3).

Из результатов эксперимента видно, при мольном соотношении фермент:ингибитор 1:1 наблюдается падение активности всего на 15%, |>5 2 2-5 3 и даже при троекратном

[5-Н4], мкМ

Рис. 3. Мигрирование БСА-ФИТЦ гидролиза избытке ингибитора

идиотшшческим антителом (5-Н4). Концентрация активность не исчезает 6В8-Е12 сохранялась постоянной 1 мкМ, концентрация

5-Н4 изменялась от 0 до 3 мкМ. Относительная полностью. Эти факты, активность рассчитывалась как отношение скорости

гидролиза субстрата в присутствии 5-Н4 к скорости СК0Рее всег0> обусловлены

гидролиза БСА-ФИТЦ в отсутствии идиотипа. стерическими

затруднениями при ингибировании. Действительно, антитела достаточно крупные белки, и имеют два связывающих центра на одной молекуле, таким образом, связывание возможно только одним центром, а второй в это время будет стерически недоступен. Молекула субстрата (БСА-ФИТЦ) примерно в 2,5 раз меньше, следовательно, ей будет не так сложно связаться со свободным активным центром и затем гидролизоваться. Полученные результаты также свидетельствует о том, что каталитическая активность связана с антителом и активный центр находится в антигенсвязывающем центре.

Степень взаимодействия идиотип-антиидиотип оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Эксперимент был проведен в Технологическом Университете г. Компьень (Франция). Рассчитанная

константа комплекса составила 4,75-10" М, что свидетельствует о высокой аффинности взаимодействия.

Альтернативное подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих ферментативных примесей нами было получено с помощью исследования соответствующих зимограмм.

6В8Е12 Трипсин

■

- "1

I... . .«зЩЯ 1 ■

-ТрШ'К'ИН

Анализ зимограммы (Рис. 4) показывает, что интенсивность флюоресценции наблюдается у белков с М\у~150 кДа (дорожки 2,3), в то время как флюоресценция контрольных антител (дорожка 1) отсутствует. Это однозначно свидетельствует о том, что протеолитическая функция связана с антителом, а не с присутствием

контаминирующих протеаз.

Для исследования

полученного

2 3 4 5 Рис. 4. Зимограмма препарата моноклонального антитела 6В8-Е12. Антиидиотипическое антитело 6В8-Е12 100 нг (дорожка 2) и 200 нг (дорожка 3) подвергали элекгрофорети чес кому разделению в 10%

ПЛЛГ в присутствии флуоресцентного субстрата БСА-ФИТЦ внесенного в гель при полимеризации. В специфичности качестве положительного контроля был взят трипсин в количестве 100 пг (дорожка 4) и 1 нг (дорожка 5). антиидиотипического

Мышиное моноклональное антитело против эпитопа

человеческого белка Мус (200 нг) использовали как каталитического антитела был отрицательный контроль (дорожка 1).

проведен масс-

спектрометрический анализ продуктов протеолиза некоторых природных биоактивных пептидов (Рис. 5).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что большинство исследованных пептидных субстратов имеют сайты расщепления, содержащие ароматические и алифатические аминокислотные остатки до или после сайта, что во многом соответствует субстратной специфичности «родительского антигена» - субтилизина Карлсберг. При этом заряженные

аминокислотные остатки не присутствуют в районах специфического разрыва пептидной связи данным абзимом, что и объясняет отсутствие гидролиза в случае пептида Substance Р.

Пептиды Абзим 6Б8Е12

Лейцин- энкафелин 1 \ 1 1

Ангиотензин J t Asp-Arg-Val|î>|liè)Hts-Pro-pîë)

Брадшсинии 4 Arg-Pro-Pro-(p^jPhe[-Ser-Pro-Phe-Arg

Кинетензин (Îi^i^Arg-Arg-His-Pi-o|ryr|]Phe[Len

Substance Р Нет гидролиза Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met

Рис. 5. Гидролиз биоактивных пептидов антителом 6В8-Е12. Гидролизуемая

связь указана стрелкой; ароматические аминокислотные остатки (прямоугольник), алифатические аминокислотные остатки (круг). Продукты гидролиза детектировались масс-спектрометричееки.

Для изучения структурных особенностей антител и для экспрессии абзима в гетерологичной системе вариабельные домены легких и тяжелых цепей данных антител были клонированы и определена их нуклеотидная последовательность.

Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12.

Вариабельные (V) домены находятся в N-концевой части цепей иммуноглобулинов. Они состоят из каркасных участков - FWR (framework) и гипервариабельных участков - CDR (complimentarity-determining regions). Больше всего различаются аминокислотные последовательности

гипервариабельных участков, тогда как последовательности каркасных участков достаточно консервативны. Непосредственно к константным областям примыкают J-сегменты и D-сегмент тяжелых цепей. Три уложенных в петли CDR и, в меньшей степени, FW-районы V-доменов каждой из цепей взаимодействуют с антигеном, формируя антигенсвязывающий сайт антитела. Аминокислотная последовательность J-сегментов и D-сегмента тяжелых цепей также оказывает влияние на конформацию антигенсвязывающего сайта.

В силу того, что последовательности ДНК, соответствующие первому FWR-району и С-концевой части J-сегмента высококонсервативны, в пределах вида животных, возможно, клонировать V-гены антител, с использованием наборов праймеров к этим областям.

В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12 использовались соответствующие гибридомы.

Из гибридом 5-Н4 и 6В8-Е12 с использованием Oligotex Direct mRNA Kit (QIAGEN, Франция) была выделена мРНК. Препарат очистили, используя аффинную хроматографию на олиго-dT.

Наработка кДНК и амплификация генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей (FvH и FvL) проводилась методом одностадийного РТ ПЦР. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (VL) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров, соответствующих N-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих J-фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали при помощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательностей тяжелых цепей антител мыши, и обратных праймеров для J-фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+),

обработанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки Е. coli штамма DH5a. Клоны, отобранные в результате бело-голубого скрининга, были дополнительно проверены на наличие вставки нужного размера методом ПЦР с колоний с использованием плазмидных праймеров M13forw и M13rev. Для положительных клонов методом секвенирования по Сенгеру была определена нуклеотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов.

Сравнительный анализ гомологии нуклеотидных последовательностей полученных клонов и опубликованных последовательностей генов семейств зародышевых линий с помощью программы IgBLAST подтвердил их принадлежность к генам иммуноглобулинов мыши, а также были получены данные о принадлежности к тому или иному семейству

Сравнение аминокислотных последовательностей антител 6В8-Е12 и 5-Н4 с последовательностями известных антител и банка последовательностей (Protein Data Bank) показало, что последовательность VH-региона идиотипического антитела сходно с аналогичной последовательностью антитела против белка р24 поверхности вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1. Последовательность вариабельного домена легкой цепи 5-Н4 показало высокую степень сходства с легкой цепью антитела Fl 1.2.32, полученного против протеазы ВИЧ 1, и легкой цепи моноклонального антитела 2b-2F; это антитело ингибнрует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками. Последовательности легких цепей антител 5-Н4 и 2b-2F имеют всего пять различий в аминокислотных остатках, причем только три из них гипервариабельных областях (один расположен в CDR1, два в CDR3). Аминокислотные последовательности легких цепей антител 5-Н4 и Fl 1.2.32 также имеют пять различий и два из них находятся в CDR1. Антитело Fl 1.2.32 имеет интересную структурную особенность: легкая цепь образует «выпячивание» CDR1, формируя подобие «пальца», который

предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1. На основе данных по первичной структуре мы построили компьютерную трехмерную модель одноцепочечного антитела 5-Н4 (Рис.6).

Даная модель была построена с использованием программного обеспечения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомологией, ldzb (анти-лизоцим scFv 1F9) и ljp5 (scFv фрагмент антитела 1696 против протеазы ВИЧ 1).

Анализ ЗБ-модели антитела 5-Н4 показал наличие плоской поверхности, образованной

тяжелой цепью, что характерно для белок-связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, по всей видимости, взаимодействует с активным центром субтилизина и, таким образом, может участвовать в передаче образа этого активного центра посредством идиотипической сети от фермента к антиидиотипическому антителу.

Последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 6В8-Е12 сходна с VH последовательностью апти-СТ)4 моноклонального | антитела Q425 и VH последовательностью антитела 2Н1 - полисахарид

связывающего антитела. VL последовательность антитела 6В8-Е12 показала высокое сходство с последовательностью легкой цепи антитела AN02.

Сравнительный анализ первичных структур субтилизина Карлсберг и антитела 6В8-Е12 - показал отсутствие каких-либо схожих мотивов в указанных последовательностях.

ЗВ-модель для одноцепочечного антитела 6В8-Е12 создавалась I аналогично модели для 5-Н4. В качестве матрицы использовалась lqok (scFv

Рис. 6. Трехмерная модель вариабельного фрагмента идиотипического антитела 5-Н4. Заметны, характерные выстушощая часть легкой цени (1) и плоский участок тяжелой цепи (2).

против анти-карциноэмбрионного антигена), как структура с высокой УН+УЬ гомологией. При анализе этой модели было также установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок-связывающих и пептид-связывающих антител, и широкой «щели» между УН и УЬ СЕЖ участками с высокой концентрацией гидрофобных аминокислотных остатков, что возможно и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6В8-Е12. (Рис. 7)

Наиболее убедительным

экспериментальным подходом, доказывающим принадлежность обнаруженной активности данному белковому продукту, является демонстрация этой активности путем экспрессии соответствующей

последовательности в

гетерологичной системе. Этот подход был использован нами в случае антиидиотипического

антитела 6В8-Е12.

Создание генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела.

Генетическую конструкцию для экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела создавали по следующей схеме (Рис. 8)

На основании полученных данных по определению нуклеотидной последовательности антитела 6В8-Е12 были созданы праймеры соответствующие 1Ч-концевым последовательностям (11, 12) и .[-фрагментам (13, 14) легких и тяжелых цепей. Для клонирования в соответствующий

Рис. 7. Трехмерная модель вариабельного фрагмента антиидиотипического антитела 6В8-Е12. Стрелками указана щель между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

вектор данные праймеры содержали необходимые сайты для эндонуклеаз

рестрикции.

12

14

Г~Ш VH ИВ-ч

f pGEM5Zf(+) J

ПЦР с использованием соответсвующих праймеров

„ 11

«л

ПЦР с использованием соответсвующих праймеров

VH

Рестрикция

по сайту SalI

^ pGEM5Zf(+) ^

ПЦР с использованием соответсвующих праймеров

ш» ^ ¡да да,

VI

Рестрикция , , рестрикция

Ш гяыту Ргн\ I ^ " 1 „л А/я

по сайту Peil

праймеров15 и 13

VL

по сайту Mrol

Лигирование и ПЦР с праймеров 15 и 13 | Рестрикция по сайту Xtol

^ гт

VH

VL

Wofl

- ««а t у

i""" I

Рестрикция по сайтам Ateol и Wotl

Рестрикция по сайтам Ncol и Noll

Лигирование <

С

pelB VH vw VL scFv в pET22N

3

BgЯ1

6xHis

Nott Рестрикция c-myc по сайтам Bgl\\ и Nottm

Рестрикция по сайтам Bgl\\ и Not\

Лигирование

С

pelB |§VH ä^w VL SxH>s c-myc: scFv-His-c-myc в pET22N

Ной }

А

Рис. 8. Схема создания генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела.

Гибкий серин-глициновый линкер ((Ser-Gly^) был создан на основе праймеров 15-17. Линкер соединяли с вариабельным доменом легкой цепи с использованием сайтов Peil и Ncol, соответственно. Полученный фрагмент (линкер-VL) был амплифицирован с использованием праймеров 15 и 13 и лигирован с VH последовательностью при помощи Xhol и Sali сайтов рестрикции.

а

б

в

Конечный фрагмент, содержащий полную последовательность одноцепочечного антитела, был амплифицирован с использованием праймеров 12 и 13, рестрицирован эндонуклеазами Ncol и Notl и клонирован по соответствующим сайтам в плазмидный вектор pET22N, созданный на основе вектора рЕТ22Ь(+) и содержащий Ncol рестриктный сайт в последовательности периплазматического лидера. Дополнительный фрагмент, содержащий последовательности, кодирующие эпитоп с-тус и

шестигистидиновый кластер, был клонирован в конечную конструкцию по сайтам Bglll и Notl (Рис. 8Б).

Для экспрессии

рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli BL21(DE3). Для scFv были подобраны условия

культивирования, приводящие к появлению максимально возможного количества целевого белка в растворимой форме (Рис. 9а). Ночную культуру клеток,

трансформированных необходимой генетической конструкцией, высевали в среду 2xYT в разведении 1:100, подращивали до достижения оптической плотности 0,6 единиц на

як

ШЯИГ .

1 2 3 4 1 2 1 2

Рис. 9. Анализ продуктов экспрессии и очистки рекомбинантного одноцепочечного

антитела, (а) - Электрофоретический анализ экспрессии 8сРу6В8-Е12. дорожки:

1 - белковый маркер; 2 - фракция тотальных клеточных белков до индукции; 3 - фракция растворимых внутриклеточных белков; 4 - фракция нерастворимых

внутриклеточных белков, (б) - Электрофоретический анализ препарата после хроматографической очистки, дорожки: 1 - белковый маркер:

2 - 5сР\'6В8-Е12. (в) - Иммуноблот, дорожки: 1 - предокрашениый белковый маркер, 2 - препарат после хроматографической очистки.

+37°С (1 ч. 40 мин. - 2 ч.). Индуцировали добавлением 1РТС до 0,1 мМ. Растили культуру при +30°С в течение 6 часов. Уровень экспрессии находился в диапазоне 1-3 мг/л.

Одноцепочечное антитело выделяли в нативных условиях методом металл-хелатной хроматографии с использованием сорбента Со2+-ТАЬ(Ж, согласно методике производителя. Дополнительная очистка была проведена с помощью ионообменной хроматографии на колонке Мопо<3 (АтегеЬат) (Рис. 96).

44

-1 1-

39 52 65

ЕУКЬЕЕЗС66ЬУ0РСС5МКЬЗС?АЗСГ1ГЗЫНШЫЙУКйЗРЕКСЬЕИ?АЕХК$КЗХКЗАТНУАЕ

69

Г

78

Г

«о

74 79

5УКСНГТ13КО05К5АУ¥Ъ0МТ0ЬЕТЕ0ТСУУУСЗКЫУУСЗТУ0-ЖабТТЬТУ3336ССС8С6

—I р-

177178

1 Г

162163

1 187

ССЗбСббЗЫМОХЬЬТОЗРАХЬЗУЗРСЕетЗРЗСКАЗОГУбЗЗХНЯУОйНТЫСЗРКЪЬХКУАЗЕЕ

199 246

МЗаРЗКГЗбЗаЗвТОГГЬЗИИТУЕЗЕтАОУУСОЕЗИЗЯРПЕвЗСТКЬЕУКЯОРННННННвЗ

260

1-1

260 275 286

СЕОКЫЗЕЕОЬМЗЗЗУОКЬАААЬЕНННННН

Положение пептида Рассчитанная масса смеси изотопов, Да Измеренная масса, Да Погрешность. % Положение пептида Рассчитанная масса смеси изотопов. Да Измеренная масса, Да Погрешность. %

39-52 1641,8 1641,0 0,05 163-187 2874,2 2875.1 0,03

44-69 2889,2 2890,9 0,06 178-199 2364,7 2369,3 0,19

55-74 2224,5 2225,5 0,04 246-260 1795,9 1798,0 0,12

79-100 2628,9 2625,9 0,11 247-260 1639,7 1639,9 0,01

79-162 8767,5 8760,4 0,08 275-286 1409,5 1410,2 0,05

157-177 2530,8 2532,2 0,06

Рис. 10. Масс-спектрометрия набора триптических фрагментов реетмбинантяого одноцепочечного антитела.

Полученный белковый препарат специфически связывался с антителами против человеческого белка Мус в условиях иммуноблоттинга, это свидетельствует о корректности экспрессии целевого продукта. (Рис. 9в).

Экспрессированный белок также был дополнительно охарактеризован с помощью масс-спектрометрии продуктов его трипсинолиза (Рис. 10). Была проанализирована область спектра 1000 - 9000 Да, что позволило идентифицировать пики тяжелых пептидов, составляющих 64% всей молекулы белка. Полученные результаты свидетельствуют о соответствии экспериментально полученного белка его теоретической пептидной карте.

Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела.

Полученное рекомбинантное антитело проявляло заметную амидазную активность (Рис. 11) по отношению к метилкумариламидным (МСА) субстратам, содержащим алифатические (Met-MCA, Leu-MCA) и ароматические (Phe-MCA) аминокислотные остатки, что соответствует данным по субстратной специфичности исходного антиидиотипического антитела 6В8-Е12.

5J 80 £

Кинетика данных реакций подчинялась уравнению

Михаэлиса-Ментен, что

что

о .10.

0 2 4 б 8 10 12 14

позволило рассчитать их кинетические параметры (Таб. 2). При этом нам не удалось

Время, ч

зарегистрировать нибудь

сколько-

Рис. 1!. Гидролиз МСА-пептидоврекомбинантным

одноцеггочечным антителом scFv6B8-E12. Коцентрацяи абзима 0.75 мкМ и МСА-субстратов по 50 мкМ. (♦) - Met-MCA (А)~Leu-MCA, (■) - Phe-MCA, (») - буфер PBS.

протеолитическую активность по отношению к БСА-ФИТЦ.

значительную

Субстрах ккат ' ^: '!>/! 'у мин1 1 мМ [ мМ^-мин1

МеьМСА РЬе-МСА 1,еи-МСА 0.9±0.2 (6.5±1.8)Т0"2 13.9±б.9 0.45-Ь0.08 (9.0±1.5)-10"3 521:17 0.52±0.07 (5.0±0.9)Т0"2 10.4±3.3

Таб. 2. Кинетические параметры для реакций амидолиза рекомбинантным одноцепочечньш антителом всК\'6В8-Е12.

Таким образом, рекомбинантное одноцепочечное антитело, в общих чертах, сохранило функцию исходного моноклонального антитела, и, тем самым, мы доказали окончательно, что обнаруженная активность действительно имеет «абзиматическую» природу. Отсутствие активности по отношению к высокомолекулярному субстрату может быть обусловлено структурными особенностями рекомбинантного антитела - наличием междоменного гибкого линкера, затрудняющего правильный фолдияг продукта. По всей видимости, полученный «минимальный катализатор», не способен осуществить в полной мере сложную протеолигическую функцию, присущую полноразмерному антителу.

Заключение.

результаты данной диссертационной работы предполагают возможность получения абзимов катализирующих широкий спектр реакций, таких как эстеролиз, амидолиз и протеолиз, при использовании подхода, основанного на переносе активного центра выбранного фермента на антитело. Данные, полученные в работе, расширяют представления о получении каталитических антител в целом и протеолитических абзимов в частности.

На этом этапе исследований трудно определить нуклеофильный остаток протеолитического антиидиотипа. Трехмерное моделирование вариабельных фрагментов антитела 6В8-Е12, хоть и помогло объяснить специфичность к гидрофобным аминокислотным остаткам каталитического антитела, но не позволило определить аминокислотные остатки, формирующие активный центр абзима. Это не удивительно, известно, что определяющими в катализе гипервариабельными регионами являются CDR2 и CDR3, и вследствие экстремально высокой гипервариабельности CDR3 тяжело подобрать подходящую матрицу для точного представления активного центра антитела.

Ранее было показано, что протеолитическая ВИПазная легкая цепь имеет активный центр, закодированный в зародышевой линии антитела (Paul, S. et al, 1989). На основании этих данных была дополнена гипотеза о врожденном «антительном» катализе. Данные же по эстеролитическому антителу 9А8 свидетельствуют о принципиальной влиянии соматических гипермутаций в формировании каталитического центра антитела и, в частности реакционного серина. Сравнение вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела 6В8-Е12 с соответствующими им зародышевыми линиями выявила несколько мутаций аминокислотных остатков, которые могут вовлекаться в образование активного центра абзима.

Сравнительный анализ первичных структур «родительского антигена», субтилизина Карлсберг, и его каталитически активного антиидиотипа - антитела 6В8-Е12 - показал отсутствие каких-либо схожих мотивов в указанных

структурах. Таким образом, их каталитическая функция закодирована в абсолютно разных последовательностях, что согласуется с данными, полученными для других антиидиотипических абзимов. Следовательно, эволюция сложной биокаталитической функции может быть осуществлена с использованием различных белковых матриц.

Описанный в диссертации подход может иметь принципиальное значение для получения сайт-специфических протеолитических антител, способных, в качестве «каталитических вакцин», разрушать в организме различные белковые мишени (патогены, цитокины и др.).

Выводы.

1. Показано, что антиидиотипическое антитело, воспроизводящее область активного центра протеиназы субтилизин Карлсберг, обладает протеолитической активностью и имеет сходную с субтилизином субстратную специфичность.

2. Проведено клонирование вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей идиотипического (5-Н4) и антиидиотипического (6В8-Е12) антител и определена их нуклеотидная последовательность.

3. Проведена экспрессия антитела 6В8-Е12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела (всБу).

4. Изучена функциональная активность бсБу и оценены кинетические параметры катализируемых им реакций амидолиза.

5. Сравнение первичной структуры идиотипического антитела показало высокую степень гомологии с известными антителами, ингибирующими ферменты.

6. Не обнаружено сходства по первичной и третичной структуре между антиидиотипическим антителом и субтилизином, однако наличие каталитической активности 6В8-Е12 свидетельствует о том, что протеолитическая функция может быть определена другими структурными мотивами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Смирнов И.В., Воробьев И.И.,Фрибуле А.,Аваль Б., Тома Д., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. (2008) Антиидиотипический подход для получения антитела-протеазы.. Доклады Академии Наук, т.420, №1, с. 130-133.

2. Ponomarenko, N.A., Pillet, D., Paon, M., Vorobiev, I.I., Smirnov, I.V., Adenier, H., Avalle, В., Kolesnikov, A.V., Kozyr, A.V., Thomas, D., Gabibov, A.G., Friboulet, A. Anti-Idiotypic Antibody Mimics Proteolytic Function of Parent Antigen. Biochemistry, 2007. У. 46, P. 14598-14609.

3. Пономаренко H.A., Пилле Д., Паон М., Воробьев И.И., Смирнов И.В., Авалле Б., Колесников А.В., Козарь А.В., Тома Д., Габибов А.Г. Фрибуле А. Антиидиотипическое антитело, обладающее протеолитической активностью исходного антигена.// XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" // Москва, 7-9 февраля, 2007, Доклад.

4. Смирнов И.В., Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Фрибуле А., Габибов А.Г. Антитело с протеолитической функцией. // XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" // Москва, 7-10 февраля, 2006, Сборник тезисов.

5. Smirnov, I.V. Functional and molecular-genetic study of monoclonal antiidiotype antibodies 6B8-E12 and 1C3-C5. // International Conference Fundamentals & Applications "Biocatalysis" // June 19-23,2005, Abstracts.

Заказ № 127/04/08 Подписано в печать 17.04.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание.

Введение.

Обзор литературы.

Индуцированные абзимы.

Природные каталитические антитела.

Антиидиотипические антитела.

Результаты и обсуждение.

Исследование каталитической активности антиидиотипического антитела

6В8-Е12.'.'.

Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и

6В8-Е12.

Создание генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела

6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела.

Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела.

Материалы и реактивы.

Стоковые растворы.

Методы.

Работа с нуклеиновыми кислотами.Г.

Методы работы с бактериями Escherichia coli.

Работа с белками.

Выводы.

Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем осуществляются при участии ферментов. В последние десятилетия прошлого века исследователям удалось с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененной субстратной специфичностью. В ряду каталитических активных молекул особенное место занимают рибозимы каталитические молекулы РНК и абзимы - каталитические антитела.Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и в основном ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.Весьма интересным было бы получить абзим, способный разрушать белки патогенов. В этой связи крайне важной является задача создания каталитического антитела с протеолитической функцией. Эта задача -оказывается практически невыполнимой с помощью подхода с использованием аналогов переходных состояний в качестве исходных гаптенов. Антительная матрица, специфически связывающаяся со структурой, мимикрирующей тетраэдр, эффективна в качестве биокатализатора эстеролиза, но не способна осуществить более сложные превращения, требующие эффективных конформационных подстроек в комплексе биокатализатор - белковый субстрат.Существует три основных подхода к созданию протеолитических абзимов: 1) реакционная иммунизация 2) индукция протеолитических антител на фоне индуцируемого аутоиммунного заболевания 3) получение антиидиотипических антител, как антител внутреннего образа на ферменты, катализирующие реакцию протеолиза.Метод получения антиидиотипических антител опирается на свойства иммунной системы образовывать антитела "внутреннего1 образа" и на идиотипическую гипотезу, высказанную в 1974 году Н. Ерни [1]. Первым удачным примером абзима, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, связывающее моноклональное антитело АЕ2, которое в свою очередь связывает активный центр ацетилхолинэстеразы.Было показано, что антитело 9А8 проявляет свойства исходного антигена, то есть обладает ацетилхолинэстеразной активностью [2].Данная диссертационная работа посвящена проблеме структурнофункционального исследования антиидибтипического антитела 6В8Е12, полученного к участку активного центра эндопротеиназы субтилизин Карлсберг.Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».

Выводы.

1. Показано, что антиидиотипическое антитело, воспроизводящее область активного центра протеиназы субтилизин Карлсберг, обладает протеолитической активностью и имеет сходную с субтилизином субстратную специфичность.

2. Проведено клонирование вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей идиотипического (5-Н4) и антиидиотипического (6В8-Е12) антител и определена их нуклеотидная последовательность.

3. Проведена экспрессия антитела 6В8-Е12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела (scFv).

4. Изучена функциональная активность scFv и оценены кинетические параметры катализируемых им реакций амидолиза.

5. Сравнение первичной структуры идиотипического антитела показало высокую степень гомологии с известными антителами, ингибирующими ферменты.

6. Не обнаружено сходства по первичной и третичной структуре между антиидиотипическим антителом и субтилизином, однако наличие каталитической активности 6В8-Е12 свидетельствует о том, что протеолитическая функция может быть определена другими структурными мотивами.

1. Jerne, N.K., Towards a network theory of the immune system. Ann Immunol (Paris), 1974.125C(l-2): p. 373-89.

2. Izadyar, L., et al., Monoclonal anti-idiotypic antibodies as functional internal images of enzyme active sites: production of a catalytic antibody with a cholinesterase activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(19): p. 8876-80.

3. Pauling, L., Chem Eng News, 1946. 36: p. 1375-77.

4. Jenks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology. New York: McGraw-Hill., 1969.

5. Raso, V. and B.D. Stollar, The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry, 1975. 14(3): p. 591-9.

6. Kohen, F., et al., Monoclonal immunoglobulin G augments hydrolysis of an ester of the homologous hapten: an esterase-like activity of the antibody-containing site? FEBS Lett, 1980.111(2): p. 427-31.

7. Kohen, F., et al., Antibody-enhanced hydrolysis of steroid esters. Biochim Biophys Acta, 1980. 629(2): p. 328-37.

8. Kohler, G. and C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975. 256(5517): p. 495-7.

9. Pollack, S.J., J.W. Jacobs, and P.G. Schultz, Selective chemical catalysis by an antibody. Science, 1986. 234(4783): p. 1570-3.

10. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Catalytic antibodies. Science, 1986. 234(4783): p. 1566-70.

11. Tramontano, A., Janda, K.D., and Lerner R.A., Antibody catalysis approaching the activity of enzymes. J Am Chem Soc, 1988. 110: p. 2282-6.

12. Shokat, K.M. and P.G. Schultz, Catalytic antibodies. Annu Rev Immunol, 1990. 8: p. 335-63.

13. Schultz, P.G., The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts. Science, 1988. 240(4851): p. 426-33.

14. Napper, A.D., et al., A stereospecific cyclization catalyzed by an antibody. Science, 1987. 237(4818): p. 1041-3.

15. Hilvert, D., et al., Catalysis of concerted reactions by antibodies: the Claisen rearrangement. Proc Natl Acad Sci USA, 1988. 85(14): p. 4953-5.

16. Bencovic S. J., N.A.D., Lerner R. A., Catalysis of a Stereospecific Bimolecular Amide Synthesis by an Antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988. 85(5355-8).

17. Hilvert D., H.K.W., Nared K. D., Auditor M. Т. M., Antibody Catalysis of a Diels-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1989. Ill: p. 9261-9262.

18. Braisted A. C., S.P.G., An Antibody-catalyzed Bimolecular Diels-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1990.112: p. 7430-1.

19. Romesberg, F.E., et al., Immunological origins of binding and catalysis in a Diels-Alderase antibody. Science, 1998. 279(5358): p. 1929-33.

20. Mundorfl", E.C., et al., Conformational effects in biological catalysis: an antibody-catalyzed oxy-cope rearrangement. Biochemistry, 2000. 39(4): p. 627-32.

21. Tawfik, D.S., et al., Efficient and selective p-nitrophenyl-ester-hydrolyzing antibodies elicited by a p-nitrobenzyl phosphonate hapten. Eur J Biochem, 1997. 244(2): p. 619-26.

22. Suzuki, H., et al., A catalytic antibody that accelerates the hydrolysis of carbonate esters. Prediction of the binding-site structure of the substrate. J Protein Chem, 1998.17(3): p. 273-8.

23. Blackburn, G.M., et al., Catalytic antibodies. Biochem J, 1989. 262(2): p. 381-90.

24. Janda, K.D., et al., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science, 1988. 241(4870): p. 1188-91.25,2627,2829,30,3132,3334,35,3637,38,3942,43,44,45,46,47,48,49.

25. Thayer, M.M., et al., Structural basis for amide hydrolysis catalyzed by the 43C9 antibody J Mol Biol, 1999. 291(2): p. 329-45.

26. Miyashita, H., et al., Prodrug activation via catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(11): p. 5337-40.

27. McKenzie, K.M., et al., Identification and characterization of single chain anti-cocaine catalytic antibodies. J Mol Biol, 2007. 365(3): p. 722-31.

28. Savitsky, A.P., et al., Kinetics of oxidation of o-dianisidine by hydrogen peroxide in the presence of antibody complexes of iron(III) coproporphyria Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3): p. 317-27.

29. Pollack, S.J., G.R. Nakayama, and P.G. Schultz, Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites. Science, 1988. 242(4881): p. 103840.

30. Fletcher, M.C., et al., Creation of a ribonuclease abzyme through site-directed mutagenesis. Nat Biotechnol, 1998.16(11): p. 1065-7.

31. Gruber, K., et al., Structural basis for antibody catalysis of a disfavored ring closure reaction. Biochemistry, 1999. 38(22): p. 7062-74.

32. Shabat, D., et al., Antibody catalysis of a reaction otherwise strongly disfavoured in water. Nature, 1995. 374(6518): p. 143-6.